一种对颈椎病和失眠均具有治疗作用药物及其制备方法

摘要

本发明属于中药领域，提供了一种治疗颈椎病与失眠的药物组合物，发明名称为一种对颈椎病和失眠均具有治疗作用的药物及其制备方法，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：栎叶槲蕨1～3、铁马豆1～3、东北卫矛1～3。该药物组合物采用中药学中常规的制药方法制备成片剂、丸剂、硬胶囊剂、颗粒剂。制法为：取栎叶槲蕨、铁马豆、东北卫矛，混合，加入3～15倍量的水浸泡0.5～2小时，煎煮2～4次，每次0.5～2小时，提取液合并，滤过，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，即得。本发明还提供了采用高效液相色谱法和气相色谱法对药物组合物进行含量测定的方法。研究表明，本发明药物对颈椎病和失眠均具有显著的治疗效果。

权利要求

1.一种对颈椎病与失眠具有双重治疗作用的药物组合物，其特征在于，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：栎叶槲蕨1、铁马豆1、东北卫矛1。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物采用中药学中常规的制药方法制备成片剂、丸剂、硬胶囊剂、颗粒剂。

3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物采用如下方法制备：取栎叶槲蕨、铁马豆、东北卫矛，混合，加入3～15倍量的水浸泡0.5～2小时，煎煮2～4次，每次

0.5～2小时，提取液合并，滤过，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，压片，即得。

4.一种对颈椎病与失眠具有双重治疗作用的药物组合物的检测方法，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：栎叶槲蕨1、铁马豆1、东北卫矛1，其特征在于，采用高效液相色谱法对药物组合物中的穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮进行含量测定：（1）色谱条件：Waters SunFire C18色谱柱；流动相A：乙腈，流动相B：1%冰醋酸溶液，梯度洗脱：0～15min，流动相A从15%线性增加至20%，流动相B从85%线性下降至80%；15～

20min，流动相A从20%线性增加至25%，流动相B从80%线性下降至75%；20～25min，流动相A从

25%线性增加至30%，流动相B从75%线性下降至70%；25～35min，流动相A保持在30%，流动相B保持在70%；35～40min，流动相A从30%线性增加至80%，流动相B从70%线性下降至20%；40～

45min，流动相A保持在80%，流动相B保持在20%；检测波长为280～290nm；柱温：25～35℃；流速：0.5～1.5mL·min-1；理论塔板数以穗罗汉松树脂酚苷峰计应不低于5000；

（2）穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液的制备：

① 精密称取穗罗汉松树脂酚苷对照品置容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得每

1mL含穗罗汉松树脂酚苷1.60mg的贮备液；

② 精密称取六氢金合欢基丙酮对照品置容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得每

1mL含六氢金合欢基丙酮1.60mg的贮备液；

③ 对照品混合溶液：分别取穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品贮备液

1.0mL、0.5mL混合后，用甲醇稀释至10mL，得穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液；

（3）供试品溶液的制备：取本发明药物，精密量取置容量瓶中，加甲醇，超声处理，放置至室温后，用甲醇补充，经离心，取上清液，过滤，即得供试品溶液；

（4）测定：取供试品溶液、穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液各2～10μL，注入高效液相色谱仪测定。

5.如权利要求4所述的药物组合物的检测方法，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：栎叶槲蕨1、铁马豆1、东北卫矛1，其特征在于，采用高效液谱法对穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮进行含量测定：（1）色谱条件：Waters SunFire C18色谱柱；流动相A：乙腈，流动相B：1%冰醋酸溶液，梯度洗脱：0～15min，流动相A从15%线性增加至20%，流动相B从85%线性下降至80%；15～

20min，流动相A从20%线性增加至25%，流动相B从80%线性下降至75%；20～25min，流动相A从

25%线性增加至30%，流动相B从75%线性下降至70%；25～35min，流动相A保持在30%，流动相B保持在70%；35～40min，流动相A从30%线性增加至80%，流动相B从70%线性下降至20%；40～

45min，流动相A保持在80%，流动相B保持在20%；检测波长为284nm；柱温：30℃；流速：

1.0mL·min-1；理论塔板数以穗罗汉松树脂酚苷峰计应不低于5000；

（2）穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液的制备：

① 精密称取穗罗汉松树脂酚苷对照品80.0mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得每1mL含穗罗汉松树脂酚苷1.60mg的贮备液；

② 精密称取六氢金合欢基丙酮对照品80.0mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得每1mL含六氢金合欢基丙酮1.60mg的贮备液；

③ 对照品混合溶液：分别取穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品贮备溶液

1.0mL、0.5mL混合后，用甲醇稀释至10mL，得穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液；

（3）供试品溶液的制备：取本发明药物，精密量取5mg，置50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，

150W，50kHz超声处理10min，放置至室温后，用甲醇补充至刻度，经3000r·min-1离心10min，取上清液，过滤，即得供试品溶液；

（4）测定：取供试品溶液、穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液各5μL，注入高效液相色谱仪测定。

6.一种对颈椎病与失眠具有双重治疗作用的药物组合物的检测方法，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：栎叶槲蕨1、铁马豆1、东北卫矛1，其特征在于，采用气相色谱法对药物组合物中的2,3,6-三甲基茴香醚进行含量测定：（1）色谱条件：SE-30毛细管柱；程序升温：柱温起始温度50℃，以15℃·min-1速率升到

150℃保持4min；氮气为载气；FID检测器；分流比5～7:1；检测器温度200～240℃；进样口温度180～220℃；

（2）对照品溶液：精密称取2,3,6-三甲基茴香醚，置容量瓶中，用环己烷溶解并定容，配成浓度为0.66mg·mL-1的对照品溶液；

（3）供试品溶液：精密量取本发明药物，加水，照《中国药典》2015年版第四部通则2204挥发油测定法进行实验，连接挥发油测定器，自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，加环己烷，连接回流冷凝管，加热保持微沸，放冷，将测定器中的液体移至分液漏斗中，分取环己烷液，水液再用环己烷提取，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，合并环己烷液，置容量瓶中，加环己烷，摇匀，即得；

（4）测定：取对照品溶液和供试品溶液各1～5μL，注入气相色谱仪，测定。

7.如权利要求6所述的药物组合物的检测方法，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：栎叶槲蕨1、铁马豆1、东北卫矛1，其特征在于，采用气相色谱法对2,3,6-三甲基茴香醚进行含量测定：（1）色谱条件：SE-30毛细管柱；程序升温：柱温起始温度50℃，以15℃·min-1速率升到

150℃保持4min；氮气为载气；FID检测器；分流比6:1；检测器温度220℃；进样口温度200℃；

（2）对照品溶液：精密称取2,3,6-三甲基茴香醚6.6mg，置10mL容量瓶中，用环己烷溶解并定容至刻度，配成浓度为0.66mg·mL-1的对照品溶液；

（3）供试品溶液：精密量取本发明药物50mg，加水250mL，照《中国药典》2015年版第四部通则2204挥发油测定法进行实验，连接挥发油测定器，自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，加环己烷3mL，连接回流冷凝管，加热保持微沸4h，放冷，将测定器中的液体移至分液漏斗中，分取环己烷液，水液再用环己烷提取2次，每次3mL，用铺有无水硫酸钠0.5g的漏斗滤过，合并环己烷液，置25mL容量瓶中，加环己烷至刻度，摇匀，即得；

（4）测定：取对照品溶液和供试品溶液各1μL，注入气相色谱仪，测定。

说明书

一种对颈椎病和失眠均具有治疗作用药物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于中药领域，涉及一种对颈椎病和失眠具有双重治疗作用的药物组合物，具体涉及一种由为栎叶槲蕨、铁马豆、东北卫矛为原料制成的药物组合物。

背景技术

[0002] 椎动脉型颈椎病是由于颈椎的不稳定、颈椎正常曲线的改变、椎体以及钩椎关节的骨质增生，直接刺激椎动脉使之痉挛，或压迫使之扭曲、狭窄、闭塞等，致使椎-基底动脉血流量减少，从而产生椎-基底动脉供血不足的症状，主要表现为眩晕、血管性头痛、视觉障碍和上肢麻木，可伴有耳鸣、眼球震颤，还可出现一侧肌力减弱及腱反射亢进。

[0003] 椎动脉型颈椎病较之脊髓型颈椎病略为多见因其中大多系由于椎节不稳所致，易经非手术疗法治愈或好转，故住院及需手术者较少。椎动脉型颈椎病是因为椎动脉受压迫或刺激而引起其供血不足所产生的一系列症状。颈椎是活动量最大的脊柱节段，因而易产生劳损，并随着年龄的增长及损伤的积累而发生颈椎退行性变，尤其是4～5，5～6颈椎段是个多事的椎段。因为颈椎退变包括向后方突出的椎间盘，钩椎关节或椎体骨刺，以及椎体半脱位或上关节突向方滑脱，都可压迫椎动脉或刺激椎动脉周围之交感神经丛，使椎动脉痉挛，管腔狭窄，造成椎基底动脉供血不足，引起一系列临床症状。椎动脉型颈椎病是中老年人的常见病。

[0004] 颈椎病患者中约70%有椎动脉受累。50岁以上头晕，头痛者。50%以上与颈椎病引起的椎基底动脉受累有关。在临床上易有“颈椎眩晕”，“椎动脉压迫综合症”等诊断，又称为“颈性偏头痛”。 椎动脉型颈椎病的临床特征，最常见的是头痛，眩晕和视觉障碍等。头痛主要由于枕大神经病变。常呈发作性疼痛，持续数分钟，数小时乃至更长，偶尔也可为持续性疼痛，阵发性加剧。疼痛的性质各人的情况不一样。一般称跳痛（搏动性痛）或灼热痛，而且局限于一侧颈枕部或枕顶部，同时伴有酸，胀等异常感觉。疼痛多于早晨起床后，转动头颈部或乘车颠簸时发生或加剧。少数患者呈现疼痛过敏，触及患不透皮时疼痛难忍，甚至触碰头发时即感剧痛，十分苦恼。疼痛发作时，常起自颈部，迅速扩展至耳后及枕顶部，或向眼眶区和鼻根部发射。有的患者在发作前有先兆，如出现“眼前发黑”，“闪光”等视觉症状。

[0005] 失眠，即睡眠失常。表现为入睡困难，断断续续不连贯，而过早地醒来，醒后不能再继续睡，有睡眠不足，全身乏力，倦怠感觉，多因健康情况不佳，疼痛、感觉不适，生理节奏被打乱，睡眠环境影响等，也有怕睡眠而失眠的。

[0006] 失眠是由于情志、饮食内伤，或病后及年迈，禀赋不足，心虚胆怯等病因，引起心神失养或心神不安，从而导致经常不能获得正常睡眠为特征的一类病症。

[0007] 主要表现为睡眠时间深度的不足、以及不能消除疲劳、恢复体力与精力，轻者入睡困难，或寐而不酣，时寐时醒，或醒后不能再寐，重则彻夜不寐。

[0008] 失眠是临床常见病症之一，虽不属于危重疾病，但妨碍人们正常生活、工作、学习和健康，并能加重或诱发心悸、胸痹、眩晕、头痛、中风病等病症。顽固性的失眠，给病人带来长期的痛苦，甚至形成对安眠药物的依赖，而长期服用安眠药物又可引起医源性疾病。

[0009] 失眠在《内经》中称为“目不瞑”、“不得眠”、“不得卧”，并认为失眠原因主要有两种：一是其他病症影响，如咳嗽、呕吐、腹满等，使人不得安卧；二是气血阴阳失和，使人不能入寐。

[0010] 本发明提供了一种对颈椎病和失眠均具有治疗作用药物，研究表明，本发明药物对颈椎病和失眠的治疗效果显著。

[0011] 本发明药物组合物的基原如下：

[0012] 栎叶槲蕨为槲蕨科槲蕨属植物栎叶槲蕨Drynaria quercifolia (L.)J. Smith [polypodium quercifolium L.]的根茎。

[0013] 铁马豆为豆科宿苞豆属植物毛宿苞豆Shuteria pampaniniana Hand.-Mazz.的全草。

[0014] 东北卫矛为卫矛科卫矛属植物毛脉卫矛Euonymus alatus (Thunb.) Sieb. Var. pubescens Maxim.的带翅茎枝或根。

发明内容

[0015] 本发明的目的是提供一种治疗颈椎病和失眠的药物组合物。

[0016] 本发明的另一目的是提供该药物组合物的制备方法和质量检测方法。

[0017] 本发明还提供了该药物组合物的制药用途。

[0018] 本发明的目的是通过以下方式实现的：

[0019] 一种对颈椎病与失眠具有双重治疗作用的药物组合物，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：栎叶槲蕨1～3、铁马豆1～3、东北卫矛1～3。

[0020] 所述的药物组合物优选是由以下重量份的原料制成的：栎叶槲蕨1、铁马豆1、东北卫矛1。

[0021] 所述的药物组合物优选是由以下重量份的原料制成的：栎叶槲蕨1、铁马豆2、东北卫矛3。

[0022] 所述的药物组合物采用中药学中常规的制药方法制备成片剂、丸剂、硬胶囊剂、颗粒剂。

[0023] 所述的药物组合物优选采用如下方法制备：取栎叶槲蕨、铁马豆、东北卫矛，混合，加入3～15倍量的水浸泡0.5～2小时，煎煮2～4次，每次0.5～2小时，提取液合并，滤过，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，压片，即得。

[0024] 一种对颈椎病与失眠具有双重治疗作用的药物组合物的质量检测方法，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：栎叶槲蕨1～3、铁马豆1～3、东北卫矛1～3，可以采用高效液相色谱法对药物组合物中的穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮进行含量测定：

[0025]  （1）色谱条件：Waters SunFire C18色谱柱；流动相A：乙腈，流动相B：1%冰醋酸溶液，梯度洗脱：0～15min，流动相A从15%线性增加至20%，流动相B从85%线性下降至80%；15～20min，流动相A从20%线性增加至25%，流动相B从80%线性下降至75%；20～25min，流动相A从
25%线性增加至30%，流动相B从75%线性下降至70%；25～35min，流动相A保持在30%，流动相B保持在70%；35～40min，流动相A从30%线性增加至80%，流动相B从70%线性下降至20%；40～
45min，流动相A保持在80%，流动相B保持在20%；检测波长为280～290nm；柱温：25～35℃；流速：0.5～1.5mL·min-1；理论塔板数以穗罗汉松树脂酚苷峰计应不低于5000；

[0026] （2）穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液的制备：

[0027] ① 精密称取穗罗汉松树脂酚苷对照品置容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得每1mL含穗罗汉松树脂酚苷1.60mg的贮备液；

[0028] ② 精密称取六氢金合欢基丙酮对照品置容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得每1mL含六氢金合欢基丙酮1.60mg的贮备液；

[0029] ③ 对照品混合溶液：分别取穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品贮备液1.0mL、0.5mL混合后，用甲醇稀释至10mL，得穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液；

[0030] （3）供试品溶液的制备：取本发明药物，精密量取置容量瓶中，加甲醇，超声处理，放置至室温后，用甲醇补充，经离心，取上清液，过滤，即得供试品溶液；

[0031] （4）测定：取供试品溶液、穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液各2～10μL，注入高效液相色谱仪测定。

[0032] 所述的药物组合物的质量检测方法，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：栎叶槲蕨1、铁马豆1、东北卫矛1，采用高效液谱法对穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮进行含量测定，优选步骤为：

[0033] （1）色谱条件：Waters SunFire C18色谱柱；流动相A：乙腈，流动相B：1%冰醋酸溶液，梯度洗脱：0～15min，流动相A从15%线性增加至20%，流动相B从85%线性下降至80%；15～20min，流动相A从20%线性增加至25%，流动相B从80%线性下降至75%；20～25min，流动相A从
25%线性增加至30%，流动相B从75%线性下降至70%；25～35min，流动相A保持在30%，流动相B保持在70%；35～40min，流动相A从30%线性增加至80%，流动相B从70%线性下降至20%；40～
45min，流动相A保持在80%，流动相B保持在20%；检测波长为284nm；柱温：30℃；流速：
1.0mL·min-1；理论塔板数以穗罗汉松树脂酚苷峰计应不低于5000；

[0034] （2）穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液的制备：

[0035] ① 精密称取穗罗汉松树脂酚苷对照品80.0mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得每1mL含穗罗汉松树脂酚苷1.60mg的贮备液；

[0036] ② 精密称取六氢金合欢基丙酮对照品80.0mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得每1mL含六氢金合欢基丙酮1.60mg的贮备液；

[0037] ③ 对照品混合溶液：分别取穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品贮备溶液1.0mL、0.5mL混合后，用甲醇稀释至10mL，得穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液；

[0038] （3）供试品溶液的制备：取本发明药物，精密量取5mg，置50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，150W，50kHz超声处理10min，放置至室温后，用甲醇补充至刻度，经3000r·min-1离心10min，取上清液，过滤，即得供试品溶液；

[0039] （4）测定：取供试品溶液、穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液各5μL，注入高效液相色谱仪测定。

[0040] 一种对颈椎病与失眠具有双重治疗作用的药物组合物的质量检测方法，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：栎叶槲蕨1～3、铁马豆1～3、东北卫矛1～3，可以采用气相色谱法对药物组合物中的2,3,6-三甲基茴香醚进行含量测定：

[0041] （1）色谱条件：SE-30毛细管柱；程序升温：柱温起始温度50℃，以15℃·min-1速率升到150℃保持4min；氮气为载气；FID检测器；分流比5～7:1；检测器温度200～240℃；进样口温度180～220℃；

[0042] （2）对照品溶液：精密称取2,3,6-三甲基茴香醚，置容量瓶中，用环己烷溶解并定容，配成浓度为0.66mg·mL-1的对照品溶液；

[0043] （3）供试品溶液：精密量取本发明药物，加水，照《中国药典》2015年版第四部通则2204挥发油测定法进行实验，连接挥发油测定器，自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，加环己烷，连接回流冷凝管，加热保持微沸，放冷，将测定器中的液体移至分液漏斗中，分取环己烷液，水液再用环己烷提取，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，合并环己烷液，置容量瓶中，加环己烷，摇匀，即得；

[0044] （4）测定：取对照品溶液和供试品溶液各1～5μL，注入气相色谱仪，测定。

[0045] 所述的药物组合物的质量检测方法，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：栎叶槲蕨1、铁马豆1、东北卫矛1，采用气相色谱法对2,3,6-三甲基茴香醚进行含量测定，优选步骤为：

[0046] （1）色谱条件：SE-30毛细管柱；程序升温：柱温起始温度50℃，以15℃·min-1速率升到150℃保持4min；氮气为载气；FID检测器；分流比6:1；检测器温度220℃；进样口温度200℃；

[0047] （2）对照品溶液：精密称取2,3,6-三甲基茴香醚6.6mg，置10mL容量瓶中，用环己烷溶解并定容至刻度，配成浓度为0.66mg·mL-1的对照品溶液；

[0048] （3）供试品溶液：精密量取本发明药物50mg，加水250mL，照《中国药典》2015年版第四部通则2204挥发油测定法进行实验，连接挥发油测定器，自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，加环己烷3mL，连接回流冷凝管，加热保持微沸4h，放冷，将测定器中的液体移至分液漏斗中，分取环己烷液，水液再用环己烷提取2次，每次3mL，用铺有无水硫酸钠0.5g的漏斗滤过，合并环己烷液，置25mL容量瓶中，加环己烷至刻度，摇匀，即得；

[0049] （4）测定：取对照品溶液和供试品溶液各1μL，注入气相色谱仪，测定。

[0050] 一种药物组合物在制备治疗椎动脉型颈椎病药物中的应用，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：栎叶槲蕨1、铁马豆1、东北卫矛1。

[0051] 一种药物组合物在制备治疗肩周炎药物中的应用，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：栎叶槲蕨1、铁马豆1、东北卫矛1。

[0052] 通过如下实验研究验证本发明的技术效果：

[0053] 实验例一：本发明药物组合物治疗椎动脉型颈椎病的临床观察

[0054] 1 资料与方法

[0055] 1.1 一般资料

[0056] 病例纳入标准：

[0057] （1）临床诊断为椎动脉型颈椎病，诊断标准参照1992年第二届颈椎病专题座谈会制定的标准（第二届颈椎病专题座谈会纪要.中华外科杂志，1993，31（8）：472-476.）；

[0058] （2）排除颈椎间盘突出、颈椎滑脱、颈椎占位病变、妊娠或哺乳期妇女、糖尿病、精神病及出血倾向患者。共26患者符合病例纳入标准，年龄22～50岁，平均38.5岁；病程最长5年，最短8个月。

[0059] 1.2 治疗方法

[0060] 患者自入院后予以本发明说明书中实施例1所述的本发明药物组合物，口服，一次2片，一日3次，服用1个月。

[0061] 1.3 观察项目及指标 参照文献《中药新药临床研究指导原则》（郑筱萸.中药新药临床研究指导原则（试行）.北京：中国医药科技出版社，2002.346-349）。

[0062] 1.3.1 临床症状及体征评分

[0063] （1）眩晕程度：

[0064] ① 无眩晕，0分；

[0065] ② 轻度眩晕尚可忍受，能正常行走，对工作生活无明显影响，1分；

[0066] ③ 中度眩晕，较难忍受，行走有困难，需扶持或坐下，对工作生活有较大影响，2分；

[0067] ④ 重度眩晕，无法忍受，需卧床，对工作生活有严重影响，3分。

[0068] （2）眩晕时间：

[0069] ① 无眩晕，0分；

[0070] ② <60 min/d，1分；

[0071] ③ 61～240 min/d，2分；

[0072] ④ >240 min/d，3分。

[0073] （3）眩晕频率：

[0074] ① 无眩晕，0分；

[0075] ② <5次/周，1分；

[0076] ③ 6～20次/周，2分；

[0077] ④ >20次/周，3分。

[0078] （4）头痛：

[0079] ① 无头痛，0分；

[0080] ② 轻度疼痛，尚可忍受，对工作生活无明显影响，1分；

[0081] ③ 中度疼痛，较难忍受，对工作生活有较大影响，2分；

[0082] ④ 重度疼痛，无法忍受，对工作生活有严重影响，3分。

[0083] （5）旋颈试验：

[0084] ① 旋颈试验阴性，0分；

[0085] ② 旋颈试验阳性，1分；

[0086] ③ 旋颈试验强阳性，2分。

[0087] 1.3.2 血液流变学指标检测

[0088] 取患者静脉血4 ml，置于1：40烘干的肝素抗凝管中混匀，在4 h内完成血液流变学指标检测，血液标本在用药前后各收集1次。采用上海LIANG-100型血液黏度仪进行检测，BME-1生物医学数据处理计算机进行数据处理。

[0089] 1.4 统计学方法 全部数据采用SAS 3.0软件包进行统计学分析，计量资料均数用±s表示，两组之间比较采用t检验。

[0090] 2 结果

[0091] 2.1 椎动脉型颈椎病患者治疗前后临床症状及体征的比较

[0092] 本发明药物组合物治疗后，患者的临床症状及体征均有明显改善，与治疗前比较差异有统计学意义（P<0.01）。见表1-1。

[0093] 表1-1 本发明药物组合物治疗前后患者症状及体征评分的比较 （ ±s）[0094]

[0095] 注：与治疗前比较，**P<0.01。

[0096] 2.2 椎动脉型颈椎病患者治疗前后血液流变学指标的比较

[0097] 本发明药物组合物治疗后，患者全血黏度低、高切变率，血浆比黏度，血细胞压积，红细胞电泳时间及血沉较治疗前均有明显下降，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。见表1-2。

[0098] 表1-2 本发明药物组合物治疗前后患者血液流变学指标的比较 （ ±s）[0099]

[0100] 注：与治疗前比较，*P<0.05，**P<0.01。

[0101] 本研究结果显示：26例椎动脉型颈椎病患者经本发明药物组合物治疗后，临床症状及体征均有明显改善（P<0.01）；血液流变学指标中全血黏度低、高切变率，血浆比黏度，血细胞压积，红细胞电泳时间及血沉较治疗前均有明显下降（P<0.05或P<0.01）。表明本发明药物组合物可以通过改善椎-基底动脉的微循环，从而缓解椎动脉型颈椎病患者的临床症状及体征。

[0102] 实验二：本发明药物治疗失眠的实验研究

[0103] 1 实验材料

[0104] 药品：

[0105] 本发明药物：处方：栎叶槲蕨333g、铁马豆333g、东北卫矛333g；制法：取栎叶槲蕨333g、铁马豆333g、东北卫矛333g，混合，加入10000mL水浸泡1小时，煎煮3次，每次的加水量均为10000mL，每次煎煮1小时，提取液合并，滤过，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，压片，即得。

[0106] 对比药物甲：处方：铁马豆500g、东北卫矛500g；制法：取铁马豆500g、东北卫矛500g，混合，加入10000mL水浸泡1小时，煎煮3次，每次的加水量均为10000mL，每次煎煮1小时，提取液合并，滤过，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，压片，即得。

[0107] 对比药物乙：处方：栎叶槲蕨500g、东北卫矛500g；制法：取栎叶槲蕨500g、东北卫矛500g，混合，加入10000mL水浸泡1小时，煎煮3次，每次的加水量均为10000mL，每次煎煮1小时，提取液合并，滤过，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，压片，即得。

[0108] 对比药物丙：处方：栎叶槲蕨500g、铁马豆500g；制法：取栎叶槲蕨500g、铁马豆500g，混合，加入10000mL水浸泡1小时，煎煮3次，每次的加水量均为10000mL，每次煎煮1小时，提取液合并，滤过，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，压片，即得。

[0109] 戊巴比妥钠：北京大田丰拓化学技术有限公司生产；

[0110] 硝酸士的宁注射液：北京双鹤药业股份有限公司生产；

[0111] 安定注射液：天津金耀氨基酸有限公司生产；

[0112] 动物：昆明种小鼠，体重18g～22g，雌性兼用，由黑龙江中医药大学实验中心提供。

[0113] 2 实验方法与结果

[0114] 2.1 对小鼠自发活动的研究

[0115] 小鼠72只，雌雄不拘，随机分为6组，即生理盐水对照组、对比药物甲组、对比药物乙组、对比药物丙组、本发明药物组，安定阳性对照组，每组12只。

[0116] 给药前把小鼠投入动物活动箱中适应5分钟后，记录2分钟的动物走动时间和前肢向上抬举次数的数值作为正常值。

[0117] 然后分别给予：

[0118] 对比药物甲组：灌胃给对比药物甲细粉10.0g·kg-1，灌胃剂量为5ml·kg-1，给药体积为0.2ml/10g，灌胃；

[0119] 对比药物乙组：灌胃给对比药物乙细粉10.0g·kg-1，灌胃剂量为5ml·kg-1，给药体积为0.2ml/10g，灌胃；

[0120] 对比药物丙组：灌胃给对比药物丙细粉10.0g·kg-1，灌胃剂量为5ml·kg-1，给药体积为0.2ml/10g，灌胃；

[0121] 本发明药物组：灌胃给化本发明药物细粉10.0g·kg-1，灌胃剂量为5ml·kg-1，给药体积为0.2ml/10g，灌胃；

[0122] 安定阳性对照组给予1mg/kg安定，灌胃；

[0123] 生理盐水对照组给予同体积生理盐水，灌胃。

[0124] 各组小鼠于给药后60分钟，按同法测定小鼠走动时间及双前肢向上抬举次数。结果以 ±S表示，结果见表2-1。

[0125] 表2-1 对小鼠自发活动次数的影响（ ±S， n= 12）

[0126]

[0127] 注：与生理盐水组比较，※P < 0.05，* P < 0.01；

[0128] 与安定组比较：# P > 0.05；□P < 0.05。

[0129] 表中结果显示：本发明药物对小鼠均有明显的镇静作用，与生理盐水组比较有显著差异（P < 0.01）。本发明药物组镇静作用明显，与安定组比较无差异（P> 0.05）。结果表明：本发明药物有明显的镇静作用。而且，实验研究结果还表明，对比药物甲（由铁马豆、东北卫矛制成）、对比药物乙（由栎叶槲蕨、东北卫矛制成）以及对比药物丙（由栎叶槲蕨、铁马豆制成）的治疗效果不明显，由此可见，本发明药物中的栎叶槲蕨、铁马豆和东北卫矛三种药味，缺一不可，缺少任何一种药味，其药物组合物的作用效果都将大大降低，三种药味组合，产生了明显的一加一大于二的协同增效作用。

[0130] 2.2 对小鼠睡眠影响的研究

[0131] 2.2.1 对小鼠戊巴比妥钠睡眠时间的影响

[0132] 小鼠72只，随机分为6组，即生理盐水对照组，对比药物甲组、对比药物乙组、对比药物丙组、本发明药物组，安定阳性对照组，每组12只。

[0133] 对比药物甲组：灌胃给对比药物甲细粉10.0g·kg-1，灌胃剂量为5ml·kg-1，给药体积为0.2ml/10g，灌胃；

[0134] 对比药物乙组：灌胃给对比药物乙细粉10.0g·kg-1，灌胃剂量为5ml·kg-1，给药体积为0.2ml/10g，灌胃；

[0135] 对比药物丙组：灌胃给对比药物丙细粉10.0g·kg-1，灌胃剂量为5ml·kg-1，给药体积为0.2ml/10g，灌胃；

[0136] 本发明药物组：灌胃给化本发明药物细粉10.0g·kg-1，灌胃剂量为5ml·kg-1，给药体积为0.2ml/10g，灌胃；

[0137] 安定阳性对照组给予1mg/kg 安定，灌胃；

[0138] 生理盐水对照组给予同体积生理盐水，灌胃。

[0139] 灌胃给药60分钟后，每组小鼠分别给予戊巴比妥钠40mg/kg，腹腔注射。记录小鼠的睡眠时间（以翻正反射消失为入睡时间，从翻正反射消失至恢复时间为睡眠持续时间）。结果见表2-2。

[0140] 表2-2 对小鼠戊巴比妥钠睡眠时间的影响（ ±S， n= 12）

[0141]

[0142] 2.2.2 对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量的影响

[0143] 小鼠72只，随机分为6组，即生理盐水对照组、对比药物甲组、对比药物乙组、对比药物丙组、本发明药物组、安定阳性对照组，每组 12 只。

[0144] 对比药物甲组：灌胃给对比药物甲细粉10.0g·kg-1，灌胃剂量为5ml·kg-1，给药体积为0.2ml/10g，灌胃；

[0145] 对比药物乙组：灌胃给对比药物乙细粉10.0g·kg-1，灌胃剂量为5ml·kg-1，给药体积为0.2ml/10g，灌胃；

[0146] 对比药物丙组：灌胃给对比药物丙细粉10.0g·kg-1，灌胃剂量为5ml·kg-1，给药体积为0.2ml/10g，灌胃；

[0147] 本发明药物组：灌胃给化本发明药物细粉10.0g·kg-1，灌胃剂量为5ml·kg-1，给药体积为0.2ml/10g，灌胃；

[0148] 安定阳性对照组给予1mg/kg 安定，灌胃；

[0149] 生理盐水对照组给予同体积生理盐水，灌胃。

[0150] 给药30分钟后，各组小鼠分别给予戊巴比妥钠30mg/kg，腹腔注射，观察并记录入睡动物数（15分钟内小鼠翻正反射消失达1分钟上的鼠数作为入睡动物数），计算入睡率。结果见表2-3。

[0151] 表2-3 对小鼠戊巴比妥钠阈下催眠剂量的影响

[0152]

[0153] 以上两实验均说明了本发明药物对小鼠均有明显的催眠作用，与生理盐水组比较有显著差异（P < 0.01）。本发明药物组具有明显的催眠作用，而且，实验研究结果还表明，对比药物甲（由铁马豆、东北卫矛制成）、对比药物乙（由栎叶槲蕨、东北卫矛制成）以及对比药物丙（由栎叶槲蕨、铁马豆制成）的催眠作用效果不明显，几乎是没有催眠作用。由此可见，本发明药物中的栎叶槲蕨、铁马豆和东北卫矛三种药味，缺一不可，缺少任何一种药味，其药物组合物的作用效果都将大大降低，三种药味组合，产生了明显的一加一大于二的协同增效作用。

[0154] 2.3 抗硝酸士的宁惊厥发作作用的研究

[0155] 小鼠72只， 雌雄不拘， 随机分为6组，即生理盐水对照组、对比药物甲组、对比药物甲组、本发明药物组、安定阳性对照组，每组12只。

[0156] 对比药物甲组：灌胃给对比药物甲细粉10.0g·kg-1，灌胃剂量为5ml·kg-1，给药体积为0.2ml/10g，灌胃；

[0157] 对比药物乙组：灌胃给对比药物乙细粉10.0g·kg-1，灌胃剂量为5ml·kg-1，给药体积为0.2ml/10g，灌胃；

[0158] 对比药物丙组：灌胃给对比药物丙细粉10.0g·kg-1，灌胃剂量为5ml·kg-1，给药体积为0.2ml/10g，灌胃；

[0159] 本发明药物组：灌胃给化本发明药物细粉10.0g·kg-1，灌胃剂量为5ml·kg-1，给药体积为0.2ml/10g，灌胃；

[0160] 安定阳性对照组给予1mg /kg 安定；灌胃；生理盐水对照组给予同体积生理盐水，灌胃。各组小鼠于给药60分钟后，分别给予硝酸士的宁注射液1.5mg /kg，皮下注射，记录小鼠惊厥数（以小鼠出现全身强直性惊厥为指标）。结果见表2-4。

[0161] 表2-4 抗硝酸士的宁惊厥发作的作用（n= 12）

[0162]

[0163] 注：与生理盐水组比较：#P < 0.05，*P < 0.01；与安定组比较：※P > 0.05，#P< 0.05

[0164] 结果表明，安定组与对比药物甲组、对比药物乙组、对比药物丙组、本发明药物组均有对抗硝酸士的宁惊厥发作的作用，各组与生理盐水组比较，经统计学处理差异均有显著意义。且发现本发明药物的抗惊厥作用最强，疗效最好，说明本发明药物有抗惊厥的作用。而且，实验研究结果还表明，对比药物甲（由铁马豆、东北卫矛制成）、对比药物乙（由栎叶槲蕨、东北卫矛制成）以及对比药物丙（由栎叶槲蕨、铁马豆制成）的抗惊厥作用效果不明显。由此可见，本发明药物中的栎叶槲蕨、铁马豆和东北卫矛三种药味，缺一不可，缺少任何一种药味，其药物组合物的作用效果都将大大降低，三种药味组合，产生了明显的一加一大于二的协同增效作用。

[0165] 3 结论

[0166] 本研究发现，本发明药物能抑制小鼠自发活动；对小鼠睡眠的影响与戊巴比妥钠有协同作用；有对抗硝酸士的宁惊厥发作的作用。说明本发明药物有明显的镇静、催眠、抗惊厥作用，具有开发治疗失眠药物或保健品的前景。而且，实验研究结果还表明，对比药物甲（由铁马豆、东北卫矛制成）、对比药物乙（由栎叶槲蕨、东北卫矛制成）以及对比药物丙（由栎叶槲蕨、铁马豆制成）的作用效果都明显降低，明显劣于本发明的药物组合物。由此可见，本发明药物中的栎叶槲蕨、铁马豆和东北卫矛三种药味，缺一不可，缺少任何一种药味，其药物组合物的作用效果都将大大降低，三种药味组合，产生了明显的一加一大于二的协同增效作用。

[0167] 典型病例：

[0168] 廖牟，男，65岁，退休工人，3个月前因脑血管病住进医院，因精神压力大，引起失眠，出院后，失眠不愈，又经多方治疗，效果不好，心慌、气短、心悸、头晕，检查发现舌红，心律不齐，精神萎靡不振，确认为轻度失眠。口服本发明说明书具体实施方式中实施例1制得片剂进行治疗，一日3次，每次口服2片，连续治疗7天，失眠治愈，未见任何不良反应。

[0169] 实验三：HPLC法同时测定本发明药物中穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮的含量

[0170] 为更好地控制本发明药物的质量，本发明以处方中栎叶槲蕨的成分穗罗汉松树脂酚苷和铁马豆的成分六氢金合欢基丙酮为定量指标，建立了一种HPLC法，用梯度洗脱的方法同时测定穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮的含量，该方法准确性和稳定性好，可作为本发明药物的含量测定方法和质量控制依据，现研究如下。

[0171] 1 仪器与试药

[0172] DGLC双三元高效液相色谱仪（美国Thermo，双三元梯度泵、自动进样器、多波长紫外检测器、柱温箱）；Chromeleon色谱工作站；Waters SunFire C18色谱柱（美国WATERS公司，150mm×4.6mm，5μm）；TP150超声清洗机（北京天鹏电子科技有限公司）；AUW120D电子分析天平（十万分之一，日本岛津公司）；乙腈、甲醇为色谱纯（美国TEDIA公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

[0173] 穗罗汉松树脂酚苷对照品（中国食品药品检定研究院），六氢金合欢基丙酮对照品（中国食品药品检定研究院），本发明药物：处方：栎叶槲蕨333g、铁马豆333g、东北卫矛333g；制法：取栎叶槲蕨333g、铁马豆333g、东北卫矛333g，混合，加入10000mL水浸泡1小时，煎煮3次，每次的加水量均为10000mL，每次煎煮1小时，提取液合并，滤过，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，压片，即得。

[0174] 2 方法与结果

[0175] 2.1 色谱条件

[0176] Waters SunFire C18色谱柱；流动相A：乙腈，流动相B：1%冰醋酸溶液，按表3-1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为284nm；柱温：30℃；流速：1.0mL·min-1；理论塔板数以穗罗汉松树脂酚苷峰计应不低于5000。

[0177] 表3-1 梯度洗脱程序

[0178]

[0179] 2.2 溶液的制备

[0180] 2.2.1 穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品溶液

[0181] 精密称取穗罗汉松树脂酚苷对照品80.0mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得每1mL穗罗汉松树脂酚苷1.60mg的贮备液。

[0182] 精密称取六氢金合欢基丙酮对照品80.0mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得每1mL含六氢金合欢基丙酮1.60mg的贮备液。

[0183] 2.2.2 供试品溶液

[0184] 取本发明药物，精密量取5mg，置50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，超声处理（150W，50kHz）10min，放置至室温后，用甲醇补充至刻度，经3000r·min-1离心10min，取上清液，过滤，即得供试品溶液。

[0185] 2.2.3 阴性样品溶液

[0186] 穗罗汉松树脂酚苷的阴性样品溶液：按原处方量和工艺制备缺栎叶槲蕨的本发明药物，依照“2.2.2”项下的方法制备阴性样品溶液Ⅰ。

[0187] 六氢金合欢基丙酮的阴性样品溶液：按原处方量和工艺制备缺铁马豆的本发明药物，依照“2.2.2”项下的方法制备阴性样品溶液Ⅱ。

[0188] 2.3 干扰试验

[0189] 取对照品混合溶液（分别取穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品贮备溶液1.0mL、0.5mL混合后，用甲醇稀释至10mL）、供试品溶液、阴性样品溶液各5μL，注入液相色谱仪，在“2.1”色谱条件下，本发明药物的供试品溶液在对照品色谱相同的位置有穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮的峰，两成分峰与其相邻峰的完全分离，理论塔板数以穗罗汉松树脂酚苷的峰计均大于5000，而且阴性样品溶液中无相应的穗罗汉松树脂酚苷峰和六氢金合欢基丙酮峰，对测定无干扰。见说明书附图中的色谱图：图1、图2、图3、图4。

[0190] 2.4 标准曲线的制备

[0191] 分别精密量取六氢金合欢基丙酮对照品贮备液3.0，2.0，1.0，0.5，0.25mL和穗罗汉松树脂酚苷对照品储备液6.0，4.0，2.0，1.0，0.5mL置同一20mL容量瓶中，混合均匀，用甲醇定量稀释成含六氢金合欢基丙酮240.0，160.0，80.0，32.0，16.0μg·mL-1；含穗罗汉松树脂酚苷480.0，320.0，160.0，64.0，32.0μg·mL-1的系列混合对照品溶液，精密取5μL，注入色谱仪，以峰面积为纵坐标（Y），对照品浓度为横坐标（X，μg·mL-1），绘制标准曲线，得标准曲线方程，Y（六氢金合欢基丙酮）=0.1935X（六氢金合欢基丙酮）－0.0235，r=1.0000，线性范围16.0～240.0μg·mL-1；Y（穗罗汉松树脂酚苷）=0.2295X（穗罗汉松树脂酚苷）+0.076，r=1.0000，线性范围32.0～480.0μg·mL-1；结果表明，在线性范围内，两者线性关系良好。

[0192] 2.5 精密度试验

[0193] 取“2.3”项下的对照品混合溶液5μL，在“2.1”色谱条件下，连续自动进样5次，记录六氢金合欢基丙酮和穗罗汉松树脂酚苷的峰面积，计算5个峰面积值的RSD，结果六氢金合欢基丙酮峰面积的RSD为0.363%，穗罗汉松树脂酚苷峰面积的RSD为0.294%；结果表明仪器精密度良好。

[0194] 2.6 重复性试验

[0195] 取同一批号的样品，按“2.2.2”供试品溶液制备项下的方法，制备5份供试品溶液，分别取5μL进样，记录两成分的峰面积，并计算峰面积的RSD值，结果，六氢金合欢基丙酮的含量平均值为0.5783mg·mL-1，RSD为1.79%；穗罗汉松树脂酚苷的含量平均值为1.6386mg·-1mL ，RSD为1.53%，表明该法重复性较好。

[0196] 2.7 稳定性试验

[0197] 取“2.9”项下的样品溶液在室温下放置1，6，12，24h，分别测定色谱峰面积，计算六氢金合欢基丙酮和穗罗汉松树脂酚苷峰面积的RSD分别为0.90%、0.32%，结果表明样品在24h内稳定。

[0198] 2.8 回收率试验

[0199] 精密量取已知含量的样品2.5mL，分别精密加入“2.2.1”项下六氢金合欢基丙酮对照品贮备液1mL和穗罗汉松树脂酚苷对照品贮备液2.5mL，共制备6份；按“2.9”项下方法制备样品并测定六氢金合欢基丙酮和穗罗汉松树脂酚苷的含量，计算加样回收率。结果六氢金合欢基丙酮的平均加样回收率为97.02%，RSD=1.03%（n=6），穗罗汉松树脂酚苷的平均加样回收率为98.71%，RSD=0.67%（n=6）。

[0200] 2.9 样品含量测定

[0201] 取3个批号的样品，按“2.2.2”供试品溶液制备项下方法，制成样品溶液，在“2.1”色谱条件下，分别取对照品混合溶液（含六氢金合欢基丙酮1.60mg·mL-1、穗罗汉松树脂酚苷1.60mg·mL-1）和样品溶液各5μL，进样，测定两成分的峰面积，以外标法计算六氢金合欢基丙酮、穗罗汉松树脂酚苷的含量。结果见表3-2。

[0202] 表3-2 样品含量测定结果（mg·mL-1，n=3）

[0203]

[0204] 3 结论

[0205] 3.1 在色谱条件筛选时，流动相采用1%冰醋酸溶液-乙腈（80:20）等度洗脱，六氢金合欢基丙酮、穗罗汉松树脂酚苷与相邻杂质分离不理想；采用梯度洗脱，流动相极性由强到弱（乙腈比例由15%增大到80%），使两成分与相邻色谱峰完全分离，取得满意结果。

[0206] 本试验经过测试，320nm、315nm、310nm、306nm、300nm、295nm、290nm、284nm、280nm、275nm、270nm的检测结果显示，284nm波长可兼顾两个被测成分的最大灵敏度，故采用284nm作为检测波长。

[0207] 3.2 本发明建立的HPLC法可同时测定六氢金合欢基丙酮和穗罗汉松树脂酚苷的含量，操作简便，准确性高，为本发明药物质量控制提供可靠的方法。

[0208] 3.3 根据3批样品的含量测定结果，以六氢金合欢基丙酮和穗罗汉松树脂酚苷含量平均值的80%作为最低标准限度来控制成品中两组分的含量。即每1g样品中六氢金合欢基丙酮和穗罗汉松树脂酚苷含量分别不得低于0.5mg和1.25mg。

[0209] 实验四：气相色谱外标法测定本发明药物中2,3,6-三甲基茴香醚的含量[0210] 本发明建立了GC（气相色谱）外标法对本发明药物中东北卫矛的成分之一2,3,6-三甲基茴香醚进行了含量测定，以此控制本发明药物的质量。

[0211] 1 仪器与试药

[0212] G-3900日立气相色谱仪，FID检测器，Anastar色谱工作站。SPH-200氢气发生器（北京中惠普分析技术研究所），SPB-3全自动空气源（北京中惠普分析技术研究所）。

[0213] 本发明药物：处方：栎叶槲蕨333g、铁马豆333g、东北卫矛333g；制法：取栎叶槲蕨333g、铁马豆333g、东北卫矛333g，混合，加入10000mL水浸泡1小时，煎煮3次，每次的加水量均为10000mL，每次煎煮1小时，提取液合并，滤过，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，压片，即得。

[0214] 2,3,6-三甲基茴香醚对照品由中国药品生物制品检定研究院提供；环己烷为分析纯。

[0215] 2 溶液制备

[0216] 2.1 对照品溶液

[0217] 利用差量法精密称取2,3,6-三甲基茴香醚6.6mg，置10mL容量瓶中，用环己烷溶解并定容至刻度，配成浓度为0.66mg·mL-1的对照品溶液。

[0218] 2.2 供试品溶液

[0219] 精密量取本发明药物50mg，加水250mL，照《中国药典》2015年版第四部通则2204挥发油测定法进行实验，连接挥发油测定器，自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，加环己烷3mL，连接回流冷凝管，加热保持微沸4h，放冷，将测定器中的液体移至分液漏斗中，分取环己烷液，水液再用环己烷提取2次，每次3mL，用铺有无水硫酸钠0.5g的漏斗滤过，合并环己烷液，置25mL容量瓶中，加环己烷至刻度，摇匀，即得。

[0220] 3 色谱条件

[0221] SE-30毛细管柱（30m×0.32mm，0.25μm）；程序升温：柱温起始温度50℃，以15℃·min-1速率升到150℃保持4min；氮气为载气；FID检测器；分流比6:1；检测器温度220℃；进样口温度200℃。

[0222] 在此色谱条件下，2,3,6-三甲基茴香醚峰与相邻色谱峰完全分离，理论塔板数按2,3,6-三甲基茴香醚峰计算应不低于10000，见说明书附图：图5、图6、图7。

[0223] 4 方法学考察

[0224] 4.1 线性关系考察

[0225] 精密吸取浓度为0.20、0.34、0.52、0.69、0.82、1.03mg·mL-1的2,3,6-三甲基茴香醚对照品溶液分别1μL注入气相色谱仪，按照“3”项下色谱条件测定2,3,6-三甲基茴香醚峰面积，以2,3,6-三甲基茴香醚浓度为横坐标，2,3,6-三甲基茴香醚吸收峰面积为纵坐标作线性回归得方程：

[0226] Y=2.514×104X—197.1，R2=0.9990，结果表明2,3,6-三甲基茴香醚进样浓度在0.20～0.98mg·mL-1范围内关系良好。

[0227] 4.2 精密度试验

[0228] 精密吸取2,3,6-三甲基茴香醚对照品溶液1μL，连续进样6次，测定峰面积分别为17532、17762、17714、17777、17843、17694，RSD为0.80%，说明仪器精密性良好。

[0229] 4.3 重复性试验

[0230] 取本发明药物样品，按照“2.2”项下方法制备6份供试品溶液，按照上述色谱条件，-1进样1μL测定峰面积。计算结果表明2,3,6-三甲基茴香醚峰含量的平均值为0.34mg·mL ，RSD为0.20%，说明本法重复性良好。

[0231] 4.4 稳定性试验

[0232] 取本发明药物样品，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，然后分别在0，2，6，10，16h进样1μL，测定峰面积。计算结果表明2,3,6-三甲基茴香醚峰含量的平均值为0.35mg·mL-1，RSD为0.50%，表明供试品溶液在16h内稳定。

[0233] 4.5 检测限及定量限测定

[0234] 取对照品溶液（浓度为0.80mg·mL-1）1mL，逐级稀释，每稀释1次，吸取1μL注入气相色谱仪，按照“3”项下色谱条件测定2,3,6-三甲基茴香醚峰面积。以S/N=3求得2,3,6-三甲基茴香醚的检测限为2.48×10-2mg·mL-1，以S/N=10求得2,3,6-三甲基茴香醚的定量限为9.93×10-2mg·mL-1。

[0235] 4.6 耐用性试验

[0236] 为测试实验的耐用性，又使用PEG-20M毛细管色谱柱（外标法），结果实验的重复性、稳定性均比较好；通过不同的操作人员，所得实验结果基本一致。

[0237] 4.7 回收率试验

[0238] 精密量取已知含量的6份本发明药物样品各25mL，分别精密加入2,3,6-三甲基茴香醚对照品7.38mg。按照“2.2”项下方法制备供试溶液，按上述色谱条件，进样1μL，计算加样回收率。计算结果表明平均回收率为99.46%，RSD为0.02%。

[0239] 5 样品测定

[0240] 分别取6批样品按照“2.2”项下方法，每批样品平行制备2份供试品溶液。按上述色谱条件进样测定，以外标法计算含量。结果批号为20150223，20150224，20150225，20150207，20150208，20150620的本发明药物中2,3,6-三甲基茴香醚含量（n=2）分别为
0.32、0.36、0.33、0.27、0.24、0.35mg·mL-1。

[0241] 6 讨论

[0242] 6.1 本发明采用外标法测定本发明药物中2,3,6-三甲基茴香醚的含量，结果发现该方法简便，重复性好，可用来测定本发明药物中2,3,6-三甲基茴香醚的含量。

[0243] 6.2 采用本研究方法对本发明药物中2,3,6-三甲基茴香醚的含量进行测定，可以有效控制药物的质量。

[0244] 实验五：本发明药物治疗大鼠骨质疏松症的实验研究

[0245] 本发明药物对颈椎病有非常好的治疗效果，研究人员预测，本发明药物对骨质疏松也应该具有一定的治疗效果，于是便开展了尝试性实验研究。

[0246] 1 材料与方法

[0247] 1.1 动物

[0248] 32只4个月龄雌性SD大鼠，体重：260g±30g。购置于黑龙江中医药大学实验动物中心。

[0249] 1.2 试剂与药品

[0250] 本发明药物：处方：栎叶槲蕨333g、铁马豆333g、东北卫矛333g；制法：取栎叶槲蕨333g、铁马豆333g、东北卫矛333g，混合，加入10000mL水浸泡1小时，煎煮3次，每次的加水量均为10000mL，每次煎煮1小时，提取液合并，滤过，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，压片，即得。

[0251] 阳性药物：苯甲酸雌二醇（2mg/ml），上海第九制药厂产品；血钙测定试剂盒、血磷测定试剂盒、ALP试剂盒，北京中生公司。戊巴比妥钠，上海第六制药厂。

[0252] 1.3 主要仪器

[0253] BT224半自动生化分析仪，双能X线骨密度仪。

[0254] 1.4 动物造模

[0255] 去势手术：以2%戊巴妥钠按40mg/kg体重腹腔注射麻醉，在背部中央十二肋下切开肌肉、腹膜，揭开脂肪层，切除左右卵巢。其中8只仅作腹腔切开而不切除卵巢的假手术，作正常空白对照组。

[0256] 1.5 分组和给药

[0257] 实验动物分为4组，每组8只：

[0258] 正常空白对照组，即假手术组，生理盐水3ml/kg灌胃。

[0259] 另外24只切除卵巢的大鼠随机分成3组，分别为：

[0260] 模型组，以生理盐水3ml/kg灌胃；

[0261] 阳性药对照组，用雌二醇溶解在3ml生理盐水中，浓度200μg/kg灌胃；

[0262] 本发明药物组，将本发明药物混悬于3ml生理盐水中，浓度1.5g/kg灌胃；

[0263] 每天灌胃1次，连续给药90d。

[0264] 1.6 观察指标

[0265] 用药结束后通过眼球后取血，根据试剂盒说明，用比色法测定Ca2+、P3+和ALPas阳性药对照活力。再取大鼠右侧大股骨和胫骨，剃除软骨组织，用双能X线骨密度仪测定股骨和胫骨的骨密度（Bone Mineral Density，BMD）。

[0266] 1.7 统计学处理

[0267] 所有数据均用（ ±s）表示，用SPSS11.0统计软件one way ANOVA，LSD方法分析，P＜0.05为有统计学意义。

[0268] 2 结果

[0269] 2.1 对Ca2+、P3+、ALPas阳性药对照影响

[0270] 模型组去势大鼠血清中的Ca2+、P3+和ALPase活力与正常空白对照组相比均明显升高。服用阳性药物后，Ca2+、P3+和ALPase活力与模型组相比，阳性药物组有明显著降低，而本发明药物组作用效果则不明显。见表5-1。

[0271] 表5-1 各组血清中Ca2+、P3+和ALPas阳性药对照活力平均值比较（ ±s）[0272]

[0273] 注：与模型组相比，**P<0.01。

[0274] 2.2 骨密度的测定

[0275] 模型组去势大鼠的股骨和胫骨的BMD与正常对照大鼠相比明显降低。服用阳性药物后，股骨和胫骨的BMD与模型组相比显著提高；与正常空白对照组比较，其差异没有统计学意义。而本发明药物组作用效果则不明显。见表5-2。

[0276] 表5-2 各组股骨和胫骨的BMD平均值比较（ ±s）

[0277]

[0278] 注：与模型组比较，**P＜0.01。

[0279] 3 讨论与结论

[0280] 本研究动物实验结果显示，本发明药物组实验动物血清中Ca2+和P3+浓度没有明显降低，说明本发明药物不能减少骨中钙和骨磷丢失，不能促进钙和磷在骨中的沉积。模型组动物由于骨高代谢，使破骨和成骨作用均旺盛，破骨作用超过成骨作用，所以出现骨质疏松；应用本发明药物后，ALPase没有明显下降，说明本发明药物不能抑制骨代谢，不能增加骨稳定，也就不能阻止骨质疏松症发生。应用本发明药物后，股骨和胫骨BMD较模型组动物没有显著增高，表明本发明药物不能降低去势大鼠的骨丢失，也不能促进骨形成，对骨代谢平衡也没有调节作用。综上，本发明药物对骨质疏松症没有治疗作用，不能用于骨质疏松症的治疗。

[0281] 附图说明：

[0282] 图1：对照品HPLC色谱图，图中1号峰为六氢金合欢基丙酮色谱峰，2号峰为穗罗汉松树脂酚苷色谱峰

[0283] 图2：供试品HPLC色谱图，图中1号峰为六氢金合欢基丙酮色谱峰，2号峰为穗罗汉松树脂酚苷色谱峰

[0284] 图3：阴性样品溶液Ⅰ（缺栎叶槲蕨）HPLC色谱图，图中1号峰为六氢金合欢基丙酮色谱峰

[0285] 图4：阴性样品溶液Ⅱ（缺铁马豆）HPLC色谱图，图中2号峰为穗罗汉松树脂酚苷丙酮色谱峰

[0286] 图5：本发明药物样品气相色谱图

[0287] 图6：对照品气相色谱图

[0288] 图7：空白对照气相色谱图

[0289] 具体实施方式：

[0290] 实施例1：

[0291] 处方：栎叶槲蕨333g、铁马豆333g、东北卫矛333g。

[0292] 制法：取栎叶槲蕨333g、铁马豆333g、东北卫矛333g，混合，加入10000mL水浸泡1小时，煎煮3次，每次的加水量均为10000mL，每次煎煮1小时，提取液合并，滤过，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，压片，即得。

[0293] 含量测定：

[0294] 采用高效液谱法对穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮进行含量测定：

[0295] （1）色谱条件：Waters SunFire C18色谱柱；流动相A：乙腈，流动相B：1%冰醋酸溶液，梯度洗脱：0～15min，流动相A从15%线性增加至20%，流动相B从85%线性下降至80%；15～20min，流动相A从20%线性增加至25%，流动相B从80%线性下降至75%；20～25min，流动相A从
25%线性增加至30%，流动相B从75%线性下降至70%；25～35min，流动相A保持在30%，流动相B保持在70%；35～40min，流动相A从30%线性增加至80%，流动相B从70%线性下降至20%；40～
45min，流动相A保持在80%，流动相B保持在20%；检测波长为284nm；柱温：30℃；流速：
-1
1.0mL·min ；理论塔板数以穗罗汉松树脂酚苷峰计应不低于5000；

[0296] （2）穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液的制备：

[0297] ① 精密称取穗罗汉松树脂酚苷对照品80.0mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得每1mL含穗罗汉松树脂酚苷1.60mg的贮备液；

[0298] ② 精密称取六氢金合欢基丙酮对照品80.0mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得每1mL含六氢金合欢基丙酮1.60mg的贮备液；

[0299] ③ 对照品混合溶液：分别取穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品贮备溶液1.0mL、0.5mL混合后，用甲醇稀释至10mL，得穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液；

[0300] （3）供试品溶液的制备：取本发明药物，精密量取5mg，置50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，150W，50kHz超声处理10min，放置至室温后，用甲醇补充至刻度，经3000r·min-1离心10min，取上清液，过滤，即得供试品溶液；

[0301] （4）测定：取供试品溶液、穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液各5μL，注入高效液相色谱仪测定；

[0302] （5）测定结果：每1g样品中六氢金合欢基丙酮和穗罗汉松树脂酚苷含量分别为0.614mg和1.32mg。

[0303] 采用气相色谱法对2,3,6-三甲基茴香醚进行含量测定：

[0304] （1）色谱条件：SE-30毛细管柱；程序升温：柱温起始温度50℃，以15℃·min-1速率升到150℃保持4min；氮气为载气；FID检测器；分流比6:1；检测器温度220℃；进样口温度200℃；

[0305] （2）对照品溶液：精密称取2,3,6-三甲基茴香醚6.6mg，置10mL容量瓶中，用环己烷-1溶解并定容至刻度，配成浓度为0.66mg·mL 的对照品溶液；

[0306] （3）供试品溶液：精密量取本发明药物50mg，加水250mL，照《中国药典》2015年版第四部通则2204挥发油测定法进行实验，连接挥发油测定器，自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，加环己烷3mL，连接回流冷凝管，加热保持微沸4h，放冷，将测定器中的液体移至分液漏斗中，分取环己烷液，水液再用环己烷提取2次，每次3mL，用铺有无水硫酸钠0.5g的漏斗滤过，合并环己烷液，置25mL容量瓶中，加环己烷至刻度，摇匀，即得；

[0307] （4）测定：取对照品溶液和供试品溶液各1μL，注入气相色谱仪，测定；

[0308] （5）测定结果：每1g样品中2,3,6-三甲基茴香醚含量为0.35mg。

[0309] 实施例2：

[0310] 处方：栎叶槲蕨333g、铁马豆333g、东北卫矛333g。

[0311] 制法：取栎叶槲蕨333g、铁马豆333g、东北卫矛333g，混合，加入10000mL水浸泡1小时，煎煮3次，每次的加水量均为10000mL，每次煎煮1小时，提取液合并，滤过，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，装入胶囊，即得。

[0312] 含量测定：

[0313] 采用高效液谱法对穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮进行含量测定：

[0314] （1）色谱条件：Waters SunFire C18色谱柱；流动相A：乙腈，流动相B：1%冰醋酸溶液，梯度洗脱：0～15min，流动相A从15%线性增加至20%，流动相B从85%线性下降至80%；15～20min，流动相A从20%线性增加至25%，流动相B从80%线性下降至75%；20～25min，流动相A从
25%线性增加至30%，流动相B从75%线性下降至70%；25～35min，流动相A保持在30%，流动相B保持在70%；35～40min，流动相A从30%线性增加至80%，流动相B从70%线性下降至20%；40～
45min，流动相A保持在80%，流动相B保持在20%；检测波长为284nm；柱温：30℃；流速：
1.0mL·min-1；理论塔板数以穗罗汉松树脂酚苷峰计应不低于5000；

[0315] （2）穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液的制备：

[0316] ① 精密称取穗罗汉松树脂酚苷对照品80.0mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得每1mL含穗罗汉松树脂酚苷1.60mg的贮备液；

[0317] ② 精密称取六氢金合欢基丙酮对照品80.0mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得每1mL含六氢金合欢基丙酮1.60mg的贮备液；

[0318] ③ 对照品混合溶液：分别取穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品贮备溶液1.0mL、0.5mL混合后，用甲醇稀释至10mL，得穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液；

[0319] （3）供试品溶液的制备：取本发明药物，精密量取5mg，置50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，150W，50kHz超声处理10min，放置至室温后，用甲醇补充至刻度，经3000r·min-1离心10min，取上清液，过滤，即得供试品溶液；

[0320] （4）测定：取供试品溶液、穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液各5μL，注入高效液相色谱仪测定；

[0321] （5）测定结果：每1g样品中六氢金合欢基丙酮和穗罗汉松树脂酚苷含量分别含量分别为0.621mg和1.35mg。

[0322] 采用气相色谱法对2,3,6-三甲基茴香醚进行含量测定：

[0323] （1）色谱条件：SE-30毛细管柱；程序升温：柱温起始温度50℃，以15℃·min-1速率升到150℃保持4min；氮气为载气；FID检测器；分流比6:1；检测器温度220℃；进样口温度200℃；

[0324] （2）对照品溶液：精密称取2,3,6-三甲基茴香醚6.6mg，置10mL容量瓶中，用环己烷溶解并定容至刻度，配成浓度为0.66mg·mL-1的对照品溶液；

[0325] （3）供试品溶液：精密量取本发明药物50mg，加水250mL，照《中国药典》2015年版第四部通则2204挥发油测定法进行实验，连接挥发油测定器，自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，加环己烷3mL，连接回流冷凝管，加热保持微沸4h，放冷，将测定器中的液体移至分液漏斗中，分取环己烷液，水液再用环己烷提取2次，每次3mL，用铺有无水硫酸钠0.5g的漏斗滤过，合并环己烷液，置25mL容量瓶中，加环己烷至刻度，摇匀，即得；

[0326] （4）测定：取对照品溶液和供试品溶液各1μL，注入气相色谱仪，测定；

[0327] （5）测定结果：每1g样品中2,3,6-三甲基茴香醚含量为0.37mg。

[0328] 实施例3：

[0329] 处方：栎叶槲蕨333g、铁马豆333g、东北卫矛333g

[0330] 制法：取栎叶槲蕨333g、铁马豆333g、东北卫矛333g，混合，加入10000mL水浸泡1小时，煎煮3次，每次的加水量均为10000mL，每次煎煮1小时，提取液合并，滤过，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，制成颗粒剂，即得。

[0331] 含量测定：

[0332] 采用高效液谱法对穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮进行含量测定：

[0333] （1）色谱条件：Waters SunFire C18色谱柱；流动相A：乙腈，流动相B：1%冰醋酸溶液，梯度洗脱：0～15min，流动相A从15%线性增加至20%，流动相B从85%线性下降至80%；15～20min，流动相A从20%线性增加至25%，流动相B从80%线性下降至75%；20～25min，流动相A从
25%线性增加至30%，流动相B从75%线性下降至70%；25～35min，流动相A保持在30%，流动相B保持在70%；35～40min，流动相A从30%线性增加至80%，流动相B从70%线性下降至20%；40～
45min，流动相A保持在80%，流动相B保持在20%；检测波长为284nm；柱温：30℃；流速：
1.0mL·min-1；理论塔板数以穗罗汉松树脂酚苷峰计应不低于5000；

[0334] （2）穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液的制备：

[0335] ① 精密称取穗罗汉松树脂酚苷对照品80.0mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得每1mL含穗罗汉松树脂酚苷1.60mg的贮备液；

[0336] ② 精密称取六氢金合欢基丙酮对照品80.0mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得每1mL含六氢金合欢基丙酮1.60mg的贮备液；

[0337] ③ 对照品混合溶液：分别取穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品贮备溶液1.0mL、0.5mL混合后，用甲醇稀释至10mL，得穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液；

[0338] （3）供试品溶液的制备：取本发明药物，精密量取5mg，置50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，150W，50kHz超声处理10min，放置至室温后，用甲醇补充至刻度，经3000r·min-1离心10min，取上清液，过滤，即得供试品溶液；

[0339] （4）测定：取供试品溶液、穗罗汉松树脂酚苷和六氢金合欢基丙酮对照品混合溶液各5μL，注入高效液相色谱仪测定；

[0340] （5）测定结果：每1g样品中六氢金合欢基丙酮和穗罗汉松树脂酚苷含量分别为0.603mg和1.34mg。

[0341] 采用气相色谱法对2,3,6-三甲基茴香醚进行含量测定：

[0342] （1）色谱条件：SE-30毛细管柱；程序升温：柱温起始温度50℃，以15℃·min-1速率升到150℃保持4min；氮气为载气；FID检测器；分流比6:1；检测器温度220℃；进样口温度200℃；

[0343] （2）对照品溶液：精密称取2,3,6-三甲基茴香醚6.6mg，置10mL容量瓶中，用环己烷溶解并定容至刻度，配成浓度为0.66mg·mL-1的对照品溶液；

[0344] （3）供试品溶液：精密量取本发明药物50mg，加水250mL，照《中国药典》2015年版第四部通则2204挥发油测定法进行实验，连接挥发油测定器，自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，加环己烷3mL，连接回流冷凝管，加热保持微沸4h，放冷，将测定器中的液体移至分液漏斗中，分取环己烷液，水液再用环己烷提取2次，每次3mL，用铺有无水硫酸钠0.5g的漏斗滤过，合并环己烷液，置25mL容量瓶中，加环己烷至刻度，摇匀，即得；

[0345] （4）测定：取对照品溶液和供试品溶液各1μL，注入气相色谱仪，测定；

[0346] （5）测定结果：每1g样品中2,3,6-三甲基茴香醚含量为0.33mg。

[0347] 此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。