本发明属于植物显微观测技术领域，公开了一种桉树组织的石蜡切片方法。该方法包括取材和固定、洗涤、脱水、透明、透蜡、包埋、切片、展片、贴片和烤片、脱蜡复水、染色、脱水和复染、封片。本发明采用新型固定液聚羟基丙烯酸，该固定液固定速度快，可以大大减少固定时间，并且可以使固定更加均匀；同时，我们使用完全无毒的TO透明剂代替二甲苯，TO透明剂25℃以上能与95％的乙醇互溶，能溶解石蜡和封固树胶，挥发性好，对常用生物染料染色无不良影响，且透明和脱蜡效果较好，透明后，组织不易变脆，切片可保持完整；还使用封片剂CVmount替代中性树胶。本发明通过优化石蜡制片中的固定、脱水和封片步骤，在保证切片效果的前提下，使制片周期缩短了至少72h。
1.一种桉树组织的石蜡切片方法，其特征在于包括以下步骤：(1)取材和固定：取0.3～0.7cm长的桉树幼嫩茎段或初生根作为固定的材料，将材料放入装有聚羟基丙烯酸固定液的玻璃瓶中，密封并抽真空，然后静置，室温下固定1h；
(2)洗涤：将固定后的材料取出，依次移入到装有50％乙醇、70％乙醇、70％乙醇的玻璃瓶中，塞紧瓶塞分别洗涤13～17min，其中玻璃瓶中的液体体积均为材料的30倍以上，然后再将材料移入装有70％乙醇的玻璃瓶中保存备用，同时加入0.05～0.20mL 1％的番红酒精溶液，以便包埋时识别材料；
(3)脱水：将步骤(2)中洗涤后的材料依次移入盛有体积为材料30倍以上的85％乙醇、
95％乙醇、无水乙醇、无水乙醇的玻璃瓶中分别脱水处理40～60min；
(4)透明：将经步骤(3)脱水后的材料依次移入装有透明剂Ⅰ、透明剂Ⅱ、透明剂Ⅲ的玻璃瓶中分别透明处理1h；
(5)透蜡：向步骤(4)中透明处理后的玻璃瓶中加入与瓶中透明剂Ⅲ等体积的碎蜡，然后放入空气恒温箱，处理温度为40℃，处理时间为8h；8h之后将空气恒温箱的温度调整为60℃，处理时间为2h；然后将材料移入预先加热熔化的纯石蜡，60℃透蜡处理4h后更换熔化的纯石蜡，继续在空气恒温箱中60℃透蜡处理2h；
(6)包埋：将熔好的石蜡倒入包埋纸盒，迅速取出步骤(5)中透蜡后的材料放入包埋纸盒，根据切片的需要用解剖针调整材料的位置；待包埋纸盒中的石蜡表面结成一层蜡膜之后将纸盒在2～6℃冷藏条件下冷却2h，使石蜡由熔融态凝固成石蜡块；
(7)切片：将步骤(6)中包埋后的石蜡块经过切割、修整和固着，然后经切片机将石蜡块切成蜡带，切片厚度为8～15μm，将蜡带保存在30％乙醇中；
(8)展片：将经步骤(7)切片后的蜡带放入30℃～40℃温水展片90～120s，使蜡带完全展开，蜡带光滑一面朝下，蜡带展片后用刀片分割蜡带；
(9)贴片和烤片：在洁净载玻片上，涂抹好蛋清甘油贴片剂，将分割好的蜡带贴在载玻片涂有贴片剂的位置上，蜡带光滑一面朝下；然后在蜡带上滴加蒸馏水，确保蜡带被完全浸过后倾斜载玻片倒掉多余的蒸馏水，将贴好切片的载玻片放入空气恒温箱，40℃烤干；
(10)脱蜡复水：将步骤(9)中烤干的贴有切片的载玻片放入空气恒温箱中，处理温度为
60℃，使切片里的石蜡完全熔化，然后将贴有切片的载玻片依次转入透明剂Ⅲ、透明剂Ⅱ中分别脱蜡处理25min，再转入到透明剂Ⅰ中脱蜡处理10min，再依次转入无水乙醇、95％乙醇、
90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇和蒸馏水中分别复水处理5min，使石蜡完全褪去，载玻片上只剩下留在原位的材料，即带材料载玻片；
(11)染色：将步骤(10)中得到的带材料载玻片转入1％番红酒精溶液，常温下染色22～
A、将经步骤(11)染色后的带材料载玻片依次转入70％乙醇、80％乙醇中分别脱水处理
B、将经A处理过的带材料载玻片转入0.63％的固绿酒精溶液中复染5s；
C、将经B复染后的带材料载玻片依次转入95％乙醇、无水乙醇中分别脱水处理2min；
D、将经C处理过的带材料载玻片转入无水乙醇中脱水处理1min，再依次转入透明剂Ⅰ、透明剂Ⅱ中分别透明处理5min，最后转入透明剂Ⅲ中透明处理2min；
(13)封片：将经步骤(12)处理后的带材料载玻片从透明剂Ⅲ中取出，用滤纸擦去材料以外多余的透明剂Ⅲ，在透明剂Ⅲ未挥发干时，在载玻片上有材料的区域滴加封片剂，取洁净的盖玻片，缓慢盖在载玻片上，使封片剂布满整个有材料的区域，室温下晾晒1h后即可观察；
步骤(4)、(5)、(10)、(12)和(13)中，所述的透明剂Ⅰ为TO透明剂和无水乙醇的等体积混合液，所述的透明剂Ⅱ和透明剂Ⅲ均为TO透明剂。
2.根据权利要求1所述的桉树组织的石蜡切片方法，其特征在于：步骤(1)～(12)中未注明温度的操作均在室温下进行。
3.根据权利要求1所述的桉树组织的石蜡切片方法，其特征在于：除步骤(2)中所述的番红酒精溶液外，步骤(1)～(12)中所用液体的量均至少能够浸没材料。
4.根据权利要求1所述的桉树组织的石蜡切片方法，其特征在于：步骤(1)中所用的材料与聚羟基丙烯酸固定液的体积比为1：(10～30)。
5.根据权利要求1所述的桉树组织的石蜡切片方法，其特征在于：步骤(1)中所述的密封是指用橡皮塞密封，并在橡皮塞与瓶口接触的地方涂抹凡士林；
6.根据权利要求1所述的桉树组织的石蜡切片方法，其特征在于：步骤(7)中所述的切割、修整和固着的具体操作如下：根据切片机选择合适的台木，将包埋后的石蜡块分割，按照台木尺寸进一步将蜡块修整成四棱台状，然后用酒精灯加热蜡块底部使其稍熔后，迅速固着在台木上，在蜡块和台木接触处滴一圈蜡液，待其凝固后加固蜡块。
7.根据权利要求1所述的桉树组织的石蜡切片方法，其特征在于：步骤(9)所述的蛋清甘油贴片剂由以下步骤制备得到：将搅拌成泡沫状的蛋清和甘油等体积混合即得蛋清甘油贴片剂。
8.根据权利要求1所述的桉树组织的石蜡切片方法，其特征在于：步骤(13)中所述的封片剂为CVmount封片剂。
一种桉树组织的石蜡切片方法
技术领域
[0001] 本发明属于植物显微观测技术领域，特别涉及一种桉树(Eucalyptus)组织的石蜡切片方法。
背景技术
[0002] 石蜡切片(paraffin section)技术的应用已经有300多年的历史，是植物组织结构学常规制片技术中最为广泛应用的方法之一。石蜡切片不仅可用于观察植物正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以观察、研究及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于基础生物学等多学科领域的研究中。近年来，随着生物科学技术的发展，植物生态解剖学和分子生物学的兴起，石蜡切片技术更加活跃地应用于植物科学研究领域，成为了不同生境植物或演替系列优势种生态适应性研究的重要手段。
[0003] 石蜡切片技术包括取材、固定、洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。取材应根据要求选取材料来源及部位，材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解和变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。固定是指用适当的固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其取材时的结构。固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且有媒浸作用，有利于组织着色。洗涤就是将留在组织内的固定液及其结晶沉淀洗净，否则会影响后期的染色效果。脱水是使用一定的试剂除去组织中多余的水分，有利于透明，浸蜡，包埋试剂的浸入。透明是指使用透明剂来置换组织中的脱水剂，使材料透明干净，增加折光系数，以便石蜡渗入组织。浸蜡是用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用，使材料可用于切片。染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察，经染色可显示细胞内不同的细胞器、内含物以及不同类型的细胞组织。染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经梯度酒精脱水，二甲苯透明，滴加适量中性树胶，盖盖玻片封片后即制成永久性玻片标本，在光镜下可长期反复观察。一般的组织从取材、固定到封片制成玻片标本需要5～7天。
[0004] 石蜡切片常用的固定液主要有FAA固定液(主要成分为福尔马林、醋酸和酒精，固定8～24h)，FPA固定液(主要成分为福尔马林、丙酸和酒精，固定8～24h)，卡诺氏(Carnoy’s)固定液(主要成分为酒精和乙酸；酒精、乙酸和氯仿；甲醇、乙酸和氯仿；根尖、花药固定15～30min，其他材料固定时不超过24h)，铬酸-乙酸固定液(主要成分为铬酸、乙酸和麦芽糖，固定12～24h)，纳瓦申(Navashin’s)固定液(主要成分为铬酸、乙酸和甲醛，固定12～24h)。其中甲醛、甲醇、乙醇、乙酸和氯仿易挥发，而且甲醛、甲醇和氯仿对人体有毒害作用，并对环境造成污染。常规固定液固定时间一般较长，一般在8h～24h之间。整个制片过程中，组织的透明、切片的脱蜡和切片的透明等步骤都离不开二甲苯，该试剂是常规植物切片技术必用试剂。但是，二甲苯为挥发性强的剧毒化学试剂，对人的呼吸、造血及神经系统具有很强的毒害作用，也是致癌物质之一，严重危害长期从事组织切片实验人员的健康；另外，二甲苯用于切片制片时对组织穿透能力强，透明时间不好把握，易使切片组织收缩，发硬变脆，增加了切片制作的难度，容易形成废片，浪费材料。因此，寻找二甲苯的无毒性替代品对改善石蜡切片工作环境，保护操作者健康和提高切片质量具有重要意义。
发明内容
[0005] 为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种桉树组织的石蜡切片方法。该方法在固定、脱水和封片环节进行了优化，使用聚羟基丙烯酸作为固定剂，并使用TO透明剂替代二甲苯，封片剂CVmount替代中性树胶，在保证切片效果的前提下大大缩短了制片所用时间。
[0006] 本发明的目的通过下述方案实现：
[0007] 一种桉树组织的石蜡切片方法，主要包括以下步骤：
[0008] (1)取材和固定：取0.3～0.7cm长的桉树幼嫩茎段或初生根作为固定的材料，将材料放入装有聚羟基丙烯酸固定液的玻璃瓶中，密封并抽真空，然后静置，室温下固定1h。
[0009] (2)洗涤：将固定后的材料取出，依次移入到装有50％乙醇、70％乙醇、70％乙醇的玻璃瓶中，塞紧瓶塞分别洗涤13～17min，其中玻璃瓶中的液体体积均为材料的30倍以上，然后再将材料移入装有70％乙醇的玻璃瓶中保存备用，同时加入0.05～0.20mL 1％的番红酒精溶液，以便包埋时识别材料。
[0010] (3)脱水：将步骤(2)中洗涤后的材料依次移入盛有体积为材料30倍以上的85％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、无水乙醇的玻璃瓶中分别脱水处理40～60min。
[0011] (4)透明：将经步骤(3)脱水后的材料依次移入装有透明剂Ⅰ、透明剂Ⅱ、透明剂Ⅲ的玻璃瓶中分别透明处理1h。
[0012] (5)透蜡：向步骤(4)中透明处理后的玻璃瓶中加入与瓶中透明剂Ⅲ等体积的碎蜡，然后放入空气恒温箱，处理温度为40℃，处理时间为8h；8h之后将空气恒温箱的温度调整为60℃，处理时间为2h；然后将材料移入预先加热熔化的纯石蜡，60℃透蜡处理4h后更换熔化的纯石蜡，继续在空气恒温箱中60℃透蜡处理2h。
[0013] (6)包埋：将熔好的石蜡倒入包埋纸盒，迅速取出步骤(5)中透蜡后的材料放入包埋纸盒，根据切片的需要用解剖针调整材料的位置；待包埋纸盒中的石蜡表面结成一层蜡膜之后将纸盒在2～6℃冷藏条件下冷却2h，使石蜡由熔融态凝固成石蜡块。
[0014] (7)切片：将步骤(6)中包埋后的石蜡块经过切割、修整和固着，然后经切片机将石蜡块切成蜡带，切片厚度为8～15μm，将蜡带保存在30％乙醇中。
[0015] (8)展片：将经步骤(7)切片后的蜡带放入30℃～40℃温水展片90～120s，使蜡带完全展开，蜡带光滑一面朝下，蜡带展片后用刀片分割蜡带。
[0016] (9)贴片和烤片：在洁净载玻片上，涂抹好蛋清甘油贴片剂，将分割好的蜡带贴在载玻片涂有贴片剂的位置上，蜡带光滑一面朝下；然后在蜡带上滴加蒸馏水，确保蜡带被完全浸过后倾斜载玻片倒掉多余的蒸馏水，将贴好切片的载玻片放入空气恒温箱，40℃烤干。
[0017] (10)脱蜡复水：将步骤(9)中烤干的贴有切片的载玻片放入空气恒温箱中，处理温度为60℃，使切片里的石蜡完全熔化，然后将贴有切片的载玻片依次转入透明剂Ⅲ、透明剂Ⅱ中分别脱蜡处理25min，再转入到透明剂Ⅰ中脱蜡处理10min，再依次转入无水乙醇、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇和蒸馏水中分别复水处理5min，使石蜡完全褪去，载玻片上只剩下留在原位的材料，即带材料载玻片。
[0018] (11)染色：将步骤(10)中得到的带材料载玻片转入1％番红酒精溶液，常温下染色22～26h。
[0019] (12)脱水和复染：
[0020] A、将经步骤(11)染色后的带材料载玻片依次转入70％乙醇、80％乙醇中分别脱水处理2min；
[0021] B、将经A处理过的带材料载玻片转入0.63％的固绿酒精溶液中复染5s；
[0022] C、将经B复染后的带材料载玻片依次转入95％乙醇、无水乙醇中分别脱水处理2min；
[0023] D、将经C处理过的带材料载玻片转入无水乙醇中脱水处理1min，再依次转入透明剂Ⅰ、透明剂Ⅱ中分别透明处理5min，最后转入透明剂Ⅲ中透明处理2min。
[0024] (13)封片：将经步骤(12)处理后的带材料载玻片从透明剂Ⅲ中取出，用滤纸擦去材料以外多余的透明剂Ⅲ，在透明剂Ⅲ未挥发干时，在载玻片上有材料的区域滴加封片剂，取洁净的盖玻片，缓慢盖在载玻片上，使封片剂布满整个有材料的区域，室温下晾晒1h后即可观察。
[0025] 上述的步骤(1)～(12)中所用的液体的量均至少能浸没材料；未注明温度的操作均在室温下进行。
[0026] 步骤(1)中所用的材料与聚羟基丙烯酸固定液的体积比为1：(10～30)。
[0027] 步骤(1)中所述的密封是指用橡皮塞密封，并在橡皮塞与瓶口接触的地方涂抹凡士林；所述的抽真空是指用注射器抽气3～5次。
[0028] 步骤(4)、(10)、(12)中，所述的透明剂Ⅰ均为TO透明剂和无水乙醇的等体积混合液，所述的透明剂Ⅱ和透明剂Ⅲ均为TO透明剂。
[0029] 步骤(7)中所述的切割、修整和固着的具体操作如下：根据切片机选择合适的台木，将包埋后的石蜡块分割，按照台木尺寸进一步将蜡块修整成四棱台状，然后用酒精灯加热蜡块底部使其稍熔后，迅速固着在台木上，在蜡块和台木接触处滴一圈蜡液，待其凝固后加固蜡块。
[0030] 步骤(9)所述的蛋清甘油贴片剂制作方法：将搅拌成泡沫状的蛋清和甘油等体积混合即得蛋清甘油贴片剂，加入防腐剂水杨酸钠后，于4℃条件下可保存3个月以上。
[0031] 步骤(13)中所述的封片剂为CVmount封片剂。
[0032] 本发明的机理为：
[0033] (1)本发明使用了新型固定液聚羟基丙烯酸，它渗透力强，可以大大加快固定速度，并且可以固定均匀；它在25～30℃时不易挥发，可高温下固定，也提高了其渗透速度，从而加快了固定的速度，将固定时间从24h大幅缩短至1h。因卡诺氏固定液主要成分是冰醋酸和乙醇，因此，高温固定虽然也可提高速度，但是，因为会蒸发，且蒸发后其体积比会发生改变，导致固定效果不佳。聚羟基丙烯酸尚未在植物中应用，因此，做植物切片的同行很难发现其在植物中用作固定液的功效。
[0034] (2)使用TO透明剂替代二甲苯。TO透明剂是以松节油为主要成分的生物制片透明剂，具有和二甲苯一致的溶解特性，也是既可以溶解酒精，又可溶解石蜡，可完全替代二甲苯在组织透明、切片染色后透明及石蜡切片脱蜡时使用。而且，该试剂对人无毒性，可使整个石蜡切片操作过程变为无毒操作。另外，TO透明剂在制片过程中作用柔和，制片材料不易被硬化，制片易于成功，切片时也不易碎掉，制作出的石蜡切片与传统方法在质量上无明显区别。
[0035] (3)使用封片剂CVmount替代中性树胶封片，使晾片时间从48h缩短至1h。传统方法所使用的中性树胶中含有二甲苯，所以在封片时需要长时间晾干以使二甲苯挥发。CVmount是一种新型的固封材料，具有较好的固封效果，且不含有二甲苯，不需要留有挥发二甲苯所需时间，所以可大大缩短封片时间。
[0036] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
[0037] 1)本发明使用了新型固定液聚羟基丙烯酸，该固定液固定速度快，可以大大减少固定时间，并且可以使固定更加均匀；它在25～30℃时不易挥发，可在高温下固定，进一步提高了固定的效率。
[0038] 2)同时，使用完全无毒的TO透明剂代替二甲苯，TO透明剂能溶解乙醇、石蜡和封固树胶，挥发性好，对常用生物染料染色无不良影响，能广泛应用于植物、动物和人体组织的切片制片，完全避免了使用二甲苯对操作者产生的毒害。
[0039] 3)使用封片剂CVmount替代中性树胶，使得封片时间从48h缩短至1h。
附图说明
[0040] 图1为传统方法制备的切片(A、B)以及本发明的方法制备的切片(C、D)的显微观察对比图。
具体实施方式
[0041] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0042] 本实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得；本实施例中所用的液体的量均至少能浸没材料；本实施例中未注明温度的均可在室温下进行。
[0043] 实施例1：
[0044] (1)取材和固定
[0045] 采用桉树组培苗，除去茎段以外的多余组织如叶，愈伤组织等，取其基部茎段0.5cm长。在茎段体积60倍大小的广口玻璃小瓶中加入体积为材料20倍的聚羟基丙烯酸固定液(由广州市艾发生物医学技术工程有限公司生产，固定速度是1mm/h，第一类医疗器械生产企业登记证号：20090363，10～30℃温度下保存)，放入茎段，塞上瓶塞。为防止空气进入小瓶，在橡皮塞上部和橡皮塞与小瓶瓶口接触位置涂抹凡士林。小瓶正放于桌面，用带针头(活塞推至底部)的注射器插入橡皮塞，但不深入固定液液面，进行抽气，抽至最大程度后拔出注射器，排出注射器中的空气，此为一次抽真空。重复该操作4次后静置材料，固定1h。
[0046] (2)洗涤
[0047] 材料在小瓶中固定1h后打开瓶塞，取出材料放入盛有50％乙醇的小瓶中，体积至少为材料的30倍，塞紧瓶塞。15min后洗涤液更换为70％乙醇，间隔15min后再更换1次70％乙醇洗涤15分钟，然后移入70％乙醇中，同时加入0.1mL 1％的番红酒精溶液。
[0048] (3)脱水
[0049] 将小瓶中的材料依次移入85％乙醇脱水处理1h，95％乙醇脱水处理1h，无水乙醇(2次)分别脱水处理40min。
[0050] (4)透明
[0051] 将脱水后的材料依次移入到装有TO透明剂和无水乙醇的等体积混合液、TO透明剂(TO型生物制片透明剂，广西岑溪县松香厂生产；TO透明剂处理2次)的玻璃瓶分别浸泡处理1h。
[0052] (5)透蜡
[0053] 把一张滤纸叠成筒状，底部封闭，伸入含有TO透明剂的小瓶，将与TO透明剂等体积的碎蜡灌入滤纸筒，盖紧。然后，放入空气恒温箱，处理温度为40℃，处理时间为8h。8h之后将空气恒温箱的温度调整为60℃，处理时间为2h。然后将材料移入预先加热熔化的纯石蜡中60℃透蜡处理4h后，更换熔化的纯石蜡，继续在空气恒温箱中60℃透蜡处理2h。
[0054] (6)包埋
[0055] 将熔好的石蜡倒入包埋纸盒，迅速取出透蜡后的材料放入包埋纸盒，根据切片的需要用解剖针调整材料的位置。待包埋纸盒中的石蜡表面结成一层蜡膜之后，将纸盒在4℃冷藏条件下冷却2h，使石蜡凝固成石蜡块。
[0056] (7)修蜡
[0057] 根据切片机选择合适的台木，将包埋后含有材料的蜡块分割，按照台木尺寸，修整蜡块成四棱台状，然后用酒精灯加热蜡块底部使其稍熔后，迅速固着在台木上，在蜡块和台木接触处滴一圈蜡液，待其凝固后加固蜡块。
[0058] (8)切片
[0059] 将带有蜡块的台木置于切片机(KD202A轮转式切片机，产自浙江金华科迪仪器设备有限公司)的蜡块嵌内，使蜡块切面与切片平行，将石蜡块切成蜡带，蜡带可暂时保存在30％乙醇中，切片厚度为8μm。
[0060] (9)展片
[0061] 切片结束后将蜡带转入35℃温水中展片100s，蜡带光滑一面朝下。蜡带展片后用刀片分割蜡带。
[0062] (10)贴片和烤片
[0063] 在洁净的载玻片上，涂抹好甘油蛋白贴片剂(搅拌成泡沫状的蛋清和甘油以等体积混合制备得到)，将分割后的蜡带贴在载玻片涂好贴片剂的位置上，蜡带光滑一面朝下；然后，在蜡带上滴加蒸馏水，确保蜡带被完全浸过后，倾斜载玻片，倒掉多余的蒸馏水，将贴好切片的载玻片放入空气恒温箱，40℃烤干。
[0064] (11)脱蜡复水
[0065] 将烤干的贴有切片的载玻片放入空气恒温箱，处理温度为60℃，使石蜡完全熔化，然后将贴有切片的载玻片依次转入TO透明剂(2次)分别脱蜡处理25min；再转入到TO透明剂和无水乙醇等比例混合液脱蜡处理10min；再依次转入到无水乙醇、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇和蒸馏水中分别复水处理5min。使石蜡完全褪去，载玻片上只剩下留在原位的材料，即带材料载玻片。
[0066] (12)染色
[0067] 将复水后的带材料载玻片放入1％的番红酒精溶液中常温染色24h。
[0068] (13)脱水和复染
[0069] 将染色后的带材料载玻片依次转入70％乙醇、80％乙醇分别脱水处理2min；脱水后的带材料载玻片转入到0.63％的固绿(cas编码：2353-45-9，购自生工生物工程(上海)股份有限公司)酒精溶液中复染5s；再将复染后的带材料载玻片依次转入到95％乙醇、无水乙醇中分别脱水处理为2min；再转入无水乙醇中脱水处理1min；然后转入TO透明剂和无水乙醇等体积混合液、TO透明剂中分别脱水处理5min；最后转入TO透明剂脱水处理2min。
[0070] (14)封片
[0071] 将带材料载玻片从TO透明剂中取出，用滤纸擦去材料以外多余的TO透明剂，在TO透明剂未挥发干时，在载玻片上有材料区域滴1滴封片剂CVmount(购自徕卡显微系统(上海)贸易有限公司)，取洁净的盖玻片，缓慢盖在载玻片上，使CVmount布满整个有材料区域，室温下晾晒1h即可进行观察。
[0072] 对比实施例1
[0073] 其余操作均与实施例1相同，仅在(1)固定、(3)脱水和(14)封片环节进行了改变，具体改变如下：
[0074] 步骤(1)中固定液采用卡诺氏固定液，固定时间为24h，其余操作均与实施例1中的步骤(1)相同。
[0075] 步骤(3)修改为：将小瓶中的材料依次移入75％乙醇脱水处理1h，85％乙醇脱水处理1h，95％乙醇中脱水处理30min，95％乙醇中脱水处理30min，无水乙醇(2次)分别脱水处理1h。
[0076] 步骤(14)中将封片剂换为中性树胶，室温下晾晒的时间为48h，其余操作均与实施例1中步骤(14)中相同。
[0077] 将本发明与传统方法相比，本发明所用方法在固定、脱水、透明和封片等环节进行了优化，大大缩短了切片制片所用时间，两种方法在制片时间上的比较见表1，从表1可以看出，本发明所用方法比传统切片方法用时至少缩短了72h。
[0078] 本发明采用了新的固定液、透明剂和封片剂，不仅改善了实验环境，彻底消除了切片制片过程中所用试剂对人的毒害，明显缩短了时间，而且保证了制片效果，所制切片的材料不易硬化，也不易碎掉，制作出的石蜡切片与传统方法获得的切片在质量上无明显区别，如图1所示，其中A、B为传统方法制备的切片的显微观察图，C、D为本发明的方法制备的切片的显微观察图。
[0079] 表1 传统方法和本发明的方法制片耗时比较
[0080]
[0081] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的未背离本发明的精神实质与原理下所作的任何改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
