一种罗汉果外植体表面灭菌方法

摘要

本发明提供的一种罗汉果外植体表面灭菌技术，属于植物组织培养技术领域，使用本发明的方法处理的罗汉果外植体，其外植体的污染率降低到15％以下，褐化率降低到5以下，诱导率在50％以上，该处理方法能够保证后续的组织培养的成活率提高。

权利要求

1.一种罗汉果外植体表面灭菌方法，其特征在于包括以下步骤：

1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；

2)用浓度为 4％的肥皂水浸泡 8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；

3)再用浓度为 0.08％的柠檬酸溶液浸泡 8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；

4)再用浓度 55％的酒精溶液浸泡 18s，捞起后使用无菌水冲洗一次；

5)再使用浓度为 0.2％的高锰酸钾溶液浸泡 4min，捞起后使用无菌 水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体。

2.如权利要求 1 所述的罗汉果外植体表面灭菌方法，其特征在于：得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒 MS+BA0.5～0.7mg/L+IAA0.1～0.2mg/L+蔗糖 30g/L 的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润。

说明书

一种罗汉果外植体表面灭菌方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物组织培养技术，尤其涉及一种罗汉果外植体表面灭菌方法。

背景技术

[0002] 罗汉果（学名：Siraitiagrosvenorii）是葫芦科多年生藤本植物。其叶心形，雌雄异株，夏季开花，秋天结果。中医以其果实入药，含有罗汉果甜苷、多种氨基酸和维生素等药用成分，主治肺热痰火咳嗽、咽喉炎、扁桃体炎、急性胃炎、便秘等。因为罗汉果是雌雄异株，又花期不遇，加之花粉粘重且着生于花药不易被昆虫触及的地方，所以很难像普通的风媒花或虫媒花那样传粉，因此自然条件下，结果的机率极低(目前人工栽培仍然必须人工授粉)。同时，罗汉果种子实生苗有70％左右为雄株，且要等到2～3年之后，开花时才能判定，生产上基本无实用价值。但是，罗汉果的习性是，到了秋季分枝藤蔓会向下垂，并迅速伸长，一经着地就会膨大变作指头大小的块茎(俗称“薯块”、“薯仔”)，可以顽强地越冬，来年萌发成为独立的新植株。这是罗汉果自然繁殖的重要方式。在人工栽培之后，演化成了人工压蔓，小“块茎”依然是罗汉果最重要的种源。然而，这些传统块茎容易传播病毒及其它病虫害，又难以大批量生产，无法满足现代规模化种植的需求。

[0003] 世纪末无菌无毒的罗汉果组培苗研究成功，很快就取代传统块茎成为最重要的种源。先研究在罗汉果组培技术前，其消毒杀菌下过不是很理想，导致后面的组织培养成活率不高。

发明内容

[0004] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种罗汉果外植体表面灭菌方法。

[0005] 本发明通过以下技术方案得以实现。

[0006] 本发明提供的一种罗汉果外植体表面灭菌方法，包括以下步骤：

[0007] 1）使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；

[0008] 2）用浓度为3 5%的肥皂水浸泡5 10min，捞起后使用无菌水冲洗一次;~ ~

[0009] 3）再用浓度为0.05 0.1%的柠檬酸溶液浸泡5 10min，捞起后使用无菌水冲洗一~ ~次;

[0010] 4）再用浓度50 60%的酒精溶液浸泡15 20s，捞起后使用无菌水冲洗一次;~ ~

[0011] 5)再使用浓度为0.1 0.3%的高锰酸钾溶液浸泡3 5min，捞起后使用无菌水冲洗一~ ~次，得到灭菌的罗汉果外植体。

[0012] 进一步的，包括以下步骤：

[0013] 1）使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；

[0014] 2）用浓度为4%的肥皂水浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次;

[0015] 3）再用浓度为0.08%的柠檬酸溶液浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次;

[0016] 4）再用浓度55%的酒精溶液浸泡18s，捞起后使用无菌水冲洗一次;

[0017] 5)再使用浓度为0.2%的高锰酸钾溶液浸泡4min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体。

[0018] 进一步的，得到灭菌的罗汉果外植体使用紫外线照射10 20s。~

[0019] 进一步的，得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS+BA0.5~0.7mg/L+IAA0.1 0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润。
~

[0020] 本发明的有益效果在于：使用本发明的方法处理的罗汉果外植体，其外植体的污染率降低到15%以下，褐化率降低到5以下，诱导率在50%以上，该处理方法能够保证后续的组织培养的成活率提高。

[0021] 为了证明本发明的技术效果，本发明还提供以下试验例：

[0022] 试验例一

[0023] 试验组1：其处理步骤为：

[0024] 1）使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；

[0025] 2）用浓度为4%的肥皂水浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次;

[0026] 3）再用浓度为0.08%的柠檬酸溶液浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次;

[0027] 4）再用浓度55%的酒精溶液浸泡18s，捞起后使用无菌水冲洗一次;

[0028] 5)再使用浓度为0.2%的高锰酸钾溶液浸泡4min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体。

[0029] 6）得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS+BA0.6mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润

[0030] 试验组2：其处理步骤为：

[0031] 1）使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；

[0032] 2）用浓度为4%的肥皂水浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次;

[0033] 3）再用浓度为0.08%的柠檬酸溶液浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次;

[0034] 4）再用浓度55%的酒精溶液浸泡18s，捞起后使用无菌水冲洗一次;

[0035] 5)再使用浓度为0.2%的高锰酸钾溶液浸泡4min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体；

[0036] 6）得到灭菌的罗汉果外植体使用紫外线照射10 20s；~

[0037] 7）得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS+BA0.6mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润

[0038] 对照组：其处理步骤为：

[0039] 1）使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；

[0040] 2）使用无菌水进行处理；

[0041] 检测上述试验的诱导率、污染率和褐化率，具体如下表：

[0042]  诱导率（%） 污染率（%） 褐化率
试验组1 56.2 13.5 4.7
试验组2 63.1 10.1 3.9
对照组 25.4 54.6 8.9

[0043] 结果表明，使用本发明的方法处理的罗汉果外植体，其外植体的污染率降低到15%以下，褐化率降低到5以下，诱导率在50%以上，该处理方法能够保证后续的组织培养的成活率提高。

具体实施方式

[0044] 下面进一步描述本发明的技术方案，但要求保护的范围并不局限于所述。

[0045] 实施例一

[0046] 本发明提供的一种罗汉果外植体表面灭菌方法，包括以下步骤：

[0047] 1）使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；

[0048] 2）用浓度为3%的肥皂水浸泡5min，捞起后使用无菌水冲洗一次;

[0049] 3）再用浓度为0.05%的柠檬酸溶液浸泡5min，捞起后使用无菌水冲洗一次;

[0050] 4）再用浓度50 60%的酒精溶液浸泡15s，捞起后使用无菌水冲洗一次;~

[0051] 5)再使用浓度为0.1%的高锰酸钾溶液浸泡3min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体。

[0052] 6）得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS+BA0.6mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润。

[0053] 实施例二

[0054] 本发明提供的一种罗汉果外植体表面灭菌方法，包括以下步骤：

[0055] 1）使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；

[0056] 2）用浓度为5%的肥皂水浸泡10min，捞起后使用无菌水冲洗一次;

[0057] 3）再用浓度为0.1%的柠檬酸溶液浸泡10min，捞起后使用无菌水冲洗一次;

[0058] 4）再用浓度60%的酒精溶液浸泡20s，捞起后使用无菌水冲洗一次;

[0059] 5)再使用浓度为0.3%的高锰酸钾溶液浸泡5min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体。

[0060] 6）得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS+BA0.6mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润。

[0061] 实施例三

[0062] 本发明提供的一种罗汉果外植体表面灭菌方法，包括以下步骤：

[0063] 1）使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；

[0064] 2）用浓度为4%的肥皂水浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次;

[0065] 3）再用浓度为0.08%的柠檬酸溶液浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次;

[0066] 4）再用浓度55%的酒精溶液浸泡18s，捞起后使用无菌水冲洗一次;

[0067] 5)再使用浓度为0.2%的高锰酸钾溶液浸泡4min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体；

[0068] 6）得到灭菌的罗汉果外植体使用紫外线照射10 20s；~

[0069] 7）得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS+BA0.6mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润。