本发明公开了一种携带前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原基因的重组腺相关病毒载体(rAAV)及其构建方法与其应用。该rAAV载体是将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为PAP抗原基因得到。本发明的rAAV的病毒载体可将其携带的PAP抗原基因输送入单核细胞‑树突状细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应细胞。实验证明，被本发明的rAAV的病毒载体感染的DC所诱导的CTL在体外或患者体内可有效地抑制PAP抗原阳性的恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞。本发明的重组腺相关病毒载体或其相关产品可被用于制备治疗抗PAP抗原阳性的前列腺癌的药物。
携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及一种携带前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase，PAP)抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法以及其在制备抗PAP阳性的前列腺癌药物中的应用。
背景技术
[0002] 腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)的基因结构已经被鉴定。1983年，Samulski等人描述了AAV的末端重复片段(上游5’端片段，下游3’端片段)(Samulski RJ,Srivastava A,Berns KI,Muzyczka N.Rescue of adeno-associated virus from recombinant plasmids:gene correction within the terminal repeats of AAV.Cell.33:135-143.)。1984年，Hermonat等人描述了AAV的低感染颗粒(lip)基因和包膜(cap)基因(Hermonat PL,Labow MA,Wright R,Berns KI,Muzyczka N.Genetics of adeno-associated virus:isolation and preliminary characterization of adeno-associated virus type 2mutants.J Virol.51:329-339.Hermonat,P.L.,and Muzyczka,N.Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector:transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470.)。1986年，Labow等人鉴定了位于上游
5’端片段和rep基因之间的p5启动子(Labow MA,Hermonat PL,Berns KI.Positive and negative autoregulation of the adeno-associated virus type 2genome.J Virol.160:251-258.)。
[0003] 1984年，美国Paul L.Hermonat证明AAV载体可用于人类疾病的基因治疗。目前，主要是欧美国家在进行以AAV为基础的基因治疗人类疾病的临床试验。据美国粮食和药品管理局统计，现有十余项以AAV为基础的基因治疗临床试验正在进行，主要是将携带治疗基因的AAV病毒注入患者体内，使其在体内表达治疗基因，从而达到治疗疾病的目的。主要针对治疗的疾病是帕金森氏综合症、风湿性关节炎、血友病、心力衰竭、进行性肌萎缩和奥兹海默综合症等非肿瘤性疾病。2012年11月2日欧盟批准UniQure公司的Glybera产品在欧盟27个成员国使用，这是西方国家第一个获批准的基因治疗药物，它是利用腺相关病毒I型(AAV-I)携带外源基因用于治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病(LPLD)的基因药物。
[0004] AAV是一种非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒(如腺病毒)的基因产物辅助，才能装配成为具有感染性的病毒颗粒。目前AAV可分为12种血清型(AAV-1～AAV-12)。其中，2型腺相关病毒载体(AAV-2)因具有无致病性、宿主范围广、目的基因长期表达等优点而成为当前基因治疗中最有潜力的病毒载体之一。AAV-2基因组全长约4700碱基对(bp)，两端为重复末端片段(TR)，中间为病毒的结构基因，包括Rep和Cap基因。由于存在AAV病毒自身的不稳定性及其携带外源性基因(治疗基因)长度有限等方面缺陷，因此有必要对其进行基因重组形成重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)。
[0005] 如何构建可用于制备治疗疾病的药物的重组腺相关病毒及其相关产品是本领域技术人员努力的方向。
发明内容
[0006] 本发明所要解决的技术问题是：弥补上述现有技术的不足，提出一种稳定性高、携带前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原基因的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)载体及其构建方法与应用。
[0007] 本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：
[0008] 一种携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体，将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为PAP抗原基因得到的重组腺相关病毒载体。
[0009] 已知的腺相关病毒载体具有p5启动子，为提高目的基因的转录水平，还可进一步将PAP抗原基因插入已经成功构建的启动子为巨噬细胞病毒(CMV)启动子、β-肌动蛋白启动子(β-actinp)、猴空泡病毒40(SV40)早期启动子(SV40p)中的一种的AAV载体中。
[0010] 本发明还提供携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法：在腺相关病毒载体中，将腺相关病毒的结构基因剔除，在剔除的位置上插入PAP抗原基因，得到重组腺相关病毒载体。
[0011] 本发明所提供的构建方法，是使用基因重组的方法，使用限制性内切酶先将AAV载体骨架DNA切断，再运用DNA连接技术，将特异抗原基因PAP与被切断的AAV载体DNA进行连接，得到携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体。该rAAV载体的启动子为p5启动子或者下述三种启动子中的一种：巨噬细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子、β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子。
[0012] 一种与携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品，包括PAP重组腺相关病毒的质粒载体、PAP重组腺相关病毒的病毒载体、被所述PAP重组腺相关病毒的病毒载体感染或转染的细胞系，所述PAP重组腺相关病毒的质粒载体由上述携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体或者上述构建方法制得的携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体制得；所述PAP重组腺相关病毒的病毒载体由所述PAP重组腺相关病毒的质粒载体进行细胞培养得到。
[0013] 一种与携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品的制备方法，PAP重组腺相关病毒的质粒载体的制备：将如上述携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体或者上述构建方法制得的携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体导入基因工程大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到PAP重组腺相关病毒的质粒载体；PAP重组腺相关病毒的病毒载体的制备：以所述PAP重组腺相关病毒的质粒载体和pHelper质粒共转染AAVp细胞得到PAP重组腺相关病毒的病毒载体；PAP重组腺相关病毒感染或转染的细胞系的制备：用所述PAP重组腺相关病毒的病毒载体感染或转染单核细胞或树突状细胞得到，所述细胞系包括单核细胞-树突状细胞系(所述AAV/PAP中的相关基因—PAP抗原基因可在单核细胞-树突状细胞系中在转录启动子的作用下获得表达)。
[0014] 一种如上所述的携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体或者如上所述的相关产品在制备抗PAP抗原阳性的前列腺癌药物中的应用。
[0015] 药物可采用溶剂或粉剂等剂型。所述溶剂的选择是多种多样的，如细胞培养液(基)、生理盐水或磷酸盐缓冲液等均可。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂和表面活性剂等。
[0016] 用药方式可为先分离出肿瘤患者体内的单核细胞，再将AAV/PAP的病毒载体感染或转染患者的单核细胞。或将转化有PAP的成熟的树突状细胞所刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞回输肿瘤患者。
[0017] 本发明与现有技术对比的有益效果是：
[0018] 本发明提供了一种稳定性高、携带外源性基因(PAP)的重组腺相关病毒(rAAV)载体(可简称为AAV/PAP)。AAV/PAP是在发明人已经成功构建的AAV载体的骨架中插入PAP抗原基因。PAP抗原基因为一种前列腺癌抗原基因，AAV载体骨架有4种，其区别在于分别携带4种不同的启动子基因，分别为p5启动子、巨噬细胞病毒(CMV)启动子(CMVp)、人beta肌动蛋白启动子(β-actinp)或猴空泡病毒40(SV40)早期启动子(SV40p)。在本发明的重组腺相关病毒(AAV/PAP)载体可将其携带的PAP抗原基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，存在PAP抗原基因的细胞被用于刺激免疫系统的效应细胞(不局限于T淋巴细胞和B淋巴细胞)。实验证明，被本发明的rAAV感染的树突状细胞和所诱导的细胞毒性T淋巴细胞在体外和患者体内可有效地抑制相关恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞，因而，本发明的携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体或与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品可被用于制备抗PAP抗原阳性的恶性肿瘤的细胞免疫治疗。本发明在恶性肿瘤的临床治疗和应用中具有重要的理论和实际意义，应用前景广阔。
附图说明
[0019] 图1为本发明具体实施方式的携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/PAP)的结构示意图。
[0020] 图2为本发明具体实施方式的构建携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/PAP)以及制备具有感染性的AAV/PAP流程图。
[0021] 图3A为本发明具体实施方式的PAP cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果图。
[0022] 图3B为本发明具体实施方式的PAP基因克隆及重组腺相关病毒载体AAV/PAP的双酶切鉴定结果图。
[0023] 图4为本发明具体实施方式的所获得的PAP基因序列与美国NCBI Gene Bank公布的基因序列比较图。
[0024] 图5为本发明具体实施方式的重组腺相关病毒载体AAV/PAP的病毒载体的病毒滴度检测结果图。
[0025] 图6为本发明具体实施方式的重组腺相关病毒载体AAV/PAP感染肿瘤患者单核细胞为基础的杀灭肿瘤实验流程图。
[0026] 图7a-7d为本发明具体实施方式的分别含不同的启动子的重组腺相关病毒载体AAV/PAP的病毒载体感染DC的效率检测结果图。
[0027] 图8a-8c为本发明具体实施方式的重组腺相关病毒载体AAV/PAP的病毒载体感染的DC表达CD80、CD83以及CD86水平的检测结果图。
[0028] 图9为本发明具体实施方式的重组腺相关病毒载体AAV/PAP的病毒载体感染的DC所诱导的CTL的IFN-γ水平与对照组对比的检测结果图。
[0029] 图10为本发明具体实施方式的重组腺相关病毒载体AAV/PAP的病毒载体感染的DC所诱导的CTL体外杀伤PAP阳性和阴性细胞的51Cr(铬-51)实验结果图。
[0030] 图11为本发明具体实施方式的在重组腺相关病毒载体AAV/PAP的病毒载体感染的DC所诱导的CTL治疗过程中6例前列腺癌患者的血清前列腺特异性抗原(PSA)水平的变化情况图。
[0031] 图12为本发明具体实施方式的在重组腺相关病毒载体AAV/PAP的病毒载体感染的DC所诱导的CTL治疗过程中6例前列腺癌患者的血清PAP水平的变化情况图。
具体实施方式
[0032] 下面结合具体实施方式并对照附图对本发明做进一步详细说明。
[0033] 发明人已经成功地将携带AAV 2型全基因组DNA的pBR322质粒(pBR-AAV2)中的AAV-2的包括rep和cap基因在内的全部结构基因删除，仅保留末端重复片段，或保留末端重复片段和p5启动子，并插入寡核苷酸片断，以提高重组腺相关病毒(rAAV)DNA复制的效率和重组腺相关病毒的稳定性，由此获得AAV-2载体的基本骨架，所应用的AAV-2载体具有p5启动子，将PAP抗原基因插入其中。此外，也成功地用巨细胞病毒(CMV)启动子、猴空泡病毒40(SV40)早期启动子、β-肌动蛋白启动子取代AAV-2载体中原有的p5启动子。也即本发明实施方式中的携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/PAP)的启动子可以为p5启动子或CMV启动子或β-肌动蛋白启动子或SV40早期启动子。此外，在此基础上成功地制备具有感染性的rAAV病毒颗粒(参见中国专利ZL201110125683.X)，为研制新的rAAV产品奠定了基础。
[0034] 前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase,PAP)系酸性磷酸酶同工酶,由两个相同亚单位组成，其分子量为100kD，由成熟的前列腺上皮细胞溶酶体产生。PAP是一种前列腺外分泌物中的糖蛋白，其在酸性条件下催化磷酸单酯水解生成无机磷酸的水解酶。由于PAP特异性地在前列腺细胞表达，并在前列腺癌细胞高表达，并具有较强的免疫原性，而前列腺为非维持人体生命的必需器官，故大量的实验和临床研究证明PAP为免疫治疗的理想的靶抗原。2010年美国粮食和药品管理局(FDA)正式批准将美国Dendreon公司的Provenge用来治疗激素无效的无症状或症状轻微的转移性前列腺癌，成为首个被美国FDA批准上市的新型治疗性肿瘤疫苗。Provenge是一种自体源性树突细胞疫苗，在该疫苗中，其药物成份为一种融合蛋白，即将前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原蛋白融合于免疫刺激细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。将该融合蛋白刺激的患者树突状细胞输回患者体内，发动细胞免疫反应，从而使T细胞能辨识并杀灭PAP抗原阳性的癌细胞。临床试验表明Provenge可降低患者的死亡风险，平均延长生存期4.1个月。虽然随后的临床试验证明Provenge的疗效并不理想，但该PAP抗原已经被公认为细胞免疫治疗的一个理想的靶抗原，在抗肿瘤的细胞免疫治疗中发挥重要的作用。
[0035] 本发明的AAV/PAP载体是在发明人已经成功构建的腺相关病毒载体的骨架中插入PAP抗原基因得到重组腺相关病毒载体，与载体相关的产品包括质粒载体、病毒载体和细胞系。
[0036] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。
[0037] 所用引物、DNA序列合成及DNA序列测定均由美国Life Technologies公司完成。
[0038] 实施例1、携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/PAP)的构建及鉴定[0039] 一、材料及其来源：
[0040] 1.四种具有不同启动子的AAV 2型(AAV-2)pBR322质粒(pBR-AAV2)：由发明人构建成功(参见中国专利ZL201110125683.X，0056～0059段pBR-AAV2质粒的改建、PCR扩增启动子、将扩增的启动子插入改建的pBR-AAV2质粒中等内容)。四种启动子分别为AAV p5启动子(AAV p5)、巨噬细胞病毒启动子(CMVp)、SV40早期启动子(SV40p)和人β-肌动蛋白启动子(β-actinp)。该质粒的特点为两端完整的重复末端片段(TR)序列，并在两端TR的第75位核苷酸序列处均插入9个核苷酸CTGCGCTGG组成的片段，目的是提高重组AAV病毒(rAAV)的稳定性以及提高病毒的复制效率，并且已剔除了AAV-2的包括复制蛋白基因(rep)和包膜蛋白基因(cap)在内的全部结构基因。
[0041] 2.人前列腺癌组织：来源于手术切除的癌组织，免疫组化证实PAP抗原阳性。
[0042] 3.基因扩增核苷酸引物：根据美国基因库中公开发表的人前列腺酸性磷酸酶(PAP)基因序列设计(GenBank:NM_001099.4)。
[0043] 二、构建本实施例携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体(如图1和2所示)[0044] 构建时：包括以下步骤：：1)改建AAV 2型pBR322质粒：使用限制性内切酶Bst98 I和Hpa I将AAV 2型pBR322质粒中的AAV 2型腺相关病毒中的结构基因切除，然后将含有限制性内切酶EcoR I和EcoR V酶切位点的核苷酸序列CGAATTCATGCGATATCGTT插入质粒中，保留两端的TR序列或者在两端的TR序列的第75位核苷酸序列处均插入由9个核苷酸组成的片段CTGCGCTGG；2)将启动子插入步骤1)得到的改建的AAV 2型pBR322质粒中，构建携带有启动子的AAV 2型pBR322质粒；所述启动子为p5启动子或者下述三种启动子中的一种：巨噬细胞病毒启动子、β-肌动蛋白启动子或SV40早期启动子。3)获取PAP cDNA；4)将已构建的携带有启动子的AAV 2型pBR322质粒和步骤1)得到的PAP cDNA进行限制性内切酶反应，然后进行DNA连接反应，得到携带有启动子和PAP cDNA的重组腺相关病毒载体(可命名为AAV/PAP)。
[0045] 具体过程包括以下步骤：
[0046] 1.获取cDNA，具体方法为：采用Trizol试剂(美国Life Technology公司生产)获取前列腺癌组织的总mRNA。首先将PAP抗原阳性的前列腺癌组织反复碾磨后，加入5ml Trizol,按照其说明书进行操作。离心获取上清液后，以75％(V/V)乙醇洗涤二次，再加入无水乙醇，离心沉淀。沉淀物以去离子水溶解，得到总mRNA溶液，将浓度调至10ng/μl。以10μl总mRNA溶液为模板，进行逆转录反应(RT)，合成总cDNA。以25μl为例的逆转录反应体系包括：0.5μg oligo(dT)15(美国Promega公司)、0.5mM dNTPs(美国Promega公司)以及200U M-MLV逆转录酶(美国Promega公司)。反应条件为37℃，1小时，得到总cDNA。
[0047] 2.获取PAP cDNA，具体方法为：总cDNA在引物1(如SEQ ID NO:1)：CATGAGAGCTGCACCCCTCC和引物2(SEQ ID NO:2)：CTAATCTGTACTGTCCTCAGT的引导下PCR扩增，得到PAP cDNA。PCR扩增条件为：先94℃4分钟；再94℃30秒，60℃35秒，72℃90秒，共30个循环；最后72℃5分钟，反应结束后，对PCR产物进行1.2％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，在
1182bp处出现一条预期的特异性cDNA条带。如图3A所示，其中，1、2是PAP cDNA，3是DNA分子量标准。
[0048] 3.构建携带PAP cDNA的重组腺相关病毒载体：分别对携带4种不同启动子的pAAV-2质粒和PAP cDNA分别用限制性内切酶进行酶切后，进行DNA连接反应。所用限制性内切酶均购自美国Promega公司。酶切反应体系为：1μg pAAV质粒或PAP cDNA；10U限制性内切酶Xba I和Xho I(购自美国Promega公司)，2.5μl 10×缓冲液C以及19.5μl去离子水；反应条件为：在37℃下水浴4小时。连接反应体系为：500ng酶切后的质粒，300ng酶切后的PAP cDNA，10IU T4DNA连接酶(购自美国Promega公司)，1.5μl 10×T4DNA连接缓冲液以及11.5μl去离子水；反应条件为：在4℃下8小时。分别得到携带有AAV的p5启动子和PAP cDNA的重组腺相关病毒载体、携带有CMV启动子和PAP cDNA的重组腺相关病毒载体、携带有SV40早期启动子和PAP cDNA的重组腺相关病毒载体、以及携带有β-肌动蛋白启动子和PAP cDNA的重组腺相关病毒载体。
[0049] 4.将连接后的AAV/PAP分别导入基因工程大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞(美国Invitrogen公司)，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到大量的AAV/PAP的质粒载体。
[0050] 三、重组腺相关病毒质粒的鉴定
[0051] 1.限制性内切酶酶切分析：将AAV/PAP质粒载体以限制性内切酶Xba I和Xho I进行酶切反应，反应体系、条件以及操作过程同实施例1中的二.3。分析结果见图3B所示，其中，1、2是两个阳性克隆；3是DNA分子量标准，证明构建AAV/PAP质粒载体成功。
[0052] 2.DNA序列测定:将AAV/PAP进行DNA序列测定。其测序结果的核苷酸序列如图4所示，与基因库相应的PAP基因对比，99％同源，进一步证明构建AAV/PAP质粒成功。
[0053] 实施例2、重组腺相关病毒载体(rAAV)的制备及滴度测定
[0054] 材料及其来源：
[0055] A.实施例1构建的携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体AAV/PAP。
[0056] B.含AAV的Rep基因和Lip/Cap基因的辅助质粒pHelper：由美国阿肯色大学医学院附属医院基因治疗中心刘勇教授构建(Liu,Y.,Chiriva-Internati,M.,Grizzi,F.Salati,E.,Roman,J.J.,Lim S.,and Hermonat,P.L.Rapid induction of cytotoxic T cell response against cervical cancer cells by human papillomavirus type 16E6antigen gene delivery into human dendritic cells by an adeno-associated virus vector.Cancer Gene Therapy 8:948-957.)。
[0057] C.含有整合于细胞染色体并表达的腺病毒基因(E1、E2A、E4、VAI和VAII基因)的AAVp细胞株：由美国阿肯色大学医学院附属医院基因治疗中心建立(Liu,Y.,Chiriva-Internati,M.,Grizzi,F.Salati,E.,Roman,J.J.,Lim S.,and Hermonat,P.L.Rapid induction of cytotoxic T cell response against cervical cancer cells by human papillomavirus type 16E6antigen gene delivery into human dendritic cells by an adeno-associated virus vector.Cancer Gene Therapy 8:948-957.)。
[0058] D.脂质体转染试剂Lipofectin：购自美国Invotrogen公司。
[0059] E.DMEM培养基和胎牛血清(或小牛血清)：购自美国Cellgro公司。
[0060] F.PCR DIG标记试剂盒和DIG杂交检测试剂盒：购自瑞士Roche公司。
[0061] G.DNA拷贝数标准：分别为1012拷贝数(copies)/μl至109(copies)/μl，购自美国Promage公司。
[0062] 一、重组腺相关病毒载体(rAAV)的制备
[0063] 参照图2，用下述方法制备重组腺相关病毒(rAAV)，以制备一盘10.0cm细胞培养皿的病毒为例，当AAV-HEK293细胞在二氧化碳细胞培养箱中生长至约占培养皿面积70％时，进行如下操作：
[0064] A.按照Lipofectin的使用说明进行操作：将1.0μg AAV/PAP的质粒载体，1.0μg pHelper质粒，4.0μl Lipofectin和50.0μl含5％(V/V)胎牛血清(或小牛血清)的DMEM培养基混匀，室温静置20分钟。
[0065] B.将混合液加入细胞培养皿中，继续置于二氧化碳细胞培养箱中培养。
[0066] C.72小时后，收获培养皿中的所有细胞和培养液。
[0067] D.剧烈振荡1分钟后，离心，保留上清，即rAAV病毒液。
[0068] E.将收集的rAAV病毒液过滤除菌，获得的携带前列腺酸性磷酸酶基因(PAP cDNA)的AAV病毒命名为AAV/PAP的病毒载体。
[0069] 二、重组腺相关病毒载体(rAAV)的病毒滴度测定
[0070] 采用常规的斑点杂交法，对步骤一获得的AAV/PAP的病毒载体进行病毒滴度测定，具体方法包括以下步骤：仅所用的DNA探针为针对PAP基因的特异性探针。
[0071] A.采用常规的DNA苯酚/氯仿提取法，提取rAAV病毒颗粒DNA。
[0072] B.将尼龙膜置于斑点印迹仪中，加入经碱变性的rAAV病毒颗粒DNA，并加入DNA拷贝数标准，抽真空。
[0073] C.取出尼龙膜干燥后，紫外线固定。
[0074] D.用PCR DIG标记试剂盒并参照试剂盒说明书制备DIG标记的特异性探针，探针为“实施例1中所获得的PAP cDNA”。PCR扩增结束后，对PCR扩增产物进行1.2％(V/V)琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下检测PCR扩增产物，结果出现阳性条带，表明探针标记成功。
[0075] E.用DIG杂交检测试剂盒并参照试剂盒说明书，在杂交炉中对各种rAAV病毒颗粒DNA进行DNA杂交。AAV/PAP的病毒载体的病毒滴度检测结果如图5所示，其中：1为标准品。2-4为3批AAV/PAP。每批AAV/PAP的滴度约在1012copies/ml；AAV/PAP的病毒载体的病毒滴度为1012拷贝(copies)/ml。
[0076] 实施例3、AAV/PAP的病毒载体导入单核细胞-树突状细胞系的杀灭肿瘤实验[0077] 材料及其来源：
[0078] A.rAAV病毒：AAV/PAP的病毒载体。
[0079] B.AIM-V细胞培养基：购自美国Life Technologies公司。
[0080] C.细胞因子：集落细胞刺激因子(GM-CSF)，白细胞介素2，4(IL-2，IL-4)以及肿瘤坏死因子(TNF-α)购自美国R&D公司。
[0081] D.PAP阳性的原代肿瘤细胞：为从患者的肿瘤组织中分离的前列腺癌细胞。
[0082] E.PAP阳性细胞：为从患者的正常前列腺组织分离的前列腺细胞。
[0083] F.PAP阴性原代细胞：肺、乳腺、肝和肾脏的上皮细胞分别从正常组织中分离获得。
[0084] G.分别针对人MHC I类抗原的多克隆抗体和人前列腺酸性磷酸酶的单克隆抗体：购自美国BD公司。
[0085] 一、杀灭肿瘤实验
[0086] 如图6所示，将本发明的携带PAP抗原基因的rAAV的病毒载体感染肿瘤患者单核细胞为基础的杀灭肿瘤实验的过程包括以下步骤：
[0087] A.取肿瘤患者50-150毫升外周血，用血细胞分离仪(或淋巴细胞分离液)按常规方法获取外周血单个核细胞(PBMC)，与AIM-V培养基混匀后，加入细胞培养瓶，置于恒温二氧化碳培养箱中培养2小时。
[0088] B.分离细胞，除去悬浮细胞，保留贴壁细胞(即单核细胞)。悬浮细胞即外周血淋巴细胞，将其与AIM-V培养基混匀后，继续培养备用。
[0089] C.在单核细胞中加入一种(或多种，效果更佳)本发明实施例2获得的rAAV病毒，加入量为100～1000MOI(本例汇中为100MOI)，同时再加入GM-CSF(800IU/ml)，继续培养4小时。
[0090] D.除去步骤C的旧培养基，补充含GM-CSF，IL-4(800IU/ml)以及TNF-α(20IU/ml)的AIM-V培养基，继续培养。
[0091] E.培养6天后，收获成熟的树突状细胞(DC)，并与所培养的外周血淋巴细胞混合，在AIM-V培养基中加入IL-2(20IU/ml)，继续培养。
[0092] F.培养至6-12天后，收获激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)进行检测。
[0093] 二、树突状细胞(DC)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的检测
[0094] A.rAAV病毒感染外周血单个核细胞的效率检测
[0095] 采用常规的荧光抗体标记染色法，用针对前列腺酸性磷酸酶(PAP)的特异性荧光抗体(购自美国BD公司)标记步骤一获得的被本发明的rAAV病毒感染的单核细胞或未成熟的DC，再进行流式细胞仪检测阳性细胞的数量。其中，rAAV病毒感染外周血单核细胞的效率检测结果如图7a-7d所示，分别携带不同启动子，即AAV p5、CMVp、SV40p或β-actinp的AAV/PAP的病毒载体感染单核细胞或DC的效率分别为87.2％、90.5％、91.8％和90.6％，即约90％的DC可表达PAP抗原，证明约90％左右的DC可被PAP抗原刺激，DC的抗原摄取、加工和提呈率较高。
[0096] B.树突状细胞(DC)表达的CD分子水平的检测
[0097] DC表达CD80、CD83以及CD86的水平与DC的功能呈正相关。用与步骤A相同的检测方法，即分别采用荧光标记的针对这三种CD分子的抗体(购自美国BD公司)对步骤一获得的被本发明AAV/PAP的病毒载体感染的DC表达CD80、CD83以及CD86的水平进行常规的流式细胞技术检测。AAV/PAP的病毒载体感染的DC表达CD80、CD83以及CD86水平的检测结果分别如图8a-8c所示，被AAV/PAP感染的DC所表达的CD分子水平较高(平均表达率分别为42.07％、
82.54％和74.21％)，有利于刺激细胞免疫反应。证明构建和制备的PAP抗原基因的rAAV病毒感染DC后，所诱导的DC的功能强大。
[0098] C.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达的γ干扰素(IFN-γ)水平的检测
[0099] CTL的功能及其杀伤肿瘤细胞的能力与IFN-γ的表达水平呈正相关。用与步骤A类似的方法检测被本发明rAAV病毒感染的DC所诱导的CTL表达IFN-γ的水平(以无刺激的DC所诱导的CTL为对照)。DC与外周血淋巴细胞混合培养结束后，收获细胞，采用传统的胞内染色法进行细胞荧光染色标记，所用抗体为针对IFN-γ的荧光标记抗体(购自美国BD公司)，最后利用流式细胞仪检测结果。其中，以携带CMV启动子(CMVp)的重组腺相关病毒AAV/PAP的病毒载体为例，检测其感染的DC所刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达的伽玛干扰素(IFN-γ)水平，如图9所示，其中，左图为对照组，右图为实验组，结果显示，其CTL表达IFN-γ的水平(平均表达率为39.0％)明显高于对照，提示细胞免疫反应较强，CTL的杀伤活性高。证明被本发明构建和制备的AAV/PAP的病毒载体感染的DC所诱导的CTL功能强大。
[0100] 三、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤肿瘤细胞试验
[0101] 被AAV/PAP的病毒载体感染的DC与淋巴细胞混合培养结束后，将被AAV/PAP的病毒载体感染的DC所诱导的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)按20:1(淋巴细胞:肿瘤细胞)与PAP阳性的肿瘤细胞混合后，采用传统的51Cr(铬-51)杀伤试验，检测CTL杀伤肿瘤细胞的活性、MHC class I限制性和杀伤特异性。如图10所示，以携带CMV启动子(CMVp)的重组腺相关病毒载体AAV/PAP的病毒载体为例，其感染的DC所诱导的CTL体外杀伤PAP阳性和阴性细胞的51Cr(铬-51)实验结果。被本发明的AAV/PAP的病毒载体感染的DC所诱导的CTL能够有效地裂解(杀伤)PAP阳性的前列腺癌细胞和前列腺细胞，前列腺癌细胞的平均杀伤率近60％，而对PAP阳性的前列腺细胞的平均杀伤率近35％，明显低于前列腺癌的杀伤率，可能与正常的前列腺细胞的PAP低水平表达有关。
[0102] 以PAP抗原阴性的肺、乳腺细胞、肝和肾脏的上皮细胞为对照，再用上述相同的方法检测上述被AAV/PAP的病毒载体感染的DC所诱导的CTL杀伤细胞的特异性。被本发明构建和制备的AAV/PAP的病毒载体感染的DC所诱导的CTL对上述PAP抗原阴性的细胞无杀伤作用，如图10所示，证明被本发明构建和制备的AAV/PAP的病毒载体感染的DC所诱导的CTL具有抗原特异性，即对抗原阴性的细胞无杀伤作用。
[0103] 对于上述PAP阳性的前列腺癌细胞和前列腺细胞，分别先用MHC I类抗体(购自美国R&D公司)或前列腺酸性磷酸酶的单克隆抗体进行预处理后，再采用传统的51Cr(铬-51)杀伤试验，以检测CTL的杀伤活性。检测结果表明对PAP阳性细胞的杀伤效果明显下降。该结果证明被本发明构建和制备的AAV/PAP感染的DC所诱导的CTL具有MHC Class I限制性和PAP抗原特异性。
[0104] 图10中的检测结果表明CTL杀伤(裂解)PAP阳性的前列腺癌细胞以及前列腺细胞的效率分别为约60％和35％，但对PAP抗原阴性的肺、乳腺、肝和肾细胞无杀伤作用。而且预先分别经PAP抗体以及MHC I抗体封闭后，CTL对PAP阳性的前列腺癌细胞以及前列腺细胞杀伤作用明显下降。实验结果提示该杀伤作用具有PAP抗原特异性和MHC I抗原限制性，具有CTL杀伤作用的特征。综合上述检测结果，证明被本发明构建和制备携带前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原基因的rAAV病毒感染的DC所诱导的CTL对PAP阳性细胞具有较好的杀伤效果，有可能用于临床抗前列腺癌的靶向性细胞免疫治疗。
[0105] 实施例4、以PAP为靶点的抗前列腺癌的靶向性细胞免疫治疗初步临床试验[0106] 本实施例提供一种携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体或者其相关产品在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是在抗PAP阳性的恶性肿瘤药物中的应用，其中PAP阳性的恶性肿瘤包括但不限于前列腺癌等。
[0107] 抗肿瘤药物的活性成分为上述携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体或与携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品。药物可采用溶剂或粉剂等剂型。所述溶剂的选择是多种多样的，如细胞培养液(基)、生理盐水或磷酸盐缓冲液等均可。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体，所述载体可包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂和表面活性剂等。
[0108] 如以本发明的PAP重组腺相关病毒为载体，将PAP基因导入单核细胞-树突状细胞系，并诱导产生树突状细胞(Dendritic Cells，DC)，以达到患者体外和体内免疫刺激细胞免疫反应的目的，用以杀灭PAP抗原阳性的肿瘤细胞，或以该DC刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocytes,CTL)，以CTL直接杀灭PAP阳性的肿瘤细胞。也即用药方式可为先分离出肿瘤患者体内的单核细胞，再将AAV/PAP的病毒载体感染或转染患者的单核细胞或树突状细胞(DC)，再将转化有PAP抗原基因的DC或其刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)回输肿瘤患者。为提高疗效，上述药物还可以与抗生素、免疫刺激剂和肿瘤靶向药物等进行组合治疗。
[0109] 上述药物的用量一般AAV/PAP:100MOI/单核细胞/次，可根据实际情况调整。
[0110] 本实施例还提供一种体外杀灭PAP阳性的肿瘤的方法，包括以下步骤：
[0111] 1)将肿瘤所在体系(该体系可通过人工模拟的方式产生或肿瘤患者体内)中自然产生的单核细胞-树突状细胞(DC)被AAV/PAP的病毒载体感染或转染，或被与AAV/PAP载体相关的产品处理，各自得到处理后的细胞；
[0112] 2)将步骤1)中处理后的单核细胞-DC加入肿瘤所在体系中杀灭肿瘤；或将未被处理的T淋巴细胞与所述处理后的单核细胞-DC混合培养形成抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，再将该抗原特异性CTL加入肿瘤所在体系中杀灭PAP阳性的肿瘤；或将被处理的CTL和未被处理的单核细胞-DC加入肿瘤所在体系中杀灭PAP阳性的肿瘤。
[0113] 也即，给予一个肿瘤患者回输PAP抗原特异性CTL，该细胞由来源于患者的自然产生的T淋巴细胞与来源于该患者的单核细胞-DC混合培养产生的。在混合培养之前，这些在单核细胞-DC已经被本发明携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒的病毒载体感染或者转染，或被与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品处理；或者，给予一个肿瘤患者回输来源于患者的单核细胞-DC。在回输之前，这些在单核细胞-DC已经被本发明携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒的病毒载体感染或者转染，或被与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品处理。
[0114] 本例中具体为：将实施例3中被AAV/PAP的病毒载体感染从肿瘤患者分离的树突状细胞(DC)所诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)回输6例内分泌治疗失败并复发，血清PSA和PAP升高的前列腺癌症患者，以患者的血清PSA和PAP的变化为标准判断疗效。
[0115] 输注细胞数为1×108-5×108个CTL细胞(本例中，输注量为100μl/5×106个单核细胞/每次)。治疗疗程：通常为6个月，每月2次，如图11和12所示，分别为重组腺相关病毒AAV/PAP病毒感染的DC所诱导的CTL治疗过程中6例前列腺癌患者的血清前列腺特异性抗原(PSA)和PAP水平的变化情况，结果显示经过6个月的治疗，被本发明的rAAV的病毒载体感染的DC所诱导的CTL在大部分受试患者体内能够发挥一定的疗效，可降低血清PSA和PAP的水平，甚至恢复正常以及改善症状。经治疗，患者的血清PSA和PAP的变化呈一致性，其中4例的血清PSA和PAP水平明显降低，甚至恢复正常，1例变化不明显，1例出现上升。所有患者在治疗过程中无明显的毒副作用发生。该试验结果提示通过该种技术制备的CTL不仅具有一定的疗效而且安全性较高，未来可用于临床抗前列腺癌的靶向性细胞免疫治疗。
[0116] 工业应用性
[0117] 实验证明，被本发明携带前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原基因的重组腺相关病毒(AAV/PAP)的病毒载体感染的树突状细胞(DC)和所诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)可有效地抑制PAP阳性的前列腺癌细胞的生长或者杀灭该种肿瘤细胞。因而，本发明的PAP重组腺相关病毒载体(AAV/PAP)或与本发明PAP重组腺相关病毒载体相关的产品可被用于制备抗肿瘤药物进行规模化和标准化生产，在前列腺癌的临床治疗应用中具有重要的意义。
[0118] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下做出若干替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。
