一种紫色马铃薯快速脱毒的组培方法

摘要

本发明提供了一种紫色马铃薯快速脱毒的组培方法，包括以下步骤：1)切取紫色马铃薯的芽茎段；2)将所述切下的芽茎段依次进行无菌水清洗、酒精瞬时消毒、消毒液浸泡消毒和无菌水冲洗，得到消毒后的芽茎段；3)将所述消毒后的芽茎段置于超净工作台，在显微镜下剥离芽茎段顶端的茎尖，然后将茎尖接种在培养基中进行一次组织培养，得到一次试管苗；4)剥离所述一次试管苗的茎尖，进行二次组织培养，得到二次试管苗；5)重复所述步骤4)的剥离和组织培养，所述重复的次数为3～5次，得到脱毒的试管苗。本发明所述方法培养的紫色马铃薯的脱毒率高达93％，繁殖周期缩短至2～4个月，可实现紫色马铃薯的批量快速繁殖，降低培养成本。

权利要求

1.一种紫色马铃薯快速脱毒的组培方法，包括以下步骤：

1)把紫色马铃薯的嫩芽切下，获得切下的嫩芽；

2)将所述切下的嫩芽依次进行无菌水清洗、酒精瞬时消毒、消毒液浸泡消毒和无菌水冲洗，得到消毒后的芽茎段；

所述的无菌水清洗的时间为10～20min；

所述的酒精瞬时消毒的时间为2～4s，所述酒精的体积浓度为85～98％；

所述的消毒液为质量分数为5.5％～6.5％的次氯酸钠水溶液；

所述的消毒液浸泡消毒的时间为15～25min；

所述无菌水冲洗的时间为3～5min；

3)将所述消毒后的芽茎段置于超净工作台，在显微镜下剥离芽茎段顶端的茎尖，获得剥离后的茎尖；所述的剥离后的茎尖带有1个叶原基，然后将茎尖接种在培养基中进行一次组织培养，得到一次试管苗；

4)剥离所述一次试管苗的茎尖，进行二次组织培养，得到二次试管苗；

5)重复所述步骤4)的剥离和组织培养，所述重复的次数为3～5次，得到脱毒的试管苗；

步骤3)和步骤4)中所述组织培养用的培养基为改良的MS培养基，所述的改良的MS培养基是在MS培养基中添加了以下终浓度的组分：BA0.04～0.06mg/L，NAA0.18～0.22mg/L，2，

4-D0.4～0.6mg/L，蔗糖30wt％和马铃薯磨粉液20wt％；

步骤3)和步骤4)中所述组织培养的光照强度为2800～3000Lx；

步骤3)和步骤4)中所述组织培养的温度为22～25℃；

所述一次组织培养的时间为10～25天。

说明书

一种紫色马铃薯快速脱毒的组培方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物的组织培养技术领域，尤其涉及一种紫色马铃薯快速脱毒的组培方法。

背景技术

[0002] 紫色马铃薯，薯形呈长椭圆形，芽眼较小，果肉为深紫色，富含花青素等天然色素。紫色马铃薯外观好看，颜色诱惑力强，产品加工过程中无需添加任何色素和增色剂，极为健康。

[0003] 紫色马铃薯原产地为南美秘鲁等国，目前我国国内已有单位、个人引进紫色马铃薯的一些品种。但是由于不同紫色马铃薯在种植过程中，引种的地区有所不同，种植后不同地区的品种在同一地块、面积、数量、单体重量一致进行种植试验，各品种出现很大的差异。一是植株生长衰退，复叶萎缩；二是株型变矮，叶面皱缩；三是叶片出现黄绿相间的斑点，叶脉坏死，复叶脱落等，还有部分引进品种在第一次种植时产量高，保留种后第二次种植产量低，块茎小退化严重；紫色马铃薯引种后不能长期稳定的生长，尤其是留种的后代不能保持植株原有性能和产量。究其原因是引种后在种植地种植的过程中，遭到病菌、病毒等的侵染，然而现有技术中并没有成熟有效的紫色马铃薯脱毒培养方法。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种紫色马铃薯快速脱毒的组培方法。

[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种紫色马铃薯快速脱毒的组培方法，包括以下步骤：

[0007] 1)把紫色马铃薯的芽切下；

[0008] 2)将所述切下的嫩芽依次进行无菌水清洗、酒精瞬时消毒、消毒液浸泡消毒和无菌水冲洗，得到消毒后的芽茎段；

[0009] 3)将所述消毒后的芽茎段置于超净工作台，在显微镜下剥离芽茎段顶端的茎尖，然后将茎尖接种在培养基中进行一次组织培养，得到一次试管苗；

[0010] 4)剥离所述一次试管苗的茎尖，进行二次组织培养，得到二次试管苗；

[0011] 5)重复所述步骤4)的剥离和组织培养，所述重复的次数为3～5次，得到脱毒的试管苗。

[0012] 优选的，步骤1)中所述的剥离后的茎尖带有1个叶原基。

[0013] 优选的，步骤2)中所述的无菌水清洗的时间为10～20min。

[0014] 优选的，步骤2)中所述的消毒液为质量分数为5.5％～6.5％的次氯酸钠水溶液或质量分数为1.2～2.5％的汞溶液。

[0015] 优选的，步骤2)中所述的酒精瞬时消毒的时间为2～4s，所述酒精的体积浓度为70～80％。

[0016] 优选的，步骤2)中所述的消毒液浸泡消毒的时间为15～25min。

[0017] 优选的，步骤2)中所述无菌水冲洗的时间为3～5min。

[0018] 优选的，步骤3)和步骤4)中所述组织培养用的培养基为改良的MS培养基，所述的改良的MS培养基是在MS培养基中添加了以下终浓度的组分：BA，0.04～0.06mg/L，NAA，0.18～0.22mg/L，24-D，0.4～0.6mg/L，蔗糖30wt％和马铃薯磨粉液20wt％。

[0019] 优选的，步骤3)和步骤4)中所述组织培养的光照强度为2800～3000Lx。

[0020] 优选的，步骤3)和步骤4)中所述组织培养的温度为22～25℃

[0021] 本发明的有益效果：本发明所述方法通过反复剥离紫色马铃薯茎尖上最新长出的叶原基，降低了原种携带病毒的几率，再通过快速组织培养，从而提高了紫色马铃薯试管苗的脱毒率，进一步的提高紫色马铃薯试管苗的稳定性；本发明所述方法培养的紫色马铃薯的脱毒率高达93％，繁殖周期缩短至2～4个月，可实现紫色马铃薯的批量快速繁殖，降低培养成本，本发明所述的方法培养的紫色马铃薯与传统的紫色马铃薯培养方法相比，产量增加了20％。

具体实施方式

[0022] 本发明提供了一种紫色马铃薯快速脱毒的组培方法，包括以下步骤：

[0023] 1)把紫色马铃薯的芽切下；2)将所述切下的嫩芽依次进行无菌水清洗、酒精瞬时消毒、消毒液浸泡消毒和无菌水冲洗，得到消毒后的芽茎段；3)将所述消毒后的芽茎段置于超净工作台，在显微镜下剥离芽茎段顶端的茎尖，然后将茎尖接种在培养基中进行一次组织培养，得到一次试管苗；4)剥离所述一次试管苗的茎尖，进行二次组织培养，得到二次试管苗；5)重复所述步骤4)的剥离和组织培养，所述重复的次数为3～5次，得到脱毒的试管苗。

[0024] 本发明中所述的紫色马铃薯优选的为从国外引进的紫色马铃薯或者国内选育的紫色马铃薯，具体的品种优选的为：云斯特(云南七彩马铃薯)、黑美人、黑金刚、红宝石、紫云1号和红色薯系列S03-2744。

[0025] 本发明在对所采的马铃薯嫩芽上的茎尖进行剥离之前，优选的对马铃薯嫩芽进行预消毒处理，所述的预消毒处理优选的为：将带芽的马铃薯薯块至于体积分数为70～80％的酒精中浸泡4～6min；晾干后采用体积分数为70～80％的酒精对马铃薯薯块表面进行擦拭消毒。本发明为了取得更好有活力的茎尖材料，采用上述较为温和的预消毒处理手段。

[0026] 本发明中所述的茎尖剥离中使用的茎尖优选的为从顶尖切割的长度为0.2～0.3mm的茎尖，所述茎尖优选的带有1～2个叶原基；本发明优选的对所述的芽进行茎尖剥离，使得剥离后的茎尖带有1个叶原基。在本发明中，所述的剥离的具体操作优选的为：将紫色马铃薯嫩芽放置于40倍的解剖镜下，用解剖针或者解剖刀将茎尖1～2个叶原基部位分剥切断保留1个叶原基，得到剥离后的茎尖。

[0027] 本发明得到切下的紫色马铃薯嫩芽，将所述切下的紫色马铃薯嫩芽依次进行无菌水清洗、酒精瞬时消毒、消毒液浸泡消毒和无菌水冲洗，得到消毒后的嫩芽。由于嫩芽较小而且数量较多，本发明优选使用纱布包裹切下的紫色马铃薯嫩芽，然后对包裹的嫩芽进行无菌水清洗；用纱布包裹起来清洗不会导致嫩芽被冲散，避免材料的浪费。在本发明中，所述的无菌水清洗的时间优选的为10～20min，更优选的为15min。

[0028] 完成无菌水清洗后，本发明对所述无菌水清洗后的紫色马铃薯嫩芽进行酒精瞬时消毒。在本发明中，所述酒精瞬时消毒的时间优选的为2～4s，更优选的为3s；所述酒精的体积浓度优选的为85～98％，更优选的为88～97％，最优选的为95％。

[0029] 本发明在完成紫色马铃薯嫩芽的酒精瞬时消毒之后，对嫩芽进行消毒液浸泡消毒。本发明中所述的消毒液优选的为质量分数为5.5％～6.5％次氯酸钠水溶液或质量分数为1.2～2.5％汞溶液；更优选的为质量分数为5.8～6.2％次氯酸钠水溶液或者质量分数为1.5～2.2％的汞溶液，最优选的为质量分数为6.0％次氯酸钠水溶液或者质量分数为2.0％的汞溶液。在本发明中，所述消毒液浸泡消毒的时间优选为15～25min，更优选为17～
23min，更优选的为20min。

[0030] 本发明在浸泡液浸泡消毒茎尖后，对嫩芽进行无菌水冲洗。在本发明中，所述无菌水冲洗的时间优选为3～5min，更优选的为4min。

[0031] 嫩芽完成无菌水冲洗后，本发明优选将嫩芽放于消毒后的吸水纸上进行吸水。在本发明中，所述吸水的时间优选的为0.5～1.5min，更优选的为1min。本发明对所述的无菌水的来源无特殊要求，采用本领域常规的无菌水即可，具体的可为自制的灭菌水或市售的无菌水。

[0032] 本发明得到消毒后的嫩芽，消毒后的嫩芽置于超净工作台，然后再显微镜下进行茎尖剥离，并把茎尖接种于培养基中进行一次组织培养，得到一次试管苗。在本发明中，所述一次组织培养的光照强度优选的为2800～3000Lx；更优选的为2850～2950Lx，最优选的为2900Lx。本发明中，所述一次组织培养的温度优选的为22～25℃，更优选的为23～24℃；所述一次组织培养的时间优选的为10～25天，更优选的为15～22天，最优选的为20天。

[0033] 本发明中所述的一次组织培养所用的培养基优选为改良的MS培养基，所述的改良的MS培养基是在MS培养基中添加了以下终浓度的组分：BA 0.04～0.06mg/L，NAA 0.18～0.22mg/L，24-D 0.4～0.6mg/L，蔗糖30wt％和马铃薯磨粉液20wt％。

[0034] 本发明在得到一次试管苗后，剥离所述一次试管苗的茎尖，进行二次组织培养，得到二次试管苗；本发明中剥离所述一次试管苗的茎尖的方法与上述茎尖剥离的方法相同，二次组织培养的方法与一次组织培养的方法相同，具体操作的参数可在上述限定的范围内独立选择，不在此重复赘述。

[0035] 本发明在得到二次试管苗之后重复上述的剥离和组织培养操作，所述重复的次数优选的为3～5次，更优选的为4次，每一次重复的剥离和组织培养的具体操作参数均可在上述限定的范围内独立选择，重复剥离和组织培养后得到脱毒的试管苗。

[0036] 下面结合实施例对本发明提供的紫色马铃薯快速脱毒的组培方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0037] 实施例1

[0038] 采自田间地块的带茎尖的黑美人马铃薯薯块，将带芽的马铃薯薯块置于体积分数为75％的酒精中浸泡5min，取出置于通风处晾干，然后采用体积分数为75％的酒精对马铃薯薯块表面进行擦拭消毒。切下2～3cm紫色马铃薯嫩芽，使用纱布包裹切下的嫩芽依次在装满无菌水的水池中清洗嫩芽15min、置于体积分数为95％酒精中消毒3s、置于质量分数为6.0％的次氯酸钠水溶液中浸泡20min、用无菌水冲洗茎尖4min后，放于消毒后的吸水纸上吸水1min。将2～3cm的嫩芽放置于40倍的解剖镜下，用解剖针将茎尖1个叶原基部位分剥切断保留1个叶原基，得到剥离后的茎尖。然后将茎尖接于改良的MS培养基中进行一次组织培养，所述的改良的MS培养基的组成为：MS培养基，添加BA0.05mg/L，NAA0.2mg/L，24-D 
0.5mg/L，30wt％蔗糖，20wt％马铃薯磨粉液。一次组织培养的光照强度为2900Lx，温度为24℃；时间为20天。

[0039] 得到一次试管苗后，剥离所述一次试管苗的茎尖，在上述依次组织培养的条件下进行二次组织培养，得到二次试管苗；然后剥离二次试管苗的茎尖再进行三次组织培养后得到脱毒的试管苗，所述三次组织培养最终得到脱毒试管苗的时间为2个月。

[0040] 本实施例中，成活的脱毒试管苗的生长和脱毒情况见表1。

[0041] 表1本发明实施例1得到的成活的脱毒试管苗的生长和脱毒情况

[0042]

[0043] 由表1可以看出，本实施例中得到的脱毒试管苗成活率为60％、生长快、脱毒率高达93％。

[0044] 实施例2

[0045] 采自田间地块的带茎尖的紫云1号马铃薯薯块，将带芽的马铃薯薯块置于体积分数为75％的酒精中浸泡5min，然后取出置于通风处晾干，然后采用体积分数为75％的酒精对马铃薯薯块表面进行擦拭消毒。切下2～3cm紫色马铃薯嫩芽，使用纱布包裹切下的嫩芽依次在装满无菌水的水池中清洗嫩芽15min、置于体积分数为95％酒精中消毒3s、置于质量分数为6.0％的次氯酸钠水溶液中浸泡20min、用无菌水冲洗茎尖4min后，放于消毒后的吸水纸上吸水1min。将2～3cm的嫩芽放置于40倍的解剖镜下，用解剖刀将茎尖2个叶原基部位分剥切断保留1个叶原基，得到剥离后的茎尖。然后将茎尖接于改良的MS培养基中进行一次组织培养，所述的改良的MS培养基的组成为：MS培养基，添加BA0.05mg/L，NAA0.2mg/L，24-D 0.5mg/L，30wt％蔗糖，20wt％马铃薯磨粉液。一次组织培养的光照强度为2950Lx，温度为22℃；时间为23天。

[0046] 得到一次试管苗后，剥离所述一次试管苗的茎尖，进行二次组织培养，得到二次试管苗；然后剥离二次试管苗的茎尖再进行三次组织培养，重复尖剥离和组织培养4次后得到脱毒的试管苗，所述4次组织培养最终得到脱毒试管苗的时间为3个月。本实施例中，成活的脱毒试管苗的生长和脱毒情况见表2。

[0047] 表2

[0048]茎尖数 4～6片叶试管苗数 生长速度 成活率(％) 脱毒率(％)
20 10 很快 50 92

[0049] 由表2可以看出，本实施例中得到的脱毒试管苗成活率为50％、生长快、脱毒率高达92％。

[0050] 实施例3

[0051] 采自田间地块的带茎尖的黑金刚马铃薯薯块，将带芽的马铃薯薯块至于体积分数为75％的酒精中浸泡3min，然后取出置于通风处晾干，然后采用体积分数为75％的酒精对马铃薯薯块表面进行擦拭消毒。切下2～3cm紫色马铃薯嫩芽，使用纱布包裹切下的嫩芽依次在装满无菌水的水池中清洗嫩芽15min、置于体积分数为95％酒精中消毒3s、置于质量分数为6.0％的次氯酸钠水溶液中浸泡20min、用无菌水冲洗茎尖4min后，放于消毒后的吸水纸上吸水1min。将2～3cm的嫩芽放置于40倍的解剖镜下，用解剖针将茎尖2个叶原基部位分剥切断保留1个叶原基，得到剥离后的茎尖。然后将茎尖接于改良的MS培养基中进行一次组织培养，所述的改良的MS培养基的组成为：MS培养基，添加BA0.05mg/L，NAA0.2mg/L，24-D 0.5mg/L，30wt％蔗糖，20wt％马铃薯磨粉液。一次组织培养的光照强度为2850Lx，温度为24℃；时间为18天。

[0052] 得到一次试管苗后，剥离所述一次试管苗的茎尖，进行二次组织培养，得到二次试管苗；然后剥离二次试管苗的茎尖再进行三次组织培养，重复茎尖剥离和组织培养5次后得到脱毒的试管苗，所述脱毒试管苗的培养时间为3个月。

[0053] 本实施例中，成活的脱毒试管苗的生长和脱毒情况见表3。

[0054] 表3

[0055]茎尖数 4～6片叶试管苗数 生长速度 成活率(％) 脱毒率(％)
20 9 较快 45 91

[0056] 由表3可以看出，本实施例中得到的脱毒试管苗成活率为45％、生长快、脱毒率高达91％。

[0057] 实施例4

[0058] 采自田间地块的带茎尖的黑美人马铃薯薯块，将芽的马铃薯薯块置于体积分数为75％的酒精中浸泡5min，取出置于通风处晾干，然后采用体积分数为75％的酒精对马铃薯薯块表面进行擦拭消毒。切下2～3cm紫色马铃薯嫩芽，使用纱布包裹切下的嫩芽依次在装满无菌水的水池中清洗嫩芽15min、置于体积分数为95％酒精中消毒3s、置于质量分数为
6.0％的次氯酸钠水溶液中浸泡20min、用无菌水冲洗茎尖4min后，放于消毒后的吸水纸上吸水1min。将2～3cm的嫩芽放置于40倍的解剖镜下，用解剖针将茎尖1个叶原基部位分剥切断保留1个叶原基，得到剥离后的茎尖。然后将茎尖接于改良的MS培养基中进行一次组织培养，所述的改良的MS培养基的组成为：MS培养基，添加BA0.05mg/L，NAA0.2mg/L，24-D 
0.5mg/L，30wt％蔗糖，20wt％马铃薯磨粉液。一次组织培养的光照强度为2900Lx，温度为24℃；时间为20天。

[0059] 得到一次试管苗后，剥离所述一次试管苗的茎尖，将一次试管苗的茎尖放置于40倍的解剖镜下，用解剖针将茎尖1个叶原基部位分剥切断保留1个叶原基，得到剥离后的茎尖。然后将所述的一次试管苗的茎尖接于改良的MS培养基中进行二次组织培养，所述的改良的MS培养基的组成为：MS培养基，添加BA0.05mg/L，NAA0.2mg/L，24-D 0.5mg/L，30wt％蔗糖，20wt％马铃薯磨粉液。二次组织培养的光照强度为2950Lx，温度为22℃；时间为23天，得到二次试管苗；

[0060] 得到二次试管苗后，剥离所述二次试管苗的茎尖，将二次试管苗的茎尖放置于40倍的解剖镜下，用解剖针将茎尖1个叶原基部位分剥切断保留1个叶原基，得到剥离后的茎尖。然后将所述的二次试管苗的茎尖接于改良的MS培养基中进行三次组织培养，所述的改良的MS培养基的组成为：MS培养基，添加BA0.05mg/L，NAA0.2mg/L，24-D 0.5mg/L，30wt％蔗糖，20wt％马铃薯磨粉液。三次组织培养的光照强度为2950Lx，温度为22℃；时间为19天，得到三次试管苗；

[0061] 本实施例中，成活的脱毒试管苗的生长和脱毒情况见表4。

[0062] 表4本发明实施例4得到的成活的脱毒试管苗的生长和脱毒情况

[0063]茎尖数 4～6片叶试管苗数 生长速度 成活率(％) 脱毒率(％)
20 12 很快 60 92

[0064] 由表4可以看出，本实施例中得到的脱毒试管苗成活率为60％、生长快、脱毒率高达92％。

[0065] 对比例1

[0066] 传统的引种栽种方法，直接分离茎尖进行消毒预处理后培养得到的茎尖苗的成活情况和生长情况见表5。茎尖苗培养使用的培养基为MS培养基添加BA0.05mg/L，IAA 1.0mg/L，2,4-D 0.5mg/L。

[0067] 表5

[0068]茎尖数 4～6片叶试管苗数 生长速度 成活率(％) 脱毒率(％)
30 3 慢 10 33

[0069] 由表5可以看出，对比例中得到的脱毒试管苗成活率为10％、生长慢、脱毒率为33％

[0070] 由上述实施例和对比例可知，本发明所述方法培养的紫色马铃薯的成活率高，脱毒率高达93％，繁殖周期缩短至2～4个月，成活率、生长速度和脱毒率都远远高于传统的引种栽种方法，本发明所述的方法可实现紫色马铃薯的批量快速繁殖，降低培养成本。

[0071] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。