一类黄酮并木脂素化合物及其提取方法转让专利
申请号 : CN201610317500.7
文献号 : CN106008445B
文献日 : 2019-01-11
发明人 : 高坤 , 刘权 , 吴成慧
申请人 : 兰州大学
摘要 :
垂穗披碱草在我国有大面积分布，是青藏高原主要的乡土牧草之一，植物资源丰富。本专利公开了从垂穗披碱草中分离10个黄酮并木脂素类化合物的方法，其中3个化合物为新化合物，8个化合物的纯度在95％以上。该类化合物具有保肝、降血脂、抗氧化等多种生理作用。此外，本专利所利用的是该植物的地上部位，生产周期短，对生态环境影响小，而且可以快速制备高纯度单体化合物，经济效益显著，对于科学合理开发垂穗披碱草资源具有非常重要的意义。
权利要求 :
1.一类黄酮并木脂素化合物提取方法，其特征在于，化合物具有下述结构式：
提取方法包括以下步骤：
A、采集垂穗披碱草地上部位，阴干粉碎后，用5-50倍甲醇或乙醇有机溶剂提取，超声波或加热回流提取10-90分钟或在室温条件下冷浸，重复提取2-4次，减压浓缩，阴干，得到垂穗披碱草提取物；
B、将提取物用水溶液分散后，用乙酸乙酯萃取，萃取体积比为1：1，萃取次数2-4次，减压浓缩，阴干，得到乙酸乙酯部分；
C、乙酸乙酯部分通过大孔树脂进行分离，用甲醇溶液梯度洗脱3次，其中甲醇的体积比依次为：30％，50％，80％，取80％甲醇部分减压浓缩，阴干得到乙酸乙酯80％部分；
D、乙酸乙酯80％部分通过MCI树脂进行分离，用甲醇溶液梯度洗脱7次，其中甲醇的体积比依次为30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，取70％-90％部分减压浓缩，阴干，得到Fr.3；
E、将Fr.3以体积比为2:1的石油醚、丙酮混合溶剂为洗脱剂，使用200-300目分析纯硅胶，进行硅胶柱层析；取层析物为Fr.3d，该混合物为黄酮并木脂素类化合物的混合物，减压浓缩阴干；
F、利用半制备高效液相色谱从Fr.3d部分中制备黄酮并木脂素类化合物，取Fr.3d部分用甲醇溶液充分振荡洗涤，洗涤液减压浓缩，制得Fr.3dr；取Fr.3dr部分样品，经过Sephadex LH-20柱层析，以甲醇为洗脱剂，除去化合物苜蓿素；剩余部分合并经硅胶柱层析，氯仿/甲醇＝10:1为洗脱剂纯化后，利用甲醇溶解后，通过半制备高效液相色谱仪，色谱溶剂为水和乙腈，重复累积制备得到化合物1。
2.一类黄酮并木脂素化合物提取方法，其特征在于，化合物具有下述结构式：
提取方法包括以下步骤：
A、采集垂穗披碱草地上部位，阴干粉碎后，用5-50倍甲醇或乙醇有机溶剂提取，超声波或加热回流提取10-90分钟或在室温条件下冷浸，重复提取2-4次，减压浓缩，阴干，得到垂穗披碱草提取物；
B、将提取物用水溶液分散后，用乙酸乙酯萃取，萃取体积比为1：1，萃取次数2-4次，减压浓缩，阴干，得到乙酸乙酯部分；
C、乙酸乙酯部分通过大孔树脂进行分离，用甲醇溶液梯度洗脱3次，其中甲醇的体积比依次为：30％，50％，80％，取80％甲醇部分减压浓缩，阴干得到乙酸乙酯80％部分；
D、乙酸乙酯80％部分通过MCI树脂进行分离，用甲醇溶液梯度洗脱7次，其中甲醇的体积比依次为30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，取70％-90％部分减压浓缩，阴干，得到Fr.3；
E、将Fr.3以体积比为2:1的石油醚、丙酮混合溶剂为洗脱剂，使用200-300目分析纯硅胶，进行硅胶柱层析；取层析物为Fr.3d，该混合物为黄酮并木脂素类化合物的混合物，减压浓缩阴干；
F、利用半制备高效液相色谱从Fr.3d部分中制备黄酮并木脂素类化合物，具体为：步骤一：将Fr.3d用20mL甲醇溶液充分振荡洗涤，洗涤液减压浓缩，制得Fr.3dr，余下部分阴干制得Fr.3dc；
步骤二：取Fr.3dc通过反相色谱梯度洗脱4次，洗脱剂为体积比:30％，50％，70％，90％的丙酮溶液，取90％部分为Fr.3dc3；
步骤三：Fr.3dc3部分经过Sephadex LH-20柱层析，以氯仿/甲醇＝1:1为洗脱剂，利用薄层色谱层析合并相似成分，分别得到化合物9和10的混合物；化合物9和10的混合物通过半制备高效液相色谱仪色谱，色谱溶剂为水和乙腈，制备得到化合物9和10。
3.如权利要求1所述的黄酮并木脂素化合物的提取方法，其特征在于，高效液相色谱仪色谱条件为：25％乙腈等度，流速：2mL/min，检测波长：340nm，化合物1的保留时间为
15.9min。
4.如权利要求2所述的黄酮并木脂素化合物的提取方法，其特征在于，所述的步骤三中，高效液相色谱仪色谱条件为：37.5％乙腈等度，流速：2mL/min，检测波长：340nm，制备得到化合物9的保留时间：26.7min，制备化合物10的保留时间：28.1min。
说明书 :
一类黄酮并木脂素化合物及其提取方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种从垂穗披碱草中提取高纯度黄酮并木脂素类化合物的方法。
背景技术
[0002] 披碱草属为禾本科小麦族的一个大属，有150种植物。它们在全世界均有广泛分布，大多是重要的牧草。中国是该属植物分布较为广泛的国家之一。然而该属植物的化学成分研究却未见报道。
[0003] 其中，垂穗披碱草在我国有大面积分布，从东北平原到内蒙草原再到青藏高原均有分布，植物资源丰富。特别作为青藏高原主要的乡土牧草之一，在长期进化过程中，垂穗披碱草已经适应青藏高原海拔高，昼夜温差大，阳光辐射强度高，全年低温缺氧，形成了独特的次生代谢物。
[0004] 据文献报道，黄酮并木脂素类化合物具有保肝、降血脂、抗氧化、防止糖尿病、保护心肌、抗血小板聚集和抗肿瘤等多种生理作用(韩百翠，黄酮并木脂素类化合物的研究进展，2009年)。该类化合物在自然界相对含量较低，目前所报道分离得到的该类化合物仅有51个，分布在20种植物中。
发明内容
[0005] 本专利提供一种从垂穗披碱草中分离10个黄酮并木脂素类化合物的方法，其中化合物1、9和10为新化合物。
[0006] 本专利的提取方法，不仅丰富了该类化合物的种类结构，而且为该类化合物以及垂穗披碱草的开发利用提供了前提。
[0007] 本发明提供一类黄酮并木脂素化合物的提取方法，包括以下步骤：
[0008] 采集垂穗披碱草地上部位，阴干粉碎后，用5-50倍甲醇或乙醇有机溶剂提取，超声波或加热回流提取10-90分钟或在室温条件下冷浸，重复提取2-4次，减压浓缩，阴干，得到垂穗披碱草提取物；
[0009] 将提取物用少量水溶液分散后，用乙酸乙酯萃取，萃取体积比为1：1，萃取次数2-4次，减压浓缩，阴干，得到乙酸乙酯部分；
[0010] 乙酸乙酯部分通过大孔树脂进行分离，用甲醇溶液梯度洗脱3次，其中甲醇的体积比依次为：30％，50％，80％，各9L；取80％甲醇部分减压浓缩，阴干得到乙酸乙酯80％部分；
[0011] 乙酸乙酯80％部分通过MCI树脂进行分离，用甲醇溶液梯度洗脱7次，其中甲醇的体积比依次为30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，；取70％-90％部分减压浓缩，阴干，得到Fr.3；
[0012] 将Fr.3以体积比为2:1的石油醚、丙酮混合溶剂为洗脱剂，使用200-300目分析纯硅胶，进行硅胶柱层析；取层析物为Fr.3d，该混合物为黄酮并木脂素类化合物的混合物，减压浓缩阴干；
[0013] 利用半制备高效液相色谱从Fr.3d部分中制备黄酮并木脂素类化合物1-10。
[0014] 除化合物7和8以外，其余化合物纯度均大于95％。制备化合物2-8的方法详见实施例2-4，制备新化合物1、9和10的方法如下：
[0015] 将Fr.3d用20mL甲醇溶液充分振荡洗涤，洗涤液减压浓缩，制得Fr.3dr，余下不溶部分阴干制得Fr.3dc。
[0016] 将Fr.3dr经过Sephadex LH-20柱层析，以甲醇为洗脱剂，除去化合物苜蓿素。剩余部分合并经硅胶柱层析，氯仿/甲醇＝10:1为洗脱剂纯化后，通过Waters 1525高效液相色谱仪配备XBridge C18色谱柱(150×10mm，10μm)(以下用的制备液相均为同一仪器)，色谱溶剂为水和乙腈，色谱条件为：25％乙腈等度，流速：2mL/min，检测波长：340nm，制备得到新化合物1(4mg，保留时间：15.9min)。
[0017] 取Fr.3dc通过反相色谱(RP-C18，Mitsubishi Chemical Corporation)，洗脱剂为丙酮/水(体积比:30％，50％，70％，90％)，各2L。取90％部分为Fr.3dc3。
[0018] Fr.3dc3部分经过Sephadex LH-20(以氯仿/甲醇＝1:1为洗脱剂,50mL)，利用薄层色谱层析合并相似成分，分别得到化合物9和10的混合物。化合物9和10的混合物通过半制备HPLC，色谱条件为：37.5％乙腈等度，流速：2mL/min，检测波长：340nm，制备得到新化合物9(2mg，保留时间：26.7min)和10(2mg，保留时间：28.1min)。
[0019] 垂穗披碱草是广泛分布于青藏高原地区的乡土牧草，植物资源非常丰富。本专利所利用的是该植物的地上部位，生产周期短，对生态环境影响小，而且可以快速制备高纯度黄酮并木脂素类化合物，经济效益显著，对于科学合理开发垂穗披碱草资源具有非常重要的意义。
[0020] 本专利制备所得黄酮并木脂素类化合物工艺简单，纯度较高，并首次分离得到3个新化合物，丰富了该类化合物的结构类型，有助于该类化合物的深入研发。此外，本专利的应用将为青藏高原地区垂穗披碱草的开发和利用提供技术支撑。
具体实施方式
[0021] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
[0022] 实施例1
[0023] 本发明的黄酮并木脂素类混合物的制备方法如下：
[0024] 采集垂穗披碱草地上部分，阴干粉碎，通过100目筛子得细粉。取11.8kg细粉用3倍甲醇溶液，在室温下浸泡3次，依次为3天、3天、7天，减压蒸馏得到粗浸膏约980g。
[0025] 粗浸膏用500mL水溶后用乙酸乙酯以体积比(1:1)依次萃取3次，得到乙酸乙酯相190g。
[0026] 乙酸乙酯部分通过大孔树脂(HP-20，Mitsubishi Chemical Corporation)，洗脱剂为甲醇-水，体积比依次为：30％，50％，80％，甲醇，各9L。其中取80％甲醇部分减压浓缩，阴干得到40g。
[0027] 乙酸乙酯80％部分通过MCI树脂(CHP 20P，75～150μm，Mitsubishi Chemical Corporation)进行分离，用甲醇/水(体积比为30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，甲醇，各3L)梯度洗脱。将不同组分合并得到Fr.1-4四部分，即30％-40％部分为Fr.1，50％-60％部分为Fr.2，70％-90％部分为Fr.3，甲醇冲柱部分为Fr.4。其中Fr.3部分减压浓缩，阴干得到21g。
[0028] 将Fr.3部分21g以石油醚/丙酮(体积比为20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，丙酮，各2L)为洗脱剂硅胶柱(200-300目分析纯硅胶)层析。20:1部分为Fr.3a，10:1部分为Fr.3b，5:1部分为Fr.3c，2:1部分为Fr.3d，1:1和丙酮部分为Fr.3e。其中Fr.3d部分为黄酮并木脂素类化合物的混合物，减压浓缩，阴干得到12g，产率0.10％。
[0029] 实施例2
[0030] 本发明的化合物1和2的制备方法如下：
[0031] 取Fr.3d部分(12g)用20mL甲醇溶液充分振荡洗涤，洗涤液减压浓缩，制得Fr.3dr(2g)，余下部分阴干制得Fr.3dc。
[0032] 取Fr.3dr部分样品(0.3g)，经过Sephadex LH-20(Sephadex LH-20，Amersham Pharmacia Biotech)柱层析，以甲醇为洗脱剂(200mL)，除去化合物苜蓿素(20mg)。剩余部分合并经硅胶柱层析，氯仿/甲醇＝10:1为洗脱剂纯化后，利用甲醇溶解后，通过Waters 1525高效液相色谱仪，色谱溶剂为水和乙腈，色谱条件为：25％乙腈等度，流速：2mL/min，检测波长：340nm，多次重复累积制备得到化合物1(4mg，保留时间：15.9min)和2(2mg，保留时间：17.2min)。
[0033] 利用核磁共振波谱、质谱、红外和紫外等现代光谱技术，确定化合物1的化学式为[0034]
[0035] 确定化合物2的化学式为
[0036]
[0037] 波谱数据如下：
[0038] 化合物1: (c＝0.1,MeOH)；UV(MeOH)λmax 272.3,363.9nm；IR(KBr)νmax cm-1:3421,2924,1653,1567,1513.HRESIMS m/z 501.1152[M+Na]+(calcd for C26H22O9Na,501.1156)；1H NMR(400MHz,Acetone-d6,δin ppm,J in Hz):δH 6.22(1H,d,J＝1.6Hz,H-
6),6.55(1H,d,J＝1.6Hz,H-8),3.69(1H,dd,J＝10.4,4.4Hz,H-11e),3.23(1H,t,J＝
10.0Hz,H-11a),3.55(1H,dd,J＝10.4,4.4Hz,H-12),4.94(1H,s,H-13),6.88(2H,d,J＝
8.4Hz,H-15,19),6.64(2H,d,J＝8.4Hz,H-16,18),7.51(1H,s,H-6′),3.61(3H,s,3′-OCH3),4.00(3H,s,5′-OCH3),13.02(1H,s,5-OH)；13C NMR(125MHz,Acetone-d6,δin ppm):δC
159.9(C-2),112.0(C-3),181.5(C-4),163.2(C-5),99.5(C-6),164.8(C-7),94.7(C-8),
158.1(C-9),105.1(C-10),62.6(C-11),42.1(C-12),36.7(C-13),138.8(C-14),129.2(C-
15,19),115.9(C-16,18),156.6(C-17),118.8(C-1′),128.6(C-2′),147.1(C-3′),148.8(C-4′),144.7(C-5′),103.6(C-6′),60.5(C-3′OMe),56.7(C-5′OMe)。
6),6.55(1H,d,J＝1.6Hz,H-8),3.69(1H,dd,J＝10.4,4.4Hz,H-11e),3.23(1H,t,J＝
10.0Hz,H-11a),3.55(1H,dd,J＝10.4,4.4Hz,H-12),4.94(1H,s,H-13),6.88(2H,d,J＝
8.4Hz,H-15,19),6.64(2H,d,J＝8.4Hz,H-16,18),7.51(1H,s,H-6′),3.61(3H,s,3′-OCH3),4.00(3H,s,5′-OCH3),13.02(1H,s,5-OH)；13C NMR(125MHz,Acetone-d6,δin ppm):δC
159.9(C-2),112.0(C-3),181.5(C-4),163.2(C-5),99.5(C-6),164.8(C-7),94.7(C-8),
158.1(C-9),105.1(C-10),62.6(C-11),42.1(C-12),36.7(C-13),138.8(C-14),129.2(C-
15,19),115.9(C-16,18),156.6(C-17),118.8(C-1′),128.6(C-2′),147.1(C-3′),148.8(C-4′),144.7(C-5′),103.6(C-6′),60.5(C-3′OMe),56.7(C-5′OMe)。
[0039] 化合物2:1H NMR(400MHz,Acetone-d6,δin ppm,J in Hz):δH 6.22(1H,d,J＝1.6Hz,H-6),6.54(1H,d,J＝1.6Hz,H-8),3.69(1H,dd,J＝10.4,4.4Hz,H-11e),3.24(1H,t,J＝10.0Hz,H-11a),3.59(1H,dd,J＝10.4,4.4Hz,H-12),4.95(1H,s,H-13),6.81(1H,d,J＝
1.6Hz,H-15),6.58(1H,d,J＝1.6Hz,H-18),6.64(1H,dd,J＝8.0,1.6Hz,H-19),7.51(1H,s,H-6’),3.14(3H,s,16-OCH3),3.62(3H,s,3′-OCH3),4.00(3H,s,5′-OCH3),13.00(1H,s,5-OH)；13C NMR(125MHz,Acetone-d6,δin ppm):δC 159.9(C-2),111.0(C-3),181.5(C-4),
163.2(C-5),99.5(C-6),164.7(C-7),94.7(C-8),158.1(C-9),105.1(C-10),62.6(C-11),
42.1(C-12),37.1(C-13),136.4(C-14),112.2(C-15),148.2(C-16),145.9(C-17),115.4(C-18),120.5(C-19),118.9(C-1′),128.4(C-2′),147.1(C-3′),148.8(C-4′),144.7(C-
5′),103.6(C-6′),56.2(C-16OMe),60.5(C-3′OMe),56.8(C-5′OMe)。
1.6Hz,H-15),6.58(1H,d,J＝1.6Hz,H-18),6.64(1H,dd,J＝8.0,1.6Hz,H-19),7.51(1H,s,H-6’),3.14(3H,s,16-OCH3),3.62(3H,s,3′-OCH3),4.00(3H,s,5′-OCH3),13.00(1H,s,5-OH)；13C NMR(125MHz,Acetone-d6,δin ppm):δC 159.9(C-2),111.0(C-3),181.5(C-4),
163.2(C-5),99.5(C-6),164.7(C-7),94.7(C-8),158.1(C-9),105.1(C-10),62.6(C-11),
42.1(C-12),37.1(C-13),136.4(C-14),112.2(C-15),148.2(C-16),145.9(C-17),115.4(C-18),120.5(C-19),118.9(C-1′),128.4(C-2′),147.1(C-3′),148.8(C-4′),144.7(C-
5′),103.6(C-6′),56.2(C-16OMe),60.5(C-3′OMe),56.8(C-5′OMe)。
[0040] 实施例3
[0041] 本发明的化合物3-6的制备方法如下：
[0042] 取Fr.3d部分(12g)用20mL甲醇溶液充分振荡洗涤，洗涤液减压浓缩，制得Fr.3dr(2g)，余下不溶部分阴干制得Fr.3dc。
[0043] 取Fr.3dc(10g)通过反相(RP-C18，Mitsubishi Chemical Corporation)，洗脱剂为丙酮/水(体积比:30％，50％，70％，90％)，各2L。30％和50％部分为Fr.3dc1，70％部分为Fr.3bc2，90％部分为Fr.3dc3，丙酮部分为Fr.3dc4。
[0044] Fr.3dc2部分经过硅胶柱层析以氯仿:甲醇，体积比依次为20:1，10:1，5:1，各300mL，梯度洗脱。取氯仿:甲醇(10:1)部分，采用20cm×20cm制备用硅胶板，氯仿/甲醇＝
10:1为洗脱剂，得到两部分，分别利用Sephadex LH-20柱层析(以氯仿/甲醇＝1:1为洗脱剂，100mL)，纯化得到Fr.3dc2-1和Fr.3dc2-2两部分。
10:1为洗脱剂，得到两部分，分别利用Sephadex LH-20柱层析(以氯仿/甲醇＝1:1为洗脱剂，100mL)，纯化得到Fr.3dc2-1和Fr.3dc2-2两部分。
[0045] 取Fr.3dc2-1部分样品(50mg)，用甲醇溶解，通过半制备HPLC，色谱条件为：25％乙腈等度，流速：2mL/min，检测波长：340nm，多次重复累积制备得到化合物4(9mg，保留时间：28.6min)和3(9mg，保留时间：30.4min)。
[0046] 取Fr.3dc2-2部分样品(60mg)，用甲醇溶解，通过半制备HPLC色谱条件为：25％乙腈等度，流速：2mL/min，检测波长：340nm，多次重复累积制备得到化合物5(10mg，保留时间：30.4min)和6(10mg，保留时间：38.8min)。
[0047] 利用核磁共振波谱、质谱、红外和紫外等现代光谱技术，确定化合物3和化合物4的化学式为：
[0048]
[0049] 利用核磁共振波谱、质谱、红外和紫外等现代光谱技术，确定化合物5和化合物6的化学式为：
[0050]
[0051] 波谱数据如下：
[0052] 化合物3:1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δin ppm,J in Hz):δH 7.03(1H,s,H-3),6.19(1H,s,H-6),6.54(1H,s,H-8),7.31(2H,s,H-2′,6′),7.19(2H,d,J＝8.4Hz,H-2″,6″),6.68(2H,d,J＝8.4Hz,H-3″,5″),4.85(1H,brs,H-7″),4.22(1H,m,H-8″),3.64(1H,dd,J＝11.5,4.4Hz,H-9″a),3.23(1H,dd,J＝11.2,4.8Hz,H-9″b),3.86(6H,s,3′,5′-OCH3)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6,δin ppm):δC 163.0(C-2),104.9(C-3),181.8(C-4),161.4(C-5),99.2(C-6),164.2(C-7),94.5(C-8),157.5(C-9),103.7(C-10),125.3(C-1′),104.3(C-2′,6′),
153.0(C-3′,5′),140.0(C-4′),132.4(C-1″),127.9(C-2″,6″),114.4(C-3″,5″),156.3(C-
4″),71.6(C-7″),87.1(C-8″),60.4(C-9″),56.4(C-3′,5′OMe)。
153.0(C-3′,5′),140.0(C-4′),132.4(C-1″),127.9(C-2″,6″),114.4(C-3″,5″),156.3(C-
4″),71.6(C-7″),87.1(C-8″),60.4(C-9″),56.4(C-3′,5′OMe)。
[0053] 化合物4:1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δin ppm,J in Hz):δH 7.02(1H,s,H-3),6.19(1H,d,J＝1.8Hz,H-6),6.54(1H,d,J＝1.8Hz,H-8),7.16(2H,d,J＝8.8Hz,H-2″,6″),6.69(2H,d,J＝8.8Hz,H-3″,5″),4.77(1H,brs,H-7″),4.31(1H,m,H-8″),3.72(1H,m,H-9″a),3.48(1H,m,H-9″b),3.86(6H,s,3′,5′-OCH3)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6,δin ppm):δC 163.1(C-2),104.9(C-3),181.9(C-4),161.5(C-5),99.1(C-6),164.3(C-7),94.5(C-8),157.5(C-9),103.9(C-10),125.4(C-1′),104.3(C-2′,6′),153.1(C-3′,5′),139.4(C-4′),132.6(C-1″),128.0(C-2″,6″),114.5(C-3″,5″),156.3(C-4″),72.0(C-7″),86.5(C-8″),60.2(C-9″),56.4(C-3′,5′OMe)。
[0054] 化合物5:1H NMR(400MHz,Acetone-d6,δin ppm,J in Hz):δH 6.82(1H,s,H-3),6.28(1H,brs,H-6),6.58(1H,brs,H-8),7.42(2H,brs,H-2′,6′),7.07(1H,d,J＝1.4Hz,H-
2″),6.79(1H,d,J＝8.1Hz,H-5″),6.87(1H,dd,J＝8.1,1.4Hz,H-6″),5.05(1H,d,J＝
4.4Hz,H-7″),4.36(1H,m,H-8″),3.91(1H,dd,J＝12.0,5.6Hz,H-9″a),3.54(1H,dd,J＝
12.0,3.2Hz,H-9″b),4.01(6H,s,3′,5′-OCH3),3.84(3H,s,3″-OCH3),12.91(1H,s,5-OH)；
13C NMR(100MHz,Acetone-d6,δin ppm):δC 164.4(C-2),106.0(C-3),183.1(C-4),163.4(C-5),99.9(C-6),165.2(C-7),95.0(C-8),158.9(C-9),105.4(C-10),127.6(C-1’),105.1(C-2′,6′),154.7(C-3′,5′),140.1(C-4′),133.7(C-1″),111.0(C-2″),148.0(C-3″),
146.6(C-4″),115.2(C-5″),120.2(C-6″),73.6(C-7″),88.2(C-8″),61.2(C-9″),57.0(C-
3′,5′OMe),56.3(C-3″OMe)。
2″),6.79(1H,d,J＝8.1Hz,H-5″),6.87(1H,dd,J＝8.1,1.4Hz,H-6″),5.05(1H,d,J＝
4.4Hz,H-7″),4.36(1H,m,H-8″),3.91(1H,dd,J＝12.0,5.6Hz,H-9″a),3.54(1H,dd,J＝
12.0,3.2Hz,H-9″b),4.01(6H,s,3′,5′-OCH3),3.84(3H,s,3″-OCH3),12.91(1H,s,5-OH)；
13C NMR(100MHz,Acetone-d6,δin ppm):δC 164.4(C-2),106.0(C-3),183.1(C-4),163.4(C-5),99.9(C-6),165.2(C-7),95.0(C-8),158.9(C-9),105.4(C-10),127.6(C-1’),105.1(C-2′,6′),154.7(C-3′,5′),140.1(C-4′),133.7(C-1″),111.0(C-2″),148.0(C-3″),
146.6(C-4″),115.2(C-5″),120.2(C-6″),73.6(C-7″),88.2(C-8″),61.2(C-9″),57.0(C-
3′,5′OMe),56.3(C-3″OMe)。
[0055] 化合物6:1H NMR(400MHz,Acetone-d6,δin ppm,J in Hz):δH 6.82(1H,s,H-3),6.28(1H,d,J＝2.0Hz,H-6),6.58(1H,d,J＝2.0Hz,H-8),7.43(2H,brs,H-2′,6′),7.07(1H,d,J＝1.6Hz,H-2″),6.78(1H,d,J＝8.0Hz,H-5″),6.93(1H,dd,J＝8.0,1.6Hz,H-6″),5.04(1H,d,J＝7.2Hz,H-7″),4.18(1H,m,H-8″),3.74(1H,dd,J＝12.0,3.6Hz,H-9″a),3.39(1H,dd,J＝12.0,3.2Hz,H-9″b),4.04(6H,s,3′,5′-OCH3),3.82(3H,s,3″-OCH3),12.91(1H,s,5-OH).13C NMR(100MHz,Acetone-d6,δin ppm):δC 164.6(C-2),106.1(C-3),183.1(C-4),
163.4(C-5),99.9(C-6),165.3(C-7),95.1(C-8),158.9(C-9),105.4(C-10),127.6(C-1’),
105.1(C-2′,6′),154.4(C-3′,5′),140.6(C-4′),133.7(C-1″),111.4(C-2″),148.0(C-
3″),146.9(C-4″),115.2(C-5″),120.7(C-6″),73.9(C-7″),89.8(C-8″),61.8(C-9″),57.0(C-3′,5′OMe),56.2(C-3″OMe)。
163.4(C-5),99.9(C-6),165.3(C-7),95.1(C-8),158.9(C-9),105.4(C-10),127.6(C-1’),
105.1(C-2′,6′),154.4(C-3′,5′),140.6(C-4′),133.7(C-1″),111.4(C-2″),148.0(C-
3″),146.9(C-4″),115.2(C-5″),120.7(C-6″),73.9(C-7″),89.8(C-8″),61.8(C-9″),57.0(C-3′,5′OMe),56.2(C-3″OMe)。
[0056] 实施例4
[0057] 本发明的化合物7-10的制备方法如下：
[0058] 取Fr.3dc3部分样品(60mg)，经过Sephadex LH-20(以氯仿/甲醇＝1:1为洗脱剂,50mL)，利用薄层色谱层析合并相似成分，分别得到化合物7和8、9和10的混合物。
[0059] 化合物7和8的混合物，用甲醇溶解，通过半制备HPLC，色谱条件为：37.5％乙腈等度，流速：2mL/min，检测波长：340nm，经过多次重复累积得到比例为1:2和2:1的7(保留时间：28.3min)和8(保留时间：29.1min)混合物(共12mg)。
[0060] 化合物9和10的混合物，用甲醇溶解，通过半制备HPLC，色谱条件为：37.5％乙腈等度，流速：2mL/min，检测波长：340nm，经过多次重复累积制备得到化合物9(2mg，保留时间：26.7min)和10(2mg，保留时间：28.1min)。
[0061] 利用核磁共振波谱、质谱、红外和紫外等现代光谱技术，确定化合物7和化合物8的化学式为：
[0062]
[0063] 化合物9和化合物10的化学式为：
[0064]
[0065] 波谱数据如下：
[0066] 化合物7:1H NMR(400MHz,Acetone-d6,δin ppm,J in Hz):δH 6.79-6.89(3H,overlapped,H-3,5″,6″),6.28(1H,br s,H-6),6.59(1H,br s,H-8),7.38(2H,brs,H-2′,6′),7.01(1H,d,J＝1.6Hz,H-2″),4.61(1H,d,J＝6.8Hz,H-7″),4.39(1H,m,H-8″),3.57(1H,dd,J＝12.4,2.8Hz,H-9″a),3.28(1H,dd,J＝12.4,4.8Hz,H-9″b),3.99(6H,s,3′,5′-OCH3),3.84(3H,s,3″-OCH3),3.18(3H,s,7″-OCH3),12.92(1H,s,5-OH)；13C NMR(100MHz,Acetone-d6,δin ppm):δC 164.54(C-2),105.8(C-3),183.0(C-4),163.0(C-5),99.8(C-6),
165.2(C-7),95.1(C-8),158.9(C-9),105.4(C-10),126.9(C-1′),105.1(C-2′,6′),154.5(C-3′,5′),141.7(C-4′),131.0(C-1″),111.8(C-2″),148.2(C-3″),147.1(C-4″),115.4(C-5″),121.3(C-6″),84.9(C-7″),87.1(C-8″),62.2(C-9″),56.9(C-3′,5′OMe),56.3(C-
3″OMe),57.0(C-7″OMe)。
165.2(C-7),95.1(C-8),158.9(C-9),105.4(C-10),126.9(C-1′),105.1(C-2′,6′),154.5(C-3′,5′),141.7(C-4′),131.0(C-1″),111.8(C-2″),148.2(C-3″),147.1(C-4″),115.4(C-5″),121.3(C-6″),84.9(C-7″),87.1(C-8″),62.2(C-9″),56.9(C-3′,5′OMe),56.3(C-
3″OMe),57.0(C-7″OMe)。
[0067] 化合物8:1H NMR(400MHz,Acetone-d6,δin ppm,J in Hz):δH 6.77-6.88(3H,overlapped,H-3,5″,6″),6.28(1H,br s,H-6),6.58(1H,br s,H-8),7.34(2H,brs,H-2′,6′),7.01(1H,d,J＝1.6Hz,H-2″),4.59(1H,d,J＝6.0Hz,H-7″),4.34(1H,m,H-8″),3.57(1H,dd,J＝12.8,2.8Hz,H-9″a),3.28(1H,dd,J＝12.8,5.2Hz,H-9″b),3.94(6H,s,3′,5′-OCH3),3.86(3H,s,3″-OCH3),3.26(3H,s,7″-OCH3),12.91(1H,s,5-OH)；13C NMR(100MHz,Acetone-d6,δin ppm):δC 164.3(C-2),105.9(C-3),183.0(C-4),163.0(C-5),99.8(C-6),
165.2(C-7),95.1(C-8),158.8(C-9),105.4(C-10),127.4(C-1′),105.1(C-2′,6′),154.5(C-3′,5′),140.2(C-4′),131.4(C-1″),111.9(C-2″),148.1(C-3″),147.0(C-4″),115.2(C-5″),121.7(C-6″),83.4(C-7”),86.8(C-8”),60.9(C-9″),56.9(C-3′,5′OMe),56.3(C-
3″OMe),57.2(C-7″OMe)。
165.2(C-7),95.1(C-8),158.8(C-9),105.4(C-10),127.4(C-1′),105.1(C-2′,6′),154.5(C-3′,5′),140.2(C-4′),131.4(C-1″),111.9(C-2″),148.1(C-3″),147.0(C-4″),115.2(C-5″),121.7(C-6″),83.4(C-7”),86.8(C-8”),60.9(C-9″),56.9(C-3′,5′OMe),56.3(C-
3″OMe),57.2(C-7″OMe)。
[0068] 化合物9:UV(MeOH)λmax 269.9,340.1nm；HRESIMS m/z 533.1414[M+Na]+(calcd for C27H26O10Na,533.1418).1H NMR(400MHz,Acetone-d6,δin ppm,J in Hz):δH 6.83(1H,s,overlap,H-3),6.28(1H,br s,H-6),6.59(1H,br s,H-8),7.41(2H,brs,H-2′,6′),7.23(2H,d,J＝8.4Hz,H-2″,6″),6.84(2H,d,J＝8.4Hz,H-3″,5″),4.62(1H,d,J＝6.8Hz,H-7″),4.38(1H,m,H-8″),3.86(1H,dd,J＝11.6,4.0Hz,H-9″a),3.58(1H,dd,overlapped,H-9″b),
4.00(6H,s,3′,5′-OCH3),3.16(3H,s,7″-OCH3),12.92(1H,s,5-OH)；13C NMR(100MHz,Acetone-d6,δin ppm):δC 164.6(C-2),106.0(C-3),183.1(C-4),163.3(C-5),99.9(C-6),
165.2(C-7),96.6(C-8),158.9(C-9),105.4(C-10),125.4(C-1′),105.1(C-2′,6′),154.5(C-3′,5′),141.7(C-4′),130.4(C-1″),129.8(C-2″,6″),115.8(C-3″,5″),158.0(C-4″),
84.7(C-7″),87.1(C-8″),62.2(C-9″),56.9(C-3′,5′OMe),57.0(C-7″OMe)。
4.00(6H,s,3′,5′-OCH3),3.16(3H,s,7″-OCH3),12.92(1H,s,5-OH)；13C NMR(100MHz,Acetone-d6,δin ppm):δC 164.6(C-2),106.0(C-3),183.1(C-4),163.3(C-5),99.9(C-6),
165.2(C-7),96.6(C-8),158.9(C-9),105.4(C-10),125.4(C-1′),105.1(C-2′,6′),154.5(C-3′,5′),141.7(C-4′),130.4(C-1″),129.8(C-2″,6″),115.8(C-3″,5″),158.0(C-4″),
84.7(C-7″),87.1(C-8″),62.2(C-9″),56.9(C-3′,5′OMe),57.0(C-7″OMe)。
[0069] 化合物10:UV(MeOH)λmax 269.9,340.1nm；HRESIMS m/z 511.1596[M+H]+(calcd for C26H22O9H，511.1599).1H NMR(400MHz,Acetone-d6,δin ppm,J in Hz):δH 6.77(1H,s,H-3),6.26(1H,br s,H-6),6.55(1H,br s,H-8),7.35(2H,brs,H-2′,6′),7.24(2H,d,J＝8.4Hz,H-2″,6″),6.84(2H,d,J＝8.4Hz,H-3″,5″),4.57(1H,d,J＝6.0Hz,H-7″),4.30(1H,m,H-8″),3.86(1H,dd,J＝12.0,4.0Hz,,H-9″a),3.60(1H,dd,J＝12.0,2.8Hz,H-9″b),3.94
13
(6H,s,3′,5′-OCH3),3.24(3H,s,7″-OCH3),12.90(1H,s,5-OH)；C NMR(100MHz,DMSO-d6,δin ppm):δC 164.6(C-2),104.7(C-3),181.6(C-4),163.3(C-5),99.9(C-6),165.2(C-7),
96.6(C-8),156.8(C-9),103.2(C-10),125.4(C-1′),104.1(C-2′,6′),153.0(C-3′,5′),
139.0(C-4′),128.8(C-1″),128.6(C-2″,6″),114.7(C-3″,5″),157.6(C-4″),82.1(C-7″),
85.2(C-8″),62.2(C-9″),56.3(C-3′,5′OMe),59.8(C-7″OMe)。
13
(6H,s,3′,5′-OCH3),3.24(3H,s,7″-OCH3),12.90(1H,s,5-OH)；C NMR(100MHz,DMSO-d6,δin ppm):δC 164.6(C-2),104.7(C-3),181.6(C-4),163.3(C-5),99.9(C-6),165.2(C-7),
96.6(C-8),156.8(C-9),103.2(C-10),125.4(C-1′),104.1(C-2′,6′),153.0(C-3′,5′),
139.0(C-4′),128.8(C-1″),128.6(C-2″,6″),114.7(C-3″,5″),157.6(C-4″),82.1(C-7″),
85.2(C-8″),62.2(C-9″),56.3(C-3′,5′OMe),59.8(C-7″OMe)。