基于LSPR检测精子顶体酶活性的方法、试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种基于LSPR检测精子顶体酶活性的方法、试剂盒及其应用。其中，该试剂盒包含：功能化纳米金标记精子顶体酶底物，包含纳米金以及通过化学键合和/或物理吸附方式固定在纳米金表面的精子顶体酶底物；以及，适于使所述精子顶体酶底物与精子顶体酶专一结合并进行反应的缓冲液。藉由本发明的试剂盒及检测方法，能快速(约3分钟左右)、可靠、灵敏且低成本的检测精子顶体酶的活性。

权利要求

1.一种基于LSPR检测精子顶体酶活性的试剂盒，其特征在于包含：

功能化纳米金标记精子顶体酶底物，包含纳米金以及通过化学键合和/或物理吸附方式固定在纳米金表面的精子顶体酶底物，所述纳米金选自纳米金棒、纳米金球或纳米金立方块，其中纳米金棒的直径为20nm、长度为30nm～50nm，纳米金球的粒径为30～120nm，纳米金立方块的边长为10nm～100nm；

适于使所述精子顶体酶底物与精子顶体酶专一结合并进行反应的缓冲液；以及，记载有所述试剂盒的使用方法的说明书，所述的使用方法包括：控制主要由所述缓冲液和均匀分散在所述缓冲液内的功能化纳米金标记精子顶体酶底物组成的混合溶液的浓度，使所述混合溶液在300-1000nm波长范围内的吸收峰的峰值在

0.6-0.8之间；测定所述混合溶液在300-1000nm波长范围内的吸收光谱，并记录吸收峰对应的吸收波长λ0以及吸收峰强度A0；

在所述混合溶液中加入不同浓度Cn的精子顶体酶溶液，并分别测定在加入不同浓度的精子顶体酶标准溶液之后所获的不同混合反应体系在300-1000nm波长范围内的吸收光谱，记录吸收峰对应波长λn和吸收峰值An，波长偏移值记为Δλn＝λn-λ0，吸收峰偏移值记为ΔAn＝An-A0，探知Cn与Δλn或ΔAn成正比，并由此建立精子顶体酶溶液浓度与波长偏移值或吸收峰偏移值的标准工作曲线，其中n为大于或等于2的自然数；

以及，在所述混合溶液中加入未知浓度Cx的精子顶体酶溶液，并测定由此形成的混合反应体系在300-1000nm波长范围内的吸收波长λx，波长偏移值Δλx＝λx-λ0或吸收峰偏移值ΔAx＝Ax-A0，并依据所述标准工作曲线而计算出Cx。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述精子顶体酶底物通过与修饰在纳米金表面的选定官能团发生偶联反应而固定连接到所述纳米金表面，所述选定官能团来源于两亲性超支化分子，所述两亲性超支化分子包括聚苯乙烯-b-聚丙烯酸,或聚苯乙烯-b-聚乙烯醇。

3.一种精子顶体酶活性的检测装置，其特征在于包含权利要求1-2中任一项所述的试剂盒。

4.一种应用于基于LSPR检测精子顶体酶活性的检测方法的试剂盒，所述试剂盒包括：

功能化纳米金标记精子顶体酶底物，其包含纳米金以及通过化学键合和/或物理吸附方式固定在纳米金表面的精子顶体酶底物，所述纳米金选自纳米金棒、纳米金球或纳米金立方块，其中纳米金棒的直径为20nm、长度为30nm～50nm，纳米金球的粒径为30～120nm，纳米金立方块的边长为10nm～100nm，以及适于使所述精子顶体酶底物与精子顶体酶专一结合并进行反应的缓冲液；

所述的检测方法包括：

控制主要由所述缓冲液和均匀分散在所述缓冲液内的功能化纳米金标记精子顶体酶底物组成的混合溶液在300-1000nm波长范围内的吸收峰的峰值在0.6-0.8之间；

测定所述混合溶液在300-1000nm波长范围内的吸收光谱，并记录吸收峰对应的吸收波长λ0；

在所述混合溶液中加入不同浓度Cn的精子顶体酶溶液，并分别测定在加入不同浓度的精子顶体酶标准溶液之后所获的不同混合反应体系在300-1000nm波长范围内的吸收光谱，记录吸收峰对应波长λn和吸收峰值An，波长偏移值记为Δλn＝λn-λ0，吸收峰偏移值记为ΔAn＝An-A0，探知Cn与Δλn或ΔAn成正比，并由此建立精子顶体酶溶液浓度与波长偏移值或吸收峰偏移值的标准工作曲线，其中n为大于或等于2的自然数；

以及，在所述混合溶液中加入未知浓度Cx的精子顶体酶溶液，并测定由此形成的混合反应体系在300-1000nm波长范围内的吸收波长λx，波长偏移值Δλx＝λx-λ0或吸收峰偏移值ΔAx＝Ax-A0，并依据所述标准工作曲线而计算出Cx。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述功能化纳米金标记精子顶体酶底物的制备方法包括：提供具有明显紫外可见吸收光谱吸收峰的纳米金，

通过化学或者物理方法在所述纳米金表面修饰选定官能团，所述选定官能团来源于两亲性超支化分子，所述两亲性超支化分子包括聚苯乙烯-b-聚丙烯酸,或聚苯乙烯-b-聚乙烯醇，使所述精子顶体酶底物与所述选定官能团进行耦合反应而固定连接在所述纳米金表面。

说明书

基于LSPR检测精子顶体酶活性的方法、试剂盒及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种精子顶体酶的活性评价方法，特别是一种基于纳米金颗粒表面等离子共振(LSPR)检测精子顶体酶活性的方法、试剂盒及其应用，属于生物检测领域。

背景技术

[0002] 顶体酶活性可反映精子质量，顶体酶活力不足可能导致不育，是评价精子功能和生育力强弱的重要指标，结合精液常规分析、精子形态染色等常规指标，能更全面反映精子质量。

[0003] 顶体酶的检测早期多利用顶体酶抗体进行放射免疫法或荧光免疫法检测，通过观察精子顶体内顶体酶的数量判断精子受精能力。后来Kennedy等人首先报道了计算顶体酶水解底物效率的方法判断精子顶体酶的活性，此方法首先将精子裂解，再将裂解液置于加入酶水解底物的检测管中，通过观察底物水解后的显色深浅，计算吸光值检测顶体酶的水解活力。此方法得出指标更能反应精子顶体酶的生理功能，现已成为标准检测方法。

[0004] 近年来又有学者根据精子顶体反应更深入的认识提出，精子顶体酶的活性应由发生顶体反应的精子判断才更符合精子受精的实际生理过程。目前已有报道先进性诱导顶体反应，然后检测发生顶体反应后释放出的顶体酶的活性，以此标示整个精液样本中精子群体的顶体酶活性。然而，目前的检测方法需要借助复杂的仪器，检测花费时间长。

发明内容

[0005] 本发明的主要目的在于提供一种基于纳米金局域表面等离子共振检测精子顶体酶活性的方法，其能实现对精子顶体酶快速、灵敏、实时检测，从而克服了现有技术的不足。

[0006] 本发明的另一重要目的在于提供一种基于纳米金局域表面等离子共振检测精子顶体酶活性的试剂盒。

[0007] 本发明的又一目的在于提供所述检测方法及试剂盒的应用。

[0008] 为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

[0009] 一种基于LSPR检测精子顶体酶活性的试剂盒，其包含：

[0010] 功能化纳米金标记精子顶体酶底物，包含纳米金以及通过化学键合和/或物理吸附方式固定在纳米金表面的精子顶体酶底物；

[0011] 以及，适于使所述精子顶体酶底物与精子顶体酶专一结合并进行反应的缓冲液。

[0012] 进一步的，所述试剂盒还包含记载有所述试剂盒的使用方法的说明书，所述使用方法包括：

[0013] 测定主要由所述缓冲液和均匀分散在所述缓冲液内的功能化纳米金标记精子顶体酶底物组成的混合溶液在300-1000nm波长范围内的吸收光谱，并记录吸收峰对应的吸收波长λ0；

[0014] 在所述混合溶液中加入不同浓度Cn的精子顶体酶溶液，并分别测定在加入不同浓度的精子顶体酶标准溶液之后所获的不同混合反应体系在300-1000nm波长范围内的吸收光谱，记录吸收峰对应波长λn和吸收峰值An，波长偏移值记为Δλn＝λn-λ0，吸收峰偏移值记为ΔAn＝An-A0，探知Cn与Δλn或ΔAn成正比，并由此建立精子顶体酶溶液浓度与波长偏移值或吸收峰偏移值的标准工作曲线，其中n为大于或等于2的自然数；

[0015] 以及，在所述混合溶液中加入未知浓度Cx的精子顶体酶溶液，并测定由此形成的混合反应体系在300-1000nm波长范围内的吸收波长λx，波长偏移值Δλx＝λx-λ0或吸收峰偏移值ΔAx＝Ax-A0，并依据所述标准工作曲线而计算出Cx。

[0016] 作为较佳实施方案之一，所述使用方法还可包括：控制所述混合溶液在300-1000nm波长范围内的吸收峰的峰值在0.6-0.8之间。

[0017] 一种精子顶体酶活性的检测装置，其包含所述的试剂盒。

[0018] 一种基于LSPR检测精子顶体酶活性的检测方法，其包含：

[0019] 提供功能化纳米金标记精子顶体酶底物以及适于使所述精子顶体酶底物与精子顶体酶专一结合并进行反应的缓冲液，所述功能化纳米金标记精子顶体酶底物包含纳米金以及通过化学键合和/或物理吸附方式固定在纳米金表面的精子顶体酶底物；

[0020] 测定主要由所述缓冲液和均匀分散在所述缓冲液内的功能化纳米金标记精子顶体酶底物组成的混合溶液在300-1000nm波长范围内的吸收光谱，并记录吸收峰对应的吸收波长λ0；

[0021] 在所述混合溶液中加入不同浓度Cn的精子顶体酶溶液，并分别测定在加入不同浓度的精子顶体酶标准溶液之后所获的不同混合反应体系在300-1000nm波长范围内的吸收光谱，记录吸收峰对应波长λn和吸收峰值An，波长偏移值记为Δλn＝λn-λ0，吸收峰偏移值记为ΔAn＝An-A0，探知Cn与Δλn或ΔAn成正比，并由此建立精子顶体酶溶液浓度与波长偏移值或吸收峰偏移值的标准工作曲线，其中n为大于或等于2的自然数；

[0022] 以及，在所述混合溶液中加入未知浓度Cx的精子顶体酶溶液，并测定由此形成的混合反应体系在300-1000nm波长范围内的吸收波长λx，波长偏移值Δλx＝λx-λ0或吸收峰偏移值ΔAx＝Ax-A0，并依据所述标准工作曲线而计算出Cx。

[0023] 作为较佳实施方案之一，所述检测方法还可包括：控制所述混合溶液在300-1000nm波长范围内的吸收峰的峰值在0.6-0.8之间。

[0024] 在本发明的一实施方案之中，所述精子顶体酶底物通过与修饰在纳米金表面的选定官能团发生偶联反应而固定连接到所述纳米金表面。

[0025] 其中，用于将纳米金功能化从而提供与精子顶体酶底物偶联的官能团不限于某种特定的种类，本领域技术人员依据本说明应当能够很容易的理解，凡是能修饰在纳米金表面并能与精子顶体酶底物作用的官能团都是适用的，其中，所述官能团末端的基团可以是羧基、氨基或者其他活性基团。

[0026] 进一步的，在本发明的一实施方案之中，所述功能化纳米金标记精子顶体酶底物的制备方法包括：

[0027] 提供具有明显紫外可见吸收光谱吸收峰的纳米金，

[0028] 通过化学或者物理方法在所述纳米金表面修饰选定官能团，

[0029] 使所述精子顶体酶底物与所述选定官能团进行耦合反应而固定连接在所述纳米金表面。

[0030] 进一步的，所述纳米金的尺寸范围为20m～150nm。

[0031] 进一步的，所述纳米金包括纳米金棒、纳米金球或纳米金立方块，但不限于此。

[0032] 优选的，所述纳米金棒的直径约20nm，长度为30nm～50nm，所述纳米金球的粒径约30～120nm，所述纳米金立方块的边长约10nm～100nm。

[0033] 进一步的，所述精子顶体酶底物可以是能与精子顶体酶反应(例如水解)的任何合适种类，例如ZP3蛋白等。

[0034] 进一步的，所述缓冲液可以是PBS缓冲液等，其pH值优选为7左右。

[0035] 与现有技术相比，本发明有益效果至少在于：

[0036] (1)通过合理设计金纳米的尺寸，纳米金(例如金纳米棒)的紫外可见吸收光谱在常规的紫外可见分光光度计的测量范围之内，不需要使用特殊的紫外可见分光光度计进行检测；

[0037] (2)利用功能化物质，特别是超支化高分子对纳米金，例如金纳米棒表面进行修饰，可以为精子顶体酶底物提供结合位点，提高在纳米金，例如金纳米棒表面修饰精子顶体酶蛋白底物的密度，提高检测精子顶体酶的检测限和灵敏度(0.1～50μmol/L)；

[0038] (3)藉由本发明的试剂盒及检测方法，能快速(3分钟左右)、可靠、灵敏且低成本的检测精子顶体酶的活性。

附图说明

[0039] 图1是本发明一典型实施方案之中在金纳米棒表面修饰精子顶体酶底物的示意图；

[0040] 图2是本发明一典型实施方案之中精子顶体酶底物修饰的纳米金棒检测精子顶体酶的示意图；

[0041] 图3是本发明一典型实施方案之中制备的纳米金棒的透射电镜照片；

[0042] 图4是本发明一典型实施方案之中制备的纳米金球的透射电镜照片。

具体实施方式

[0043] 如前所述，鉴于现有技术的诸多缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，即，一种基于纳米金局域表面等离子共振(LSPR)检测精子顶体酶活性的方法，其主要是通过在纳米金表面修饰精子顶体酶底物，利用精子顶体酶水解顶体酶底物引起纳米金的表面等离子共振信号的变化，实现对精子顶体酶快速、灵敏、实时检测。

[0044] 进一步的讲，在本发明的一实施方案之中，一种基于LSPR检测精子顶体酶活性的方法可以包含：

[0045] (1)提供精子顶体酶底物修饰的纳米金，包括：

[0046] 纳米金，主要利用其表面等离子共振信号受外界环境的介电常数的影响，可以监测精子顶体酶与精子顶体酶底物作用过程中的变化；

[0047] 修饰在纳米金表面的官能团，主要是在纳米金棒表面提供大量的可以与精子顶体酶蛋白结合的位点，较为优选的，可以采用两亲性超支化分子(例如，聚苯乙烯-b-聚丙烯酸,或者聚苯乙烯-b-聚乙烯醇)对纳米金表面进行官能化，其优点在于：a、两亲性超支化高分子可以提高纳米金在不同溶剂中的稳定性，不会发生团聚；b、超支化高分子的外围可以暴露出更多的官能团，便于进一步修饰。

[0048] 精子顶体酶底物(例如ZP3蛋白)，通过物理方式或与纳米金表面的官能团反应，尤其优选是后一种方式而固定在纳米金的表面。

[0049] (2)纳米金的等离子共振信号的检测：精子顶体酶水解精子顶体酶底物(例如ZP3蛋白)后，引起纳米金(例如金纳米棒)周围环境的介电常数发生变化，通过紫外可见吸收光谱可以清楚的检测出这一变化。

[0050] 在一更为具体的实施方案之中，一种基于LSPR检测精子顶体酶活性的方法具体包括：

[0051] a.制备纳米金；

[0052] b.纳米金表面功能化。通过化学或者物理方法在纳米金外修饰上官能团；

[0053] c.功能化纳米金标记精子顶体酶底物。精子顶体酶底物通过与步骤(2)中修饰的官能团反应或者物理吸附作用固定在纳米金表面。

[0054] d.纳米金/精子顶体酶底物杂化体系检测顶体酶。测定被精子顶体酶底物修饰的纳米金的紫外可见吸收光谱，其紫外可见吸收峰对应的波长记为λa，加入精子顶体酶后，精子顶体酶底物被精子顶体酶部分水解，测定部分水解的精子顶体酶底物修饰的纳米金的紫外可见吸收光谱，其纵向吸收峰对应的波长为λb，吸收峰波长的差值记为Δλ＝λa-λb,精子顶体酶的浓度c与Δλ成正比。

[0055] e.定量检测设备的制备及评价。

[0056] 其中，纳米金的形貌包括纳米金棒、纳米金球、纳米金立方块等。

[0057] 其中，纳米金(例如金纳米棒)的功能化不限于某种特定的反应和方法，凡是能在纳米金表面修饰上能与精子顶体酶底物作用官能团的适用方法都是可行的。

[0058] 进一步的，所述精子顶体酶底物的主要特点是能与精子顶体酶专一结合。任意一种精子顶体酶底物都可以作为被纳米金标记的底物。

[0059] 前述的本发明实施方案之中，主要是利用纳米金的表面等离子共振的变化与精子顶体酶的浓度成正比进行检测的。但是，本领域技术人员应当知悉，利用等离子共振变化的其他参数如纳米金吸收峰的强度的也可以用来检测精子顶体酶浓度。

[0060] 此外，适合利用本发明的试剂盒和检测方法进行检测的精子顶体酶应当不限于人类的精子，而还可以是一般性哺乳动物如猪、狗、马等动物的精子顶体酶。

[0061] 又，在本发明的一典型实施案例中，本发明的技术方案可通过如下方式实现：

[0062] (1).制备纳米金棒：纳米金棒的制备主要分为两个步骤:种子溶液制备和金种生长。

[0063] i)种子溶液制备：将5mL 0.5mM HAucl4溶液和5mL 0.2M CTAB溶液混合，在剧烈搅拌条件下(1200r/min)将0.6mL新配置的0.01M硼氢化钠(NaBH4)溶液稀释到1mL然后加入到上述混合溶液中，搅拌2min后停止，所得溶液作为生长金纳米棒的种子；

[0064] ii)种子生长：在25℃条件下将5mL 0.2M CTAB溶液和0.2mL 4mM AgNO3混合，再加入5.0mL 1mM HAuCl4溶液，搅拌混合均匀后加入70μL 0.0788M抗坏血酸；最后取12μL种子溶液加入到生长液中，在30℃下静置6h即可。制备的金纳米棒在8000r/min条件下离心10min,以去除金纳米棒表面的CTAB。

[0065] (2)在纳米金棒表面修饰末端为羟基的超支化高分子的技术路线(图1)如下：

[0066] a)首先纳米金棒与2,2'-二硫代双[1-(2-溴-2-甲基-丙酰氧基)]乙烷(DTBE)通过硫金键(S-Au)反应吸附在金纳米棒周围，大分子引发剂引发苯乙烯(PS)单体聚合反应生成聚苯乙烯。将10mg DTBE溶解在100mL DMF中，在剧烈搅拌条件下加入1mL上述去除CTAB的金纳米棒溶液，再加入30mg苯乙烯在40℃下搅拌12h。

[0067] b)进一步引发2-((溴丁酰)氧基)乙基丙烯酸酯(BBEA)进行自缩合乙烯基聚合反应(SCVP)，在金表面修饰上超支化的高分子聚合物。再添加15mg丙烯酸单体(AA)单体进行聚合，在金纳米棒外围修饰上大量的羧基。

[0068] (3)精子顶体酶底物修饰的：将96mg EDC和29mg NHS溶于10mL去离子水，3mL外围含有大量羧基的纳米金棒在5000r/min条件下离心10min浓缩到500μL后在快速搅拌条件下加入到上述溶液中，利用PBS缓冲液调pH到7.1，然后加入400μL 2mg/mL精子顶体酶底物ZP3蛋白，在25℃下培育1h。反应液在10000r/min条件下离心，除去没有偶联到金纳米棒表面的抗体。

[0069] (4)纳米金棒-精子顶体酶底物杂化体系检测顶体酶。首先建立一条工作曲线，取适量精子顶体酶修饰的金纳米棒溶液于石英比色皿中，控制上述溶液的浓度以保证金纳米棒纵向吸收峰的峰值在0.6-0.8之间为宜，在300-1000nm波长范围内测定精子顶体酶修饰的金纳米棒的吸收光谱，其纵向吸收峰对应的波长记为λ0，在上述溶液中加入含有不同浓度Cn的精子顶体酶的溶液，分别测定加入不同浓度的精子顶体酶的紫外可见吸收光谱λn，波长偏移值记为Δλn＝λn-λ0,建立Cn和Δλn之间的关系。对于未知浓度c的精子顶体酶，可以利用测定的Δλ进行计算。

[0070] 以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。

[0071] 实施例1：使用精子顶体酶底物修饰的金纳米棒检测精子顶体酶

[0072] 1.制备纳米金棒：纳米金棒的制备主要分为两个步骤:种子溶液制备和金种生长。1)种子溶液制备：将5mL 0.5mM HAucl4溶液和5mL 0.2M CTAB溶液混合，在剧烈搅拌条件下(1200r/min)将0.6mL新配置的0.01M硼氢化钠(NaBH4)溶液稀释到1mL然后加入到上述混合溶液中，搅拌2min后停止，所得溶液作为生长金纳米棒的种子；2)种子生长：在25℃条件下将5mL 0.2M CTAB溶液和0.2mL 4mM AgNO3混合，再加入5.0mL 1mM HAuCl4溶液，搅拌混合均匀后加入70μL 0.0788M抗坏血酸；最后取12μL种子溶液加入到生长液中，在30℃下静置6h即可。制备的金纳米棒在8000r/min条件下离心10min,以去除金纳米棒表面的CTAB。制备的纳米金棒的TEM如图3所示。

[0073] 2.在纳米金棒表面修饰末端为羟基的超支化高分子的技术路线(参阅图1)如下：

[0074] a)首先纳米金棒与2,2'-二硫代双[1-(2-溴-2-甲基-丙酰氧基)]乙烷(DTBE)通过硫金键(S-Au)反应吸附在金纳米棒周围，大分子引发剂引发苯乙烯(PS)单体聚合反应生成聚苯乙烯。将10mg DTBE溶解在100mL DMF中，在剧烈搅拌条件下加入1mL上述去除CTAB的金纳米棒溶液，再加入30mg苯乙烯在40℃下搅拌12h。b)进一步引发2–((溴丁酰)氧基)乙基丙烯酸酯(BBEA)进行自缩合乙烯基聚合反应(SCVP)，在金表面修饰上超支化的高分子聚合物。添加15mg丙烯酸单体(AA)单体进行聚合，在金纳米棒外围修饰上大量的羧基。

[0075] 3.精子顶体酶底物修饰的：将96mg EDC和29mg NHS溶于10mL去离子水，3mL外围含有大量羧基的纳米金棒在5000r/min条件下离心10min浓缩到500μL后在快速搅拌条件下加入到上述溶液中，利用PBS缓冲液调pH到7.1，然后加入400μL 2mg/mL精子顶体酶底物ZP3蛋白，在25℃下培育1h。反应液在10000r/min条件下离心，除去没有偶联到金纳米棒表面的抗体。

[0076] 4.纳米金棒-精子顶体酶底物杂化体系检测顶体酶。首先建立一条工作曲线，取适量精子顶体酶修饰的金纳米棒溶液于石英比色皿中，控制上述溶液的浓度以保证金纳米棒纵向吸收峰的峰值在0.6-0.8之间为宜，在300-1000nm波长范围内测定精子顶体酶修饰的金纳米棒的吸收光谱，其纵向吸收峰对应的波长记为λ0，在上述溶液中加入含有不同浓度Cn的精子顶体酶的溶液，分别测定加入不同浓度的精子顶体酶的紫外可见吸收光谱λn，波长偏移值记为Δλn＝λn-λ0,建立Cn和Δλn之间的关系。对于未知浓度c的精子顶体酶，可以利用测定的Δλ进行计算

[0077] 5.参考所做的标准曲线图，测定样品中精子顶体酶的浓度为5μM，检测范围为0.01μM～50μM。

[0078] 实施例2：使用精子顶体酶底物修饰的纳米金球检测精子顶体酶

[0079] 1.制备纳米金球：取100mL 2.5×10-4mol/L HAuCl4溶液加热至100-150℃，加入10mL 1％柠檬酸三钠溶液，当溶液的颜色完全变为透明的酒红色时,继续回流10min后停止加热，冷却至室温，4℃保存，得到的纳米金球紫外光谱吸收波长为526nm。纳米金球的透射电镜图见图4。

[0080] 2.纳米金颗粒的标记：将10mg DTBE溶解在100mL DMF中，在剧烈搅拌条件下加入20mL上述纳米近球溶液，在加入30mg苯乙烯在40℃下搅拌12h。然后加入40mg BBEA单体，引发聚合，形成超支化高分子，反应一段时间后，添加15mg丙烯酸单体(AA)，从在金纳米棒外围修饰上大量的羧基。

[0081] 3.精子顶体酶底物修饰的金纳米：将96mg EDC和29mg NHS溶于10mL去离子水，10mL外围含有大量羧基的纳米金球在5000r/min条件下离心10min，浓缩到500μL后在快速搅拌条件下加入到上述溶液中，利用PBS缓冲液调pH到7.1，然后加入400μL 2mg/mL精子顶体酶底物ZP3蛋白，在25℃下培育1h。反应液在10000r/min条件下离心10min，除去没有偶联到纳米金球表面的抗体。

[0082] 4.纳米金球-精子顶体酶底物杂化体系检测顶体酶。首先建立一条工作曲线，取10mL精子顶体酶修饰的纳米金球溶液与石英比色皿中，控制上述溶液的浓度以保证纳米金吸收峰的峰值在0.6-0.8之间为宜，在300-1000nm波长范围内测定精子顶体酶修饰的纳米金球的吸收光谱，其吸收峰对应的波长记为λ0，在上述溶液中加入含有不同浓度Cn的精子顶体酶的溶液，分别测定加入不同浓度的精子顶体酶的紫外可见吸收光谱λn，波长偏移值记为Δλn＝λn-λ0,建立Cn和Δλn之间的关系。对于未知浓度的精子顶体酶c，可以利用测定的Δλ进行计算。

[0083] 5.参考所做的标准曲线图，测定样品中精子顶体酶的浓度为7μM，检测范围为0.01μM～30μM。

[0084] 最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

[0085] 本领域技术人员应当理解，以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。