microRNA 100的应用

摘要

本发明公开了一种microRNA 100的应用。本发明公开抑制microRNA 100活性或表达的物质在制备抑制肿瘤发展的产品中的应用。本发明的实验证明，microRNA 100过表达可抑制大肠癌细胞的生长、增殖，但却能显著促进其垂直及水平迁移扩散能力，高度提示其在大肠癌发生发展中发挥重要功能，既能发挥抑癌基因的功能抑制肿瘤增殖、生长，又有促进肿瘤发展的功能促进肿瘤转移。

权利要求

1.抑制microRNA 100活性或表达的物质在制备抑制肿瘤发展的产品中的应用；

所述肿瘤为大肠癌；所述大肠癌的癌细胞为HCT-8细胞；

所述肿瘤发展体现为肿瘤细胞迁移和/或扩散。

2.如下1)-7)任一所述的物质在制备具有促进肿瘤发展功能的产品中的应用：

1)microRNA 100；

2)microRNA 100的编码基因；

3)含有microRNA 100的编码基因的重组载体；

4)含有microRNA 100的编码基因的表达盒；

5)含有microRNA 100的编码基因的转基因细胞系；

6)含有microRNA 100的编码基因的重组菌；

7)含有microRNA 100的编码基因的重组病毒；

所述肿瘤为大肠癌；所述大肠癌的癌细胞为HCT-8细胞；

所述肿瘤发展体现为肿瘤细胞迁移和/或扩散。

3.如下1)-7)任一所述的物质作为靶点在制备具有抑制肿瘤发展功能的产品中的应用：

1)microRNA 100；

2)microRNA 100的编码基因；

3)含有microRNA 100的编码基因的重组载体；

4)含有microRNA 100的编码基因的表达盒；

5)含有microRNA 100的编码基因的转基因细胞系；

6)含有microRNA 100的编码基因的重组菌；

7)含有microRNA 100的编码基因的重组病毒；

所述肿瘤为大肠癌；所述大肠癌的癌细胞为HCT-8细胞；

所述肿瘤发展体现为肿瘤细胞迁移和/或扩散。

4.如下1)-7)任一所述的物质在制备抑制肿瘤细胞的生长和/或增殖的产品中的应用：

1)microRNA 100；

2)microRNA 100的编码基因；

3)含有microRNA 100的编码基因的重组载体；

4)含有microRNA 100的编码基因的表达盒；

5)含有microRNA 100的编码基因的转基因细胞系；

6)含有microRNA 100的编码基因的重组菌；

7)含有microRNA 100的编码基因的重组病毒；

所述肿瘤为大肠癌；所述大肠癌的癌细胞为HCT-8细胞。

说明书

microRNA 100的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种microRNA的应用；特别涉及microRNA 100的应用，属于生物技术领域。

背景技术

[0002] micro RNAs(miRNAs)，是一种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA，通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻译，通常在转录后水平调控蛋白表达(最近发现micro RNA也能在转录水平调控基因表达)。随着对micro RNA研究的不断深入，越来越多的证据表明micro RNA分子在肿瘤发生发展的各个环节中发挥着原癌基因或抑癌基因的作用。

[0003] MiR-100(microRNA100，GenBank number:NR_029515.1，mir编号：MI0000102)定位于11号染色体，与miR-99a、miR-99b同属于miR-99家族。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供预防和/或治疗大肠癌的一种microRNA。

[0005] 为了解决以上技术问题，本发明提供一种抑制microRNA 100活性或表达的物质在制备抑制肿瘤发展的产品中的应用；

[0006] 所述microRNA 100的序列如SEQ ID No.1所示。

[0007] 为了解决以上技术问题，本发明还提供如下1)-7)任一所述的物质在制备具有促进肿瘤发展功能的产品中的应用：

[0008] 1)microRNA 100；

[0009] 2)microRNA 100的编码基因；

[0010] 3)含有microRNA 100的编码基因的重组载体；

[0011] 4)含有microRNA 100的编码基因的表达盒；

[0012] 5)含有microRNA 100的编码基因的转基因细胞系；

[0013] 6)含有microRNA 100的编码基因的重组菌；

[0014] 7)含有microRNA 100的编码基因的重组病毒；

[0015] 所述microRNA 100的序列如SEQ ID No.1所示。

[0016] 为了解决以上技术问题，本发明还提供如下1)-7)任一所述的物质作为靶点在筛选和/或制备具有抑制肿瘤发展功能的产品中的应用：

[0017] 1)microRNA 100；

[0018] 2)microRNA 100的编码基因；

[0019] 3)含有microRNA 100的编码基因的重组载体；

[0020] 4)含有microRNA 100的编码基因的表达盒；

[0021] 5)含有microRNA 100的编码基因的转基因细胞系；

[0022] 6)含有microRNA 100的编码基因的重组菌；

[0023] 7)含有microRNA 100的编码基因的重组病毒；

[0024] 所述microRNA 100的序列如SEQ ID No.1所示。

[0025] 上述任一所述的应用中，所述肿瘤发展体现为肿瘤细胞迁移和/或扩散；

[0026] 所述肿瘤细胞迁移和/或扩散具体可为A和/或B：

[0027] A、肿瘤细胞的水平迁移和/或扩散；

[0028] B、肿瘤细胞的垂直迁移和/或扩散。

[0029] 为了解决以上技术问题，本发明还提供如下1)-7)任一所述的物质在制备抑制肿瘤细胞的生长和/或增殖的产品中的应用：

[0030] 1)microRNA 100；

[0031] 2)microRNA 100的编码基因；

[0032] 3)含有microRNA 100的编码基因的重组载体；

[0033] 4)含有microRNA 100的编码基因的表达盒；

[0034] 5)含有microRNA 100的编码基因的转基因细胞系；

[0035] 6)含有microRNA 100的编码基因的重组菌；

[0036] 7)含有microRNA 100的编码基因的重组病毒；

[0037] 所述microRNA 100的序列如SEQ ID No.1所示。

[0038] 上述任一所述的应用中，所述肿瘤为大肠癌；

[0039] 所述大肠癌的癌细胞可为HCT-8细胞。

[0040] 本发明的实验证明，microRNA 100过表达后抑制大肠癌细胞的生长和/增殖，但可显著增强其迁移能力，在大肠癌转移过程中起重要作用。microRNA 100在大肠癌的预防和/或治疗领域具有重要应用。

附图说明

[0041] 图1为HCT-8high细胞系和HCT-8(NC)细胞系的荧光显微镜观察结果。

[0042] 图2为细胞生长曲线。

[0043] 图3为microRNA 100对HCT-8细胞迁移能力的影响。

[0044] 图4为microRNA 100对HCT-8划痕愈合能力的影响。

具体实施方式

[0045] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0046] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0047] 大肠癌细胞系HCT-8为ATCC产品,产品目录号为CCL-244。

[0048] GFP-MIR-100慢病毒表达系统为上海吉凯基因化学技术有限公司产品，货号为PMUL209000102，其中外源基因为microRNA 100(GenBank号为NR_029515.1，序列如SEQ ID No.1所示)，该慢病毒表达系统为能表达microRNA 100的慢病毒颗粒。

[0049] NC慢病毒表达系统(即为空载的GV209-EGFP)为上海吉凯基因化学技术有限公司产品，其与GFP-MIR-100慢病毒表达系统的区别仅在于没有外源基因microRNA 100。

[0050] 实施例1、稳定高表达microRNA 100的转移性大肠癌细胞系的获得[0051] 一、大肠癌细胞系的获得

[0052] (一)将大肠癌细胞系HCT-8在含有体积百分含量10％的胎牛血清(Hyclone)和体积百分含量1％的青链霉素溶液(Invitrogen，货号10378-016)的RPMI-1640培养基(Invitrogen，11875-093)中，37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养，根据细胞生长情况，每天或者隔天更换新鲜培养基，在细胞浓度约为培养瓶培养面积80％-90％时进行传代。

[0053] (二)倒掉培养基，加入37℃PBS轻轻洗涤细胞，吸出PBS，加入胰蛋白酶(25cm2培养瓶加500微升胰酶，75cm2培养瓶和10cm直径培养皿加入1毫升胰酶)，在显微镜下观察消化过程，直至HCT-8细胞变圆、细胞间连接断开。

[0054] (三)加入十倍于胰蛋白酶体积的PBS，用一次性吸管将HCT-8细胞轻轻吹打，制成HCT-8细胞悬液。

[0055] (四)收集HCT-8细胞悬液于离心管中，离心(1000转/分钟，5分钟)。

[0056] (五)用新鲜培养基(含有体积百分含量10％的胎牛血清(Hyclone)和体积百分含量1％的青链霉素溶液(Invitrogen，货号10378-016)的RPMI-1640培养基)重悬细胞，取1/2移入新的培养瓶或培养皿进行培养，得到传代后的HCT-8细胞。

[0057] 二、细胞转染

[0058] 将GFP-MIR-100慢病毒表达系统进行细胞转染：

[0059] (一)分别将生长良好的步骤一得到的传代后HCT-8细胞按照每孔100ul，每孔共5*103个HCT-8细胞的量于转染前一天接种到96孔板中(正常培养，37℃，5％CO2培养箱)，转染时细胞密度约30％。

[0060] (二)每孔中弃去原培养液，加入90ul ENI.S(Enhanced Infection Solution，促转染溶液，上海吉凯基因化学技术有限公司产品，产品目录号为REVG0002)、10ul polybrene(聚凝胺，上海吉凯基因化学技术有限公司产品，产品目录号为REVG0001)及1ul慢病毒试剂(GFP-MIR-100慢病毒表达系统，1*108U/mL)，温和混匀。

[0061] (三)37℃培养12小时后，换正常培养基(含有体积百分含量10％的胎牛血清(Hyclone)和体积百分含量1％的青链霉素溶液(Invitrogen产品，货号为10378-016)的RPMI-1640培养基)终止转染。

[0062] (四)37℃培养72小时后，得到HCT-8high细胞系。

[0063] 采用上述同样的方法将NC慢病毒表达系统转染HCT-8细胞，得到HCT-8(NC)细胞系。

[0064] 三、检测细胞中microRNA 100的表达

[0065] (一)荧光显微镜观察

[0066] 将HCT-8high细胞系和HCT-8(NC)细胞系分别置于倒置荧光显微镜下，检测其表达microRNA 100情况，结果如图1所示。

[0067] 图1中，miR-100为HCT-8high细胞系，NC为HCT-8(NC)。

[0068] 图1表明，HCT-8high细胞系有绿色荧光反应，表明其稳定高表达microRNA 100。

[0069] 通过流式细胞仪计数得到HCT-8high细胞系的转染率高达81.1％。

[0070] (二)qRT-PCR检测

[0071] 提取HCT-8high细胞系的总RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，利用QIAGEN miScript SYBR Green PCR Kit(QIAGEN产品，货号为218075)及microRNA 100引物(QIAGEN产品,货号为MS00003386)，进行RT-PCR，以RNU6B为内参(其引物为QIAGEN产品,货号为MS00033740)；

[0072] 以未转染病毒的HCT-8细胞和HCT-8(NC)细胞系进行上述实验，作为对照。

[0073] 以HCT-8(NC)的microRNA 100的相对表达率为1，RT-PCR结果表明，HCT-8high细胞系的microRNA 100的相对表达率为50，microRNA 100在HCT-8high细胞系中稳定过表达。

[0074] 实施例2、HCT-8high细胞系稳定高表达microRNA 100的功能研究[0075] 一、细胞生长和/或增殖实验

[0076] (一)取转染24小时、生长状态良好的实施例1得到的HCT-8high细胞系，消化，制成4
细胞悬液，调整细胞浓度为4×10 个/mL。将细胞悬液接种在96孔板中，每孔100ul，细胞总数一致(4000个/孔)，作为实验孔，并设置空白对照(即每孔同样体积的含有体积百分含量
10％的胎牛血清(Hyclone)和体积百分含量1％的青链霉素溶液(Invitrogen，货号10378-
016)的RPMI-1640培养基)。将96孔板置37℃，5％CO2培养箱中孵育4-6小时待细胞全部贴壁。

[0077] (二)每孔加入10ul的5mg/ml MTT溶液。

[0078] (三)正常培养条件(37℃，5％CO2培养箱)下培养3小时。

[0079] (四)吸弃上清，每孔加入50ul DMSO，水平振动15分钟后，用酶标仪测量每孔490nm波长下的OD490值。

[0080] (五)再取转染后2、3、4、5天的生长状态良好的实施例1得到的HCT-8high细胞系进行上述实验，按照上述方法测得转染后2、3、4、5天的OD490值。

[0081] (六)以转染后天数为横轴，每次测定的实验孔的OD490值减去空白对照的OD490值为纵轴，制成细胞生长曲线。

[0082] HCT-8(NC)细胞系进行上述实验制成细胞生长曲线。

[0083] 实验重复三次，结果取平均值。

[0084] 结果如图2所示。

[0085] 图2中，HCT-8(mir-100)代表HCT-8high细胞系。

[0086] 图2表明，转染后第一天，HCT-8high和HCT-8(NC)的OD值相当，从第二天起HCT-8high的OD值小于HCT-8(NC)，第三天起两组细胞间差异显著，由此表明，microRNA 100过表达后能抑制HCT-8细胞的生长和/或增殖。

[0087] 二、细胞迁移实验

[0088] (一)将Transwell小室(Corning公司产品)用无血清RPMI  1640培养基(Invitrogen，货号为31800-022)平衡至少一个小时或过夜，有助于细胞更好贴附和生长。

[0089] (二)实验前一天，将由实施例1得到的HCT-8high细胞在无血清RPMI 1640培养基中饥饿过夜培养。

[0090] (三)将Transewll放入24孔板，在Transewll下室中加入600ul含有体积百分含量10％胎牛血清(Hyclone)的RPMI 1640培养基作为趋化因子。

[0091] (四)取步骤(二)的细胞消化后进行活细胞计数，用无血清RPMI 1640培养基调整细胞浓度为5×105个/mL，制成HCT-8high细胞悬液。再在步骤(三)的每个Transwell小室中加入100ul该悬液，设三个平行样本，置于孵箱中培养。

[0092] (五)24小时后吸去上室液体，用PBS湿润棉签擦去膜上面未穿过聚碳酸酯膜上小孔的细胞，生理盐水漂洗，稍干。

[0093] (六)0.6mL甲醇固定20分钟后，0.6mL0.5％结晶紫溶液(甲醇配置)染色10分钟，流水冲洗3-5次，晾干。

[0094] (七)用小刀片将聚碳酸酯膜小心切下，置膜于载玻片上，膜底面朝上，滴树脂后用盖玻片封片，显微镜下随机计数5个视野的细胞数，求和，进行统计学检验，实验重复三次，结果取平均值。

[0095] 以HCT-8(NC)细胞系进行上述实验作为阴性对照。

[0096] 结果如图3所示。

[0097] 图3中，A为显微镜检测结果图，B为迁移细胞数统计结果。NC代表HCT-8(NC)，mir-100代表HCT-8high。

[0098] 图3中A表明，细胞迁移24小时后，与HCT-8(NC)相比，有更多HCT-8high细胞迁移到Transwell小室的另一侧。

[0099] 图3中B表明，HCT-8high组的迁移细胞数为150，HCT-8(NC)组的迁移细胞数为78，HCT-8high组大约为HCT-8(NC)组的2倍，而步骤(一)结果表明microRNA100过表达后抑制HCT-8细胞增殖，因此，此处迁移实验中HCT-8high组增加的细胞为迁移的细胞，这说明microRNA 100能够促进细胞的垂直迁移能力。

[0100] 三、划痕愈合实验

[0101] (一)实验前一天，先在未接种细胞的24孔培养板背面用marker笔画横线标记，将HCT-8high细胞消化、计数，每孔取3×105个细胞均匀种于24孔板中，作多个平行，在含有体积百分含量10％的胎牛血清(Hyclone)和体积百分含量1％的青链霉素溶液(Invitrogen，货号为10378-016)的RPMI-1640培养基中，37℃培养箱培养。

[0102] (二)选择贴壁均匀且细胞密度达到90％以上的孔进行实验，利用20ul白色枪头垂直于孔板轻轻在细胞上划过一道直线制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。

[0103] (三)吸去上清培养液，用PBS轻轻冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞。

[0104] (四)加入含体积百分含量2％胎牛血清(Hyclone)的RPMI-1640培养基，选择有marker笔标记的地方进行拍照。

[0105] (五)培养16小时后，再次选择相同地方进行拍照，比较两次拍照时细胞划痕的宽度观察划痕愈合情况，至少3个平行。

[0106] 以HCT-8(NC)细胞系进行上述实验作为阴性对照。

[0107] 结果如图4所示。

[0108] 图4中，NC代表HCT-8(NC)，mir-100代表HCT-8high。

[0109] 图4中，A为划痕愈合实验镜下照相结果，B图为划痕实验统计结果图。

[0110] 图4中A表明，HCT-8细胞划痕后经相同时间，HCT-8high的划痕愈合能力优于HCT-8(NC)。

[0111] 图4中B表明，HCT-8high的平均迁移愈合距离为180um，HCT-8(NC)的平均迁移愈合距离为125um，HCT-8high的平均迁移愈合距离大约为HCT-8(NC)的平均迁移愈合距离1.5倍，这说明microRNA 100能够促进HCT-8细胞的水平迁移扩散。

[0112] 上述实验证实，microRNA 100过表达可抑制大肠癌细胞的生长、增殖，但却能显著促进其垂直及水平迁移扩散能力，高度提示其在大肠癌发生发展中发挥重要功能，既能发挥抑癌基因的功能抑制肿瘤增殖、生长，又有促进肿瘤发展的功能促进其转移。