治疗神经变性疾病

摘要

本发明公开了在慢性实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)(多发性硬化(MS)的实验性模型)期间，乳糖神经酰胺(LacCer)在CNS中被上调。LacCer以自分泌方式起作用以触发转录程序，所述转录程序促进CNS浸润单核细胞和小神经胶质细胞的募集和活化以及神经退行性变。另外，在具有CNS MS病变的人患者中检测到B4GALT6和LacCer的表达水平的增加。最终，LacCer合成的抑制在EAE中压制了局部CNS先天免疫和神经退行性变，并且体外干扰人星形胶质细胞的活化。因此，B4GALT6是用于MS和其他神经炎性病症的治疗性靶标。

权利要求

1.LacCer合成的抑制剂在制备用于治疗受试者的进展型多发性硬化MS的药物组合物中的用途，其中LacCer合成的所述抑制剂是B4GALT6的抑制剂或葡糖神经酰胺GlcCer合成的抑制剂。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述进展型多发性硬化MS是原发进展型多发性硬化PPMS或继发进展型多发性硬化SPMS。

3.根据权利要求1-2任一项所述的用途，其中LacCer合成的所述抑制剂是葡糖神经酰胺GlcCer合成的抑制剂。

4.根据权利要求3所述的用途，其中GlcCer合成的所述抑制剂选自由以下组成的组：1-(3',4'-亚乙二氧基)苯基-2-壬酰基氨基-3-吡咯烷-1-丙醇；1-(3',4'-亚乙二氧基)苯基-

2-辛酰基氨基-3-吡咯烷-1-丙醇；D-苏型-(1R,2R)-苯基-2-癸酰基氨基-3-吗啉代-1-丙醇(PDMP)和其类似物，包括D-PDMP；PPMP(DL-苏型-1-苯基-2-棕榈酰基氨基-3-吗啉代-1-丙醇)、D-苏型-EtDO-P4；((1R，2R)-壬酸[2-(2',3'-二氢-苯并[1,4]二噁英-6'-基)-2-羟基-

1-吡咯烷-1-基甲基-乙基]-酰胺-L-酒石酸盐；CCG0203586(1-羟基-3-(吡咯烷-1-基)乙酰胺)；Genz-112638(依利格鲁司特)；Genz-529468；基于脱氧野尻霉素的GlcCer抑制剂；GZ-

161；Genz-682452；EXEL-0346；OGT2378；和Genz-123346。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述基于脱氧野尻霉素的GlcCer抑制剂是N-(5′-金刚烷-1′-基-甲氧基)-戊基-1-脱氧野尻霉素(AMP-DNM)、N-丁基-脱氧野尻霉素(美格鲁特)或在烷基链中具有9至20个碳原子的1,5-双脱氧-1,5-亚氨基-D-葡糖醇的长链N-烷基衍生物。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述N-烷基取代基选自由以下组成的组：壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、顺式-11-十六烯基、十八烷基、顺式-13-十八烯基以及二十烷基。

7.根据权利要求1-2任一项所述的用途，其中LacCer合成的所述抑制剂是选自由以下组成的组的B4GALT6的抑制剂：小分子，靶向B4GALT6的抑制性核酸，或特异性结合B4GALT6且抑制LacCer合成的抑制性抗体。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述靶向B4GALT6的抑制性核酸选自由以下组成的组：反义核酸、siRNA、shRNA和miRNA。

9.根据权利要求1-2任一项所述的用途，其中所述治疗包括施用B4GALT6的抑制剂和GlcCer合成的抑制剂。

10.根据权利要求1-2任一项所述的用途，其包括基于所述受试者患有进展型MS来选择所述受试者。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述进展型MS为PPMS或SPMS。

12.根据权利要求1-2任一项所述的用途，其中所述治疗还包括施用葡糖脑苷脂酶的活化剂。

13.根据权利要求12所述的用途，其中葡糖脑苷脂酶的所述活化剂是鞘脂激活蛋白C或其活性片段；NCGC00182186(5-环丙亚基-7-(二氟甲基)-N-(2-苯基硫苯基)-1H-吡唑并[1,

5-a]嘧啶-3-甲酰胺)；NCGC00182510([2-(叔丁基氨基)-2-氧乙基]2-[2-(4-溴苯胺基)-2-氧代乙氧基]苯甲酸酯)或磷脂酰丝氨酸。

14.根据权利要求1-2任一项所述的用途，其中所述抑制剂为口服、经鼻、静脉内或鞘内施用。

15.根据权利要求1-2任一项所述的用途，其中所述受试者患有SPMS和/或基于他们患有SPMS来进行选择。

说明书

治疗神经变性疾病

[0001] 优先权要求

[0002] 本申请要求2013年12月12日提交的美国临时专利申请序列号 61/963,738和2014年9月12日提交的62/049,813的权益。前述申请的全部内容据此以引用的方式并入。

[0003] 联合发起的研究或开发

[0004] 本发明是根据国立卫生研究院颁发的基金号AI075285和 AI093903在政府支持下作出的。政府享有本发明的某些权利。

技术领域

[0005] 本发明涉及基于检测乳糖神经酰胺(LacCer)的水平来在受试者中诊断或确定发展进展型多发性硬化(MS)(例如，原发进展型多发性硬化(PPMS)或继发进展型多发性硬化(SPMS))的风险的方法，以及基于施用LacCer合成的抑制剂来治疗进展型MS的方法。

背景技术

[0006] 星形胶质细胞是中枢神经系统(CNS)中最丰富的细胞。在正常条件下，星形胶质细胞调节突触活性，并且提供神经元的存活所需的营养和支持1-4。在神经炎症的情形下，星形胶质细胞通过外周促炎性白细胞5-8控制CNS浸润并且调控适应性免疫系统的小神经胶质细胞、少突胶质细胞和细胞的活性9。因此，重要的是表征CNS炎症期间调控星形胶质细胞活化的机制以及用于星形胶质细胞活性的治疗性调节的潜在靶标。

[0007] 多发性硬化(MS)是CNS的慢性脱髓鞘自身免疫疾病。在大多数患者中，MS初始呈现复发-缓解临床病程(复发-缓解型MS，RRMS)，继之以进展型阶段(继发进展型MS，SPMS)，其特征为疾病的连续和不可逆累积，其中可用的治疗显示有限的效力10。最近的发现表明，局部CNS先天免疫反应驱动SPMS中的疾病进展9,11,12。

发明内容

[0008] 如本文所述，在慢性实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)(多发性硬化(MS)的实验性模型)期间，乳糖神经酰胺(LacCer)在CNS中被上调。在星形胶质细胞中由β-1,4-半乳糖基转移酶6(B4GALT6)合成的 LacCer以自分泌方式起作用以触发转录程序，所述转录程序促进CNS 浸润单核细胞和小神经胶质细胞的募集和活化以及神经退行性变。另外，在人患者中在CNS MS病变内检测到B4GALT6表达和LacCer 水平增加。最终，LacCer合成的抑制在EAE中压制了局部CNS先天免疫和神经退行性变，并且体外干扰人星形胶质细胞的活化。因此， B4GALT6是用于MS和其他神经炎性病症的治疗性靶标。

[0009] 因此，在第一方面，本发明提供用于诊断或确定受试者中发展继发进展型多发性硬化(SPMS)的风险的方法。该方法包括：检测来自受试者的样本中的乳糖神经酰胺(LacCer)的水平；将所述样本中 LacCer的水平与LacCer的参考水平进行比较，所述参考水平代表了患有SPMS或处于发展SPMS风险的对照受试者中的LacCer的水平；以及当所述样本中LacCer的所述水平高于所述参考水平时，诊断受试者中的SPMS或者鉴定处于发展SPMS的风险的受试者。在一些实施方案中，该方法包括向已鉴定为患有SPMS或处于发展SPMS的风险的受试者施用例如本领域已知或本文所述的用于MS的治疗。

[0010] 在一些实施方案中，该受试者患有复发缓解型多发性硬化，并且水平表明受试者处于发展SPMS的风险。在一些实施方案中，其中所述受试者具有在1个月、3个月、6个月、9个月、12个月、2年、3 年、4年、或5年内发展SPMS的增加风险。

[0011] 在另一个方面，本发明提供用于通过向受试者施用治疗有效量的 LacCer合成的抑制剂，治疗受试者中的进展型MS，例如原发进展型多发性硬化(PPMS)或继发进展型多发性硬化(SPMS)的方法。还提供了LacCer合成的抑制剂治疗需要其的受试者中的进展型MS，例如原发进展型多发性硬化(PPMS)或继发进展型多发性硬化(SPMS)的用途，或者在制造用于治疗进展型MS，例如原发进展型多发性硬化 (PPMS)或继发进展型多发性硬化(SPMS)的药剂中的用途。

[0012] 在其他方面，本发明提供用于治疗受试者中的进展型多发性硬化 (MS)的方法。该方法包括：检测来自患有或疑似患有进展型MS的受试者的样本中的乳糖神经酰胺(LacCer)的水平；将所述样本中LacCer 的水平与LacCer的参考水平进行比较，所述参考水平为例如代表了患有进展型MS或处于发展进展型MS风险的对照受试者中的LacCer 的水平的参考水平；以及施用治疗，所述治疗包括向具有高于所述参考水平的LacCer的水平的受试者施用治疗有效量的LacCer合成的抑制剂。在一些实施方案中，该方法包括施用例如本领域已知或本文所述的用于MS的另一种治疗，例如用于MS的标准治疗。

[0013] 在又一方面，本发明特征为用于为患有或疑似患有MS，例如进展型MS的受试者选择治疗的方法。该方法包括：检测来自患有或疑似患有进展型MS的受试者的样本中的乳糖神经酰胺(LacCer)的水平；将所述样本中LacCer的水平与LacCer的参考水平进行比较，所述参考水平为例如代表了患有进展型MS或处于发展进展型MS风险的对照受试者中的LacCer的水平的参考水平；以及选择治疗，所述治疗包括向具有高于所述参考水平的LacCer的水平的受试者施用治疗有效量的LacCer合成的抑制剂。在一些实施方案中，该方法包括：向已鉴定为患有SPMS或处于发展SPMS的风险的受试者施用用于 MS的治疗，以及任选地施用例如本领域已知或本文所述的用于MS 的另一种治疗。

[0014] 在一些实施方案中，LacCer合成的抑制剂是葡糖神经酰胺 (GlcCer)合成的抑制剂。在一些实施方案中，GlcCer合成的抑制剂选自由以下组成的组：1-(3',4'-亚乙二氧基)苯基-2-壬酰基氨基-3-吡咯烷 -1-丙醇；1-(3',4'-亚乙二氧基)苯基-2-辛酰基氨基-3-吡咯烷-1-丙醇； D-苏型-(1R,2R)-苯基-2-癸酰基氨基-3-吗啉代-1-丙醇(PDMP)和其类似物，包括D-PDMP；PPMP(DL-苏型-1-苯基-2-棕榈酰基氨基-3-吗啉代-1-丙醇)、D-苏型-EtDO-P4；((1R，2R)-壬酸[2-(2',3'-二氢-苯并[1,4] 二噁英-6'-基)-2-羟基-1-吡咯烷-1-基甲基-乙基]-酰胺-L-酒石酸盐； CCG0203586(1-羟基-3-(吡咯烷-1-基)乙酰胺)；
Genz-112638(依利格鲁司特(eliglustat))；Genz-529468；基于脱氧野尻霉素的GlcCer抑制剂； GZ-161；Genz-682452；EXEL-0346；OGT2378；和Genz-123346。在一些实施方案中，基于脱氧野尻霉素的GlcCer抑制剂是N-(5′-金刚烷-1′-基-甲氧基)-戊基-1-脱氧野尻霉素(AMP-DNM)，N-丁基-脱氧野尻霉素(美格鲁特(miglustat))或在所述烷基链中具有9至约20个碳原子的1,5-双脱氧-1,5-亚氨基-D-葡糖醇的长链N-烷基衍生物。在一些实施方案中，所述N-烷基取代基选自由以下组成的组：壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、顺式-11-十六烯基、十八烷基、顺式-13-十八烯基以及二十烷基。

[0015] 在一些实施方案中，LacCer合成的所述抑制剂是选自由以下组成的组的B4GALT6的抑制剂：小分子，靶向B4GALT6的抑制性核酸，或特异性结合至B4GALT6且抑制LacCer合成的抑制性抗体。

[0016] 在一些实施方案中，所述靶向B4GALT6的抑制性核酸选自由以下组成的组：反义核酸、siRNA、shRNA和miRNA。

[0017] 在一些实施方案中，该方法包括施用B4GALT6的抑制剂和 GlcCer合成的抑制剂。

[0018] 在一些实施方案中，该方法包括基于所述受试者患有进展型MS，例如PPMS或SPMS来选择所述受试者。

[0019] 在一些实施方案中，该方法包括施用葡糖脑苷脂酶的活化剂。在一些实施方案中，葡糖脑苷脂酶的活化剂是鞘脂激活蛋白C(Saposin C)或其活性片段；NCGC00182186(5-环丙亚基-7-(二氟甲基)-N-(2-苯基硫苯基)-1H-吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺)；NCGC00182510([2-(叔丁基氨基)-2-氧代乙基]2-[2-(4-溴苯胺基)-2-氧代乙氧基]苯甲酸酯)或磷脂酰丝氨酸。

[0020] 在一些实施方案中，该方法包括口服、经鼻、静脉内或鞘内施用治疗(例如化合物)。

[0021] 在一些实施方案中，所述受试者患有SPMS和/或基于他们患有 SPMS来进行选择。

[0022] 除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域一般技术人员通常所理解含义相同的含义。本文针对本发明的用途描述了方法和材料；也可使用在本领域中已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实施例仅具有说明性而非意图具有限制性。本文提到的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献以引用方式并入整体并入本文。如有矛盾，以包括定义在内的本说明书为准。

[0023] 根据以下详细说明和附图，并且根据权利要求书，本发明的其他特征和优点将显而易见。

附图说明

[0024] 专利或申请文件包含至少一幅以彩色绘制出的绘图。在提出请求并支付必要费用后，将由政府机关提供具有一张或多张彩色附图的本专利或专利申请公布的副本。

[0025] 图1a-l.B4GALT6活性对照CNS炎症和神经退行性变。(a，b) 野生型(WT)和GFAP-TK转基因(GFAPTK)F1杂交小鼠的EAE得分(平均值和s.e.m.)。右图，线性回归曲线；虚线指示回归线的95％置信区间。如指示(黑色条)，小鼠每日用更昔洛韦(GCV，25mg/kg)或媒介物 (PBS)处理。采用n≥7小鼠/组的3次独立实验的代表性数据。(a)小鼠在EAE诱导之前预处理7天并且连续直至第15天，(b)或者仅在进展型阶段期间(第30至第50天)处理。(c)描绘星形胶质细胞中差异性 mRNA表达谱的热图，所述星形胶质细胞分离自初次用于实验的 NOD小鼠的CNS，或者是在NOD EAE的急性或进展型阶段期间，如通过Nanostring nCounter分析所检测；3次独立实验的代表性数据。 (d)描绘了在EAE的进展型阶段期间特异性上调的独特基因簇的热图。起初，最右3列的大部分是高表达，而中间和最左是低表达。(e) 对在来自初次用于实验的小鼠或EAE NOD小鼠的小神经胶质细胞或星形胶质细胞中b4galt6表达的qPCR分析；将表达标准化为gapdh 并且相对于来自初次用于实验的小鼠的细胞的表达来呈现。3次独立实验的代表性数据，通过学生t检验来进行统计学分析。(f)相对于净组织重量，对初次用于实验的小鼠或EAE NOD小鼠的CNS中的乳糖神经酰胺(LacCer)进行定量。每个条件采用n≥15个样本的3次独立实验的代表性数据，通过学生t检验进行统计学分析。(g，h)如箭头或条指示，施用LacCer(每只小鼠10μg)或媒介物之后，C57BL/6(g) 和NOD(h)小鼠中的EAE临床得分。采用n≥8小鼠/组的2次独立实验的代表性数据。统计学分析与(a)相同。
(g)在EAE诱导期间LacCer 或媒介物与MOG35-55肽一起施用于C57BL/6小鼠，以及此后每隔3 天腹膜内(i.p.)施用之后的EAE得分(平均值和s.e.m.)。(h)在EAE诱导后第35天(进展型阶段)开始的LacCer或媒介物施用之后的EAE得分。(i)PDMP抑制由B4GALT6合成LacCer。(j)用PDMP或媒介物处理的初次用于实验的或EAE NOD小鼠的CNS中的LacCer水平的定量，如(k)所示。(k)用PDMP或媒介物处理的NOD小鼠中EAE的临床得分，所述小鼠从EAE诱导(进展型阶段)之后第40天起每天施用 (20mg/kg，每天两次腹膜内给药)持续整个实验时间，用n≥8小鼠/组的3次独立实验的代表性数据)。(l)对来自EAE NOD小鼠的腰脊髓部分的组织病理学分析，所述小鼠如(k)所述用PDMP或媒介物处理并且用劳克坚牢蓝(Luxol fast blue)或比尔肖夫斯基银染色法(Bielschowsky’s silver stain)来染色以用于分别分析脱髓鞘或轴突损失。用n≥6小鼠/组的2次独立实验的代表性数据(平均值和s.e.m.)。 *P<0.05、**P<
0.01、***P<0.001，n.s.不显著。

[0026] 图2a-e.B4GALT6抑制在EAE期间压制星形胶质细胞活化。(a) 描绘在分离自初次用于实验的小鼠或用PDMP或媒介物(媒介物)处理 EAE NOD小鼠的星形胶质细胞中的mRNA表达的热图，如通过 Nanostring nCounter分析检测。上图为各基因簇中标准化基因表达的示意图。3次独立实验的代表性数据，通过学生t检验来进行统计学分析。在左图的开始时，左列大部分高表达，中央列低表达，而右列则混合；在右图的开始时，左列大部分低表达，中央列大部分高表达，而右列则混合。(b)对分离自初次用于实验的小鼠和用媒介物或PDMP 处理的EAE NOD小鼠的星形胶质细胞中的ccl2、ccl5、cxcl10、il1b、 nos2、opn、H2-Aa、vim和tlr2的qPCR分析；表达相对于gapdh来呈现。3次独立实验的代表性数据，通过学生t检验来进行统计学分析。(c)在分离自用媒介物或PDMP处理的EAE NOD小鼠的星形胶质细胞中，与髓鞘化的对照相关的相对表达(相对于NOD初次用于实验的组)(表2)。3次独立实验的代表性数据。通过学生t检验的统计学分析。(d，e)如(b)中那样执行的Irf1(d)和Relb(e)表达的qPCR分析。所有数据提供为平均值和s.e.m*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 并且n.s.不显著。

[0027] 图3a-m.由B4GALT6生成的LacCer以自分泌方式起作用以促进星形胶质细胞活化。培养的星形胶质细胞用PDMP(25μM)、LacCer (10μM)、两者(LacCer+PDMP)、或媒介物(媒介物)预处理1h，随后用脂多糖(100ng/ml)和干扰素γ(100单位/ml)(LPS/IFNγ)活化或者保持未处理(对照)。(a)描绘用LPS/IFNγ刺激的星形胶质细胞中mRNA 表达的热图，通过Nanostring nCounter分析检测。3次独立实验的代表性数据。(b)(a)中提供的标准化基因表达的示意图，通过单向 ANOVA随后Tukey post-hoc分析来进行统计学分析。(c-f)使用经检验shRNA，敲低C8-D30星形胶质细胞中B4galt5(shB4galt5)、B4galt6 (shB4galt6)或非靶向shRNA(ShControl)的表达(n≥4)。(c)B4galt5和 B4galt6mRNA表达的qRT分析。(d-f)如(a)中那样激活星形胶质细胞，并且确定(d)H2-Aa、(e)Ccl5和(f)Cxcl10的mRNA表达；相对于管家基因(Gapdh)(n≥4)来呈现表达。(g)星形胶质细胞特异性shRNA慢病毒载体的示意图。(h-j)星形胶质细胞特异性shB4galt6慢病毒的脑室内注射使疾病严重程度改善。在EAE诱导之后第35天(进展型阶段)用1×107IU的shControl、shB4galt5或shB4galt6慢病毒脑室内注射NOD小鼠。在脑室内注射实验之后10天处死n＝10的每组小鼠(h， i)，并且(h)通过在分离自初次用于实验的小鼠或EAE NOD小鼠的星形胶质细胞中的qPCR来测定b4galt5和b4galt6表达水平；表达标准化至gapdh并且相对于初次用于实验的小鼠的细胞的表达来呈现。2 次独立实验的代表性数据，通过单向ANOVA、随后Tukey post-hoc 分析进行统计学分析。(i)在如(j)中所示初次用于实验的小鼠或经处理的EAE NOD小鼠的CNS中定量LacCer水平。通过单向ANOVA、随后Tukey post-hoc分析来进行统计学分析。(j)EAE临床得分。2次独立实验的代表性数据。统计学分析与(图1a)相同。(k)培养的原代星形胶质细胞用PDMP(25μM)、LacCer(10μM)、两者(LacCer+PDMP)、或媒介物对照(媒介物)预处理1h，随后用LPS/IFNγ活化45min，或保持未处理(对照，Con)。核部分中的IRF1和核纤层蛋白B表达通过 western印迹分析，并且在对4次独立实验进行密度定量之后通过 IRF1与Lamin-B的在核部分中表达之间的比率来评估IRF1向细胞核的转运程度。通过单向ANOVA、随后Tukey post-hoc分析来进行统计学分析。(l)原代培养星形胶质细胞中NF-κB和IRF1与nos2启动子的相互作用的ChIP分析。试验设计和数据分析与(图4c)中相同。2 次独立实验的数据，(m)：在由WT或IRF1缺陷(IRF1KO)小鼠建立的星形胶质细胞培养物中nos2、csf2、ccl2、ccl5、il6和tlr2的表达的qPCR分析，所述小鼠用LacCer或媒介物预处理，并且用LPS/IFNγ活化。响应于5次独立实验的LPS/IFNγ-活化细胞中的LacCer处理的平均基因诱导。通过学生t检验的统计学分析。所有数据提供为平均值和s.e.m*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01并且n.s.不显著。

[0028] 图4a-m.B4GALT6在星形胶质细胞中调控ccl2转录活性。(a)鼠 ccl2启动子。(b)293T细胞中的荧光素酶活性，所述293T细胞用ccl2 荧光素酶报道基因和编码IRF1、p65或空白对照载体(空白)的以下构建体之一转染。结果是相对于分泌的碱性磷酸酶活性，提供为比空白载体的减小倍数。3次独立实验的数据，通过学生t检验来进行统计学分析。(c)在原代培养星形胶质细胞中NF-κB和IRF1与ccl2启动子的相互作用的ChIP分析，所述原代培养星形胶质细胞在LPS/IFNγ诱导之后2小时用PDMP和LacCer预处理并且用LPS/IFNγ活化(如图3)。(d-h)炎性单核细胞(定义为CD11b+Ly6C高或CD11b+CD45高细胞)向用PDMP或媒介物处理的EAE NOD小鼠的CNS募集，如(图 1k)，通过流式细胞仪分析，并且呈现为细胞频率(e，g)和总细胞数量 (f，h)。3次独立实验的代表性数据。通过学生t检验的统计学分析。 (i)如(图3j)中那样脑室内注射星形胶质细胞特异性shRNA慢病毒之后10天，在CNS中测定的CD11b+Ly6C高单核细胞的频率和数目。2 次独立实验的代表性数据。通过单向ANOVA、随后Tukey post-hoc 分析来进行统计学分析。(j)单核细胞用PDMP、LacCer、两者 (LacCer+PDMP)、或媒介物预处理1h，并且使用transwell室系统测量单核细胞趋化性。将CCL2或PBS添加至下部隔室，并且3h后，测定细胞活力(j,k)和迁移单核细胞的数量(l)以及细胞活力。
迁移数据提供为与对照相比的倍数，并且细胞活力提供为与对照相比的百分比。操作浓度标记为红色。4次独立实验的代表性数据。(m)CD11b+ Ly6C高单核细胞用PDMP、LacCer或媒介物处理，随后用LPS/IFNγ活化6h或未处理(对照)，如(图3a)。通过nCounter Nanostring分析测定mRNA表达。通过2次ANOVA进行的统计学分析表明LacCer或 PDMP处理对单核细胞迁移无显著性作用。对于所有数据，数据提供为平均值和s.e.m。*P<0.05，**P<0.01，***P<
0.001并且n.s.不显著。

[0029] 图5a-m.星形胶质细胞中的B4GALT6调控小神经胶质细胞和 CNS浸润单核细胞的活化。(a)描绘在来自初次用于实验的小鼠或用 PDMP或媒介物处理的EAE NOD小鼠的小神经胶质细胞中的mRNA 表达的热图，如通过nCounter Nanostring分析测定。3次独立实验的代表性数据。通过学生t检验的统计学分析。(b)相对于Gapdh的ccl5、 il1b、opn、nos2、cd40和H2-Aa基因表达的qPCR分析。(c，d)与小神经胶质细胞中(表3)(c)和Ly6C高单核细胞(d)中的M1或M2表现型相关的基因的平均标准化表达。通过学生t检验的统计学分析。(e-h) 原代小神经胶质细胞用PDMP、LacCer、或媒介物预处理，随后用 LPS/IFNγ活化6h或者保持未处理(对照)，如(图3a)。通过nCounter Nanostring分析测定mRNA表达(e，g)，并且测定小神经胶质细胞活力(f，h)。5次独立实验的代表性数据。(i)混合神经胶质培养物用温和的胰蛋白酶/EDTA(T/E)处理以除去星形胶质细胞单层的留下仅小神经胶质细胞附接至板，或者保持未处理。培养物用PDMP、LacCer 或媒介物预处理，并且用LPS/IFNγ活化6h。活化之后，洗涤两种培养物，并且与温和的T/E孵育以除去星形胶质细胞；因此，留下仅小神经胶质细胞(MG)附接至板。在不存在[MG(纯)]或存在[MG(混合)] 星形胶质细胞的情况下从被处理小神经胶质细胞中收获RNA，并且针对相对于gapdh的表达ccl2、ccl5和nos2通过qPCR分析基因表达。数据呈现出在5次独立实验中，PDMP(左图)或LacCer(右图)预处理对LPS/IFNγ触发的基因诱导的相对效果。通过学生t检验的统计学分析。(j)混合神经胶质用所指示的阻断抗体或适当的同种型对照 (25μg/ml)和LacCer(10μM)或媒介物对照预处理，并随后用LPS/IFNγ活化6h。将小神经胶质细胞与(i)相同分离，并且小神经胶质细胞nos2 表达相对于gapdh通过qRT来测定并且与(i)相同地呈现。3次独立实验的代表性数据。(k)在原代培养星形胶质细胞中NF-κB和IRF1与 csf2启动子的相互作用的ChIP分析。(l,m)如(图3j)那样脑室内注射星形胶质细胞特异性shRNA慢病毒之后10天，从慢性EAE NOD小鼠的CNS分离的星形胶质细胞(l)中csf2和小神经胶质细胞(m)中nos2 的表达。来自2次独立实验的数据。针对所有数据，示出平均值和 s.e.m.。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001并且n.s.不显著。

[0030] 图6a-d.在MS病变中B4GALT5和B4GALT6和LacCer水平被上调。尸检样本是得自MS、非MS CNS炎性疾病(NMSCID,包括病毒性脑炎、Rasmussen脑炎和ADEM，n＝5)患者的病变(n＝10)或 NAWM(n＝5)和健康对照(n＝6)。(a)CNS样本中相对于ACTB的 B4GALT5和B4GALT6mRNA表达的qPCR分析。(b)在MS患者的 NAWM和病变中，GFAP+星形胶质细胞内的B4GALT6、CCL2和 iNOS的IF分析。(c)相对于蛋白质含量，CNS样本中测定的LacCer 水平。通过单向ANOVA、随后Tukey post-hoc分析来进行统计学分析。(d)原代人星形胶质细胞用PDMP(25μM)或媒介物预处理，并且用IL-1β(10ng/ml)或Poly(I:C)(10μg/ml)活化或保持未处理(对照)。 RNA在6h后收获，并且CCL2、CCL5、COX2、IL6、NOS2和TLR2 的表达通过qPCR相对于3次独立实验中的ACTB来分析。通过学生 t检验的统计学分析。所呈现数据是平均值和s.e.m.。*P<0.05，**P<0.01 并且***P<0.001.

[0031] 图7a-b.美格鲁特在SPMS中的治疗潜力。A.B4GALT6/LacCer 在CNS炎症中的作用。B.用美格鲁特通过PDMP或GlcCer抑制来进行B4GALT6抑制对用LPS和IFNγ(LPS/IFNγ)活化的原代小鼠星形胶质细胞的作用。

[0032] 图8a-c.F1杂交小鼠发展了慢性进展型EAE。(a)NOD C57BL/6 F1杂交小鼠EAE的临床得分提供为平均值和s.e.m。右图，线性回归曲线；虚线指示回归线的95％置信区间。数据代表7次独立实验(平均值和s.e.m.)(n≥15小鼠/组)。(b，c)组织病理学分析。在实验结束时获得EAE诱导的F1小鼠的腰脊髓部分，并且针对轴突密度用(b) 比尔肖夫斯基银染色法(Bielschowsky’s silver stain)染色或者针对髓磷脂含量用(c)劳克坚牢蓝染色。数据代表3次独立实验。

[0033] 图9a-d.反应性星形胶质细胞的损耗减少了外周白细胞向CNS 的募集。(a-d).在WT或GFAPTK F1杂交小鼠中诱导EAE并且如图 1b施用更昔洛韦(GCV)或媒介物对照(PBS)。数据代表3次独立实验，其中n≥7只小鼠/组(平均值和s.e.m.)。(a)GCV施用对由GFAP染色检测的反应性星形胶质细胞的作用。(b)通过FACS评估单核细胞(红门)和淋巴细胞(绿门)向CNS的募集。数据代表3次独立实验。通过学生t检验的统计学分析。(c，d)在EAE的慢性阶段期间反应性星形胶质细胞的损耗对于对MOG35-55或抗CD3(c)作出的回忆增生性响应和脾CD4+T细胞(d)内IFN-γ、IL-17A、Foxp3和IL-10的表达的作用。*P<0.05，并且(n.s)不显著。

[0034] 图10a-g.从CNS中分离成年星形胶质细胞。(a-c)从成年小鼠中分离星形胶质细胞。(a)排除死细胞。(b)基于CD11b+染色(小神经胶质细胞和单核细胞，蓝门)或CD45+CD11bneg(淋巴细胞，绿门)，排除免疫细胞。(c)使用清除通道(dump channel)(如在材料和方法中详细描述)，从“非免疫”细胞级分(b,红门)中除去污染的免疫细胞和少突胶质细胞。阴性级分(c，红门)指定为星形胶质细胞富集级分并且被用于细胞内染色(d)或mRNA分析(e-f)。还获取来自GFAP-GFP FVB小鼠的全体细胞、小神经胶质细胞/单核细胞和淋巴细胞级分、以及GFP+星形胶质细胞以用于mRNA分析。(d)星形胶质细胞富集级分中的 GFAP表达(黑色–GFAP染色，灰色–同种型对照)。(e-f)富集星形胶质细胞、小神经胶质细胞/单核细胞、淋巴细胞和脑级分中纯度的qPCR 分析。(e)星形胶质细胞标记物gfap、aldh1l1和aqp4的表达。(f)免疫细胞标记物的表达∶小神经胶质细胞/单核细胞细胞(Cd11b， F4/80)、树状细胞(Cd11c)、NK细胞(Klrb1c)、T细胞(Cd3)、B细胞 (Cd19)。(g)少突胶质细胞(mog，mbp)和神经元(Syt1，Snap25)标记物的表达。数据代表3次独立实验(平均值和s.e.m.)(n≥5只小鼠/组)。

[0035] 图11a-d.在慢性NOD EAE期间，LacCer合酶表达在星形胶质细胞中被上调。(a)对白质、灰质和血管周围神经胶质界膜中GFAP+ 星形胶质细胞内B4GALT6表达的免疫染色(CD31用作内皮细胞的标记物)。(b)巢蛋白+神经祖细胞中B4GALT6表达的免疫染色。对分离自初次用于实验的NOD小鼠的CNS的(c)星形胶质细胞或(d)小神经胶质细胞中、或在EAE的慢性阶段期间对B4galt5 mRNA表达进行 qRT分析；表达相对于管家基因(Gapdh)来呈现。数据代表4次独立实验。所呈现数据是平均值和s.e.m.。通过学生t检验执行统计学分析，*P<0.05，并且(n.s)无显著性。

[0036] 图12a-i.B4GALT6和LacCer在EAE期间未影响周围T细胞响应。(a)初次用于实验的C57BL/6(左图))和NOD(右图)小鼠用LacCer (10μg/小鼠)或媒介物处理，如红色箭头指示，并且记录EAE临床得分。在实验结束时(第25天)，分离星形胶质细胞，并且它们的转录谱通过nCounter Nanostring分析测定。(b-e)EAE是在C57BL/6(b， c)或NOD小鼠(d，e)中诱导并且LacCer或媒介物分别如图1g和图 1h那样施用。对MOG35–55(20μg/ml)的脾T细胞回忆响应；IL-17A、 IFN-γ和IL-10细胞因子(c，e)的增殖(b，d)和分泌。数据代表2次独立实验，其中n≥8只小鼠/组(平均值和s.e.m.)。(f-i)在慢性阶段期间如图1K用PDMP或媒介物处理EAE NOD小鼠。数据代表3次独立实验，并且n≥8只小鼠/组(平均值和s.e.m.)。(f)对分离自CNS的 CD3+CD4+T细胞的tbx21、ifng、rorc、il17A、csf2、il10、foxp3、和 tgfb1mRNA的表达进行qPCR分析；表达相对于gapdh来呈现。(g， h)对MOG(35–55)(20μg/ml)的回忆响应；IL-17A、IFN-γ和IL-10细胞因子(h)的增殖(g)和分泌。(i)通过脾CD3+CD4+T细胞表达IFN-γ、 IL-
17A、Foxp3和IL-10(平均值和s.e.m.)。

[0037] 图13.CCL-2和iNOS由B4GALT6+GFAP+星形胶质细胞共表达。免疫染色研究鉴定了在慢性EAE期间B4GALT6+GFAP+星形胶质细胞中、而非初次用于实验的脊髓部分中的CCL-2或iNOS的表达。 2次独立实验的代表性数据，使用6只动物/组。

[0038] 图14a-g.B4GALT6直接控制星形胶质细胞活化。(a)培养的星形胶质细胞用PDMP(25μM)、LacCer(10μM)、两者(LacCer+PDMP)、或媒介物对照(媒介物)预处理，随后用LPS/IFNγ活化6h，或者保持未处理(对照，Con)。活化之后6h，分析mRNA表达。ccl5、csf2、 nos2、il6、H2-Aa和tlr2的表达的qPCR分析相对于gapdh来呈现。通过单向ANOVA、随后Tukey post-hoc分析来进行统计学分析。(b,c) 培养的星形胶质细胞用指示浓度下的LacCer(b)或PDMP(c)预处理 1h，随后用LPS/IFNγ活化，或者保持未处理(对照，Con)。在活化之后6h测定细胞活力。单向ANOVA的统计学分析表明无显著细胞死亡。操作浓度(如a中)标记为红色。(d)使用经检验的shRNA敲低原代星形胶质细胞中B4galt6(shB4galt6)或非靶向shRNA(ShControl)的表达。星形胶质细胞随后用PDMP、或媒介物对照(媒介物)预处理1h，随后用LPS/IFNγ活化6h，或保持未处理(对照，Con)。测定H2-Aa、 Ccl5和Cxcl10的mRNA表达；将表达呈现为相对于管家基因(Gapdh) 的降低倍数。通过单向ANOVA、随后Tukey post-hoc分析(n≥3)来进行统计学分析。(e)来自Mock感染或慢病毒感染小鼠的免疫染色分析鉴定仅在GFAP+星形胶质细胞中的GFP+表达。2次独立实验的代表性数据，使用至少6只动物/组。(f)通过western印迹分析细胞质和核部分中的NF-κB(P65)、GAPDH和核纤层蛋白B表达。NF-κB向细胞核转运的程度是通过在4次独立实验(右图)中进行密度定量之后在核和细胞质级分中P65表达之间的比率来评估。通过单向ANOVA、随后Tukey post-hoc分析来进行统计学分析。数据来自5次独立实验(平均值和s.e.m.)，*P<0.05，并且**P<0.01。(g)在慢性EAE期间通过 IF来测定的IRF1+GFAP+星形胶质细胞中CCL-2或iNOS的表达。2 次独立实验的代表性数据，使用6只动物/组。

[0039] 图15a-b.LacCer未影响原代柔脑膜噬菌细胞和脉络丛细胞的转录响应。柔脑膜噬菌细胞(a)和脉络丛细胞(b)用LacCer(10μM)、或媒介物对照(媒介物)预处理1h，随后用LPS/IFNγ活化6h，或保持未治疗(对照，Con)。通过nCounter Nanostring分析测定mRNA表达。2 次独立实验的代表性数据。

[0040] 图16.美格鲁特处理使慢性EAE进展停止。用MOG35-55使NOD 小鼠免疫。在NOD EAE的慢性/进展型阶段开始时以及此后，每天用美格鲁特或媒介物对照处理小鼠。

[0041] 图17.美格鲁特处理减少了单核细胞向CNS的募集。

[0042] 图18.美格鲁特处理未影响T细胞极化。

[0043] 图19.美格鲁特处理未影响体重。

具体实施方式

[0044] 星形胶质细胞在CNS发育和功能中起到多种作用1-4。取决于诸多因素，诸如研究下的星形胶质细胞的活化状态、类型和位置，涉及的活化刺激，以及免疫反应的持续时间，在CNS炎症期间，有益和有害的作用被分配给星形胶质细胞3,32-36。的确，星形胶质细胞异质性最近刚刚被识别为影响星形胶质细胞对活化响应的显著因素37,38。 GFAP高反应性星形胶质细胞调节白细胞浸润7,8，并且响应于CNS损伤和急性EAE而调控炎性响应5-9，但它们在慢性CNS炎症期间的调控和功能还缺乏理解。

[0045] 如本文所述，在NOD EAE的慢性阶段期间星形胶质细胞中 B4GALT6的上调增加生物活性脂质LacCer的CNS水平，所述 B4GALT6以自分泌方式起作用以促进CNS炎症并且促进神经退行性变。B4GALT5和B4GALT6是催化LacCer合成的β4半乳糖基转移酶家族的成员17。虽然在慢性EAE和MS期间，两种酶都通过星形胶质细胞特异性上调，但B4GALT6而不是B4GALT5引起CNS LacCer水平增加以及因此引起星形胶质细胞活化和疾病进展。先前研究描述了B4GALT5和B4GALT6的不同生物学作用。例如， B4GALT5而不是B4GALT6是胚胎发育必需的23,24。Tokuda和同事最近证明，B4GALT6缺乏导致在初次用于实验的小鼠的CNS中LacCer 24
合酶活性显著降低；然而，肾中的LacCer合成是通过B4GALT5 控制。综上所述，这些数据表明B4GALT5和B4GALT6LacCer合酶活性的空间和功能区分。

[0046] 小神经胶质细胞和Ly6C高CCR2+炎性单核细胞是CNS中免疫反应的主要组分，并且对神经退行性变具有很大影响9,14,19,21,31。星形胶质细胞通过范围从胶质瘢痕39的形成至趋化因子的分泌的若干机制来调控白细胞向CNS的浸润，所述趋化因子例如为CCL-2，其向CNS 募集炎性单核细胞20,21。如本文证明，B4GALT6/LacCer轴通过NF-κB 和IRF1控制ccl2启动子的反式激活，以及因此通过星形胶质细胞控制CCL-2生产。相应地，LacCer合成的抑制导致星形胶质细胞的 CCL-2生产减少，以及炎性单核细胞向CNS的募集明显减少。还发现B4GALT6控制CCL-5和CXCL-10的产生；因此，这些数据将 B4GALT6/LacCer路径鉴定为向CNS中进行炎性细胞募集的重要调节剂。

[0047] CNS浸润单核细胞和小神经胶质细胞采用与促炎或抗炎活性相关的不同表现型；M1促炎性小神经胶质细胞和单核细胞被认为有助于MS和其他CNS病症的发病机理29,30,40。若干因素影响小神经胶质细胞和单核细胞活化29,30,40。例如，GM-CSF促进M1巨噬细胞的极化并且在EAE期间活化小神经胶质细胞41。如本文所示， B4GALT6/LacCer轴控制由星形胶质细胞产生GM-CSF并且因此控制小神经胶质细胞活化。因此，数据表明除Th17细胞42,43以外，星形胶质细胞也在慢性CNS炎症期间构成GM-CSF的显著来源。共同地，所述数据证明，星形胶质细胞产生的LacCer在慢性CNS炎症期间控制炎性单核细胞和小神经胶质细胞的募集和活化。

[0048] 脂质对微生物感染和自身免疫期间的免疫反应发挥显著作用，因而充当免疫反应的靶标或调节剂44-46。虽然已在MS中鉴定了脂质特异性抗体和T细胞47,48，但CNS自身免疫中生物活性脂质的作用很大程度上未知。Steinman和同事最近报道，髓鞘脂质诱导自身反应T 44
细胞中的细胞凋亡并且改善EAE 。在MS脑样本中检测到这些脂质水平降低，表明它们在CNS特异性T细胞的调控中起作用。考虑到本文示出的LacCer的促炎性效应，似乎CNS中抗炎性和促炎性脂质的平衡的扰乱在MS病理学中起到重要作用。因此，对CNS脂质进行谱分析可用于鉴定患有MS或其他神经变性疾病，并且是用于本文所述治疗性干预的候选者的受试者。

[0049] 重要地，如图1A-B所示，在急性阶段期间反应性星形胶质细胞的损耗导致EAE的显著恶化(图1A)，但进展型阶段期间星形胶质细胞损耗导致EAE的显著改善(图1B)。此外，虽然急性EAE中反应性星形胶质细胞损耗导致募集至CNS的单核细胞和T细胞增加，但如本文所示，在EAE进展型阶段期间的损耗使CNS中白细胞浸润减少 (图9b)，而且未影响周围T细胞响应(图9c,d)。

[0050] 综上所述，这些结果证明，由B4GALT6产生的LacCer控制驱动CNS炎症和神经退行性变的一系列过程并且被认为在进展型MS 中起到重要作用。因此，LacCer合成的调节是用于进展型MS和也用于其中星形胶质细胞活化有助于疾病病理学的其他神经病学病症的治疗性方法。

[0051] 诊断和预测进展型MS发展的方法

[0052] 本文包括用于诊断神经变性疾病、尤其进展型多发性硬化(例如， PPMS或SPMS)以及用于预测其发展的方法。该方法包括：从受试者获得样本，和评估该样本中LacCer的存在和/或水平，和将存在和/ 或水平与一种或多种参考比较，所述参考例如代表LacCer的正常水平，例如未受影响受试者中的水平的对照参考，和/或代表与进展型多发性硬化(例如，PPMS或SPMS)相关的LacCer的水平，例如患有进展型多发性硬化(例如，PPMS或SPMS)的受试者中的水平的疾病参考。高于参考水平的LacCer水平的存在表明该受试者表明该受试者患有进展型多发性硬化(例如，PPMS或SPMS)。

[0053] 在一些实施方案中，如果LacCer的水平与疾病参考中LacCer的水平相当，并且该受试者具有与进展型MS(例如PPMS或SMPS) 相关的一种或多种症状，那么该受试者患有进展型MS，例如PPMS 或SMPS。在一些实施方案中，该受试者不具有进展型MS的明显迹象或症状，例如PPMS或SMPS的明显迹象或症状(例如，具有复发- 缓解MS，但未显示发展进展型MS，例如PPMS或SMPS的迹象)，但LacCer的水平与疾病参考中LacCer的水平相当，那么该受试者很可能发展了进展型MS(例如，PPMS或SMPS)或发展进展型MS (例如，PPMS或SMPS)的风险增加。在一些实施方案中，该样本包括：生物学流体，例如血液、血浆、血清、眼泪、唾液、精液、尿和/或脑脊髓流体；或生物学组织，例如来自CNS病变的活检样本。

[0054] 在一些实施方案中，一旦确定人员患有进展型MS，例如PPMS 或SMPS，或发展进展型MS，例如PPMS或SMPS的风险增加，则可以施用例如本领域已知或本文所述的治疗。

[0055] LacCer的存在和/或水平可以使用本领域已知方法评估，例如，色谱法(例如，液体或薄层色谱法)和/或质谱法，例如，使用LC-MS/MS 分析，例如在三重四极LC/MS/MS系统上执行，MRI光谱学(参见例如Taki等人，J Biochem.1992May；111(5):614-9)，生物测定(例如，通过测量LacCer存在下增殖的肿瘤细胞系的增殖；参见例如Jiang 等人，Glycobiology 16:1045–1051(2006)；Hamamura等人，Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.102(31):11041–11046(2005))；用于检测B4GALT6 活性的酶学测定；和免疫测定，例如，使用抗LacCer抗体的定量免疫测定方法(诸如ELISA或免疫荧光法)。抗LacCer抗体是本领域已知的，例如，小鼠抗乳糖神经酰胺抗体(克隆TrA7；IgM)(Symington 等人，J Biol Chem 259:6008-6012(1984)和Dohi等人，Cancer Res.48:5680-5685(1988))；其他抗体可商购获得，例如来自Funakoshi Corp。

[0056] 合适的参考值可以使用本领域已知的方法来确定，例如使用标准临床试验方法和统计学分析。参考值可以具有任何相关形式。在一些情况下，该参考包括：针对有意义的LacCer水平的预定值，例如代表LacCer的正常水平的对照参考水平，例如在未受影响受试者或患有RRMS但目前未处于发展进展型MS(例如PPMS或SMPS)风险的受试者中的水平；和/或代表与进展型MS(例如PPMS或SMPS) 相关的LacCer的水平的疾病参考，例如，在患有进展型MS(例如PPMS或SMPS)或稍后发展进展型MS(例如PPMS或SMPS)(例如，在1个月、3个月、6个月、9个月、12个月、2年、3年、4年、或5年内)的受试者中的水平。

[0057] 预定水平可以是单个截止(阈)值，诸如中值或平均值，或是这样的一种水平，其界定被确定为统计上不同于其他部分的临床试验群体的上或下四分位数、三分位数、或其他部分的边界。该预定水平可以是截止(或阈)值的范围，诸如置信区间。其可以基于比较组来确定，诸如其中与一个定义组中发展疾病的风险或疾病的存在的关联性比另一个定义组中疾病的风险或存在高或低数倍(例如，大约2倍、4 倍、8倍、16倍或更多)。其可以是一种范围，例如，其中受试者的群体(例如对照受试者)等分为(或非等分为)组，诸如低风险组、中等风险组和高风险组，或分为四分位数，最低四分位数是具有最低风险的受试者，并且最高四分位数是具有最高风险的受试者，或分为n- 分位数(即，n个有规律间隔的区间)，n-分位数的最低者是具有最低风险的受试者并且n-分位数的最高者是具有最高风险的受试者。

[0058] 在一些实施方案中，预定水平是例如在不同时间点(例如较早时间点)处在相同受试者中的水平或发生率。

[0059] 与预定值相关的受试者通常称为参考受试者。例如，在一些实施方案中，对照参考受试者在1个月、3个月、6个月、9个月、12个月、2年、3年、4年、或5年内不患有本文所述病症(例如，进展型 MS，例如PPMS或SMPS)，并且未发展进展型MS，例如，PPMS 或SMPS。在一些情况下，所希望的是该对照受试者患有RRMS，并且在其它情况下，所希望的是对照受试者是健康对照。

[0060] 疾病参考受试者是患有进展型MS，例如PPMS或SMPS(或例如在特定时间周期内如1个月、3个月、6个月、9个月、12个月、2 年、3年、4年、或5年内，发展MS，例如PPMS或SMPS的风险增加)的受试者。风险增加定义为高于一般群体中的受试者风险的风险。

[0061] 因此，在一些情况下，受试者中LacCer的水平大于或等于LacCer 的参考水平指示临床状态(例如，指示本文所述病症，例如SPMS)。在其它情况下，受试者中LacCer的水平小于或等于LacCer的参考水平指示不存在进展型MS，例如PPMS或SMPS，或指示在例如1个月、3个月、6个月、9个月、12个月、2年、3年、4年、或5年内发展进展型MS(例如，PPMS或SMPS)的正常风险。在一些实施方案中，受试者中水平高于参考水平的量足以将受试者与对照受试者区分，并且任选地在统计上显著地大于对照受试者中的水平。在其中受试者中LacCer的水平等于LacCer的参考水平的情况下，“等于”是指近似相等(例如，无统计学差异)。

[0062] 预定参考值可能取决于所选受试者(例如，人受试者)的具体群体。例如，表面健康群体，或患有RRMS而不是进展型MS，例如 PPMS或SMPS的群体(并且其在给定时间周期内，例如在1个月、3 个月、6个月、9个月、12个月、2年、3年、4年、或5年内未发展进展型MS，例如PPMS或SMPS)，与患有或可能发展本文所述病症 (例如在给定时间周期内，例如在1个月、3个月、6个月、9个月、 12个月、2年、3年、4年、或5年内)的受试者的群体相比，将具有 LacCer的水平的不同‘正常’范围。因此，所选预定值可将受试者(例如，人受试者)所属种类(例如性别、年龄、健康、风险、RRMS或其他疾病的存在与否)考虑在内。适当的范围和种类可由本领域普通技术人员仅通过常规的实验来选择。

[0063] 在表征可能性或风险时，可以确定许多预定值。

[0064] 作为LacCer水平的替代，可以评估来自受试者的样本中的AHR、 CCL2、CCL5、CCL7、CXCL10、CXCL3、CXCL9、Marco、NRF2、 Timp1、TLR2、TLR8、TNFa、或VEGF mRNA或蛋白质的水平。高于参考水平的水平表明受试者患有进展型MS，例如PPMS或SPMS 或者处于发展进展型MS，例如PPMS或SPMS的风险。用于测定 mRNA或蛋白水平的许多方法在本领域是已知的。蛋白质的存在和/ 或水平可以使用本领域已知方法来评估，例如使用定量免疫测定法。在一些实施方案中，本领域已知高通量方法，例如蛋白质或基因芯片  (参见例如Ch.12，Genomics，in Griffiths等人编Modern genetic Analysis，1999,W.H.Freeman and Company；Ekins and Chu，Trends in Biotechnology，1999，17:217-218；MacBeath and Schreiber，Science 2000，289(5485):1760-1763；Simpson，Proteins and Proteomics：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press；2002； Hardiman，Microarrays Methods and Applications：Nuts&Bolts，DNA Press，2003)可用于检测蛋白质或mRNA的存在和/或水平。

[0065] 治疗方法

[0066] 本文所述方法包括将LacCer合成的抑制剂，例如B4GALT6和/ 或葡糖神经酰胺(GlcCer)合酶的抑制剂用作活化剂，来治疗神经病症 (即，与星形胶质细胞的功能障碍相关的神经病症)的方法。如图 1A-B所示，在急性阶段期间反应性星形胶质细胞的损耗导致EAE的显著恶化(图1A)，但进展型阶段期间星形胶质细胞损耗导致EAE的显著改善(图1B)。因此，在一些实施方案中，病症是进展型MS，例如SPMS或PPMS，并且不是RRMS。或者，该疾病可能是另一种神经变性疾病，例如帕金森氏病(Parkinson’s Disease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、肌萎缩性侧索硬化、亚历山大病(Alexander disease)、亨廷顿病(Huntington Disease)、或Rett病(Rett’s disease) (参见例如，Maragakis和Rothstein，Nature Clinical Practice Neurology (2006)2，679-689)；或者是脑和脊髓损伤。星形胶质细胞的功能障碍描述于例如：Maragakis和Rothstein，Nature Clinical Practice Neurology (2006)2，679-689。

[0067] 在一些实施方案中，一旦确定人员患有进展型MS，例如PPMS 或SMPS，或者发展进展型MS，例如PPMS或SMPS的风险增加，或者具有升高的LacCer合成水平，则可以施用包括施用治疗有效量的LacCer合成的抑制剂的治疗。这些方法因此可以包括：从受试者获得样本，和评估该样本中LacCer的存在和/或水平，和将所述存在和/或水平与一种或多种参考比较，所述参考例如代表LacCer的正常水平，例如未受影响受试者中的水平的对照参考，和/或代表与进展型多发性硬化(例如，PPMS或SPMS)相关的LacCer的水平，例如患有进展型多发性硬化(例如，PPMS或SPMS的受试者中的水平的疾病参考。高于参考水平的LacCer水平的存在表明该受试者表明该受试者患有进展型多发性硬化(例如，PPMS或SPMS)，并且应该用 LacCer合成的抑制剂来治疗。这些方法还可以用于预测某人是否将受益于用GlcCer合酶的抑制剂的治疗；具有高于参考水平的LacCer 水平的受试者与具有低于参考水平的水平的受试者相比，更可能受益于用LacCer合成的抑制剂的治疗。另外，该方法可以用于选择针对受试者的治疗；针对具有高于参考水平的LacCer水平的受试者选择用LacCer合成的抑制剂的治疗。在一些实施方案中，受试者具有与进展型MS，例如PPMS或SMPS相关的一种或多种症状，和/或受试者已诊断为患有MS，例如进展型MS，例如PPMS或SMPS，或先前诊断为患有RRMS，但疑似已转变为进展型MS。

[0068] 一般而言，该方法包括向需要此类治疗，或经确定为需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的如本文所述的GlcCer合酶的抑制剂。如这种情形中所用，“治疗”意味着使与星形胶质细胞的活化相关的病症的至少一种症状改善。治疗可导致MS的一种或多种症状的减少，所述症状例如抑郁和疲劳，膀胱功能障碍，痉挛状态，疼痛，共济失调和意向性震颤。治疗有效量可以是足以阻止急性发作的开始或缩短急性发作的持续时间，或降低一种或多种症状(例如，热敏感性、核间性眼肌麻痹、视神经炎和莱尔米特症(Lhermitte symptom))的严重度的量。在一些实施方案中，治疗有效量是足以在受试者的脑部、视神经和脊髓中的一者或多者内防止脱髓鞘病变的出现，延迟或防止脱髓鞘病变的生长(即，大小增加)，或促进对脱髓鞘病变的治愈的量，如在MRI上证明。

[0069] 在一些实施方案中，例如其中施用了GlcCer合酶的抑制剂，则病症是MS，例如进展型MS，例如PPMS或SMPS；在一些实施方案中，该病症不是阿尔茨海默氏病(AD)，尼曼匹克病(Niemann-Pick Disease)、帕金森氏病、兰兑-吉兰-巴雷-斯特尔综合症 (Landry-Guillain-Barre-Strohl syndrome)、RRMS、病毒性脑炎、获得性免疫缺陷疾病(AIDS)相关痴呆、肌萎缩性侧索硬化、脑损伤或脊髓病症。在一些实施方案中，例如其中施用了GlcCer合酶的抑制剂，所述方法不包括施用谷胱甘肽供体，诸如S-硝基谷胱甘肽(GSNO)、 L-2-氧代-噻唑烷4-羧酸(丙环司坦(Procysteine))、N-乙酰基半胱氨酸 (NAC)、或N-乙酰基谷胱甘肽来作为活化剂。

[0070] 复发-缓解型和进展型MS

[0071] 多发性硬化(MS)是中枢神经系统(CNS)的炎性脱髓鞘疾病。MS 的通常临床特征为由CNS中病变所导致的复发型或慢性进展型神经病学功能障碍。病理上，所述病变包括影响脑部、视神经和脊髓的多个脱髓鞘区域。潜在病原学不确定，但MS广泛地被认为至少部分地是自身免疫性或免疫介导性疾病。

[0072] 在85％的患者中，MS初始遵循复发-缓解病程(RRMS)，其中针对中枢神经系统(CNS)的急性自身免疫攻击之后为完全恢复 (Compston和Coles，Lancet 372，1502-1517(2008))。大多数RRMS 患者继续发展出继发进展型MS(SPMS)，其特征为神经疾病的进展型、不可逆累积(Rovaris等人，Lancet Neurol 5，343-354(2006))。表征SPMS的进展型和不可逆疾病在不存新炎性病变的情况下发生，表明在MS的这个阶段中可能有其他机制起作用(Rovaris等人，Lancet Neurol 5，343-354(2006))。虽然若干疗法对RRMS显示积极作用，但它们通常在SPMS中无效，并且无标记物可用于监测向SPMS的转变。的确，停止适应性炎性响应的治疗对RRMS的管理起积极作用，但在SPMS中通常无效(Lopez-Diego和Weiner，Nat Rev Drug Discov 7，909-925(2008))。因此，重要的是表征涉及向SPMS转变的过程，鉴定用于进展型MS的新疗法和监测RRMS向SPMS转变的生物标记。

[0073] 继发进展型多发性硬化(SPMS)为多发性硬化的4种国际上认可的形式之一(其它为复发/缓解型多发性硬化、原发进展型多发性硬化以及进展复发性多发性硬化)，其特征在于在有或没有叠加性复发和轻微缓解和平稳状态的情况下，临床神经损害的稳定进展。发展了 SPMS的人一般先前已遭受一段时间的复发/缓解型多发性硬化 (RRMS)，所述时间可能已持续2至40年或更长。偶尔，在SPMS发展之后，受试者将具有一些复发和缓解，但所述复发和缓解往往随时间而变得较不频繁。

[0074] 原发进展型MS(PPMS)相对稀少(MS患者群体中的约15％)，并且特征是从疾病开始后能力的缓慢进展型损失。大多数PPMS患者具有进展型脊髓病或进展型小脑功能障碍。

[0075] MS的诊断以及亚型的确定可以使用本领域已知方法进行，例如，根据在空间和时间上散布开的CNS病变的存在，以及替代性诊断的排除(Problems of experimental trials of therapy in multiple sclerosis： Report  by the panel on the evaluation of experimental trials of therapy in multiple sclerosis.Ann N Y Acad Sci.122：1965；552-568)。或者，基于包括热敏感性、核间性眼肌麻痹、视神经炎以及莱尔米特症的临床迹象的存在来作出诊断(参见例如，McDonald等人，Recommended Diagnostic Criteria for Multiple Sclerosis：Guidelines From the International Panel on the Diagnosis of Multiple Sclerosis.Ann.Neurol.2001；50:121；和Polman等人，Diagnostic Criteria for Multiple Sclerosis：2005Revisions to the“McDonald Criteria.”Ann Neurol 2005；58:840-846)。

[0076] 对MS中疾病定量的方法包括：库兹克扩展疾病状态度量表(the Kurtzke Expanded Disability Status Scale；EDSS)；MRI扫描；临时神经症状测度量表(The Scripps Neurologic Rating Scale；SNRS)；Krupp 疲劳严重程度量表(The Krupp Fatigue Severity Scale，FSS)；无能力状态度量表(The Incapacity Status Scale；ISS)；功能无关度量(The Functional Independence Measure；FIM)；步行指数(The Ambulation Index；AI)；剑桥多发性硬化基本得分(The Cambridge Multiple Sclerosis Basic Score；CAMBS)；多发性硬化功能评估(The Functional Assessment of Multiple Sclerosis；FAMS)；情绪状态量表(Profile of Mood States；POMS)；以及疾病影响量表(the Sickness Impact Profile； SIP)。

[0077] 关于诊断和治疗MS以及进展型MS(例如，PPMS或SMPS) 的其他信息在本领域中已发现，例如见于：Hurwitz等人，Ann Indian Acad Neurol.2009年10月-12月；12(4)：226–230；和Spinal Cord Medicine，Principles and Practice，Lin等人，Eds.，(Demos Medical Publishing，Inc.，2003)，例如，第32章第V节，“Multiple Sclerosis”。

[0078] 靶向LacCer合成∶B4GALT6和GlcCer合成

[0079] 本文所述方法包括用于使用LacCer合成的抑制剂，例如 B4GALT6和/或葡糖神经酰胺(GlcCer)合酶的抑制剂、或葡糖脑苷脂酶的活化剂来治疗进展型多发性硬化(例如，PPMS或SPMS)的方法。该方法包括：鉴定患有进展型多发性硬化(例如，PPMS或SPMS)的受试者，和向患有进展型多发性硬化(例如，PPMS或SPMS)的受试者施用治疗有效量的LacCer合成的特异性抑制剂，例如，包含 B4GALT6和/或GlcCer合成的特异性抑制剂的治疗性组合物。

[0080] GlcCer合酶的小分子抑制剂

[0081] GlcCer合酶的抑制剂包括小分子，所述小分子的大部分是结合至酶活性位点并且阻止底物结合的酶底物类似物。这些抑制剂包括神经酰胺类似物(参见例如美国专利号6,569,889；6,255,336；5,916,911； 5,302,609；Lee等人，J.Biol.Chem.274(21):14662(1999)；Abe等人， J.Biochem.111:191(1992)；Inokuchi等人，J.Lipid Res.28:565(1987)； Shayman等人，J.Biol.Chem.266:22968(1991)；和Bell等人编，1993， Advances in Lipid Research：Sphingolipids in Signaling(Academic Press，San Diego))和糖类似物(参见例如美国专利号6,660,749； 6,610,703；5,472,969；5,525,616；Overkleef等人，J.Biol. Chem.273(41):26522(1998))；也参见US20120022126、 US20130040953、US20130225573、US20070135487、5,700,826和 5,840,721；和Koltun等人，Bioorg Med Chem Lett.2011年11月15 日；21(22):6773-7。实例包括：1-(3',4'-亚乙二氧基)苯基-2-壬酰基氨基-3-吡咯烷-1-丙醇；1-(3',4'-亚乙二氧基)苯基-2-辛酰基氨基-3-吡咯烷 -1-丙醇；D-苏型-(1R,2R)-苯基-2-癸酰基氨基-3-吗啉代-1-丙醇 (PDMP)和其类似物，包括D-PDMP，参见例如Hillaert等人，Bioorg Med Chem.2006年8月1日；14(15):5273-84；D-苏型-EtDO-P4；((1R， 2R)-壬酸[2-(2',3'-二氢-苯并[1,4]二噁英-6'-基)-2-羟基-1-吡咯烷-
1-基甲基-乙基]-酰胺-L-酒石酸盐；AMP-DNM；CCG0203586(1-羟基-3-(吡咯烷-1-基)乙酰胺)；Genz-112638(依利格鲁司特)；Genz-529468； GZ-161；Genz-682452；EXEL-0346(Richards等人，J Med Chem.2012 年5月10日；55(9):4322-35)；OGT2378；Genz-123346；基于脱氧野尻霉素的GCS抑制剂(例如，N-丁基-脱氧野尻霉素(NB-DNJ又名美格鲁特)，N-(5′-金刚烷-1′-基-甲氧基)-戊基-1-脱氧野尻霉素 (AMP-DNM)，或具有长烷基侧链的a1-脱氧野尻霉素，例如，在烷基链中具有9至约20个碳原子的1,5-双脱氧-1,5-亚氨基-D-葡糖醇的长链N-烷基衍生物。N-烷基取代基因此可能是例如：壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、顺式-11-十六烯基、十八烷基、顺式-13-十八烯基以及二十烷基。参见US 
6,610,703))；和 PPMP(DL-苏型-1-苯基-2-棕榈酰基氨基-3-吗啉代-1-丙醇)参见 US20130217691和US 20050101674。

[0082] 可用于本方法的另外的抑制剂包括描述于以下中的那些：  8,389,517；20110166134；20070203223；20050222244；20130095089； 7,335,681；7,253,185；7,148,
251；6,916,802；6,890,949；6,051,598； 6,040,332；6,030,995；5,952,370；5,945,442；
20090247559； 20060111400；20060058349；20060074107；8,557,844；20100204162； 8,
252,789；20130012539；和20090163500。

[0083] 靶向B4GALT6的抑制性核酸

[0084] B4GALT6的特异性抑制剂包括靶向B4GALT6基因或mRNA的抑制性核酸；人B4GALT6mRNA的序列在GenBank中是Acc.No. NM_004775.3；该基因组序列是NC_000018.10。可用于本方法和组合物中的抑制性核酸包括反义寡核苷酸、核酶、外部引导序列(EGS) 寡核苷酸、siRNA化合物、单链或双链RNA干扰(RNAi)化合物如 siRNA化合物、修饰碱基/锁核酸(LNA)、antagomir、肽核酸(PNA)和与靶标B4GALT6核酸的至少一部分杂交并且调节其功能的其他低聚化合物或寡核苷酸模拟物。在一些实施方案中，抑制性核酸包括反义 RNA、反义DNA、嵌合反义寡核苷酸、包含经过修饰的键联的反义寡核苷酸、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)；微干扰 RNA(miRNA)；时序小RNA(stRNA)；或短发夹RNA(shRNA)；小 RNA诱导的基因活化(RNAa)；小活化RNA(saRNA)；或其组合。抑制性核酸可以被修饰(例如)以包括经修饰核苷酸(例如，锁核酸)或主链(例如，其中不包括磷原子的主链)，或可以是mixmer或gapmer；参见例如WO2013/006619。针对B4GALT6的大量siRNA可商购，例如，来自origene、labome、abnova以及qiagen。

[0085] 用于实践本文所述方法的抑制性核酸(无论是RNA、cDNA、基因组DNA、载体、病毒或其杂合物)可以从各种来源中分离、经基因工程改造、扩增、和/或表达或通过重组或合成方式产生。重组体核酸序列可以个别地分离或克隆并且针对所需活性进行测试。可以使用任何重组表达系统，包括例如体外、细菌、真菌、哺乳动物、酵母、昆虫或植物细胞表达系统。

[0086] 核酸序列可以被插入递送载体中并且在载体内由转录单位表达。重组载体可为DNA质粒或病毒载体。载体构建体的产生可以使用本领域众所周知的任何合适基因工程技术来实现，所述技术包括但不限于PCR的标准技术、寡核苷酸合成、限制性内切核酸酶消化、连接、转化、质粒纯化以及DNA测序，例如描述于Sambrook等人“Molec ular Cloning：A Laboratory Manual.”(1989))，Coffin等人(Retrovi ruses.(1997))和“RNA Viruses：A Practical Approach”(Alan J.Can n，编，Oxford University Press，(2000))。如将对本领域普通技术人员显而易见的，可获得多种合适载体来用于将本发明核酸转移到细胞中。选择适当的载体来递送核酸以及最佳化用于将所选表达载体插入到细胞中的条件在本领域普通技术人员的所知范围内，不必过度实验。病毒载体包含一种核苷酸序列，该核苷酸序列具有在包装细胞内用于产生重组病毒的序列。表达本发明核酸的病毒载体可以基于病毒主链来构建，所述病毒主链包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘病毒或甲病毒。能够表达本发明核酸的重组载体可如本文所述进行递送并存留于靶细胞中(例如，稳定转化体)。

[0087] 抑制性核酸可以通过众所周知的化学合成技术在体外合成，如描述于，例如，Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105:661；Belousov(1997) Nucleic Acids Res.25:3440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med. 19:373-380；Blommers(1994)Biochemistry 
33:7886-7896；Narang (1979)Meth.Enzymol.68:90；Brown(1979)Meth.Enzymol.68:109； Beaucage(1981)Tetra.Lett.22:1859；美国专利号4,458,066。

[0088] 用于本文所述方法中的抑制性核酸可以包含一种或多种修饰，例如，通过并入修饰(例如，核苷酸修饰)来针对溶核降解进行稳定化。例如，抑制性核酸可以包含硫代磷酸酯、在核苷酸序列的5'或3'端处至少第一、第二、或第三核苷酸间键联。作为另一个实例，抑制性核酸可以包含2'-修饰核苷酸，例如，2'-脱氧、2'-脱氧-2'-氟代、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)、 2'-O-二甲基氨基乙基乙氧基(2'-O-DMAEOE)或2'-O--N-甲基乙酰胺基 (2'-O--NMA)。作为另一个实例，抑制性核酸可以包含至少一个2'-O- 甲基-修饰核苷酸，并且在一些实施方案中，所有核苷酸包含2'-O-甲基修饰。在一些实施方案中，抑制性核酸被“锁住”，即，包括这样的核酸类似物，其中通过连接2’-O原子和4’-C原子的亚甲基桥将核糖环“锁住”(参见，例如，Kaupinnen等人，Drug Disc.Today 2(3):287-290 (2005)；Koshkin等人，J.Am.Chem.Soc.，120(50):13252–13253(1998))。对于另外的修饰，参见US 20100004320、US 20090298916和US 20090143326。

[0089] 用于操纵抑制性核酸的技术，诸如像亚克隆、标记探针(例如，使用Klenow聚合酶的随机引物标记，缺口翻译，扩增)、测序、杂交等，在科学和专利文献中有充分描述，参见例如Sambrook等人， Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第三版(2001)；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编(John Wiley&Sons， Inc.，New York 2010)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；
Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology：Hybridization With Nucleic Acid Probes，Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen，ed.Elsevier，N.Y. (1993)。

[0090] 结合并且抑制B4GALT6的抗体

[0091] 还可以使用结合B4GALT6并抑制B4GALT6活性的抗体(即，抑制LacCer合成)；人B4GALT6蛋白质的序列在GenBank中为Acc.No. NP_004766.2。如本文所用术语“抗体”是指免疫球蛋白分子或其抗原结合部分。免疫球蛋白分子的抗原结合部分的实例包括F(ab)和F(ab') 2片段，其保持结合抗原的能力。该抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、去免疫化或人源化抗体、全人抗体、非人抗体(例如，鼠)、或单链抗体。在一些实施方案中，该抗体具有效应功能并且可以固定补体。在一些实施方案中，该抗体结合Fc受体的能力已降低或没有该能力。例如，该抗体可以为同种型或亚型、片段或其他突变体，其不支持与Fc受体结合，例如，其具有诱变或缺失的Fc受体结合区。制备抗体和其片段的方法是本领域已知的，参见例如Harlow等人编，Antibodies：A Laboratory Manual(1988)； Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，(N.Y.Academic Press 1983)；Howard和Kaser，Making and Using Antibodies：A Practical Handbook(CRC Press；第1版，2006年12月13日)；Kontermann和 Dübel，Antibody Engineering第1卷(Springer Protocols)(Springer；第 2版，2010年5月21日)；Lo，Antibody Engineering：
Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(Humana Press；2010年11 月
10日)；和Dübel，Handbook of Therapeutic Antibodies：Technologies， Emerging Developments and Approved Therapeutics，(Wiley-VCH；第 1版，2010年9月7日)。结合B4GALT6的抗体可商购自EMD Millipore、R&D Systems、Cell Signaling Technology、OriGene、Novus Biologicals、Thermo Fisher Scientific、LSBio、Abcam、和/或 Cloud-Clone Corp.)，并且本领域技术人员将能够容易地制备或获得抗体并且测试抗体在表达B4GALT6的细胞中抑制LacCer合成的能力。

[0092] 葡糖脑苷脂酶的活化剂

[0093] 除本文所述其他化合物以外或作为其替代，还可以使用葡糖脑苷脂酶的活化剂。活化剂是本领域已知的，包括NCGC00182186(5-环丙亚基-7-(二氟甲基)-N-(2-苯基硫苯基)-1H-吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺)和NCGC00182510([2-(叔丁基氨基)-2-氧乙基]2-[2-(4-溴苯胺基)-2-氧代乙氧基]苯甲酸酯)(参见例如Goldin等人，PLoS ONE 7(1):
e29861)；或鞘脂激活蛋白C或磷脂酰丝氨酸(参见例如Salvioli 等人，Biochem.J.(2005)
390(95–103))。鞘脂激活蛋白C是8.5kDa 的鞘脂活化剂蛋白质，其活化溶酶体葡糖脑苷脂酶。已鉴定了2个功能结构域，各自包含邻近于活化位点或与活化位点部分重叠的结合位点。结构域1位于氨基酸位置6-34内，并且结构域2是氨基酸41-60。活化位点跨越残基27-34以及41-49，并且结合位点包含残基6-27以及45-60。含有结构域1的序列或者显示全长合成鞘脂激活蛋白C的 90％的活性的肽。(参见Yoneshige等人，J Neurosci Res.2010Aug 1；88(10):2118-34；Weiler等人，Protein Sci.1995Apr；4(4):756-64；Weiler 等人，J Mol Neurosci.1993Fall；4(3):161-72；Fujibayashi和Wenger， Clin Chim Acta.1985Mar 15；
146(2-3):147-56；Zschoche等人，Eur J Biochem.1994May 15；222(1):83-90)。因此，可以使用鞘脂激活蛋白C 或其活性片段(例如，包含结构域1或2。)人鞘脂激活蛋白C的序列如下(结构域1和2为粗体且双下划线)∶

[0094]

[0095] 鉴定患有进展型多发性硬化(例如，PPMS或SPMS)的受试者

[0096] 在一些实施方案中，该方法可以包括(例如)通过筛选进展型多发性硬化(例如，PPMS或SPMS)的一种或多种指示物来筛选SPMS 的受试者。用于鉴定患有进展型多发性硬化的方法(例如，PPMS或 SPMS)是本领域已知的，并且还可以包括通过本文所述检测LacCer 的升高水平来鉴定受试者。在一些实施方案中，通过通常在运动/小脑机能方面患有MS的受试者中疾病进展至3.5或更大的EDSS，鉴定SPMS。SPMS还可以在存在症状恶化的情况下被诊断，而与初始复发-缓解病程之后复发≥6个月无关。例如，基于从疾病开始后疾病的进展(例如，无改善期)，例如，最少一年的疾病进展伴随有阳性脑部MRI、阳性脊髓MRI和阳性CSF检查结果中的至少两种可诊断为 PPMS。

[0097] 所述方法可以包括：检测受试者中进展型多发性硬化(例如， PPMS或SPMS)的存在，或受试者中进展型多发性硬化(例如，PPMS 或SPMS)的发展可能性(例如，在特定时间段内，例如，1个月、3个月、6个月、9个月、12个月、2年、3年、4年、或5年，例如，使用本文所述方法)，和基于它们患有或可能发展进展型多发性硬化(例如，PPMS或SPMS)来选择受试者。

[0098] 一般说来，本文所述方法可以对任何哺乳动物、优选人实践。

[0099] 标准治疗

[0100] 在一些实施方案中，本文所述的治疗与用于MS的标准治疗组合施用，所述标准治疗例如为施用皮质类固醇疗法、干扰素β-1b、乙酸格拉默(Glatiramer acetate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、芬戈莫德 (Fingolimod)、特立氟胺(teriflunomide)、二甲基富马酸、那他珠单抗(natalizumab)、大麻、或它们的组合。在一些实施方案中，本文所述的治疗与用于MS的一种或多种症状的治疗组合施用，所述一种或多种症状例如为抑郁和疲劳、膀胱功能障碍、痉挛状态、疼痛、共济失调和意向性震颤；此类治疗包括药理学药剂、锻炼和适当的矫正术。MS的诊断和治疗的另外信息可以见于National MS Society网站，万维网地址为nationalmssociety.org。

[0101] 在一些实施方案中，在受试者被鉴定为在特定时间段内患有或可能发展SPMS，例如，鉴定为具有高于参考水平的GlcCer水平的情况下，则施用用于进展型MS的治疗，所述治疗例如包括米托蒽醌或那他珠单抗。

[0102] 药物组合物

[0103] 本文所述方法包括制造和使用药物组合物，所述药物组合物包含 LacCer合成的抑制剂作为活性成分。还包括的是药物组合物其本身。

[0104] 药物组合物通常包含药学上可接受的载体。如本文所用的表述“药学上可接受的的载体”包括盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，这些都与药物施用相容。补充活性化合物也可并入所述组合物中。

[0105] 通常配制药物组合物以与其预期施用途径相容。尤其可用于本方法的施用途径的实例包括胃肠外(例如，静脉内)施用、鞘内施用、口服施用以及经鼻或鼻内施用(例如，通过作为滴剂或吸入剂施用)。对于未穿越血脑屏障的化合物，可以进行向CNS或CSF内直接递送，例如使用植入的鞘内泵(参见例如，Borrini等人，Archives of Physical Medicine and Rehabilitation 2014；95:1032-8；Penn等人，N.Eng.J.Med. 320:1517-21(1989)；和Rezai等人，Pain Physician 2013；16:415-417)，或使用纳米颗粒，例如金纳米颗粒(例如，葡萄糖包覆的金纳米颗粒，参见例如Gromnicova等人(2013)PLoS ONE 8(12)：e81043)。配制和递送合适的药物组合物的方法是本领域已知的，参见例如系列书籍Drugs and the Pharmaceutical Sciences：a Series of Textbooks and Monographs(Dekker，NY)；和Allen等人，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，Lippincott Williams& Wilkins；8th edition(2004)。

[0106] 适用于可注射用途的药物组合物可以包括无菌水溶液(在可水溶的情况下)或分散液，以及用于无菌可注射溶液和分散液的临时制备的无菌粉末。对于静脉内施用，适当的载体包括生理盐水、抑菌水、 Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须无菌且就存在容易可注射性而言应是流体。所述组合物应该在制造和储存条件下稳定且必须被保藏以防诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。所述载体可为溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等) 及其合适的混合物。适当流动性可例如通过使用诸如卵磷脂的包衣、通过在分散液的情况下维持所需粒子大小且通过使用表面活性剂来维持。防止微生物作用可由各种抗细菌剂及抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞(thimerosal)等)实现。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖；多元醇诸如甘露糖醇、山梨糖醇；氯化钠。可以通过在组合物中包含延缓吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)而使可注射组合物的吸收延长。

[0107] 无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性化合物与(必要时)上文所列成分中的一种或成分的组合并入适当的溶剂中，随后进行过滤灭菌来制备。一般而言，分散液通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备，所述媒介物含有碱性分散介质和来自上文列举那些成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，此举产生活性成分加来自其前述无菌过滤溶液的任何其它所需成分的粉末。

[0108] 对于口服施用，该组合物可以用惰性稀释剂或可食载体来配制。出于口服治疗施用的目的，活性化合物可与赋形剂合并，并以片剂、锭剂或胶囊(例如，明胶胶囊)的形式使用。还可使用流体载体制备口腔组合物以作为漱口水使用。可以纳入药学上相容的粘合剂和/或佐剂物质作为组合物的一部分。所述片剂、丸剂、胶囊或锭剂等可包含下列成分中的任何一种或具有类似性质的化合物：粘合剂，诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖；崩解剂，诸如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。

[0109] 对于通过吸入施用，化合物可以气溶胶喷雾形式递送，该气溶胶喷雾来自压力容器或含有适合推进剂(例如，气体，如二氧化碳)的分配器，或喷雾器。此类方法包括美国专利号6,468,798中所述的那些。

[0110] 可以通过适合于施用核酸药剂、如DNA疫苗的任何方法施用为核酸或包含核酸的治疗性化合物。这些方法包括基因枪、生物注射器 (bio injector)和皮肤贴片，以及无针方法，例如美国专利号6,194,389 中公开的微粒DNA疫苗技术，和美国专利号6,168,587中公开的利用粉末形式疫苗的哺乳动物透皮无针疫苗接种技术。另外，鼻内递送也是可能的，尤其是如Hamajima等，Clin.Immunol.Immunopathol.， 88(2)，205-10(1998)等中所述。

[0111] 还可以使用脂质体(例如，如美国专利号6,472,375中所述)和微胶囊包封技术来递送本文所述的化合物。也可以使用生物可降解的微粒递送系统(例如，如美国专利号6,471,996中所述)。

[0112] 在一个实施方案中，治疗性化合物用保护治疗性化合物免于从身体迅速消除的载体来制备，例如控制释放制剂，包括植入物和微胶囊包封的递送系统。可以使用可生物可降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。此类制剂可以使用标准技术制备，或例如从Alza  Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.商购。还可以将脂质体悬浮液(包括脂质体，其靶向具有针对细胞抗原的单克隆抗体的所选细胞)用作药学上可接受的载体。这些都可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如美国专利号4,522,811中所述。

[0113] 所述药物组合物可与施用说明书一起包括在容器、包装或分配器如单剂量分配器中。容器、包装或分配器还可以被作为试剂盒的一部分包括，所述试剂盒包括例如用于1天、1周、或1个月治疗的充足的单剂量分配器。

[0114] 剂量

[0115] 例如可以通过细胞培养或实验动物中的标准制药程序测定所述化合物的毒性和疗效，所述标准制药程序例如用于测定LD50(对所述群体的50％致命的剂量)以及ED50(在所述群体的50％中治疗有效的剂量)。在毒性效果与治疗效果之间的剂量比为治疗指数，且其可表示为LD50/ED50的比率。优选表现出高治疗指数的化合物。虽然可以使用表现毒副作用的化合物，但应小心设计使这些化合物靶向受影响组织的部位的递送系统，以便使对未受感染的细胞的潜在损伤减到最低，并由此降低副作用。

[0116] 可在配制用于人的剂量范围中使用由细胞培养测定和动物研究获得的数据。这类化合物的剂量优选处于包括ED50同时具有极小或无毒性的循环浓度的范围内。剂量可取决于所采用的剂型和所利用的施用途径而在这个范围内变化。对于本发明方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量最初可由细胞培养测定来估计。可以在动物模型中配制剂量，以实现包括如在细胞培养物中所测定的IC50(即，达到症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。所述信息可用于更准确地测定人中的有用剂量。血浆水平可例如通过高效液相色谱来测量。

[0117] “有效量”为足以实现有益或所需结果的量。例如，治疗性量为实现所需治疗性效果的量。该量可以与预防有效量相同或不同，所述预防有效量为防止疾病或疾病症状开始所需的量。有效量可以以一种或多种施用方法、应用或剂量来施用。组合物的治疗有效量取决于所选组合物。组合物可以每天施用一次或多次到每周施用一次或多次；包括每隔一天一次。技术人员应理解，某些因素会影响有效治疗受试者所需的剂量和时程，这些因素包括但不限于，疾病或病症的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄，以及存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的本文所述组合物治疗受试者可包括单次治疗或一系列的治疗。

[0118] 实施例

[0119] 本发明在下列多个实施例中被进一步描述，其并非限制描述于权利要求中的本发明范围。

[0120] 材料和方法

[0121] 在以下所阐述的实施例中使用以下方法和材料。

[0122] 动物。C57BL/6J、NOD/ShiLtJ(NOD)、IRF1缺陷小鼠和 GFAP-HSV-TK小鼠得自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)。使用携带杂合子GFAP-HSV-TK的C57Bl/6小鼠来产生F1同窝仔畜，所述 F1同窝仔畜为GFAPTK或WT F1。Tg(GFP-hGFAP)FVB转基因小鼠已有描述49。所有动物皆保存于哈佛医学研究所(Harvard Institutes of Medicine)的无病原体设备中。所有实验皆按照哈佛医学院动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee of Harvard Medical School)规定的准则进行。

[0123] EAE诱导和治疗。如所述，EAE通过以下方式诱导：用在CFA 中乳化的MOG35-55肽(Difco Laboratories)以每只小鼠100μg(C57BL/6 和F1小鼠)或150μg(NOD小鼠)的剂量免疫雌性小鼠，随后在第0天和第2天施用百日咳毒素(每只小鼠150ng；List biological laboratories Inc.)14。EAE的临床迹象根据以下分数来评估∶0，无疾病迹象；1，尾部平衡丧失；2，后肢轻瘫；3，后肢瘫痪；4，四肢麻痹；5，濒死。 GCV(APP Pharmaceutical)、或媒介物对照(PBS)在EAE诱导之前7 天每天施用(25mg/kg，皮下)，并且继续施用持续整个急性阶段(第15 天)，或仅在进展型/慢性阶段期间(第30-50天)施用。在EAE诱导期间以每只小鼠10μg的剂量将LacCer(Matreya LLC)或媒介物(10％ DMSO)与MOG35-55肽一起施用于C57BL/6J小鼠，并且还在此后每3 天腹膜内(i.p.)施用。疾病诱导之后35天，开始向NOD小鼠施用 LacCer或媒介物，剂量为每3天腹膜内给予每只小鼠10μg。PDMP (Matreya LLC)或媒介物对照(5％tween-80)在EAE诱导之后第40天施用，每天两次，腹膜内给予20mg/kg，持续整个实验时间。

[0124] 免疫荧光法(IF)。动物用0.1M PBS中的4％多聚甲醛灌注。将组织在0.1M PBS加30％蔗糖中冷冻保护，并且用低温恒温器切成 10-μm厚的切片。将切片在5％山羊血清、含有0.3％TritonTM X-100  (Sigma-Aldrich)的M.O.M.TM小鼠Ig封闭试剂(Vector laboratories)中封闭，并且在4℃下与以下抗体孵育过夜∶GFAP(鸡，1:500，Abcam)、 GFP(鸡，1:500，Abcam)，IBA-1(兔，1:200，Dako)、B4GALT6(兔， 1:100，proteintech)、iNOS[小鼠(4E5)，1:100，iNOS]、CCL2[小鼠 (2D8)，1:100，Fisher scientific]，巢蛋白[小鼠(大鼠-401)，Millipore]、 CD31[小鼠(RM0032-1D12)，1:100，Abcam]，和IRF1(兔，1:250， Santa cruz)。第二天，将切片洗涤3次，并且与适当的荧光团缀合的山羊二抗(1:1000；
Abcam)在室温下孵育1h。使用6只动物/组。使用 LSM 710共焦显微镜(Carl Zeiss)获取图像。

[0125] 从成年小鼠CNS中分离细胞。如先前描述50在微小修饰的情况下从CNS中分离单核细胞。使初次用于实验的小鼠和EAE小鼠安乐死，并随后通过左心室用冰冷无菌PBS进行灌注。然后除去脑部和脊髓，切碎并且在37C下用0.05％(w/v)III型胶原酶(Worthington Biochemical)、0.5％分散酶II(Roche Applied Science)、40μg/mL DNA 酶I，HBSS中的20mM HEPES)酶促离解30min以制备单细胞悬浮液。用包含2mM EDTA和20mM HEPES的20ml无
2+ 2+
Ca /Mg HBSS 使酶失活。研磨该消化的组织并且使其通过100-μM细胞滤网。使细胞离心并且再悬浮于30％等渗Percoll(GE Healthcare)和40μg/ml DNA 酶I，由70％等渗Percoll划线，并且以1000×g在4℃下离心25min。从70％–30％间期中收集细胞，并且由FACS Aria分选。

[0126] 星形胶质细胞、小神经胶质细胞和单核细胞的FACS分选。这些纯化程序是基于先前描述的解离和纯化方案50,51。分离的CNS细胞与抗小鼠CD16/CD32在冰上孵育15分钟以封闭Fc受体，并且用荧光染料缀合的针对CD11b(M1/70)、CD45(90)、CD3(145-2C11)、CD4 (GK1.5)和Ly6C(HK1.4)的抗体，以及Biotion缀合的GSL I–同工凝集素B4(Vector labs)、CD105(N418)、CD140a(APA5)、CD11c(N418)、 F4/80(BM8)、O4(O4，Miltenyi Biotec)和CD19(eBio1D3)，以及识别小鼠MOG 8-18C5，Millipore)的未缀合抗体、O1(O1)以及半乳糖脑苷脂(mGlaC，Millipore)来进行染色。所有抗体来自Ebioscience，除非另有提及(克隆数目，当相关时，以括号表示)。洗涤细胞并且在4C 下在黑暗中孵育PE缀合的抗生蛋白链菌素(Streptavidin)和山羊抗小鼠IgG+IgM(H+L)的R-藻红蛋白AffiniPure F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch laboratories)20min。洗涤细胞，与7-AAD或Fixable Viability Dye 450孵育(如果细胞用于细胞内染色)，以便除去死细胞(图3A)，并且如下分选。小神经胶质细胞被分选为具有低 CD45表达和低Ly6C的CD11b+细胞(CD11b+/CD45低/Ly6C低)，而炎性单核细胞被认为是CD11b+/Ly6C高52。T细胞被分选为CD3+CD4+细胞。在淋巴细胞、小神经胶质细胞、单核细胞(图3B)、和少突胶质细胞和淋巴细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)(图3C)损耗之后，分离星形胶质细胞。通过FACS分析发现分选的细胞>85％GFAP+(图3D)。我们确认我们通过针对星形胶质细胞标记物44,51gfap、aldh1l1和aqp4 的qPCR已分离了星形胶质细胞的相对纯群体，并且发现它们仅表达于星形胶质细胞级分中(表达模式与分选自Tg(GFP-hGFAP)FVB转基因小鼠49的GFP+星形胶质细胞类似)(图3E)。我们使用另外的标记物组来探测免疫细胞[小神经胶质细胞/单核细胞–itgam(CD11b)，和 emr1(F4/80)，树状细胞-itgax(CD11c)，NK细胞-Klrb1c(Nk1.1)，T 细胞-cd3，以及B细胞-cd19]、少突胶质细胞(mog、mbp)以及神经元 (syt1、snap25)(图3F，G)的存在。

[0127] LacCer测量。LacCer(d18:1/16:0)和LacCer(d18:1/18:0)的化学标准得自Avanti Polar Lipids。通过在Agilent(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)6460三重四极LC/MS/MS系统上执行的LC-MS/MS分析，实现对LacCer(d18:1/16:0)和LacCer(d18:1/18:0)的定量。来自用于 LacCer和内标的[M+H]+离子的片段经受碰撞诱导解离，并且两个主要类型的片段离子经由正离子模式下的电喷射电离以多反应监测 (MRM)模式针对各离子来监测。这两种MRM转变对应于中性乳糖基部分的损失，以及乳糖离子的形成。特定而言，用于定量LacCer (d18:1/16:0)和LacCer(d18:1/18:0)的MRM转变分别是862.5>464.5和 890.6>548.5。还监测到针对862.5>264.3和890.6>264.3的LacCer (d18:1/16:0)和LacCer(d18:
1/18:0)的继发确认性MRM转变。质谱仪参数设定为气体温度(325℃)、气体流量(12L/min)、喷雾器(25psi)、鞘气温度(400℃)、鞘气流量(12L/min)，毛细管电压(4000v)以及喷嘴电压(500v)。使用采用Phenomenex Gemini C18柱4.6×50mm 5μm粒度的液相色谱条件来分离。
色谱法按以下设定：流速＝0.4mLs/min；溶剂A＝5％MeOH和0.1％甲酸中的5mM甲酸铵v/v/v；溶剂B＝80％ 2-丙醇、15％甲醇、5％水和0.1％甲酸(v/v/v/v)。梯度以20％A开始并且在
10分钟内发展至100％A，并且维持下一个10分钟。在接下来注射之前，经5分钟使柱再平衡至起始条件。因为稳定同位素形式不可用，所以使用非原生LacCer的内标(18:1/12:0)。在LacCer (d18:1/16:0)中0.10nM至3.3μM的各种浓度下和1μM的内标浓度下分析标准曲线混合物。定量的下限在1nM下估计，并且使用线性回归分析获得0.9969的R2。采用内标掺杂的标准曲线在1nM至3.3μM 之间运行。因为所述标准物仅可用于LacCer(18:1/16:0)，所以LacCer (18:1/18:0)的值假定两种密切相关脂质的相对电离效率是相同的。

[0128] 脂质的提取。称量脑组织并且使用Dounce均化器(VWR)在提取溶剂中，使用Bligh和Dyer型液-液提取均化。所有溶剂以超高纯度得自Sigma-Aldrich。使内标LacCer(18:1/12:0)溶于2:1氯仿-甲醇v/v， 6ml的2:1氯仿-甲醇以及2ml PBS。大约2分钟的均化之后，将液体转移至8ml玻璃小瓶。混合物以1000g高速离心下旋转20分钟。这导致中间蛋白质圆盘和不可溶解材料的形成。底层使用玻璃Pasteur 吸移管除去，并且转移至清洁小瓶以用于在平缓的氮流下蒸发。使干燥样本在100μl的2:1氯仿-甲醇中复水，并且使用HPLC-MS分析。

[0129] nCounter基因表达。根据制造商说明书(NanoString Technologies)，将100-200ng总RNA与用于nCounter基因表达编码套装(nCounter Gene Expression code sets)(小鼠炎症试剂盒，或定制的星形胶质细胞指向探针组(表S1))的报道基因和捕获探针杂交。数据被标准化至加标阳性对照和管家基因(nSolver分析系统)。将小于阴性对照转录物的平均值加2个标准偏差的对于各样本的转录物数目视为背景。

[0130] 基因表达数据的分析。通过使用Expander 6.06平台分析 Nanostring产生的基因表达数据53。使用无偏CLICK算法对基因分簇，并且针对转录因子中结合位点的富集进一步分析各簇(启动子分析)。

[0131] q PCR。RNA用RNAeasy柱(Qiagen)、或 (Invitrogen) 提取，制备cDNA并且用于qPCR，并且将结果标准化至gapdh(小鼠)或ACTIN(人)。所有引物和探针皆来自Applied Biosystems。Ald h1l1(Mm03048957_m1)、aqp4(Mm00802131_m1)、b4galt5(Mm00 480147_m1)、b4galt6(Mm00480045_m1)、ccl5(Mm01302427_m1)、 cd19(Mm00515420_m1)、cd3e(Mm00599684_g1)、cd40(Mm00441 891_m1)、csf2(Mm01290062_m1)、cxcl10(Mm00445235_m1)、emr 1(Mm00802529_m1)、foxp3(Mm00475162_m1)、gapdh(Mm00484 668_m1)、gfap(Mm01253033_m1)、h2-Aa(Mm00439211_m1)、Ifng (Mm01168134_m1)、Il10(Mm00439614_m1)、il17a(Mm00439618_ m1)、il1b(Mm00434228_m1)、il6(Mm00446190_m1)、irf1(Mm012 88580_m1)、itgam(Mm00434455_m1)、itgax(Mm00498698_m1)、kl rb1c(Mm00824341_m1)、mbp(Mm01266402_m1)、mog(Mm00447 824_m1)、nos2(Mm00440502_m1)、relb(Mm00485664_m1)、snap2 5(Mm00456921_m1)、spp1(Mm00436767_m1)、syt1(Mm00436858 _m1)、tbx21(Mm00450960_m1)、tgfb1(Mm01178820_m1)、tlr2(M m00442346_m1)、tnf(Mm00443260_g1)、vim(Mm01333430_m1)、A CTB(Hs01872448_s1)、B4GALT5(Hs00941041_m1)、B4GALT6(H s00153133_m1)、CCL2(Hs01060665_g1)、CCL5(Hs00941041_m1)、 IL6(Hs00234140_m1)、NOS2(Hs00174575_m1)、PTGST2(Hs00191 135_m1)，和TLR2(Hs00985639_m1)。

[0132] T细胞增殖和细胞因子测量。使脾细胞和淋巴结细胞在X-VIVO 培养基中培养，并且在MOG35-55肽存在下以每孔5×105个细胞的密度接种72h。在最终16h期间，用1Ci[3H]胸苷(PerkinElmer)使细胞脉冲，随后在玻璃纤维过滤器上收集，并且在a-counter(1450MicroBeta TriLux；PerkinElmer)中分析掺入的[3H]胸苷。培养48h之后收集上清液以用于通过酶联免疫吸附测定进行细胞因子测量14。对于细胞内细胞因子染色，用PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯；50ng mL； Sigma)、离子霉素(1μg/ml；Sigma)和莫能菌素(GolgiStop；1ml/ml；BD Biosciences)刺激细胞6h。在表面标记物的染色之后，根据制造商说明书BD Cytofix/CytopermTMKit(BD Biosciences)或Foxp3  Fixation/
Permeabilization(Ebiosceince)，使细胞固定并且可浸润。

[0133] 小鼠原代小神经胶质细胞。按照描述54来制备小鼠原代小神经胶质细胞，带有微小修饰。解剖1天至3天龄的新生小鼠的大脑皮层，谨慎地剥掉它们的脑膜，用0.25％胰蛋白酶消化，并且分散成单细胞水平。随后，在37℃下于加湿5％CO2–95％空气中培养细胞悬液(“混合神经胶质”)。每4–5天替换培养基。混合神经胶质细胞培养物在7–10 天之后达到汇合，并且被用于收获制备之后15至20天的小神经胶质细胞。通过温和胰蛋白酶消化程序(温和T/E)按照先前描述54来分离小神经胶质细胞。简单地说，用0.06％胰蛋白酶(温和T/E)处理汇合的混合神经胶质培养物导致包含几乎所有星形胶质细胞的完整细胞层分离，并且留下高度富集的小神经胶质细胞群体(>98％，通过用荧光素缀合的加纳谷物(Griffonia simplicifolia)同工凝集素B4(IB4) (Vector Laboratories)或PE-缀合的CD11b Ab所测定(数据未示出))。使连接的小神经胶质细胞恢复24-48小时。

[0134] 小鼠原代星形胶质细胞。如上所述制备混合神经胶质，并且在室温下与20ug/ml生物素抗IB4(Vector Labs)孵育20min，洗涤并且在 4C下与抗生蛋白链菌素缀合的磁性珠粒(Miltenyi Biotec)孵育15 min。洗涤细胞，并且使用细胞分离柱(Miltenyi Biotec)清除IB4+细胞 (小神经胶质细胞和内皮细胞)51。然后培养细胞，直至汇合(第7-10天)，使用温和胰蛋白酶消化程序分离星形胶质细胞单层，用Accutase (Invitrogen)分离成单细胞悬浮液并且接种。细胞为>98％星形胶质细胞，如通过用GFAP或GLAST染色来确定，并且小于2％CD11b+小神经胶质细胞被污染(数据未示出)。

[0135] 小鼠原代柔脑膜噬菌细胞。从1至3天龄新生小鼠的脑部谨慎地剥离脑膜，并且在37℃下用1％胶原酶消化20分钟，并随后分散成单细胞水平。将分离的细胞与抗小鼠CD16/CD32在冰上孵育15min 以阻断Fc受体，并且在4℃下用APC缀合抗体针对CD11b(M1/70) 染色30min。洗涤细胞，与7-AAD孵育以除去死细胞，并且分选。

[0136] 小鼠原代脉络丛细胞。按照描述55,56制备小鼠原代脉络丛细胞，其具有微小修饰。简单地说，从1至3天龄新生小鼠的脑部除去脉络丛，在37℃下用1％胶原酶消化20min，并随后分散成单细胞水平。细胞悬液在用于脉络丛细胞的培养基[杜氏改良伊氏培养基/汉姆氏 F12(Invitrogen)，补充有10％胎牛血清(Sigma-Aldrich)、1mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、
100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素、5mg/ml 胰岛素、20mM Ara-C)中洗涤，并且在37℃、5％CO2下于聚-D-赖氨酸包覆的24孔板中培养(2.5×105细胞/孔)。24h之后，改变培养基，并且使细胞保持未处理或者按照描述来处理。

[0137] 质粒。在鼠Ccl2启动子下表达Gaussia荧光素酶以及在CMV启动子(用于转染标准化)下表达分泌性碱性磷酸酶(SEAP)的双报道基因构建体来自GeneCopoeia公司。编码IRF1的构建体来自Addgene。 pLenti-GFAP-EGFP-mir30-shAct1载体25是来自Guang Xian Zhang博士(Thomas Jefferson University，PA，USA)的赠品。

[0138] 用shRNA进行体外敲低。使用针对b4galt5(TRCN0000018782)、  b4galt6(TRCN0000334278)的shRNA慢病毒颗粒、或非靶向序列 (TRCN0000018782)作为对照(Sigma)，在C8-D30星形胶质细胞中敲低LacCer合酶的表达。将星形胶质细胞与慢病毒和8μg/ml聚凝胺(皆来自Sigma-Aldrich)孵育12h，使其恢复24h，并且用嘌呤霉素选择 (2μg/ml)。耐嘌呤霉素的细胞中的基因敲低通过qPCR检验。

[0139] 用shRNA慢病毒进行体内星形胶质细胞特异性敲低。通过用上述体外验证的shRNA序列替换用于Act1的所述shRNA，使用pLent i-GFAP-EGFP-mir30-shAct1载体25作为主链克隆针对b4galt5、b4gal t6的含shRNA序列的pLenti-GFAP-EGFP-mir30-shRNA和非靶向sh RNA(b4galt5：5’-GCAGCCTGAATGACTCAGATTctcgagAATCTG AGTCATTCAGGCTGC-3’(SEQ ID NO:2)，b4galt6：5’-CGATGGA CTGAACAATTTATTctcgagAATAAATTGTTCAGTCCACG-3’(SEQ I D NO:3)，和非靶向shRNA：5’-GCGCGATAGCGCTAATAATTTctcg agAAATTATTAGCGCTA-TCGCGC-3’(SEQ ID NO:4))。随后，通过用3μg新产生的pLenti-GFAP-EGFP-mir30-shRNA载体和9μgViraPo werTM包装混合物(辅助质粒pLP1、pLP2、pLP/VSV-G，Invitrogen) 转染293FT细胞(Invitrogen)，产生慢病毒颗粒。48h后收集上清液，通过0.45μMPVDF过滤器过滤，并且用Lenti-XTM浓缩器试剂盒(Clo ntech)根据制造商说明书过夜浓缩。使用Lenti-XTM qRT-PCR滴定试剂盒(Clontech)根据制造商说明书测定病毒滴定液，并且在-70℃下存储。

[0140] 对于体内注射，在免疫之后35天(进展型阶段)，通过腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(20mg/kg)使NOD EAE小鼠麻醉，并且置放于Kopf立体定位校准系统。使用Hamilton注射器，在前囟后0.44mm、前囟侧1.0mm以及颅骨表面下2.2mm处注射1×107IU/ 小鼠的shB4galt5、shBrgalt5、shControl(非靶向)病毒。注射速度维持在1μl/分钟以阻止泄漏。

[0141] 活力分析。星形胶质细胞、小神经胶质细胞或Ly6Chigh单核细胞用所示浓度的PDMP或LaCcer预处理，并且用LPS/IFNγ(小神经胶质细胞和星形胶质细胞)、CCL-2(单核细胞)进一步活化，或保持未处理。活化之后，使用CellTiter-FluorTM细胞活力测定(Promega)评估活力。

[0142] 亚细胞分级和免疫印迹分析。如所示来处理星形胶质细胞，并且总提取物(30μg蛋白质)、或细胞的核和细胞质亚细胞分级物通过 NuPAGE 10％Bis-Tris Gel(Invitrogen)分离，并且电印迹到支撑硝化纤维膜上。使用 核和细胞质提取试剂盒(Pierce Biotechnology)，根据制造商说明书，制备亚细胞级分。用兔抗IRF1 (D5E4) 兔mAb、GAPDH(D16H11) 兔mAb、核纤层蛋白B1多克隆兔Ab、NF-κB p65(D14E12) 兔mAb，随后用山羊抗兔 IgG过氧化物酶缀合物Ab(所有抗体来自Cell signaling)，探测印迹。使用SuperSignal West Pico化学发光试剂盒(Pierce Biotechnology)使印迹显色。各印迹用GAPDH(总提取物，或细胞质级分)或核纤层蛋白B1(核级分)再探测以检验蛋白质均匀性。使用Image Studio软件(版本3.1.4)(LI-COR公司)，完成数据定量。

[0143] 转染和荧光素酶测定。使293T细胞在补充有10％FBS的DMEM 中生长，用Fughene-HD转染试剂(Roche)转染，所述转染试剂具有 CCL2双报道基因和构建体，所述构建体编码IRF1、NF-κBp65、或适当的空白对照。用分泌对双发光测定试剂盒(GeneCopoeia,Inc)转染之后24h，分析荧光素酶和SEAP活性。

[0144] ChIP。将细胞用1％甲醛交联15分钟。通过添加甘氨酸终止交联，并且用包含1×蛋白酶抑制剂'混合物'(Roche Molecular Biochemi cals)的0.35ml溶解缓冲液(1％SDS，10mM EDTA和50mM Tris -HCl，pH 8.1)溶解细胞。通过超声处理剪切染色质，并且离心之后收集上清液，并且烯释于缓冲液中(1％Triton X-100，2mM EDTA， 150mM NaCl和20mM Tris-HCl，pH  8.1)。抗体(5μg)经6h预结合至蛋白质A和蛋白质G Dynal磁性珠粒(Invitrogen)，并且用冰冷5％ BSA于PBS中的溶液洗涤3次，并随后添加至稀释的染色质，并且免疫沉淀过夜(如下所述抗体)。磁性珠粒-染色质复合物随后在RIPA 缓冲液中(50mM HEPES，pH 7.6，1mM EDTA，0.7％脱氧胆酸钠， 1％Nonidet-P40和0.5M LiCl))洗涤3次，随后用Tris-EDTA缓冲液洗涤3次。免疫沉淀的染色质随后用1％SDS、0.1M NaHCO3提取，并且在65℃下加热至少8h以用于反转甲醛交联。DNA片段用QIA quick DNA纯化试剂盒(Qiagen)纯化，并且通过SYBR Green实时P CR(如下所述引物)分析。以下抗体用于ChIP∶抗IRF1(SC-
640x；S anta Cruz Biotechnology)、抗NF-κBp65(ab7970；Abcam)以及兔Ig G(ab27478；
Abcam)。使用以下引物对∶使用以下引物对∶ccl2:NF- κB正向，5 ′-
CAGCTAAATATCTCTCCCGAAGG-3′(SEQ ID NO:5)，和反向，5′-CATAGATGCCCACAGCTCAT-3′(SEQ ID NO:6)；ccl2: ISRE正向，5′-CTGCCAATTCTTCCCTCTTTC-3′(SEQ ID NO:7)，和反向，5′-GTGGGTTGGA-ATTTGGTATTT-3′(SEQ  ID  NO:8)；csf  2:NF-κB正向，5′-
GACCAGATGGGTGGAGTGACC-3′(SEQ ID NO: 9)，和反向，5′-AGCCACACGCTTCTGGTTCC-3′(SEQ ID NO:10)； csf2:ISRE正向，5′-GCTTTCGAGGGTCA-GATAACA-3′(SEQ ID N O:11)，和反向，
5′-CACACGCTTGGGCTAAGA-3′(SEQ  ID NO:12)；  nos2:NF-κB(1)正向，5′-CACAGACTAGGAGTGTCCATCA-3′(SEQ I D NO:13)，和反向，5′-GCAGCAGCCATCAGGTATTT-3′(SEQ ID NO:14)；nos2:ISRE/NF-κB(2)正向，5′-ACCATGCGAAGATGAGTGG A-3′(SEQ ID NO:
15)，和反向，5′-AGCC-AGGAACACTACACAGA A-3′(SEQ ID NO:16)。

[0145] 单核细胞迁移测定。分选脾Ly6C高单核细胞(CD11b+/F4-80+，SSC 低/Ly6C高)，并且接种于孔径3-μm的24孔细胞培养插管(Corning)的上部室中。用PDMP、LacCer、PDMP+LacCer或媒介物预处理细胞1h。随后，将插管转移至具有预温热培养基或媒介物(PBS)的不同孔，所述培养基包含CLL-2(50ng/ml，peprotech)。3小时之后，在下部室中定量迁移的单核细胞。

[0146] 人原代星形胶质细胞。遵循加拿大卫生研究院(Canadian Institutes for Health Research)核准的准则，如先前所描述57从来自17-23周妊娠的胎儿的人CNS组织中分离人胎儿星形胶质细胞如，所述人CNS 组织得自人胚胎组织库(Human Fetal Tissue Repository)(Albert Einstein College of Medicine，Bronx，NY)。培养物>90％纯度。

[0147] MS组织。脑组织得自患有临床诊断和神经病理学确认的MS、非MS CNS炎性疾病(NMSCID,包括病毒性脑炎、Rasmussen脑炎和 ADEM)的MS患者以及健康对照。尸检样本立即冷冻于液氮中。如先前所述58选择白质MS组织样本。所有患者和对照，或他们的近亲，已给予知情同意尸检以及将他们的脑组织用于研究目的。在尸检之前，给予伦理认可(CHUM伦理认可：SL05.022和SL05.023和 BH07.001)。

[0148] 统计分析。使用Prism软件版本6.0e(GraphPad Software)来进行统计学分析。小于0.05的P值被认为是显著的。

[0149] 实施例1。LacCer合酶对照CNS炎症以及神经退行性变

[0150] 易感小鼠品系中诱导的实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)构成MS 的有用实验性模型。然而，通过各小鼠品系中发展的EAE，来对MS 的不同方面建模。用髓磷脂肽MOG35-55免疫的C57BL/6小鼠(例如) 发展出单相形式的EAE，该EAE类似于RRMS期间的单次发病。然而，用相同抗原使非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠免疫导致发展出急性发病(急性阶段)，随后是类似13,14
SPMS 的神经损伤的进展型和不可逆累积的阶段(进展型阶段)。

[0151] 我们最近发现，来源于繁殖NOD和C57BL/6小鼠的F1杂交小鼠还发展出慢性进展型形式的EAE(图8a-c)。因此，为研究CNS炎症期间星形胶质细胞的作用，我们分析了在F1NOD C57BL/6 GFAP-HSV-TK杂交小鼠中EAE的病程，其中反应性星形胶质细胞可以通过更昔洛韦7,8
(GCV)施用被损耗(图9a)。根据C57BL/6小鼠中的先前发现 ，我们发现急性阶段期间反应性星形胶质细胞的损耗导致 EAE的显著恶化(图1a)。然而，进展型阶段期间星形胶质细胞损耗导致EAE的显著改善(图1b)。此外，虽然急性EAE中反应性星形胶质细胞损耗导致募集至CNS的单核细胞和T细胞增加5,8，但我们发现在进展型阶段期间EAE的损耗使CNS中白细胞浸润减少(图9b)，但未影响周围T细胞响应(图9c,d)。值得注意的是，虽然GCV施用可能潜在地损耗NOD C57BL/6GFAP-HSV-TK杂交小鼠中的神经祖细胞(NPC)，但NPC在EAE中显示保护作用15,16。因此，这些数据表明反应性星形胶质细胞的损耗导致了EAE的改善。

[0152] 为研究在慢性自身免疫CNS炎症期间控制星形胶质细胞活性的分子机制，我们从初次用于实验的NOD小鼠，或在EAE的急性阶段和进展型阶段期间(图10a-g)分离星形胶质细胞，并且使用定制的 Nanostring nCounter阵列分析其转录组(表1)。我们发现在NOD EAE (图1c)的不同阶段期间星形胶质细胞的mRNA表达谱中的显著差异，并且鉴定出在进展型阶段期间上调的独特的基因簇(图1d)。表达与进展型NOD EAE相关的基因之一为b4galt6，一种LacCer合酶17。验证qPCR研究确认了在NOD EAE的进展型阶段期间在星形胶质细胞中(而不是小神经胶质细胞中)的B4galt6表达上调(图1e)。通过免疫荧光法(IF)进一+步验证检测到在白质GFAP星形胶质细胞，而不是在灰质、血管周围神经胶质界膜、或在巢蛋白+神经祖细胞中的 B4GALT6表达(图11a,b)。另外，我们还检测到β-1,4-半乳糖基转移酶5(B4GALT5)的显著上调，其与B4GALT6一起是具有LacCer合酶活性17的B4GALT家族的仅有成员(图11c)。的确，与B4GALT5和 B4GALT6(B4GALT5/6)的LacCer合酶活性相一致，我们检测到在 EAE的进展型阶段期间NOD小鼠的CNS中LacCer水平增加(图1f)。

[0153] 我们随后研究了LacCer对CNS炎症的作用。在不存MOG免疫的情况下，LacCer施用未导致EAE样疾病的诱导，也未导致体内星形胶质细胞活化(图12a)。然而，LacCer施用导致C57BL/6小鼠中 EAE的显著恶化(图1g)。类似地，在NOD小鼠中进行EAE诱导之后35天，在进展型阶段期间开始的LacCer施用，还导致疾病临床症状的显著恶化(图1h)。值得注意的是，LacCer施用之后C57BL/6和 NOD EAE的恶化与T细胞响应的改变没有关联(图12b-e)。

[0154] 为进一步研究LacCer在NOD EAE的进展型阶段中的作用，我们使用B4GALT5/6-特异性抑制剂D-苏型-1-苯基-2-癸酰基氨基-3-吗啉代-1-丙醇(PDMP)17来抑制其合成(图1i)。EAE诱导之后40天开始的每天PDMP施用(20mg/kg，每天两次)导致CNS LacCer水平(图 
1j)显著降低，并且就临床得分、脱髓鞘和轴突损失而言，使疾病进展被抑制(图1k,l)。然而，未检测到PDMP处理小鼠的T细胞响应的显著改变(图12f-i)。综上所述，这些数据表明由B4GALT5/6产生的LacCer在CNS炎症中起到不利作用。

[0155]

[0156]

[0157]

[0158]

[0159] 实施例2。B4GALT5/6抑制在EAE期间压制了星形胶质细胞活化

[0160] LacCer已表明在实验性脊髓损伤期间促进病理学18。因此，我们研究了在EAE的进展型阶段期间(第100天)B4GALT5/6抑制对分离自媒介物或PDMP处理的NOD小鼠的星形胶质细胞的转录程序的影响。我们的无偏分析鉴定出两组基因∶在EAE期间下调的和通过 PDMP上调的基因；以及在EAE期间上调的和通过PDMP下调的基因(分别为图2a中的簇1和2)。簇219-21
包括与EAE和MS病理学相关的若干基因∶ccl2(向CNS中募集炎性单核细胞) ，ccl5和cxcl10 (向CNS募集周围免疫细胞)，IL-1β(il1b)，骨桥蛋白(opn)，氧化氮合酶(nos2)，MHC-II(H2-Aa)和波形蛋白(vim，与星形胶质细胞活化相关)。通过qPCR对独立样本进行的验证实验确认PDMP对簇2中包括的代表性基因的表达的压制性影响(图2b)。通过IF研究提供了对于在调控与EAE和MS病理学相关的基因的表达方面B4GALT6的作用的额外支持，在所述IF研究中我们检测到B4GALT6与CCL2和 iNOS在GFAP+星形胶质细胞中共表达(图13)。

[0161] 此外，因为星形胶质细胞被报道会调控髓鞘再生和神经元活力9,22，我们分析了与通过星形胶质细胞控制髓鞘化相关的基因的表达 (表2和图2c)。与图1l中所示脱髓鞘和轴突损害相符合，我们检测到与脱髓鞘相关的基因的显著上调，以及与NOD EAE的进展型阶段中髓鞘再生相关的基因的下调。然而，由PDMP进行的B4GALT5/6抑制导致脱髓鞘相关基因的表达明显减少并且伴随髓鞘再生相关基因的表达增加(图2c)。共同地，这些数据证明B4GALT5/6在EAE期间控制星形胶质细胞活化。

[0162] 为鉴定介导在EAE期间B4GALT5/6阻断对星形胶质细胞转录响应的影响的分子机制，我们针对特定转录因子结合部位点的富集来搜索包括在簇1和簇2中的基因的启动子序列。我们发现簇2中包括的基因(其表达受B4GALT5/6抑制所压制)针对干扰素敏感性响应元件(ISRE)(P＝4.83x10-6)和NF-κB响应元件(P＝9.99x10-6)富集。在 B4GALT5/6调控EAE期间这些路径参与的额外支持通过在EAE期间检测到的irf1和relB表达的上调来提供，并且其随后在LacCer合成时的压制用PDMP来抑制(图2d,e)。综上所述，这些结果表明 B4GALT5/6在CNS炎症期间控制NF-κB和IRF1活化。

[0163]

[0164] 实施例3。由B4GALT6产生的LacCer以自分泌方式起作用以促进星形胶质细胞活化。

[0165] 为研究由B4GALT5/6产生的LacCer是否直接作用于鼠星形胶质细胞以调控其活性，我们研究B4GALT5/6抑制和LacCer补充对原代星形胶质细胞对活化的转录响应的影响。我们发现B4GALT5/6抑制在脂多糖和干扰素-γ(LPS/IFNγ)的情况下压制了星形胶质细胞对刺激的转录响应(图3a,b和图14a)。相反地，用外源LacCer补充促进了星形胶质细胞对LPS/IFNγ的响应，从而表明由B4GALT5/6合成的 LacCer以自分泌方式起作用以促进在这些实验性条件下的星形胶质细胞活化(图3a,b和图14a)。与这些解释一致，外源LacCer克服了 PDMP对星形胶质细胞活化的压制性作用(图3a,b和图14a)。值得注意的是，PDMP或LacCer处理不影响星形胶质细胞活力(图14b,c)，并且当我们分析其对用IL-1β,poly(I:
C)、或由致脑炎T细胞产生的 IFNγ和IL-17的组合活化的星形胶质细胞的作用时，检测到PDMP 和LacCer的类似作用。

[0166] 为分析B4GALT5和B4GALT6对星形胶质细胞活化的相对贡献17,23,24，我们使用验证的慢病毒递送的shRNA敲低b4galt5和b4galt6 表达(图3c)。我们发现b4galt6的敲低显著地压制了由LPS/IFNγ活化触发的h2-Aa、ccl5和cxcl10表达的上调，程度与PDMP处理类似。然而，b4galt5的敲低不影响那些基因的表达(图3d-f)，表明B4GALT6 在由LacCer对星形胶质细胞活化的调控中起到主导作用。值得注意的是，其中已用shRNA敲低了B4GALT6的星形胶质细胞的PDMP 处理未进一步压制h2-Aa、ccl5和cxcl10表达，表明PDMP的作用由 B4GALT6依赖性LacCer合成的特异性抑制所产生(图14d)。

[0167] 为测定B4GALT5和B4GALT6对体内星形胶质细胞活化的相对贡献以及对EAE进展的控制，我们使用针对体内星形胶质细胞特异性敲低优化过的基于慢病毒的系统来向NOD小25
鼠递送shRNA (图 3g)。在该系统中，小鼠gfap启动子驱动对选择的shRNA以及GFP 报道基因的表达。在进展型阶段期间脑室内(i.c.v.)注射shRNA编码慢病毒之后，在NOD小鼠中EAE诱导35天之后，我们检测到GFP报道基因的表达局限于GFAP+星形胶质细胞，而不是Iba1+小神经胶质细胞和炎性巨噬细胞(图3h和图14e)。因此，我们检测到b4galt6和 b4galt5表达的星形胶质细胞特异性敲低(图3h)。b4galt6(而非 b4galt5)的敲低导致在NOD EAE的进展型阶段期间CNS LacCer水平显著降低(图3i)。此外，b4galt6(而非b4galt5)的敲低压制了NOD 小鼠中的疾病进展(图3j)。综上所述，这些数据显示由B4GALT6产生的LacCer以自分泌方式作用以促进星形胶质细胞活化和EAE进展。

[0168] 为研究介导LacCer对星形胶质细胞活化的作用的分子机制，我们针对特异性TF结合位点的富集来搜索培养物中原代星形胶质细胞内由LacCer调控的基因的启动子(图3a)。类似于我们在分离自用 PDMP处理的NOD小鼠的星形胶质细胞中所发现的，我们检测到在 NF-κB和ISRE反应性元件中的显著富集(p<10-5)。

[0169] 先前已报道了LacCer活化星形胶质细胞中的NF-kB18,26。因此，我们发现在B4GALT6抑制之后NF-κB向细胞核的转运减少；相反地，外源LacCer触发NF-κB活化，并且甚至消除由PDMP诱导的抑制(图 14f)。然而，IRF1/ISRE在由LacCer进行的星形胶质细胞活性调控中的作用尚未知。我们发现LacCer处理加强了IRF1向细胞核的转运，而B4GALT6抑制干扰该过程(图3k)。此外，在染色质免疫沉淀法 (ChIP)实验中，我们检测到在用LPS/IFNγ活化的星形胶质细胞中 NF-κB和IRF1向nos2启动子的显著募集(图3l)。为研究IRF1对星形胶质细胞对LacCer响应的功能相关性，我们将WT和IRF1缺陷性星形胶质细胞对活化的响应与LPS/IFNγ进行比较。我们发现IRF1 缺陷消除了由nos2的LacCer和其他基因触发的上调，所述基因在其启动子中含有ISRE结合位点(csf2、ccl2、ccl5、il6和tlr2)(图3m)。在进展型NOD EAE期间IRF1在ccl2和nos2表达的调控方面的作用的进一步支持通过由IF在GFAP+星形胶质细胞中检测到的IRF1与 CCL-2和iNOS的共表达来提供(图14g)。综上所述，这些结果证明，由B4GALT6产生的LacCer以自分泌方式作用以通过NF-κB和IRF1 依赖性路径活化星形胶质细胞。

[0170] 实施例4。B4gaLt6在星形胶质细胞中调控ccl2转录活性。

[0171] 由CCL-2驱动的炎性单核细胞向CNS中的募集被认为促进MS 和EAE中的神经退行性变和疾病进展19-21,27。我们发现B4GALT6和 LacCer通过星形胶质细胞控制ccl2表达(图2a,b和3a)。基于我们在星形胶质细胞中LacCer对NF-κB和IRF1的活化的效应的发现，我们针对这些转录因子的反应性元件搜索ccl2启动子。我们的生物信息研究鉴定了用于NF-κB和IRF1的潜在结合位点(图4a)。为了评估其功能相关性，我们使用含有受ccl2启动子控制的荧光素酶基因的报道基因构建体。我们发现IRF1和NF-κB(p65)显著地反式激活ccl2 启动子(图4b)。此外，在ChIP研究中，我们检测到在用LPS/IFNγ活化的星形胶质细胞中NF-κB和IRF1向ccl2启动子显著募集(图4c)。通过用PDMP抑制LacCer合成了阻止该募集，并且PDMP的作用可以通过添加外源LacCer来消除(图4c)。因此，B4GALT6产生的LacCer 控制ccl2表达。

[0172] 为了研究由B4GALT6-LacCer调控ccl2表达的体内相关性，我们分析了炎性单核细胞向用媒介物或用B4GALT6抑制剂PDMP处理的NOD EAE小鼠的CNS中的募集。我们发现B4GALT6抑制使在 EAE期间募集至CNS的炎性单核细胞(定义为CD11b+Ly6C高或者 CD11b+高CD45 细胞)的频率和总数(图4d-h)显著地降低。当在NOD EAE的慢性阶段期间使用慢病毒递送的shRNA在星形胶质细胞中敲低B4GALT6时，还获得类似结果(图4i)。因此，B4GALT6控制CCL-2 的产生以及炎性单核细胞向CNS中的募集。值得注意的是，对 B4GALT6的抑制或用LacCer进行处理未影响纯化ly6c高单核细胞的活力，其在CCL-2梯度中的迁移，或其对LPS/IFNγ刺激的响应(图 4j-m)，从而表明B4GALT6/LacCer未直接作用于单核细胞以控制其向CNS的募集。

[0173] 实施例5。星形胶质细胞中的B4GALT6调控小神经胶质细胞和 CNS浸润单核细胞的活化

[0174] 小神经胶质细胞在CNS炎症的控制中起着重要作用28。为研究 B4GALT5/6对小神经胶质细胞的作用，我们从初次用于实验的小鼠中分离小神经胶质细胞，或在媒介物或PDMP处理的小鼠中NOD EAE的进展型阶段期间，通过NanoString nCounter分析其转录谱。我们发现B4GALT5/6抑制降低了在EAE期间与小神经胶质细胞活化相关的基因的表达(图5a,b)。为进一步分析B4GALT5/6抑制对小神经胶质细胞和CNS浸润单核细胞的作用，我们研究了巨噬细胞/单核细胞谱系中与促或抗炎性表现型(分别为M1或M2)相关的基因的表达，其被认为影响MS和EAE中的疾病病理学29-31。我们发现 B4GALT5/6抑制导致M1相关基因的显著下调，伴随小神经胶质细胞和CNS浸润单核细胞中M2相关基因的上调(图5c、图5d和表3)。因此，虽然在EAE期间B4GALT5/6未由小神经胶质细胞上调，但 LacCer调节小神经胶质细胞和CNS浸润单核细胞的活化。

[0175] 假定体内B4GALT5/6抑制改变了小神经胶质细胞和CNS浸润单核细胞中的M1/M2平衡(图5c,d)，我们研究小神经胶质细胞和单核细胞中B4GALT5/6和LacCer的作用是否是细胞自主的。我们发现不仅活力而且培养的原代小鼠小神经胶质细胞对LPS/IFNγ的响应，在不存星形胶质细胞的情况下都不受B4GALT5/6抑制或LacCer添加的影响(图5e-h)。另外，LacCer未影响柔脑膜噬菌细胞或脉络丛细胞对活化的转录响应(图15a,b)。

[0176] 然而，我们检测到PDMP和LacCer对含有小神经胶质细胞和星形胶质细胞的混合神经胶质培养物中的小神经胶质细胞活化的显著效应(图5i)。为鉴定涉及由星形胶质细胞对小神经胶质细胞活化的调控的B4GALT6/LacCer依赖性机制，我们使用阻断抗体。我们用阻断抗体处理混合神经胶质培养物以中和GM-CSF、IL-12、TNFα、或IL-6 信号传导，并且在LPS/IFNγ和LacCer存在下分析小神经胶质细胞活化(如由nos2上调所示)。我们发现GM-CSF的阻断抑制了小神经胶质细胞nos2的上调中的LacCer依赖性促进(图5j)。的确，我们还发现B4GALT6/LacCer路径在星形胶质细胞活化期间控制NF-κB和 IRF1向csf2(GM-CSF)启动子的募集(图5k)。

[0177] 为评估这些体外发现的生理相关性，我们分析了在NOD EAE的慢性阶段期间，用shRNA进行b4galt6敲低之后，星形胶质细胞中的 csf2表达。与体外结果相符合，b4galt6的敲低导致星形胶质细胞中 csf2表达显著减少(图5l)。此外，星形胶质细胞中b4galt6的特异性敲低导致小神经胶质细胞中nos2表达降低(图5m)。综上所述，这些数据表明，由星形胶质细胞产生的GM-CSF以B4GALT6/LacCer依赖性方式调节小神经胶质细胞活化。

[0178]

[0179] 实施例6。B4GALT6和LacCer水平在MS病变中上调

[0180] 为检查我们发现对于MS的相关性，我们分析来自MS患者和对照的脑部样本中的B4GALT6和B4GALT5表达。我们发现在MS病变中，而非在外观正常白质(NAWM)或对照中，B4GALT5(2.15±0.28倍) 和B4GALT6(8.26.15±2.11倍)表达的显著上调。另外，在来自非MS CNS炎性疾病(NMCID)的脑部样本中，我们检测到B4GALT5 (1.95±0.34)而非B4GALT6表达(0.82±0.37)的上调(图6a)。

[0181] 为进一步研究B4GALT6上调在MS中的作用，我们通过IF分析患者脑部样本，并且检测GFAP+星形胶质细胞中的B4GALT6表达(图 6b)。此外，我们检测到B4GALT6与CCL2和iNOS在GFAP+星形胶质细胞中共表达(图6b)。

[0182] 为研究B4GALT5/6表达的上调的生物学相关性，我们在样本的相同集合中定量LacCer水平。与我们对B4GALT5/6表达的数据相符合，我们在对照、NMCID和MS NAWM样本中检测到类似的LacCer 水平(图6c)。然而，LacCer水平在MS病变中显著地上调，表明增加的B4GALT6活性和LacCer水平也与MS病理学相关。

[0183] 我们接下来研究B4GALT6是否也调节人星形胶质细胞的活性。为此，通过TLR-3激动剂poly(I:C)(外源刺激)或IL-1β(内源刺激)在 PDMP或媒介物对照存在下来活化人原代星形胶质细胞。我们发现 B4GALT6抑制导致CCL2、CCL5、COX2、IL6、NOS2和TLR2表达的显著降低(图6d)。因此，这些结果表明B4GALT6为调控人神经炎性病症中星形胶质细胞活性的潜在性治疗性靶标。

[0184] 实施例7。美格鲁特抑制星形胶质细胞活化

[0185] 如本文证明，LacCer促进星形胶质细胞活化和神经退行性变。美格鲁特，一种批准供人使用的药物(Venier，R.E.&Igdoura， S.A.Miglustat as a therapeutic agent：prospects and caveats.J Med Genet 49，591-597(2012))，跨越血脑屏障并且抑制葡糖神经酰胺(GlcCer) 的合成，所述葡糖神经酰胺(GlcCer)由B4GALT6使用来合成LacCer (图
1A(Venier&Igdoura，J Med Genet 49，591-597(2012)；Jeyakumar 等人，Nature reviews.Neuroscience 6，713-725(2005)；Platt等人 Science(New York，N.Y.)276，428-
431(1997))。为支持其再以星形胶质细胞活性的调节为目的，据发现，与用PDMP观察类似，美格鲁特抑制星形胶质细胞活化(图7B)。因此，美格鲁特可用于在MS和其他神经变性疾病中压制病理性星形胶质细胞活化。

[0186] 实施例8。美格鲁特处理使慢性EAE进展停止

[0187] 实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)构成MS的有用的实验性模型，在归因于MS研究的经证明的记录情况下以及事实上，EAE已直接导致开发出经批准用于多发性硬化(MS)的三种疗法：乙酸格拉默、米托蒽醌以及那他珠单抗。用MOG35-55使非肥胖糖尿病(NOD)小鼠免疫，导致急性发病(急性阶段)，随后是神经损伤的进展型和不可逆累积的阶段(进展型阶段)，其类似于继发进展型MS。

[0188] 为研究在NOD EAE的进展型阶段中美格鲁特的治疗潜力，我们在进展型阶段的开始时开始美格鲁特施用(图16)。美格鲁特每天经由口服或经鼻途径施用。口服处理的小鼠被给予1800kg/mg或600mg/kg 美格鲁特的单次剂量，而经鼻处理的小鼠用900mg/kg的剂量每天两次处理(合计1800mg/kg每日)。我们发现美格鲁特的每天施用压制了疾病进展的临床病程(图16)。此外，炎性单核细胞向CNS的募集也降低(图17)，该募集被认为是MS和其他神经变性病症的发病机理的主要原因(参见例如，David和Kroner，Nat  Rev Neurosci.2011；12(7)：388-99；Lawrence和Natoli，Nat Rev Immunol. 2011；11(11)：750-
61；Murray和Wynn，Nat Rev Immunol. 2011；11(11)：723-37)。值得注意的是，美格鲁特未影响T细胞响应或体重损失(分别为图18和19)。综上所述，这些数据表明美格鲁特施用使慢性EAE进展停止，并且代表用于进展型MS的治疗性方法。

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[0252] 其他实施方案

[0253] 应理解，虽然本发明已结合其发明详述进行了描述，但以上描述意图说明且并非限制本发明的范围，本发明的范围是由所附权利要求书来限定。其它方面、优势和改进在以下权利要求书范围内。