检测样品中N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的方法

摘要

本发明提出了一种检测样品中N‑酰基‑高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的方法，该方法包括：(1)将预先制备的半固体LB培养基胶片置于TLC薄层色谱板的上表面，所述半固体LB培养基胶片中含有报告菌株，所述样品预先在所述薄层色谱板上展开；(2)利用X‑gal使所述胶片进行显色反应；以及(3)基于所述显色反应的结果，确定所述样品中是否含有N‑酰基‑高丝氨酸内酯类群体感应信号分子。本发明实施例所提出的检测方法的实验结果可重复性显著提高、显色斑点不扩散、显色清晰、分辨率高、X‑gal用量少、检测结果保真性高。

权利要求

1.一种检测样品中N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的方法，其特征在于，包括：(1)将预先制备的半固体LB培养基胶片置于薄层色谱板的上表面，所述半固体LB培养基胶片中含有报告菌株，所述报告菌株是根癌农杆菌A136菌株，所述样品预先在所述薄层色谱板上展开；

(2)利用X-gal使所述胶片进行显色反应，所述X-gal涂布在所述胶片的上表面，基于1L半固体LB培养基，所述X-gal的用量是20mg/L；以及(3)基于所述显色反应的结果，确定所述样品中是否含有N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子，其中，所述胶片不同位置的高度差不超过0.5mm，所述胶片的大小是20.5*20.5cm,所述胶片的厚度是0.3～0.4cm，所述胶片是通过制胶槽制备的，所述制胶槽由可拆卸的制胶板和插条组成，所述制胶板的大小是22*22cm，所述插条的高度是0.5cm，

所述胶片是通过以下操作制备的：

(1)所述报告菌株与温度为40～50℃的半固体LB培养基进行混合；以及(2)将所得混合液进行成型处理，所述展开是在甲醇和水的流动相中进行的，所述甲醇：水的体积比是6:4，所述显色反应是在28～30℃进行12～18h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：基于蓝斑线性迁移值的大小，确定样品中N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的分型。

说明书

检测样品中N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及检测样品中N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的方法。

背景技术

[0002] 群体感应(Quorum sensing，QS)是细菌之间的密度调节信号，被视为细菌的通讯语言，它在生物荧光的产生、生物膜的形成、毒理因子的分泌以及环境适应性上具有十分重要的调节作用。QS系统由自诱导分子、感应分子及下游调控蛋白组成。根据细菌性质、合成的信号分子和感应机制的不同，QS系统主要包括三类：LuxR/AI-I系统(主要是革兰氏阴性菌)，LuxS/AI-2和寡肽类系统(革兰氏阳性菌为主、阴性菌为辅)，以及适应于种间交流(intra-communication)的AI-3系统(例如微生物与植物)。AI-1和AI-2主要适用于微生物的种内交流(inter-communication)。至今，已经确认了包括AI-1和AI-2在内的多种信号分子，如酰基高丝氨酸内酯类化合物(N-acyl homoserine lactones，AHLs)，寡肽类化合物、芳香醇类化合物、二酮哌嗪类化合物(di-keto-piperazines,DKP)，2-庚基-3-羟基-4-喹啉(2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone PQS)以及呋喃硼酸二酯(Furanosyl  borate diester)等。这些信号的存在可调节细菌自身的群体行为，以实现特定环境下的生态功能。

[0003] 目前，以AHL分子为代表的AI-1类信号物是研究最为广泛的一种，最先关注于医学领域，例如开发新型的抗生素替代药品，以减少微生物的耐药性。此外，应用AHL系统可以阻止毒力基因的表达，通过合成信号分子类似物，产生使信号分子灭活的降解酶或阻断信号分子的合成，来阻断感应系统，使毒力基因的表达不能够被激活，从而降低细菌的感染能力。另外，在医学中应用AHL系统的另一个典型就是利用生物膜，因为微生物膜受AHL分子的调节，AHL系统在细菌生物被膜的形成中发挥着相当大的作用。现已证实AHL系统的信号分子参与细菌生物被膜的形成、发育与成熟。若干扰该系统，就会使病原菌合成细菌生物被膜的能力降低，则形成的细菌生物被膜较薄并且易受到抗生素的攻击。因此，阻断系统的运行对阻止生物被膜的形成也具有相当大的作用，通过调控AHL系统来干扰细菌生物被膜的形成从而控制病原菌。近10年来，随着AHL认识的深入和学科交叉的发展，AHL应用的范围越来越广泛，已逐渐应用到污水治理、海洋生物抗污损、能源藻类的培养、以及水产养殖等方面。

[0004] 从而，为了在各个行业都能利用这一系统，针对AHL的有效检测成为了当下所亟待关心的一个技术问题。

发明内容

[0005] 本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识做出的：

[0006] 现有的利用薄层色谱(TLC)检测N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的方法，是将含有报告菌株和X-gal的半固体LB培养基直接倾倒在薄层色谱板上，通过半固体LB培养基的自由扩散从而平铺固定在薄层色谱板上形成半固体LB培养基胶片，因此，现有技术中，很难保证不同操作人员在每次实验中，都能在薄层色谱板上形成厚度均匀的胶片，因此很难保证实验结果的可重复性；另外,现有技术中，半固体LB培养基在薄层平板上自由扩散和凝固过程中，水分的浸润在薄层平板上产生张力，进而会对待检的AHL物质产生稀释和扩散，造成显色点有浸润、显色圈过大、显色点有扩散、视觉效果差、分辨率低；再一方面，现有技术中，是将X-gal预先与半固体LB培养基进行混合，X-gal用量大，且X-gal与待检的AHL直接接触，有一定的假阳性结果。

[0007] 基于发明人对现有薄层色谱方法问题的发现，发明人尝试了预先制备半固体LB培养基胶片，再将其与薄层色谱板接触，发明人发现，采用这种方式，所得胶片厚度均一、胶面平整、实验结果可重复性显著提高、显色点直径小、不同显色点区分度好、显色清晰、分辨率高；并且发明人尝试了在形成的半固体LB培养基胶片上涂布X-gal的方式进行显色检测AHL，发明人发现，采用这种方式，X-gal用量显著减少，检测结果保真性显著提高。

[0008] 在本发明中，本发明提出了一种检测样品中N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将预先制备的半固体LB培养基胶片置于薄层色谱板的上表面，所述半固体LB培养基胶片中含有报告菌株，所述样品预先在所述薄层色谱板上展开；(2)利用X-gal使所述胶片进行显色反应；以及(3)基于所述显色反应的结果，确定所述样品中是否含有N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子。本发明实施例所提出的检测样品中N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的方法，实验结果可重复性高、显色点聚焦、不同显色点区分度好、显色清晰、分辨率高、X-gal用量少、检测结果保真性高。

[0009] 根据本发明的实施例，上述检测样品中N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

[0010] 根据本发明的实施例，所述胶片的不同位置的高度差不超过0.5mm。本发明实施例的检测方法的LB半固体培养基胶片的表面平整光滑、无气泡、平整度好，厚度均一，进一步提高了本发明实施例所提出方法的稳定性和可重复性。

[0011] 根据本发明的实施例，所述胶片的大小是20.5*20.5cm,所述胶片的厚度是0.3～0.4cm。本发明实施例中的胶片在上述大小和厚度下，样品中N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的显色更加清晰、分辨率更高。

[0012] 根据本发明的实施例，所述胶片是通过制胶槽制备的，所述制胶槽由可拆卸的制胶板和插条组成，任选地，所述制胶板的大小是22*22cm，任选地，所述插条的高度是0.5cm。本发明实施例的检测方法中的胶片采用制胶槽进行制备，所得胶片的厚度均一、平整度高、易于操作，进而本发明实施例所提出的检测方法的实验结果的可重复性进一步提高，显色点不扩散、斑点清晰，分辨率进一步提高。

[0013] 根据本发明的实施例，所述报告菌株是根癌农杆菌A136菌株。碳链长度为C6～C14的AHL分子启动根癌农杆菌A136菌株的报告基因的表达，进而可使X-gal显示为蓝色，从而可通过显色底物颜色的显著变化更为直观方便地判定C6～C14的AHL分子的存在与否。

[0014] 根据本发明的实施例，所述胶片是通过以下操作制备的:(1)所述报告菌株与温度为40～50℃的半固体LB培养基进行混合；以及(2)将所得混合液进行成型处理。本发明实施例所提出的检测方法通过上述操作制备胶片，所得胶片中报告菌株活性高、分布均匀，进而进一步提高了本发明实施例检测方法的灵敏度和准确度。

[0015] 根据本发明的实施例，所述展开是在甲醇和水的流动相中进行的，任选地，所述为甲醇：水的体积比是6:4。本发明实施例的待检测样品AHL分子的分散度好，显色斑点的离散度好、分辨率高，进一步提高了本发明实施例的检测方法的灵敏度和准确度。

[0016] 根据本发明的实施例，基于1L半固体LB培养基，所述X-gal的用量是13～33mg/L。现有薄层色谱的检测方法，本发明实施例的检测方法中，X-gal在13～33mg/L的用量下，显色辨识度好、显色点分辨率高。

[0017] 根据本发明的实施例，所述显色反应是在28～30℃进行12～18h。在28～30℃进行12～18h的显色反应，显色反应结果分辨率好、准确度高。

[0018] 根据本发明的实施例，进一步包括：基于蓝斑线性迁移值的大小，确定样品中N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的分型。根据本发明的实施例，样品中存在N-酰基-高丝氨酸内酯类(AHL)群体感应信号分子，会使X-gal显示为蓝色，在半固体LB培养基胶片形成蓝斑，同时，基于蓝斑线性迁移值(Rf)的大小，由于线性迁移值(Rf)仅与AHL信号分子的结构相关，因此基于蓝斑线性迁移值的大小，本发明实施例所提出的方法可以进一步确定AHL信号分子的分型。

附图说明

[0019] 图1是根据本发明实施例利用现有方法和本发明所提出的方法对AHL的标准品分别进行点样的检测结果图；

[0020] 图2是根据本发明实施例的现有方法和本发明所提出的方法中X-gal的用量以及线性迁移值的线性程度的比较结果图；

[0021] 图3是根据本发明实施例的利用现有方法和本发明所提出的方法对AHL的混合标准品进行检测的结果图；以及

[0022] 图4是根据本发明实施例的利用现有方法和本发明所提出的方法对铜绿假单胞菌P.aeruginosa PAO1AHL信号分子抽提物进行检测的结果图。

具体实施方式

[0023] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

[0024] 在本发明中，本发明提出了一种检测样品中N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)将预先制备的半固体LB培养基胶片置于薄层色谱板的上表面，半固体LB培养基胶片中含有报告菌株，样品预先在薄层色谱板上展开；(2)利用X-gal使胶片进行显色反应；以及(3)基于显色反应的结果，确定样品中是否含有N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子。本发明实施例所提出的检测样品中N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的方法，实验结果可重复性高、显色点直径小、不同显色点容易区分、显色清晰、分辨率高、X-gal用量少、检测结果保真性高。

[0025] 根据本发明的具体实施例，上述胶片的高度差不超过0.5mm。本发明实施例的检测方法所制得的LB半培养基胶片相比于现有技术所制备的胶片，表面平整光滑、无气泡，平整度更有保障，厚度均一，不同操作人员在不同实验中易于保持实验结果的可重复性，进而本发明实施例所提出的方法的稳定性和可重复性显著提高。

[0026] 根据本发明的实施例，上述胶片的大小是20.5*20.5cm,胶片的厚度是0.3～0.4cm。本发明实施例中的胶片在上述大小和厚度下，样品中N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的显色更加清晰、分辨率更高。

[0027] 根据本发明的实施例，上述胶片是通过以下操作制备的:(1)所述报告菌株与温度为40～50℃的半固体LB培养基进行混合；以及(2)将所得混合液进行成型处理。本发明实施例的检测方法中，报告菌株与温度为40～50℃的半固体LB培养基预先进行混合，报告菌株在温度为40～50℃的半固体LB培养基中的活性高，并且LB培养基处于半固体状态，报告菌株在LB培养基中分布均匀，继而将所得报告菌株与LB培养基的混合液进行成型处理，所得胶片中报告菌株活性高、分布均匀，进一步提高了本发明实施例检测方法的灵敏度和准确度。

[0028] 根据本发明的实施例，上述胶片是通过制胶槽制备的，制胶槽由可拆卸的制胶板和插条组成，任选地，所述制胶板的大小是22*22cm，任选地，所述插条的高度是0.5cm。发明人通过大量的实验发现，预先利用制胶槽制备胶片，所得胶片的厚度均一、平整度高，并且易于操作。本发明实施例中所采用的制胶槽由可拆卸的制胶板和插条组成，这样既方便拆洗，又方便组装制胶，制胶板的大小的选择是根据待铺薄层色谱板的大小确定的，本发明实施例中待铺薄层色谱板的大小为20*20cm,进而本发明实施例的所采用的制胶板的大小为22*22cm；另一方面，制胶板的插条的高度的选择是根据待制备胶片的厚度进行确定的，本发明实施例的待制备胶片的厚度为0.3～0.4cm,进而本发明实施例的插条设计为0.5cm,略高于待制备胶片的厚度，既节省了制备材料，又确保了胶片的厚度。综上，本发明实施例的检测方法中的胶片采用制胶槽进行制备，所得胶片的厚度均一、平整度高、易于操作，进而本发明实施例所提出的检测方法的实验结果的可重复性进一步提高，显色点直径小、不同显色斑点相互不干扰、显色清晰，并且分辨率进一步提高。

[0029] 另外，根据本发明的具体实施例，本发明实施例中的报告菌株是根癌农杆菌A136菌株。根癌农杆菌A136菌株携带报告基因LacZ,碳链长度为C6～C14的AHL分子启动根癌农杆菌A136菌株的报告基因LacZ,进而表达β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶消化X-gal，使X-gal发生颜色变化，因此，在β-半乳糖苷酶的显色底物X-gal存在的条件下，碳链长度为C6～C14的AHL分子可使X-gal显示为蓝色，进而可通过显色底物颜色的变化判定C6～C14的AHL分子的存在与否。

[0030] 另外，根据本发明的具体实施例，展开是在甲醇和水的流动相中进行的，任选地，甲醇：水的体积比是6:4。本发明实施例的待检测样品在甲醇和水的体积比为6:4的流动相下进行展开，样品中AHL分子的分散度好，进而显色斑点的离散度好、分辨率高，进一步提高了本发明实施例的检测方法的灵敏度和准确度。

[0031] 另外，根据本发明的具体实施例，基于1L半固体LB培养基，所述X-gal的用量是13～33mg/L。现有薄层色谱的检测方法，基于1L半固体LB培养基，X-gal的用量是15～50mg/L，相比于现有技术，采用最后涂布X-gal的方式而不是预先与半固体LB培养基进行混合，X-gal大约节省了1/3的用量。本发明实施例的检测方法中，X-gal在13～33mg/L的用量下，显色效果好、显色点分辨率高，X-gal用量低于13mg/L,颜色变化不明显而影响结果判断，X-gal用量高于33mg/L，X-gal过量，造成浪费。

[0032] 另外，根据本发明的具体实施例，显色反应是在28～30℃进行12～18h。28～30℃是报告菌株A136的最适温度，28～30℃下，报告菌株进一步增殖，待12～18h后，待检测样品中AHL群体感应信号分子可使显色底物X-gal发生明显的颜色变化，显色反应低于12h，显色底物X-gal颜色变化不明显，显色反应长于18h,显色反应结果不再有明显变化，时间过长，又会造成假阳性结果几率升高。在28～30℃进行12～18h的显色反应，显色反应结果分辨率高、准确度有保障。

[0033] 最后，根据本发明的具体实施例，该方法进一步包括：基于蓝斑线性迁移值的大小，确定样品中N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的分型。样品中存在N-酰基-高丝氨酸内酯类(AHL)群体感应信号分子，会使X-gal显示为蓝色，在半固体LB培养基胶片形成蓝斑，同时，基于蓝斑线性迁移值(Rf)的大小，由于线性迁移值(Rf)仅与AHL信号分子的结构相关，因此基于蓝斑线性迁移值的大小，可以确定AHL信号分子的分型。根据本发明的具体实施例，发明人通过平行实验确定AHL信号分子的分型，平行实验中对已知AHL信号分子分型的标准品进行同等条件下的薄层色谱，将待测样品与标准品的薄层色谱结果进行比较，进而判断待测样品中AHL信号分子的分型，同时可根据蓝斑的颜色深浅，定性判断样品中AHL信号分子的相对含量。

[0034] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0035] 实施例1所用菌株、材料、试剂的准备

[0036] 在以下实施例中，所用N-酰基-高丝氨酸内酯类(AHL)群体感应信号分子检测菌株为根瘤杆菌Agrobacterium tumefaciens A136(pCF218)(pCF372)，培养条件为LB+壮观霉素Sp(50微克/ml)+四环素Tc(4.5微克/ml)。

[0037] 另外一个所使用的菌株为铜绿假单胞菌P.aeruginosa PAO1，它具有产C4和3-oxo-C12AHL的能力。

[0038] 壮观霉素Sp、四环素Tc、X-gal(5-溴4-氯3-吲哚β-半乳糖苷)、AHL标准品C6(货号10940-25MG)，C8(货号17247-25MG)，C11(货号10937-25MG)和C14-HSL(货号09139-25MG)购自Sigma公司，RP-C18F254s薄层色谱板(TLC板)购自德国Merck公司。

[0039] LB液体(Luria-Bertani)培养基的准备过程如下所述：准确称取蛋白胨(Typtone)1.0g，酵母提取物(Yeast Extract)0.5g，氯化钠NaCl 1.0g，加双蒸水(ddH2O)至100ml，充分混匀溶解，在121℃下高压蒸汽灭菌15分钟。

[0040] 半固体LB培养基(软培养基)的准备过程如下所述：在上述LB液体培养基中加入10.0g/L的琼脂粉后高压蒸汽灭菌。

[0041] 其它使用到的化学试剂包括二甲基亚枫(DMSO)(购自Sangon，大连)，乙酸乙酯(分析纯，购自天津市致远化学试剂有限公司)，甲醇、乙醇(分析纯，购自天津市光复精细化工研究所)，以及醋酸等(分析纯，购自上海国药集团)。

[0042] 实施例2与现有的检测样品中AHL信号分子的薄层色谱法进行比较

[0043] 现有的检测样品中AHL信号分子的薄层色谱法如下所述：

[0044] (1)将AHL标准品2～3微升点样于RP-C18F254s薄层色谱板(20*20cm)上，以甲醇/水(60﹕40，v/v)作为流动相充分展开后，挥干溶剂。

[0045] (2)根据经典文献所记载(Kendra P.Rumbaugh(ed.),Quorum Sensing:Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,vol.692,DOI 10.1007/978-1-60761-971-0_1,Springer Science Business Media,LLC 2011)的薄层色谱的方法制备上层半固体培养基，铺于TLC板上。制备方法如下所述：配置50mL半固体LB培养基，高压蒸汽灭菌之后，待冷却到45℃左右(避免琼脂凝结成块)，通过无菌操作将过夜培养的3mL A136菌株接入半固体培养基，摇匀，再添加50微升60mg/mL的X-gal,轻摇混匀后，铺于预先展开有待测样品的TLC板上。

[0046] (3)将上层半固体培养基和TLC板置于28℃培养箱，24～48h后观察显色结果。

[0047] 本发明实施例所提出的检测样品中AHL信号分子的方法如下所述：

[0048] (1)将AHL标准品2～3微升点样于RP-C18F254s薄层色谱板(20*20cm)上，以甲醇/水(60﹕40，v/v)作为流动相充分展开后，挥干溶剂。

[0049] (2)通过无菌操作将冷却到45℃左右的100mL半固体LB培养基与6mL A136菌株混合，轻轻摇匀后铺板，铺板所用的制胶槽由大小是22*22cm的制胶板和高度为0.5cm的插条组成，制备成厚度约为3-4mm的薄层培养基，于室温冷却凝固形成培养基胶片。

[0050] (3)拔下插条，用一张无菌硬质胶板托起整张凝固好的胶片，一端轻轻接触TLC板，缓慢覆盖，以类似手机贴膜的方式向前平铺，直至整张胶片完好贴合于TLC板上方，平铺过程中抽出无菌硬质胶板，操作过程注意排除气泡。

[0051] (4)贴合过程完成后，使用微生物涂布棒将100微升浓度为20微克/微升的X-gal均匀涂布于胶片上方。

[0052] (5)待x-gal液体风干后，置于28℃培养箱，12-18h后观察显色结果。

[0053] 具有不同侧链的AHL信号分子经薄层色谱层析展开后，在有AHL存在的区域，上层的报告菌株感受到，并在X-gal存在的情况下呈现蓝色斑点。根据斑点的大小、位置、迁移率和颜色深浅定性判定AHL的相对含量及其类别。

[0054] 发明人分别利用现有方法和本发明实施例所提出的方法对AHL的C6，C9，C11，3-o-C8，3-o-C14标准品进行检测，其中C6，C9，C11，3-o-C8，3-o-C14标准品分别标记为1,2,3,4,5，检测结果如图1所示，其中A显示了利用现有方法检测AHL标准品的显色结果图，B显示了利用本发明实施例所提出的方法检测标准品的显色结果图。通过比较A和B的显色结果可以看出，B图的显色斑点的直径比A图缩小了1.4～1.9倍，斑点扩散程度小，灰度值也明显提高，显色更清晰，且线性迁移值Rf的线性程度更高，线性迁移值Rf的线性程度的比较结果如图2所示。

[0055] 同时，发明人分别利用现有方法和本发明实施例所提出的方法对AHL的混合标准品进行检测，检测结果如图3所示，图3显示了对5种碳链长度的AHL混合标准品(C6，C8，C11，C14和3-o-C8))的检测结果，发明人发现，本发明实施例提出的方法对混合样品的显色结果的显色分辨率更高，视觉效果更明显。

[0056] 另外，发明人对现有方法和本发明实施例所提出的方法中X-gal的用量进行比较分析，发现X-gal的用量节省了三分之一，X-gal的用量统计结果如图2所示。

[0057] 实施例3铜绿假单胞菌P.aeruginosa PAO1 AHL信号分子的抽提及对此抽提物的检测

[0058] 发明人通过以下操作抽提了铜绿假单胞菌P.aeruginosa PAO1 AHL信号分子：

[0059] (1)将单克隆PAO1菌株接种于10mL液体LB培养基中，过夜培养获得一级种子，之后将一级种子加入到含有500mL无菌LB液体培养基的锥形瓶中进行扩大培养，扩大培养是在30℃，220r/min的条件下培养24h。

[0060] (2)将发酵菌液在4℃下离心20min，离心速度6000g/min。

[0061] (3)收集上清，用0.22微米的滤膜对离心后的上清进行过滤，进一步除杂。

[0062] (4)在1L的分液漏斗中将收集到的发酵上清液与乙酸乙酯按照体积比为1：1的比例混合，每5分钟上下颠倒数次，充分摇匀，萃取30分钟。

[0063] (5)在旋转蒸发仪上进行蒸馏(温度控制在45℃)，以去除全部乙酸乙酯。

[0064] (6)将抽提物晾干后用2mL甲醇溶解，并用1.0微米的有机相滤膜进行过滤，得到AHL信号分子抽提物。

[0065] 进而，发明人分别利用现有方法和本发明实施例所提出的检测方法对铜绿假单胞菌P.aeruginosa PAO1 AHL信号分子抽提物进行检测。检测结果如图4所示，其中，数字1-4为PAO1潜在的AHL分泌物，包括C4和3-O-C12，结果显示本发明实施例所提出的检测方法显色视觉更美观，效果更清晰，以此表明本发明实施例所提出的方法不仅仅适用于标准品，也适用于天然来源的AHL提取物。

[0066] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

[0067] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。