岷江百合诱导型启动子及其应用

摘要

本发明公开了一种岷江百合诱导型启动子LrP1及其应用，LrP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，本发明通过分子生物学和基因工程相关技术研究证实岷江百合启动子LrP1响应几种植物激素、生物和非生物胁迫；将本发明岷江百合启动子LrP1与β‑葡萄糖苷酸酶基因连接构建成的表达框转入烟草中表达，通过荧光法定量检测转基因烟草的葡萄糖苷酸酶活性，结果表明转基因烟草在赤霉素、乙烯、脱落酸、NaCl、受伤、尖孢镰刀菌、核盘菌、灰葡萄孢处理后葡萄糖苷酸酶活性明显增强；可见岷江百合启动子LrP1受几种激素、生物和非生物胁迫因子的诱导，能用于植物抗逆境基因工程。

权利要求

1.一种诱导型启动子LrP1，来源于岷江百合，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的诱导型启动子LrP1在逆境胁迫下调控外源基因在转基因受体植物中的特异高效表达；

所述在逆境胁迫下是指在赤霉素、乙烯、脱落酸、NaCl、受伤、尖孢镰刀菌、核盘菌或灰葡萄孢胁迫因子存在下。

说明书

岷江百合诱导型启动子及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学以及基因工程相关研究领域，具体涉及一种诱导型启动子LrP1及其应用。

背景技术

[0002] 启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。植物中常见的启动子有组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。组成型启动子(constitutive promoter)是指在该类启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织、部位表达水平没有明显差异。组织特异启动子(tissue-specific promoter)又称器官特异性启动子，分为根特异启动子、茎特异启动子等。在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。利用基因工程的方法将水稻(Oryza sativa)蔗糖合酶基因启动子RSP1和RSP2转入水稻，结果表明RSP1和RSP2都可以驱动β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUS)基因在根、茎、叶及颖壳中高效特异表达，但在胚和胚乳中不表达（李永春，张宪银，薛庆中. 蔗糖合酶基因启动子克隆及其转基因水稻植物中特异性表达. 作物学报, 2002, 28(5):586-590）。

[0003] 诱导型启动子(inducible promoter)是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。诱导型启动子可以在植物受到外界物理或化学胁迫时提高基因的表达量，在去除胁迫后停止对基因的调控。诱导型启动子的这个特性可保证在植物受到外界胁迫时起到保护植物、抵抗外界刺激的效果，并且在适宜的环境中保证植物能量不浪费。在基因工程中，转入植物的外源基因如不加以控制，会在植物体内大量表达，导致蛋白大量积累且浪费能量。在载体上加入诱导型启动子可以在外界刺激时调控目的基因的表达，很好的解决了外源基因无限制表达的问题。

[0004] 诱导型启动子包括非生物诱导型启动子和生物因素诱导型启动子。非生物因素诱导型启动子包括干旱、盐刺激、温度等诱导型启动子；生物因素诱导型启动子即指病虫害诱导的启动子。利用基因组末端随机扩增技术，从斑茅(Erianthus arundinaceus)的PR10基因末端扩增出592bp的启动子，并连接与GUS报告基因转入烟草、水稻和甘蔗中，结果表明斑茅PR10启动子可以很快响应伤害、茉莉酸甲酯和脱落酸的处理（Chakravarthi M, Syamaladevi DP, Harunipriya P, Augustine SM, Subramonian N. A novel PR10 promoter from Erianthus arundinaceus directs high constitutive transgene expression and is enhanced upon wounding in heterologous plant systems. Mol Biol Rep, 2016, 43(1):17-30）。从西部白松（Pinus monticola）中克隆得到PmPR10-1.13的启动子和三个5’缺失端，连接报告基因GUS后转入拟南芥。结果显示GUS最早出现在2-3天幼苗的胚轴和子叶，后在植株的顶端大量表达。但在成年植株中，PmPR10-1.13启动子响应病原体侵染和伤口胁迫，表明PmPR10-1.13启动子响应生物或非生物胁迫（Liu JJ，Ekramoddoullah AK，Piggott N, Zamani A. Molecular cloning of a pathogen/wound-inducible PR10 promoter from Pinus monticola and characterization in transgenic Arabidopsis plants. Planta, 2005, 221(2):159-169）。芦笋(Asparagus officinalis)中克隆得到一个PR10基因(AoPR10)的启动子，将AoPR10启动子连接报告基因GUS转入拟南芥中并给与适当的逆境处理，GUS基因会在受伤、病原体侵染以及H2O2处理部位表达并积累，表明AoPR10启动子受上述生物和非生物胁迫因子的诱导（Mur LA，Sturgess FJ，Farrell GG，Draper J. The AoPR10 promoter and certain endogenous PR10 genes respond to oxidative signals in Arabidopsis. Mol Plant Pathol, 2004, 5(5):435-451）。

发明内容

[0005] 本发明目的是提供一种诱导型启动子LrP1，来源于岷江百合，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

[0006] 本发明另一目的是将该启动子应用在基因工程中，即在逆境胁迫下作为诱导表达启动子调控外源基因在转基因受体植物中的特异高效表达。

[0007] 本发明涉及分离诱导型启动子片段并鉴定其表达活性，本发明从岷江百合中克隆获得诱导型启动子，该启动子全长为1489bp；生物信息学分析表明诱导型启动子中包含一系列不同的顺式作用元件，如组织特异性元件，多种激素(脱落酸、赤霉素、乙烯、水杨酸、茉莉酸甲酯)的响应元件，非生物胁迫(水分、高盐、伤害)响应元件，防卫基因响应病原菌诱导转录的元件等。WRKY转录因子在植物抗病防卫反应中起重要的调控作用，该诱导型启动子序列具有三个WRKY的顺式作用元件w box（C/TTGACC/T）。

[0008] 将本发明分离克隆的诱导型启动子片段置换pBI121载体上的CaMV的35s启动子，由诱导型启动子驱动报告基因GUS的表达框，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将转入模式植物烟草(Nicotiana tabacum)中表达，并通过进一步实验揭示诱导型启动子的表达特性，为后期利用该启动子调控外源基因在转基因植株中的高效特异表达奠定基础。发明人将这个启动子命名为LrP1。

[0009] 将本发明中LrP1启动子驱动GUS的表达框转入烟草中，采用几种植物激素、生物和非生物胁迫处理转基因烟草植株，并进行GUS活性的荧光定量分析，检测结果表明，LrP1启动子响应几种非生物、生物胁迫及几种植物激素的处理，赤霉素、乙烯、脱落酸、NaCl、伤害、尖孢镰刀菌、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)能明显诱导启动子LrP1的活性。

[0010] 上述启动子LrP1可以在基因工程应用于外源基因的诱导表达，具体操作如下：

[0011] (1)采用扩增LrP1的特异引物，从岷江百合幼嫩组织中提取基因组DNA，通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增出LrP1的全长序列，然后将其连接到pGEM-T载体上，经测序获得具有序列正确的克隆；

[0012] (2)用限制性内切酶酶切pGEM-T-LrP1载体，回收启动子片段；同时采用合适的限制性内切酶酶切去除植物表达载体上的组成型表达启动子，通过胶回收得到载体大片段；再将所获得LrP1片段与pCAMBIA2300S载体片段连接，构建植物诱导表达载体；之后将所构建的植物诱导表达载体与目的基因重组，并通过根癌农杆菌介导转入受体植物中，表达转基因的植株在遭受NaCl、伤害胁迫或尖孢镰刀菌、核盘菌、灰葡萄孢侵染时，启动子LrP1驱动的目的基因会诱导并上调表达水平，此外体内体外的赤霉素、乙烯、脱落酸也会诱导目的基因高水平表达。

[0013] 本发明为植物基因工程应用中提供了一个新的诱导表达的启动子。基因工程中植物超表达载体常用来自花椰菜花叶病毒的35S启动子，该启动子为组成型表达启动子，目的基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织、部位表达水平没有明显差异，所以转入植物的外源基因其表达不受控制，导致蛋白大量积累且浪费能量。而诱导型启动子可以在植物受到外界胁迫或化学因素影响时提高基因的表达量，在去除胁迫或化学处理后即下调目的基因的表达，可保证在植物受到逆境胁迫时起到保护植物、抵抗外界刺激的效果，反之在适宜的环境中不浪费植物的能量。基因工程应用中，在载体上加入诱导型启动子可以克服目的基因无限制表达的问题。几种激素(赤霉素、乙烯、脱落酸)、非生物胁迫(NaCl、伤害)、生物胁迫(尖孢镰刀菌、核盘菌、灰葡萄孢)明显诱导本发明中诱导型启动子LrP1的表达活性，因此本发明在抗生物或非生物胁迫的基因工程中具有广阔的应用前景。

附图说明

[0014] 图1是本发明中启动子LrP1 (A图)和pBI-121载体(B图)的胶回收产物检测结果；

[0015] 图2是本发明中pBI121- LrP1-GUS转化大肠杆菌的阳性克隆检测结果，其中阳性对照是以pGEM-T-LrP1质粒为模板的PCR反应，空白对照是以无菌水为模板的PCR反应；

[0016] 图3 是本发明中部分pBI121-LrP1-GUS转基因烟草的PCR筛选结果，其中阳性对照是以质粒pBI121-LrP1-GUS为模板的PCR反应；WT：非转基因烟草(野生型)总DNA为模板进行的PCR；

[0017] 图4是本发明中GUS酶活的标准曲线；

[0018] 图5是本发明中pBI121-LrP1-GUS转基因烟草在赤霉素、乙烯、脱落酸处理后的GUS活性，其中CK为正常生长的pBI121-LrP1-GUS转基因烟草的GUS活性；

[0019] 图6是本发明中pBI121-LrP1-GUS转基因烟草在NaCl、受害处理后的GUS活性，其中CK为正常生长的pBI121-LrP1-GUS转基因烟草的GUS活性；

[0020] 图7是本发明中pBI121-LrP1-GUS转基因烟草在尖孢镰刀菌、灰葡萄孢、核盘菌接种后的GUS活性，其中CK为正常生长的pBI121-LrP1-GUS转基因烟草的GUS活性。

具体实施方式

[0021] 下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。

具体实施方式

[0022] 下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。

[0023] 实施例1：岷江百合诱导型启动子LrP1的克隆以及序列分析

[0024] 以提取的岷江百合根基因组DNA为模板，用扩增启动子LrP1的特异引物(上游引物为：5’TCGAGTTTGGTGTTATTGTTATTAG3’’，下游引物为：5’GATGTGTTTGAGAAGGAGGTGT3’)为上下游引物，通过PCR克隆启动子LrP1的序列。反应体系(20 μL)为岷江百合基因组DNA 0.5 μg、2 μL 10×Advantage 2 PCR Buffer、1.8 μL dNTP Mix (10mM each)、0.2 μL 上游引物(10 μM)、0.2 μL 下游引物(10 μM)、0.2 μL Advantage 2 PCR Polymerase Mix、14.6 μL PCR-Grade 水。PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 2 min，32个循环；72℃ 5 min。PCR结束后，取8 μL进行琼脂糖凝胶电泳，用以检测扩增产物的特异性以及大小。

[0025] 所得到PCR产物只有一条DNA带，因此直接对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒为pGEM-T vector system (Promega)，反应体系和操作过程为：取1.5 μL PCR产物，依次加入1 μL pGEM-T vector (50 ng/μL)和2.5 μL 2×Ligation solutionⅠ，混匀后置于16℃过夜反应。通过热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态中。用含有氨苄青霉素(ampicillin，Amp)的LB固体培养基筛选阳性克隆。挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增LrP1的特异引物检测多克隆位点插入LrP1的克隆。将得到的阳性克隆进行测序，最终获得的启动子LrP1长 1489 bp。采用PLANTCARE对启动子的顺式作用元件进行预测，预测启动子序列中与逆境胁迫相关的顺式作用元件(表1)。启动子中包含一系列不同的顺式作用元件，如组织特异性元件，多种激素(脱落酸、赤霉素、乙烯、水杨酸、茉莉酸甲酯)的响应元件，非生物胁迫(水分、高盐、伤害)响应元件，防卫基因响应病原菌诱导转录的元件等；WRKY转录因子在植物抗病防卫反应中起重要的调控作用，启动子序列具有三个WRKY的顺式作用元件w box（C/TTGACC/T）。

[0026] 表1：启动子序列中的顺式作用元件预测结果

[0027] 。

[0028] 实施例2：LrP1-GUS表达载体构建

[0029] pBI121多克隆位点有HindⅢ和BamHⅠ酶切位点，因此在扩增启动子的特异引物分别添加HindⅢ和BamHⅠ的识别位点。采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工)提取插入LrP1的大肠杆菌质粒pGEM-T-LrP1以及植物表达载体pBI121质粒，取1 μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低。用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ分别对质粒pGEM-T-LrP1和pBI121进行双酶切(100 μL体系)，反应体系和操作过程为：分别取20 μL pGEM-T-LrP1和pBI121质粒、依次加入10 μL 10×H buffer、5 μL BamHⅠ、5 μL HindⅢ、60 μL ddH2O，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应。将所有酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒 (上海生工)对启动子片段和pBI121载体大片段分别进行胶回收，取1 μL回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，结果如图1所示。

[0030] 利用T4 DNA Ligase (TaKaRa)，将回收的启动子DNA片段和pBI121载体片段连接起来，反应体系(20 μL)和操作过程为：取10 μL LrP1 DNA片段依次加入2 μL pBI121载体DNA、2 μL 10×T4 DNA Ligase Buffer、1 μL T4 DNA Ligase、5μL ddH2O，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，用含有50 mg/L卡那霉素(kanamycin，Km)的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增启动子LrP1的特异引物进行PCR，挑选出LrP1与pBI121成功连接的克隆，在得到的阳性菌株中加入甘油并置于-80℃保存备用。

[0031] 采用SanPrep柱式质粒抽提试剂盒提取并纯化上述大肠杆菌DH5α中的pBI121-LrP1-GUS质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pBI121-LrP1-GUS转入所制备的根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中。操作步骤为：取0.2 μg pBI121-LrP1-GUS质粒加入含有200 μL感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5 min，随后转入液氮中冷冻1 min，然后迅速置于37℃水浴5 min，再冰浴2 min，之后加入500 μL LB液体培养基于28℃振荡培养4 h。将活化后的农杆菌涂于含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃倒置培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增LrP1的特异性引物进行PCR反应，检测pBI121-LrP1-GUS是否转入农杆菌中。对于图2中所示的阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。

[0032] 实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选

[0033] 本实验的转基因受体是烟草，将烟草种子用75%的酒精浸泡30 s，无菌水洗涤后用0.1%的HgCl2浸泡8 min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2 MS培养基上，28℃暗培养
5-8 d，发芽后转至光照培养箱(25℃，16h/d光照)，以后每月用MS培养基继代一次。

[0034] 将-80℃冰箱中保存的含有pBI121-LrP1-GUS质粒的农杆菌LBA4404菌液取出，取10 μL菌液接种于1 mL含有20 mg/L利福平和50 mg/L Km的LB液体培养基中，28 ℃ 200 rpm振荡培养至浑浊。吸取500 μL菌液均匀涂布于含有20 mg/L利福平和50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃倒置培养至长出菌苔。用接种环刮取3-5环菌苔接种于40 mL含25 mg/mL乙酰丁香酮的MGL培养基中，28℃ 220 rpm振荡培养直至OD600约为0.6。将无菌烟草组培苗叶片剪成约1 cm2大小的叶盘，浸泡于含有悬浮农杆菌的MGL培养基中，25℃震荡培养15 min。用无菌滤纸将叶盘表面的菌液吸干后转入烟草共培养培养基（MS+0.02 mg/L 6-BA+
2.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂）中，22 ℃暗培养2天。将共培养后的叶盘转接到烟草筛选培养基（MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂+50 mg/L Km+
200 mg/L 头孢霉素）上，培养于光照培养箱(25 ℃，16 h/d光照)。培养约3周，将分化出来的烟草幼苗切下并继代于含有50 mg/L Km和300 mg/L头孢霉素的生根培养基（MS+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂+50 mg/L Km+300 mg/L 头孢霉素）上进行生根培养。

[0035] 采用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的基因组DNA，取1 μL基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度。以转基因植株的基因组DNA为模板用扩增启动子LrP1的特异引物进行PCR反应。PCR结束后，取8 μL产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株。部分转基因烟草植株的扩增结果如图3所示，岷江百合诱导型启动子LrP1转基因烟草共筛选到22株阳性转基因植株。

[0036] 实施例4：转基因烟草的GUS荧光定量检测

[0037] 对转基因烟草根部GUS活性的荧光定量分析参考Jefferson等(Jefferson R. Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep. 1987,5(4): 387–405)的方法，其反应机理是：GUS可与底物4-MUG反应，催化产生4-MU，4-MU在激发波长为365 nm、发射波长为455 nm条件下产生荧光，产生的荧光值可以通过荧光分光光度计进行定量测定。

[0038] 将预先处理好的烟草根置于装有液氮的研钵中研磨成粉末，加入400 μL GUS提取缓冲液，将匀浆转移至1.5 mL离心管中，于4℃、12000 g离心10 min。离心结束后，收集上清于新的离心管中。预先取1 mL的4-MUG溶液(1 mmol/L)于2.0 mL离心管中37℃预热10 min。取50 μL上清液加入至预热的GUS反应缓冲液中，迅速摇匀，并立即取200 μL反应混合液置于1.8 mL的终止缓冲液中(操作时间少于30 s)，作为酶促反应0点样(荧光测定时以此为空白对照)，剩余液体继续37 ℃反应并开始计时。在反应15 min、30 min、45 min时分别取200 μL反应混合液，加入至1.8 mL终止缓冲液中，用于荧光测定。使用荧光分光光度计在激发波长为365 nm，发射波长为455 nm的条件下测定各样品的荧光值。制作4-MU标准曲线：将1 mM 
4-MU母液用反应终止液分别稀释成50 nM、100nM、200 nM，400 nM，500 nM和1000 nM的不同梯度液，在激发波长为365 nm，发射波长为455 nm的条件下测定各梯度液的荧光值，以反应终止液为空白对照，用测得的荧光值和4-MU的浓度绘制标准曲线(如图4所示)。取10 μL上清液，采用改良的考马斯亮蓝法测定样品的蛋白含量。以一分钟催化4-MUG生成1 nmol 4-MU的酶量为一个活力单位，GUS酶活以每mg总蛋白的酶活力计算，即表示为4-MU nmol/min/mg(蛋白)。通过标准曲线，计算出转基因烟草的GUS活性。

[0039] 为了检测岷江百合启动子对植物激素、生物与非生物胁迫的响应，分别用几种植物激素、生物胁迫和非生物胁迫因子处理转基因烟草的根部，并通过上述方法测定处理前后的GUS活性，以正常生长未处理的转基因烟草根部GUS活性作为对照(CK)。如图5，在赤霉素、脱落酸和乙烯处理后，岷江百合启动子LrP1转基因烟草根中的GUS活性明显上调，对启动子活性的诱导程度来看，赤霉素>脱落酸>乙烯。NaCl、受害处理后转基因烟草的GUS活性如图6所示，伤害和NaCl这两种非生物胁迫因子均显著上调启动子LrP1的活性，与NaCl胁迫相比，启动子LrP1对伤害胁迫的响应度更强，受伤处理后，LrP1驱动的GUS活性远高于NaCl胁迫及对照。用三种病原菌尖孢镰刀菌、核盘菌和灰葡萄孢处理转基因烟草的根，也明显诱导了启动子的活性，从诱导程度上来看，灰葡萄孢>尖孢镰刀菌>核盘菌(图7)。上述实验结果表明，岷江百合启动子LrP1响应几种植物激素、非生物胁迫及生物胁迫的处理，赤霉素、脱落酸、乙烯、NaCl、受伤、灰葡萄孢、尖孢镰刀菌、核盘菌能明显上调LrP1驱动的GUS活性。显然，岷江百合启动子LrP1是一种植物激素、生物胁迫和非生物胁迫因子诱导型启动子，可应用于植物抗逆基因工程。