一种微反应器专用纳米粒子固定化酶合成异槲皮苷的方法

摘要

一种微反应器专用纳米粒子固定化酶合成异槲皮苷的方法，属于生物催化领域。以石墨烯为固定化酶载体对游离柚皮苷酶进行固定化，加入表面活性剂混匀通入微通道反应器中，可大大提高酶促反应速率和酶的重复利用效率。该方法设计新颖，操作简便，反应条件温和，既可以提高该催化反应的反应速率、解决底物与酶液难分离的缺点，又提高了单位酶量生产异槲皮苷的效率，拓宽了微反应器用于生物催化的领域。

权利要求

1.一种微反应器专用纳米粒子固定化酶合成异槲皮苷的方法，其特征在于步骤为：按比例，将10mg石墨烯加入10mL离心管中，再加入20g/L柚皮苷酶2mL，盖紧后用保鲜膜密封，将其置于50℃的水浴摇床中震荡5h，取出离心管后，以10000r/min高速离心10min，除去上清液，向试管中加入2mL纯水离心10min，除去上清液，重复两到三次后，即为固定化柚皮苷酶；将表面活性剂十二烷基苯磺酸钠按照10%的体积比例加入反应体系中，选择微通道反应器，流速控制在8μL/min，反应温度选取50℃，芦丁溶液和固定化柚皮苷酶质量比5:1，底物浓度芦丁设为0.5g/L，溶剂为pH 7的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；反应结束后产物和固定化柚皮苷酶混匀在一起，以10000 r/min的转速高速离心10 min，取上清液测HPLC，沉淀石墨烯使用0.2M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液清洗两遍以后继续加入底物溶液和表面活性剂后通入微通道反应器中继续催化反应，重复15次；所述微通道反应器由注射泵、反应器本体和接收器三部分通过塑料管连接而成，注射泵调节流速；反应器本体材料为聚甲基丙烯酸甲酯，由一个T-型双入口和一个出口组成，通道宽200μm，深50μm，长度1m；反应器本体进口设有的不锈钢针连接塑料管，再连接注射器，出口设有的不锈钢针连接塑料管，再连接样品接装置。

说明书

一种微反应器专用纳米粒子固定化酶合成异槲皮苷的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物催化领域，具体涉及一种微反应器专用纳米粒子固定化酶合成异槲皮苷的方法。

背景技术

[0002] 现有技术：异槲皮苷(Isoquercitrin)是一种自然界中非常罕见但具有显著抗氧化性、抗肿瘤等生物活性的黄酮类有效成分，也是近年来国际上新型功能性食品添加剂EMIQ(Enzymatically modified isoquercitrin)的合成原料(Toxicology,2010,268(3):213-218)，自然界含量极低，需要依赖于芦丁的选择性水解。目前合成异槲皮苷的主要方法是采用生物催化水解芦丁而得到，但是依然存在反应速率低、时间长的问题，且游离酶催化也存在着产物与酶溶液难分离的缺点。新型功能性食品添加剂EMIQ(Enzymatically modified isoquercitrin)的制备需要大量的底物芦丁来制备，其前体异槲皮苷需要快速大量制备，酶促催化合成又需要在水溶液中进行来保证酶的活力，因而亟需找到一种提高反应速率及酶的重复利用度的方法。

[0003] 微反应器是一种在微米尺度空间内对流体进行操控为主要特征的科学技术。生物催化与转化利用生物体系作为催化剂来实现物质转化，是可持续发展过程中替代传统化学合成的重要方法，是制备高活性、低含量和复杂结构高附加值精细化学品的有效途径，是全球生物制造源头创新最有希望的技术之一(Advanced Synthesis & Catalysis,2011,353(13):2511-2521)。随着微流化学(Microfluidic chemistry)和微流控技术(Microfluidic technique)的迅猛发展，2011年，国际上提出了“Miniaturizing Biocatalysis”(译为“微型生物催化”)这一全新概念(Bioresource Technology,2014,158:39-47)，并迅速成为生物化工领域优先发展的方向之一。微反应器中生物催化合成异槲皮苷即可以解决反应速率低、时间长的缺点。

[0004] 固定化酶，是通过化学或物理的处理方法使原来游离性的酶与难溶性的载体相结合，旨在获取良好的酶活力和重复利用度，可以反复多次使用，从而降低反应成本。固定化酶的载体材料作为固定化酶的一部分，其结构和性能对固定化酶的催化性能具有重大的影响。迄今为止，随着研究的深入，固定化酶的载体材料的选择已从最初的天然高分子材料发展到合成高分子材料、无机材料以及现在的复合材料，甚至是直接对反应器直接进行固定化等，从而方便其实际应用。但是一般的固定化材料主要包括壳聚糖、活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷以及多孔玻璃等等，这些材料对于在常规反应器中固定化酶促合成均可以较好的作为固定化载体，但是本实验拟采用固定化酶直接运用于微通道反应器中，上述的固定化载体由于其密度较大、颗粒粒径较大的原因就不能在微反应器中使用。为此就需要寻找新兴的材料来克服传统固定化酶载体的缺陷，使其可正常用于微通道高反应器内酶的固定化，解决酶的重复利用度低的问题。

[0005] 石墨烯作为目前发现的最薄、强度最大、导电导热性能最强的一种新型纳米材料，被称为“黑金”，是“新材料之王”，科学家甚至预言石墨烯将掀起一场席卷全球的颠覆性新技术新产业革命。目前关于石墨烯固定化酶的研究报道较少，其研究主要停留在石墨烯固定化蛋白水平的研究(Nanoscale,2012,4:3969-3976)和在生物传感方面，目前还没有应用于微流控酶催化反应方面的研究。纳米粒子固定化酶运用于微流控反应器,需要对载体的粒径和密度有较高的要求,而石墨烯正好具有传统的固定化载体不具备的特点。因此本实验拟采用石墨烯作为固定化酶载体将其应用于微通道反应器中的生物催化合成反应。

[0006] 专利CN 102391947 A发明了一种多孔整体柱固定化酶微反应器的制备方法，首先制备聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯整体柱，然后分别用半胱胺和金纳米粒子修饰poly(GMA-co-EDMA)整体柱，得到表面固载金纳米粒子的多孔聚合物整体柱。利用Au-NH2键作用，将酶固定于该金纳米粒子修饰的多孔整体柱孔表面，即得多孔整体柱固定化酶微反应器，该反应器相当于固定床固定化酶微反应器，虽然解决了酶的重复利用度的问题，但仍存在固定化酶与底物可能存在混匀不均的问题。专利CN 103627634 A发明了一种毛细管内固定化酶微反应器的制备方法，采用戊二醛键合法将神经氨酸酶固定在毛细管出口端，该固定化酶微反应器可连续使用1个月以上；酶的活性没有明显降低，大大增强了酶的稳定性，从而很大程度地降低了酶的用量，此方法虽然操作方便、筛选速度快，但使用的局限性较大，仅适合应用于神经氨酸酶抑制剂的筛选。因此本发明提出的微反应器专用纳米粒子固定化酶催化合成异槲皮苷的方法是一种通用的固定化游离酶用于生物催化合成天然产物的通用方法，拓宽固定化酶的应用范围。

发明内容

[0007] 解决的技术问题：针对现有技术中所述的不足，本发明提供了一种微反应器专用纳米粒子固定化酶合成异槲皮苷的方法，扩大固定化酶应用范围和领域。

[0008] 技术方案：一种微反应器专用纳米粒子固定化酶合成异槲皮苷的方法，选取的固定化酶载体为石墨烯，且将石墨烯固定化酶同时运用于微通道反应器中提高传热传质和粒子的空间效应。

[0009] 具体步骤为：按比例，将10mg石墨烯加入10mL离心管中，再加入20g/L柚皮苷酶2mL，盖紧后用保鲜膜密封，将其置于50℃的水浴摇床中震荡5h，取出离心管后，以10000r/min高速离心10min，除去上清液，向试管中加入2mL纯水离心10min，除去上清液，重复两到三次后，即为固定化柚皮苷酶；将表面活性剂按照5％～100％的体积比例加入反应体系中，选择微通道反应器，流速控制在2-20μL/min，反应温度选取30-55℃，芦丁和固定化柚皮苷酶质量比2:1-1:5，底物浓度芦丁设为0.01-2g/L，溶剂为pH 7的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；反应结束后产物和固定化柚皮苷酶混匀在一起，以10000r/min的转速高速离心10min，取上清液测HPLC，沉淀石墨烯使用0.2M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液清洗两遍以后继续加入底物溶液和表面活性剂后通入微通道反应器中继续催化反应，重复15次。

[0010] 上述表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠、聚乙烯醇、十二烷基磺酸钠、十二烷基二甲基氧化胺或十六烷基三甲基溴化铵，反应体系和表面活性剂添加体积比例为20:1-1:1。

[0011] 上述微通道反应器由注射泵、反应器本体和接收器三部分通过塑料管连接而成，注射泵调节流速；反应器本体材料为聚甲基丙烯酸甲酯，由一个T-型双入口和一个出口组成，通道宽200μm，深50μm，长度0.5-3m；反应器本体进口设有的不锈钢针连接塑料管，再连接注射器，出口设有的不锈钢针连接塑料管，再连接样品接装置。

[0012] 有益效果：在使用微反应器专用纳米粒子固定化酶酶促合成异槲皮苷过程中，反应时间和常规反应器相比反应时间大大缩短，酶可高效的重复利用多次而仍保持较高的催化活力，从而提高单位酶量催化合成异槲皮苷的产量。以此衍生到其它珍稀天然产物的合成可以利用此方法进行，拓宽微反应器专用纳米粒子固定化酶的适用范围。该方法操作简便、条件温和，对环境友好，且不易破坏底物或产物化合物的生物活性，多个反应器串接后提高产量，易于工业化应用。

具体实施方式

[0013] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0014] 本发明固定化酶固载量的测定方法用的是考马斯亮蓝法，吸附前后样品中分别加入1mL待测样品液体和5mL考马斯亮蓝染液，将试管中的溶液纵向倒转混匀，室温静止5min后，测其吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出蛋白含量，即可计算得到纳米粒子的吸附量。

[0015] 实施例中所用微通道反应器由注射泵、反应器本体和接收器三部分通过塑料管连接而成，注射泵调节流速；反应器本体材料为聚甲基丙烯酸甲酯，由一个T-型双入口和一个出口组成，通道宽200μm，深50μm，长度0.5-3m；反应器本体进口设有的不锈钢针连接塑料管，再连接注射器，出口设有的不锈钢针连接塑料管，再连接样品接装置。

[0016] 本发明实施例中使用检测异槲皮苷的测定方法为高效液相色谱法，色谱条件：Alltima C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：0.02％磷酸-乙腈(80:20，v/v)；检测波长：
360nm；流速：1.0mL/min；进样量：20μL。

[0017] 其中，异槲皮苷得率的计算方法为：

[0018]

[0019] 式中,Y为异槲皮苷的得率(％),M芦丁是芦丁的摩尔质量(g/mol),M异槲皮苷是异槲皮苷的摩尔质量(g/mol),C为芦丁的质量浓度(g/L),V为体系的总体积(L),m芦丁是反应体系中芦丁的质量(g)。

[0020] 实施例1

[0021] 一种微反应器专用纳米粒子固定化酶合成异槲皮苷的方法，以石墨烯固定化酶和微通道反应器为研究对象，按照下述步骤进行：将10mg石墨烯加入10mL离心管中，再加入20g/L柚皮苷酶2mL，盖紧后用保鲜膜密封，将其置于50℃的水浴摇床中震荡5h，取出离心管后，以10000r/min高速离心10min，除去上清液，向试管中加入2mL纯水离心10min，除去上清液，重复两到三次后，即为固定化柚皮苷酶。选取了5种表面活性剂十二烷基苯磺酸钠、聚乙烯醇、十二烷基磺酸钠、十二烷基二甲基氧化胺和十六烷基三甲基溴化铵，分别按照5％的比例加入反应体系(包括1mL芦丁溶液，一定量的石墨烯固定化酶)中，使石墨烯固定化酶(柚皮苷酶)可以相对均匀地分散在溶液中。通入1m长的微通道反应器中，流速控制在2μL/min，反应温度选取50℃，芦丁和石墨烯固定化酶质量比1:1，底物浓度设为0.1g/L。反应结束后离心取样，用HPLC测其样品中异槲皮苷的浓度，结果见表一。结果表明，所有添加了表面活性剂的实验组的异槲皮苷得率均高于空白对照组，且添加十二烷基苯磺酸钠作为表面活性剂的异槲皮苷得率最高，达到86.3±1.8％。

[0022] 表一不同类型的表面活性剂对应的异槲皮苷得率

[0023]

[0024] 实施例2

[0025] 使用实施例1中的石墨烯固定化柚皮苷酶，将预先配制好的0.01g/L的芦丁溶液和石墨烯固定化酶按照质量比2:1混匀。将配制好的石墨烯固定化酶和芦丁溶液与十二烷基苯磺酸钠表面活性剂按照体积比20:1混匀，后通过微量注射泵以2μL/min的流速注入通道长度为0.5m的微通道反应器中，柱温箱温度控制在30℃，定时收集出口物料，用HPLC检测反应结束后混合液中异槲皮苷的浓度，实验重复三次，异槲皮苷的得率可达到58.4±2.1％。

[0026] 实施例3

[0027] 使用实施例1中的石墨烯固定化柚皮苷酶，将预先配制好的2g/L的芦丁溶液和固定化酶按照质量比1:5混匀。将配制好的石墨烯固定化酶和芦丁反应液与十二烷基苯磺酸钠表面活性剂按照体积比1:1加入混匀，后通过微量注射泵以20μL/min的流速注入通道长度为3m的微通道反应器中，柱温箱温度控制在55℃，定时收集出口物料，用HPLC检测反应结束后混合液中异槲皮苷的浓度，实验重复三次，异槲皮苷的得率可达到83.4±0.8％。

[0028] 实施例4

[0029] 使用实施例1中的石墨烯固定化柚皮苷酶，将预先配制好的0.5g/L的芦丁溶液和固定化酶按照质量比5:1混匀。将配制好的石墨烯固定化酶和芦丁反应液与十二烷基苯磺酸钠表面活性剂按照体积比10:1加入混匀，后通过微量注射泵以8μL/min的流速注入通道长度为1m的微通道反应器中，柱温箱温度控制在50℃，定时收集出口物料，用HPLC检测反应结束后混合液中异槲皮苷的浓度，实验重复三次，异槲皮苷的得率可达到96.4±0.7％。