草酸青霉EU2101及其在制备纤维素酶制剂与降解纤维素中的应用

摘要

本发明公开了草酸青霉(Penicillium oxalicum)EU2101及其在制备纤维素酶制剂与降解纤维素中的应用。本发明公开的草酸青霉EU2101的保藏编号为CGMCC No.12769。本发明还提供了利用草酸青霉EU2101制备的纤维素酶制剂，其制备方法包括用培养基在28‑42℃下培养草酸青霉EU2101，收集发酵产物，得到纤维素酶制剂。本发明的实验证明草酸青霉EU2101经固态发酵培养后，其浸提液具有纤维素酶活力，包括滤纸酶活力、CMC酶活力、Avicel酶活力、pNPC酶活力和pNPG酶活力，可以高效水解碱预处理的木薯渣产生葡萄糖，在木薯渣的转化和利用中具有应用潜力。

权利要求

1.草酸青霉(Penicillium oxalicum) EU2101，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.12769。

2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的草酸青霉EU2101。

3.下述任一产品：

P1）、利用权利要求1所述的草酸青霉EU2101制备的降解纤维素的产品；所述降解纤维素的产品的活性成分为权利要求1所述的草酸青霉EU2101；

P2）、利用权利要求2所述的菌剂制备的降解纤维素的产品；所述降解纤维素的产品的活性成分为权利要求2所述的菌剂。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于：P1）所述降解纤维素的产品为纤维素酶制剂，所述纤维素酶制剂的制备方法，包括：用培养基在28-42℃下培养权利要求1所述的草酸青霉EU2101，收集发酵产物，得到纤维素酶制剂；

所述培养基由农业有机废弃物与盐溶液组成，其中，所述农业有机废弃物与所述盐溶液的配比为1g:（0.5-3）mL，所述培养基的pH值为3-8；所述盐溶液由水、KH2PO4、氮源、MgSO4·7H2O、吐温80和微量元素母液组成，每升所述盐溶液含KH2PO4 2.5 g、所述氮源5 g、MgSO4·7H2O 2.5 g、吐温80 1 g、所述微量元素母液 0.1 mL；所述微量元素母液由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为FeSO4·7H2O 5 g/L、MnSO4·H2O 1.6 g/L、ZnSO4·7H2O 1.4 g/L和CoCl2 2.0 g/L。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述农业有机废弃物为麦麸、稻秆、米糠、甘蔗渣和/或玉米芯；

所述氮源为酵母提取物、硫酸铵、尿素、蛋白胨、硝酸钠、硝酸铵和/或氯化铵；

所述培养基的pH值为5-6；

所述培养基中所述农业有机废弃物与所述盐溶液的配比为1 g:（0.5-3）mL。

6.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述培养基中所述农业有机废弃物与所述盐溶液的配比为1g:（0.5-2）mL。

7.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述培养基中所述农业有机废弃物与所述盐溶液的配比为1 g:1.5 mL。

8.下述M1）或M2）的方法：

M1）降解纤维素或含纤维素物质的方法，包括：将权利要求4中所述纤维素酶制剂与纤维素或含纤维素物质在50 ℃下于pH为5的环境中进行反应来降解纤维素；

M2）纤维素酶制剂的制备方法；

包括如下步骤：用培养基在28-42℃下培养权利要求1所述的草酸青霉EU2101，收集发酵产物，得到纤维素酶制剂；

所述培养基由农业有机废弃物与盐溶液组成，其中，所述农业有机废弃物与所述盐溶液的配比为1g:（0.5-3）mL，所述培养基的pH值为3-8；所述盐溶液由水、KH2PO4、氮源、MgSO4·7H2O、吐温80和微量元素母液组成，每升所述盐溶液含KH2PO4 2.5 g、所述氮源5 g、MgSO4·7H2O 2.5 g、吐温80 1 g、所述微量元素母液 0.1 mL；所述微量元素母液由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为FeSO4·7H2O 5 g/L、MnSO4·H2O 1.6 g/L、ZnSO4·7H2O 1.4 g/L和CoCl2 2.0 g/L。

9.权利要求1所述的草酸青霉EU2101或权利要求2所述菌剂在下述a1)- a6)中任一种中的应用：a1)在降解纤维素或含纤维素物质中的应用；

a2)在制备降解纤维素或含纤维素物质产品中的应用；

a3)在制备纤维素酶中的应用；

a4)在制备生产纤维素酶产品中的应用；

a5)在制备葡萄糖、纤维二糖或燃料乙醇中的应用；

a6)在制备生产葡萄糖、纤维二糖或燃料乙醇产品中的应用。

10.根据权利要求8所述的方法或权利要求9所述的应用，其特征在于：所述含纤维素物质为木薯渣、麦麸、稻秆、米糠、甘蔗渣和/或玉米芯。

说明书

草酸青霉EU2101及其在制备纤维素酶制剂与降解纤维素中的

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域中草酸青霉EU2101及其在制备纤维素酶制剂与降解纤维素中的应用。

背景技术

[0002] 随着人口的不断增加，煤炭、石油等不可再生的化石能源的迅速消耗及化石能源的使用所带来的严峻环境问题，使得人们逐渐意识到寻找一种可再生的，对环境友好的新能源的重要性。纤维素来源的燃料乙醇比汽油具有更高的辛烷值，带来更少的尾气排放，使得燃料乙醇被广泛认为是化石能源的替代品或化石能源中的添加剂。

[0003] 木质纤维素类物质是世界上含量最丰富，分布最广泛的可再生生物资源(Kuhad,R.C.,Singh,A.,Eriksson,K.E.L.1997.Microorganisms and enzymes involved in the degradation of plant fiber cell walls[M].Springer Berlin Heidelberg)。全球每年可以产数千亿吨的木质纤维素类物质。如果可以利用生物转化技术将这些含量丰富的纤维素类物质转化为可发酵的糖，然后再转化成燃料乙醇，不仅可以解决能源紧张和粮食短缺等全球性问题，而且在一定程度上缓解化石能源所带来的一系列环境问题。第一代燃料乙醇的生产大都是以玉米淀粉等粮食为原料，但是，其大规模应用将导致粮食短缺等问题。第二代燃料乙醇的生产为了避免以上问题，以秸秆、麦麸等农业废弃物、食品加工废物和城市固体废弃物等非粮食类的纤维素类物质为原料。第二代燃料乙醇工业不仅可以变废为宝，而且可以有效地避免燃烧秸秆或废弃物堆积所带来的环境污染问题。

[0004] 木质纤维素类物质转化为燃料乙醇的生物炼制主要分成3个步骤：木质纤维素材料的预处理、木质纤维素被酶解成可发酵的单糖、微生物发酵生产酒精(Saini,R.,Saini,J.K.,Adsul,M.,Patel,A.K.,Mathur,A.,Tuli,D.,Singhania,R.R.2015.Enhanced cellulase production by Penicillium oxalicum for bio-ethanol application[J].Bioresource Technology,188:240-246)。木质纤维素水解酶包括纤维素酶和半纤维素酶等的生产成本过高严重阻碍了木质纤维素生物炼制的商业化进程(Deswal,D.,Khasa,Y.P.,Kuhad,R.C.2011.Optimization of cellulase production by a brown rot fungus Fomitopsis sp.RCK2010under solid state fermentation[J].Bioresource Technology,102:6065-6072)。

[0005] 纤维素酶是一种复合酶，根据催化功能的不同，纤维素酶可分为三类：(1)内切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.4),又称Cx酶。内切葡聚糖酶随机切割非结晶区纤维素分子的β-1,4-糖苷键，将纤维素分子长链降解成短链纤维素分子，同时产生大量含有非还原性末端的纤维素小分子。(2)外切葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91),又称C1酶、纤维二糖水解酶。外切葡聚糖酶以纤维二糖为单位从纤维素分子的末端降解纤维素分子链。与内切葡聚糖酶不同，外切葡聚糖酶可直接作用于纤维素分子的结晶区。(3)β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC 3.2.1.21)，简称BGL。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖和纤维寡糖生成葡萄糖(Juturu,V.,and Wu,J.C.2014.Microbial cellulases:Engineering,production and applications[J].Renewable and Sustainable Energy Reviews,33:188–203；Wang,J.,Quirk,A.,Lipkowski,J.,Dutcher,J.R.,Clarke,A.J.2013.Direct in situ observation of synergism between cellulolytic enzymes during the biodegradation of crystalline cellulose fibers[J].Langmuir,29:
14997-15005)。

[0006] 纤维素酶广泛存在于微生物及动植物中，但是主要来源于丝状真菌，其中木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)的菌株产纤维素酶能力强。目前，木霉属是研究最多的纤维素酶产生菌，且工业上的应用也较多。虽然木霉属的纤维素酶产量较高且酶系比较完整，但胞外β-葡萄糖苷酶活力较低(Gusakov,
A.V.2011.Alternatives to Trichoderma reesei in biofuel production[J].Trends in Biotechnology,29:419-425)，在生产中需要添加额外的β-葡萄糖苷酶或者和β-葡萄糖苷酶高产菌株一起发酵产酶(Dhillon,G.S.,Oberoi H.S.,Dhillon,K.S.,Brar,S.K.2011.Value-addition of agricultural wastes for augmented cellulase and xylanase production through solid-state tray fermentation employing mixed-culture of fungi[J].Industrial Crops and Products,34:1160-1167)。

[0007] 最近实验证明青霉属菌株可以产生完整的纤维素酶系及高活力的β-葡萄糖苷酶(Gusakov,A.V.2011.Alternatives to Trichoderma reesei in biofuel production[J].Trends in Biotechnology,29:419-425；Ng,I.S.,Li,C.W.,Chan,S.P.,Chir,J.L.,Chen,P.T.,Tong,C.G.,Yu,S.M.,Ho,T.H.2010.High-level production of a thermoacidophilic beta-glucosidase from Penicillium citrinum YS40-5by solid-state fermentation with rice bran[J].Bioresource Technology,101:1310-1317；Zhang,H.,Sang,Q.2012.Statistical optimization of cellulases production by Penicillium chrysogenum QML-2under solid-state fermentation and primary application to chitosan hydrolysis[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,28:1163-1174)。但是，青霉属菌株产纤维素酶活力和产量离大规模的工业应用差距还很大。因此，经济可行的制备高活力纤维素酶制剂方法的开发具有重要意义。

发明内容

[0008] 本发明所要解决的技术问题是如何水解纤维素以及制备纤维素酶制剂。

[0009] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了草酸青霉(Penicillium oxalicum)EU2101。

[0010] 本发明所提供的草酸青霉EU2101，已于2016年07月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.12769，下文称为草酸青霉EU2101CGMCC No.12769。

[0011] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种菌剂。

[0012] 本发明所提供的菌剂的活性成分为草酸青霉EU2101CGMCC No.12769。

[0013] 上述菌剂可为下述1)或2)所述菌剂：

[0014] 1)用于降解纤维素的菌剂；

[0015] 2)用于降解含纤维素物质的菌剂。

[0016] 为解决上述技术问题，本发明还提供了用于培养草酸青霉EU2101CGMCC No.12769的培养基。

[0017] 本发明所提供的用于培养草酸青霉EU2101CGMCC No.12769的培养基，由农业有机废弃物与盐溶液组成，其中，所述农业有机废弃物与所述盐溶液的配比为1g:(0.5-3)mL，所述培养基的pH值为3-8；所述盐溶液由水、KH2PO4、氮源、MgSO4·7H2O、吐温80和微量元素母液组成，每升所述盐溶液含KH2PO4 2.5g、所述氮源5g、MgSO4·7H2O 2.5g、吐温80 1g、所述微量元素母液0.1mL；所述微量元素母液由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为FeSO4·7H2O 5g/L、MnSO4·H2O 1.6g/L、ZnSO4·7H2O 1.4g/L、CoCl2 2.0g/L。

[0018] 上述培养基中，所述农业有机废弃物是指农业加工及农民日常生活过程中产生的有机废弃物，主要以秸秆、树叶、杂草和木屑为主，还包括相应的粮食品加工厂、酿造厂、农副产品加工厂的下脚料、加工残渣，如糠皮、麦麸、糟渣、玉米芯、豆荚、花生壳、棉籽壳等。所述农业有机废弃物具体可为麦麸、稻秆、米糠、甘蔗渣和/或玉米芯。

[0019] 上述培养基中，所述氮源可为酵母提取物、硫酸铵、尿素、蛋白胨、硝酸钠、硝酸铵和/或氯化铵。

[0020] 上述培养基中，所述培养基的pH值可为4-7，如5-6。

[0021] 上述培养基中，所述培养基中所述农业有机废弃物与所述盐溶液的配比可为1g:(0.5-3)mL。所述培养基中所述农业有机废弃物与所述盐溶液的配比进一步可为1g:(0.5-
2)mL，如1g:1.5mL。

[0022] 上述培养基中，所述农业有机废弃物颗粒大小可为0.2-0.9mm。所述农业有机废弃物颗粒大小具体可为0.3-0.9mm。进一步所述农业有机废弃物颗粒大小可为0.3-0.45mm。

[0023] 上述培养基中，所述农业有机废弃物为麦麸和稻秆，所述培养基中麦麸、稻秆与所述盐溶液的配比为(2-8)g:(2-8)g:20mL。所述培养基中麦麸、稻秆与所述盐溶液的配比具体可为(4-6)g:(4-6)g:20mL，如4g:6g:20mL或6g:4g:20mL。

[0024] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一产品：

[0025] P1)、利用草酸青霉EU2101CGMCC No.12769制备的降解纤维素的产品；

[0026] P2)、利用所述菌剂制备的降解纤维素的产品；

[0027] P3)、利用草酸青霉EU2101CGMCC No.12769制备的纤维素酶；

[0028] P4)、利用所述菌剂制备的纤维素酶。

[0029] 上述产品中，P1)所述降解纤维素的产品的活性成分可为草酸青霉EU2101CGMCC No.12769；

[0030] P2)所述降解纤维素的产品的活性成分可为所述菌剂。

[0031] 上述产品中，P1)所述降解纤维素的产品可为纤维素酶制剂，所述纤维素酶制剂的制备方法，包括：用所述培养基在28-42℃下培养草酸青霉EU2101CGMCC No.12769收集发酵产物，得到纤维素酶制剂。

[0032] 上述产品中，培养草酸青霉EU2101CGMCC No.12769的温度可为28-37℃。进一步，培养草酸青霉EU2101CGMCC No.12769的温度可为28-32℃。

[0033] 上述产品中，培养草酸青霉EU2101CGMCC No.12769的时间可为3-8天。进一步，培养草酸青霉EU2101CGMCC No.12769的时间可为6-8天。

[0034] 上述产品中，所述纤维素酶制剂的制备方法还可包括：浸提所述发酵产物，得到浸提产物，将所述浸提产物进行离心，收集上清液，该上清液即为得到纤维素酶制剂。

[0035] 其中，浸提所述发酵产物可用水(如去离子水)进行。

[0036] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述M1)或M2)或M3)的方法：

[0037] M1)降解纤维素或含纤维素物质的方法，包括：将权利要求8中所述纤维素酶制剂与纤维素或含纤维素物质在50℃下于pH为5的环境中进行反应来降解纤维素；

[0038] M2)所述纤维素酶制剂的制备方法；

[0039] M3)培养草酸青霉EU2101CGMCC No.12769的方法，包括用所述培养基在28-42℃下培养草酸青霉EU2101CGMCC No.12769。

[0040] 上述方法中，所述pH为5的环境中可为pH为5的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液。所述pH为5的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液为用Na2HPO4与柠檬酸制备的pH为5的缓冲液。所述pH为5的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液的制备方法具体可为将0.2M Na2HPO4水溶液和0.1M柠檬酸水溶液按10.3:9.7的体积比混合得到的溶液，其中Na2HPO4和柠檬酸的浓度分别可为0.103M、
0.0485M。

[0041] 上述方法中，所述含纤维素物质具体可为木薯渣、麦麸、稻秆、米糠、甘蔗渣和/或玉米芯等含有纤维素的农业有机废弃物。所述农业有机废弃物是指农业加工及农民日常生活过程中产生的有机废弃物，主要以秸秆、树叶、杂草和木屑为主，还包括相应的粮食品加工厂、酿造厂、农副产品加工厂的下脚料、加工残渣，如糠皮、麦麸、糟渣、玉米芯、豆荚、花生壳、棉籽壳等。

[0042] 上述方法中，所述木薯渣具体可为用NaOH与H202处理后的木薯渣。

[0043] 上述方法中，所述含纤维素物质(底物)的浓度可为(20-80)g/L反应体系。所述含纤维素物质(底物)的浓度可为(40-80)g/L反应体系，如60g/L反应体系。

[0044] 上述方法中，所述纤维素酶制剂的浓度可为1-30FPU/g底物，进一步可为5-30FPU/g底物，进一步可为10-30FPU/g底物，进一步可为20-30FPU/g底物。

[0045] 上述降解纤维素或含纤维素物质的方法中，所述反应时间可为0-96小时(不包括0小时)。进一步可为3-96小时，进一步可为6-96小时，进一步可为12-96小时，进一步可为24-96小时，进一步可为48-96小时，进一步可为72-96小时。

[0046] 上述培养草酸青霉EU2101CGMCC No.12769的温度可为28-37℃。进一步，培养草酸青霉EU2101CGMCC No.12769的温度可为28-32℃。

[0047] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述X1)、X2)或X3)：

[0048] X1)草酸青霉EU2101CGMCC No.12769或所述菌剂在下述a1)-a6)中任一种中的应用：

[0049] a1)在降解纤维素或含纤维素物质中的应用；

[0050] a2)在制备降解纤维素或含纤维素物质产品中的应用；

[0051] a3)在制备纤维素酶中的应用；

[0052] a4)在制备生产纤维素酶产品中的应用；

[0053] a5)在制备葡萄糖、纤维二糖或燃料乙醇中的应用；

[0054] a6)在制备生产葡萄糖、纤维二糖或燃料乙醇产品中的应用；

[0055] X2)所述培养基在上述a2)、a4)或a6)中的应用；

[0056] X3)所述产品在上述a1)-a6)中任一种中的应用。

[0057] 上述应用中，所述含纤维素物质具体可为木薯渣、麦麸、稻秆、米糠、甘蔗渣和/或玉米芯等含有纤维素的农业有机废弃物。所述农业有机废弃物是指农业加工及农民日常生活过程中产生的有机废弃物，主要以秸秆、树叶、杂草和木屑为主，还包括相应的粮食品加工厂、酿造厂、农副产品加工厂的下脚料、加工残渣，如糠皮、麦麸、糟渣、玉米芯、豆荚、花生壳、棉籽壳等。所述木薯渣具体可为用NaOH与H202处理后的木薯渣。

[0058] 本发明中，纤维素酶酶活力包括内切葡聚糖酶酶活力、纤维二糖水解酶酶活力和/或β-葡萄糖苷酶酶活力。纤维素酶酶活力具体可体现在滤纸酶活力、羧甲基纤维素酶活力(CMC酶活力)、结晶纤维素酶活力(Avicel酶活力)、对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷纤维素酶活力(pNPC酶活力)和/或对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷纤维素酶活力(pNPG酶活力)上。

[0059] 本发明的实验证明草酸青霉EU2101经固态发酵培养后，其浸提液具有纤维素酶活力，包括滤纸酶活力、CMC酶活力、Avicel酶活力、pNPC酶活力和pNPG酶活力。其浸提液可以高效水解碱预处理的木薯渣产生葡萄糖，在木薯渣的转化和利用中具有应用潜力。本发明得到的草酸青霉EU2101，可以生产纤维素酶制剂，该制剂可以高效地水解预处理的木薯渣。该制剂可以用于生产酒精。

[0060] 生物材料保藏说明

[0061] 生物材料的分类命名：草酸青霉(Penicillium oxalicum)

[0062] 生物材料的菌株编号：EU2101

[0063] 生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心[0064] 生物材料的保藏单位简称：CGMCC

[0065] 生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

[0066] 生物材料的保藏日期：2016年07月14日

[0067] 生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.12769

附图说明

[0068] 图1为草酸青霉EU2101发酵培养基最适初始pH优化实验结果。

[0069] 图2为草酸青霉EU2101发酵最适温度优化实验结果。

[0070] 图3为草酸青霉EU2101发酵培养基最适固液比优化实验结果。

[0071] 图4为草酸青霉EU2101发酵培养基最佳碳源的优化实验结果。

[0072] 图5为草酸青霉EU2101发酵培养基最佳碳源颗粒大小的优化实验结果。

[0073] 图6为草酸青霉EU2101发酵培养基组合碳源最佳浓度的优化实验结果。

[0074] 图7为草酸青霉EU2101发酵培养基最佳氮源的优化实验结果。

[0075] 图8为草酸青霉EU2101发酵培养最佳时间的优化实验结果。

[0076] 图9为不同底物浓度对纤维素酶制剂水解预处理木薯渣的影响。

[0077] 图10为不同纤维素酶制剂添加量对水解预处理木薯渣的影响。

具体实施方式

[0078] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

[0079] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0080] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0081] 下述实施例中的麦麸为小麦麸，米糠为水稻米糠，麦麸、米糠、稻秆、玉米芯和甘蔗渣的含水量均在5％以下。

[0082] 下文中，pH 5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液为将0.2M Na2HPO4水溶液和0.1M柠檬酸水溶液按10.3:9.7的体积比混合而的得到的Na2HPO4浓度为0.103M、柠檬酸浓度为0.0485M的溶液。

[0083] 下面的葡萄糖标准曲线的绘制、木糖标准曲线的绘制、对硝基苯酚标准曲线的绘制、滤纸酶活力的测定、羧甲基纤维素酶活力的测定、Avicel酶活力的测定、木聚糖酶活力的测定、pNPG酶活力的测定、pNPC酶活力的测定以及木薯渣纤维素的含量均按照如下方法进行：

[0084] 1.葡萄糖标准曲线的绘制

[0085] 称取0.1g葡萄糖标准品，用去离子水配制1mg/mL浓度的葡萄糖标准溶液。按表1的配方将试剂加入2mL离心管中，混匀，沸水浴10分钟显色后，取出样品冷却至室温(DNS试剂在反应结束后加入，用来终止反应)。在12,000rpm条件下离心2分钟，吸取200μL上层溶液至96孔酶标板中，在540nm波长下测定其吸光值并绘制葡萄糖的标准曲线，得到的线性回归方程为Y＝3.6433X-0.0325，方差R2＝0.9993。

[0086] 表1、葡萄糖标准曲线溶液的组分

[0087]

[0088] 表1中的缓冲液为pH 5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液。

[0089] 2.木糖标准曲线的绘制

[0090] 称取0.1g木糖标准品，用去离子水配制1mg/mL浓度的木糖标准溶液。按表2的配方将试剂加入2mL离心管中混匀，沸水浴10分钟显色后，取出样品冷却至室温(DNS试剂在反应结束后加入，用来终止反应)。待样品冷却至室温，在12,000rpm条件下离心2分钟，吸取200μL上层溶液至96孔酶标板中，在540nm波长下测定其吸光值并绘制木糖的标准曲线，其线性回归方程为Y＝3.739X-0.1503，方差R2＝0.9994。

[0091] 表2、木糖标准曲线溶液的组分

[0092]

[0093] 表2中的缓冲液为pH 5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液。

[0094] 3.对硝基苯酚标准曲线的绘制

[0095] 用去离子水配制10mM的对硝基苯酚(pNP)标准溶液。按表3的配方将试剂加入1.5mL离心管中混匀(pNP浓度为将pNP标准溶液和缓冲液混合后计算的终浓度。)。在
12000rpm条件下离心2分钟，吸取200μL上层溶液至96孔酶标板中，在410nm波长下测定其吸光值并绘制对硝基苯酚的标准曲线，标准曲线线性回归方程为Y＝6.3918x+0.0023，方差R2＝0.9999。

[0096] 表3、pNP标准曲线溶液的组分

[0097]

[0098] 表3中的缓冲液为pH 5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液。

[0099] 4.滤纸酶活力的测定

[0100] 滤纸酶活力的测定参照Ghose的方法(Ghose,T.K.1959.Measurement of cellulase activities[J].Pure and Applied Chemistry.59:257-268)进行，具体方法如下：

[0101] (1)取1×6cm大小WhatmanⅠ号滤纸(WhatmanTM，Cat NO.1001917)，将滤纸折叠放置于10mL的离心管底，加入1mL pH 5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，使滤纸完全被缓冲液浸没，将样品置于55℃的恒温水浴锅中预热至温度恒定。

[0102] (2)向上述10mL离心管中加入500μL待测酶液，对照组为灭活的酶液，55℃温度反应60分钟，每10分钟晃动混匀一次。

[0103] (3)向上述10mL离心管中加入3mL DNS试剂终止反应，沸水浴10分钟，取出样品冷却至室温。

[0104] (4)待样品冷却至室温，吸取200μL上层溶液至96孔酶标板中，在540nm波长下测定吸光值。并根据葡萄糖标准曲线的线性回归方程计算出葡萄糖的浓度，再通过葡萄糖的浓度计算出滤纸酶活力。

[0105] 滤纸酶活力单位(U)定义为：在pH 5.0，55℃条件下，每分钟催化生成1μmoL还原糖所需要的酶量为一个单位，滤纸酶产量(U/gds)定义为:在pH 5.0，55℃反应条件下，每克干基质(gram dried substrate)所含有的滤纸酶活力。

[0106] 5.羧甲基纤维素酶活力的测定

[0107] 羧甲基纤维素酶活力(CMC酶活力)的测定参照Gokhale的方法(Gokhale,D.V.,Puntambekar,U.S.,Deobagkar,D.N.,Peberby,J.F.1988.Production of cellulolytic enzymes by mutants of Aspergillus niger NCIM 1207[J].Enzyme&Microbial Technology,10:442-445)进行，具体如下：

[0108] (1)向2mL的离心管中加入450μL的1mg/mL的CMC溶液(CMC溶液为用pH 5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液溶解CMC得到的溶液)，置于60℃的水浴锅中预热至温度恒定。

[0109] (2)向上述2mL的离心管中加入50μL待测酶液，对照组为灭活的酶液，60℃反应30分钟，每10分钟晃动混匀一次。

[0110] (3)向上述2mL的离心管中加入1mL的DNS试剂终止反应，沸水浴10分钟，取出样品冷却至室温。

[0111] (4)待样品冷却至室温，12,000rpm离心2分钟。吸取200μL上层溶液至96孔酶标板中，在540nm波长下测定吸光值。并根据葡萄糖标准曲线的线性回归方程计算出还原糖的浓度，再通过还原糖的浓度计算出羧甲基纤维素酶活力。

[0112] 羧甲基纤维素酶活力单位(U)定义为：在pH 5.0，60℃反应条件下，每分钟催化生成1μmoL还原糖所需要的酶量为一个单位。羧甲基纤维素酶产量(U/gds)定义为：在pH 5.0，60℃反应条件下，每克干基质所含有的羧甲基纤维素酶活力。

[0113] 6.Avicel酶活力的测定

[0114] Avicel酶活力的测定参照Ghose的方法(Ghose,T.K.1959.Measurement of cellulase activities[J].Pure and Applied Chemistry.59:257-268)进行，具体如下：

[0115] (1)向2mL的离心管中加入450μL的1mg/ml的Avicel水溶液(Avicel溶液为用pH 5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液溶解Avicel得到的溶液)，置于55℃的水浴锅中预热至温度恒定。

[0116] (2)向上述2mL的离心管中加入50μL待测酶液，对照组为灭活的酶液，55℃反应60分钟，每10分钟晃动混匀一次。

[0117] (3)向上述2mL的离心管中加入1mL的DNS试剂终止反应，沸水浴10分钟，取出样品冷却至室温。

[0118] (4)待样品冷却至室温，12,000rpm离心2分钟。吸取200μL上层溶液至96孔酶标板中，在540nm波长下测定吸光值。并根据葡萄糖标准曲线的线性回归方程计算出还原糖的浓度，再通过还原糖的浓度计算出Avicel酶活力。

[0119] Avicel酶活力单位(U)定义为：在pH 5.0，55℃反应条件下，每分钟催化生成1μmoL还原糖所需要的酶量为一个单位。Avicel酶产量(U/gds)定义为：在pH 5.0，55℃反应条件下，每克干基质所含有的Avicel酶活力。

[0120] 7.木聚糖酶活力的测定

[0121] 木聚糖酶活力的测定参照Ghose等人的方法(Ghose,T.K.1959.Measurement of cellulase activities[J].Pure and Applied Chemistry.59:257-268)进行，具体如下：

[0122] (1)向2mL的离心管中加入450μL的1mg/ml的木聚糖水溶液(木聚糖溶液为用pH5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液溶解木聚糖得到的溶液)，置于60℃的水浴锅中预热至温度恒定。

[0123] (2)向上述2mL的离心管中加入50μL待测酶液，对照组为灭活的酶液，60℃反应10分钟，每2分钟晃动混匀一次。

[0124] (3)向2mL的离心管中加入1mL的DNS试剂终止反应，沸水浴10分钟，取出样品冷却至室温。

[0125] (4)待样品冷却至室温，12,000rpm离心2分钟。吸取200μL上层溶液至96孔酶标板中，在540nm波长下测定吸光值。并根据木糖标准曲线的线性回归方程计算出还原糖的浓度，再通过还原糖的浓度计算出木聚糖酶活力。

[0126] 木聚糖酶活力单位(U)定义为：在pH 5.0，60℃反应条件下，每分钟催化生成1μmoL还原糖所需要的酶量为一个单位。木聚糖酶产量(U/gds)定义为：在pH 5.0，60℃反应条件下，每克干基质所含有的木聚糖酶活力。

[0127] 8.pNPG酶活力的测定

[0128] pNPG酶活力的测定参照Gokhale等人的方法(Gokhale,D.V.,Puntambekar,U.S.,Deobagkar,D.N.,Peberby,J.F.1988.Production of cellulolytic enzymes by mutants of Aspergillus niger NCIM 1207[J].Enzyme&Microbial Technology,10:442-445)进行，具体如下

[0129] (1)向1.5mL的离心管中加入14μL 25mM pNPG溶液(pNPG溶液为用pH 5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液溶解pNPG得到的溶液)和116μL pH 5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，充分混匀后，将样品置于70℃恒温水浴锅中预热至温度恒定。

[0130] (2)向上述1.5mL的离心管中加入10μL待测酶液，70℃反应15分钟。

[0131] (3)向上述1.5mL的离心管中加入70μL 0.4M Na2CO3溶液终止反应，取出样品冷却至室温。

[0132] (4)待样品冷却至室温，12,000rpm离心2分钟，吸取200μL上层溶液至96孔酶标板中，在410nm波长下测定吸光值并根据pNP浓度标准曲线的线性回归方程计算出pNP的浓度，再通过pNP的浓度计算出pNPG酶活力活力。

[0133] pNPG酶活力单位(U)定义为：在pH 5.0，70℃反应条件下，每分钟催化生成1μmoL的pNP所需要的酶量为一个单位。pNPG酶产量(U/gds)定义为：在pH 5.0，70℃反应条件下，每克干基质所含有的pNPG酶活力。

[0134] 9.pNPC酶活力的测定

[0135] pNPC酶活力的测定参照Gokhale等人的方法(Gokhale,D.V.,Puntambekar,U.S.,Deobagkar,D.N.,Peberby,J.F.1988.Production of cellulolytic enzymes by mutants of Aspergillus niger NCIM 1207[J].Enzyme&Microbial Technology,10:442-445)进行，具体步骤如下：

[0136] (1)向1.5mL离心管中加入14μL 25mM pNPC溶液(pNPC溶液为用pH 5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液溶解pNPC得到的溶液)和58μL pH 5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，充分混匀后置于60℃恒温水浴锅中预热至温度恒定。

[0137] (2)向上述1.5mL的离心管中加入68μL待测酶液，60℃反应15分钟。

[0138] (3)向上述1.5mL的离心管中加入70μL 0.4M Na2CO3水溶液终止反应，取出样品冷却至室温。

[0139] (4)待样品冷却至室温，12,000rpm离心2分钟，用移液枪吸取200μL上层溶液至96孔酶标板中，在410nm波长下测定吸光值并根据pNP浓度标准曲线的线性回归方程计算出pNP的浓度，再通过pNP的浓度计算出纤维二糖水解酶活力。

[0140] pNPC酶活力单位(U)定义为：在pH 5.0，60℃反应条件下，每分钟催化生成1μmoL的pNP所需要的酶量为一个单位。pNPC酶产量(U/gds)定义为:在pH 5.0，60℃反应条件下，每克干基质所含有的pNPC酶活力。

[0141] 10.木薯渣中纤维素含量的测定

[0142] 木薯渣中纤维素含量的测定方法以美国国家能源部可再生能源实验室的方法(Sluiter，A.,Hames,B.,Ruiz,R.,Scarlata,C.,Sluiter,J.,Templeton,D.,Crocker,D.2012.Determination  of structural  carbohydrates and lignin in biomass.Technical.Report NREL/TP-510-42618-revised)，并略微做了一定的修改，具体步骤如下：

[0143] (1)向加有0.3g过40目筛的木薯渣的试管中添加3mL 72％(w/w)的硫酸溶液，充分混匀，每个实验组设置3个重复。

[0144] (2)将样品置于30℃恒温水浴锅中温浴60分钟，每10分钟充分混匀一次。

[0145] (3)取出样品并向试管中加入84mL的去离子水，将样品转移至250mL的三角瓶中。

[0146] (4)将250mL三角瓶置于灭菌锅高压121℃反应60分钟后，冷却至室温。

[0147] (5)用0.22μm的滤膜过滤1mL真空抽滤的滤液。

[0148] (6)通过高效液相色谱法(HPLC)分析滤液中的组分(浓度为1mg/mL的葡萄糖和木糖作为标准品)。

[0149] (7)葡萄糖的测定：以每10mL样品加入0.384mL 72％(w/w)的硫酸的比例向标准样品中加入72％(w/w)的硫酸，在121℃条件下反应60分钟，计算糖的回收率(％Rsugar)：

[0150] ％Rsugar＝HPLC(g/L)/已知标准液浓度(g/L)

[0151] 标准样品体积10mL，标准样品浓度5mg/mL，实验组加入0.384mL 72％(w/w)硫酸，对照组加入0.384mL超纯水。葡萄糖损失率为：

[0152] ％Rglucose＝88.71％

[0153] 样品中单糖的实际浓度：

[0154] C(g/L)＝CHPLC×稀释倍数/(％Rglucose/100)

[0155] 通过单糖的实际浓度计算纤维素的含量，葡萄糖的校正系数为0.9

[0156] 实施例1、草酸青霉EU2101的鉴定

[0157] 草酸青霉EU2101是本申请的发明人实验室原有的真菌菌株中，经过诱变后筛选得到产纤维素酶活力更高的菌株。以草酸青霉野生型菌株HP7-1(CGMCC No.10781)为出发菌株，采用3轮Co60-γ射线辐照，得到了一株滤纸酶活力较出发菌株HP7-1提高的突变株TCO7-4。再将TCO7-4及其突变株EU122进行甲基磺酸乙酯(Ethylmethylsulfone，EMS)与紫外线(ultraviolet，UV)复合诱变和筛选，最终得到突变株EU2101。

[0158] 具体操作为将菌株HP7-1进行Co 60-γ射线辐照时，选择致死率为85％左右对应剂量下的孢子悬浮液对突变株进行大规模分离与筛选；而EMS与UV复合诱变处理的顺序是，先将突变株TCO7-4分别进行EMS处理24h，28h和32h后在紫外线下照射5min，6min，7min。结果发现，不论是哪一种组合方案，致死率均达99％。因此，选取24h EMS处理和7min紫外线照射孢子液进行大规模诱变、分离与筛选突变株，得到一株突变株EU122。再将突变株EU122用上述同样方法进行EMS与UV复合诱变。经过分离、筛选，最后得到突变株EU2101。

[0159] 草酸青霉EU2101已于2016年07月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.12769。

[0160] 实施例2、草酸青霉EU2101固态发酵产纤维素酶条件的优化

[0161] 实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

[0162] 一、孢子悬浮液的制备

[0163] 1.将PDA固体培养基115℃灭菌30min，得到PDA平板。

[0164] 2.用0.1％(v/v,体积百分比浓度)吐温80水溶液洗下在PDA平板上培养5天的草酸青霉EU2101孢子，制备浓度为1×108个/mL的孢子悬浮液。

[0165] 二、培养基初始pH的优化

[0166] 1.配制不同pH的发酵培养基

[0167] 配制基本培养基：基本培养基由麦麸与盐溶液组成，其中，麦麸与盐溶液的配比为10.0g：20mL。盐溶液由水、KH2PO4、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、吐温80和微量元素母液组成，每升盐溶液含KH2PO4 2.5g、(NH4)2SO4 5.0g、MgSO4·7H2O 2.5g、吐温80 1.0g、微量元素母液
0.1mL。微量元素母液由溶质和溶剂组成，溶剂为水，每升微量元素母液中各溶质的含量分别为FeSO4·7H2O 5.0g、MnSO4·H2O 1.6g、ZnSO4·7H2O 1.4g、CoCl2 2.0g。

[0168] 用5M HCl水溶液或NaOH水溶液调节基本培养基的pH，使其pH分别为3、4、5、6、7和8，121℃高压灭菌30min，分别得到pH为3的培养基、pH为4的培养基、pH为5的培养基、pH为6的培养基、pH为7的培养基和pH为8的培养基。

[0169] 2.发酵培养

[0170] 将步骤一的孢子悬浮液按10％(v/w)分别接种至上述不同pH的培养基中，28℃恒温培养箱静置培养5天，得到发酵产物；向发酵产物中加入无菌去离子水(无菌去离子水与发酵产物的体积比为10：1)，在28℃、180rpm浸提1h，得到浸提产物，将浸提产物离心(8,000g离心15min)，收集上清液，该上清液即为粗酶液。

[0171] 3.酶活力测定

[0172] 收集粗酶液，对不同pH的培养基得到的粗酶液分别进行滤纸酶活力、CMC酶活力、Avicel酶活力、木聚糖酶活力、pNPC酶活力和pNPG酶活力的测定。

[0173] 结果见图1，结果表明，草酸青霉EU2101产滤纸酶活力(图1中A)的培养基最适初始pH为5.0，草酸青霉EU2101产Avicel酶活力(图1中C)、CMC酶活力(图1中B)和pNPG酶活力(图1中E)的培养基最适初始pH均为6.0，草酸青霉EU2101产木聚糖酶活力的培养基最适初始pH为3.0(图1中D)，草酸青霉EU2101产pNPC酶活力的培养基最适初始pH为4.0(图1中F)。

[0174] 三、培养温度的优化

[0175] 1.利用步骤二的pH为5的培养基优化培养温度。

[0176] 2.将步骤一的孢子悬浮液按10％(v/w)接种至上述步骤二的pH为5的培养基中，分别置于不同温度(28、32、37和42℃)的恒温培养箱中静置培养5天，得到发酵产物；向发酵产物中加入无菌去离子水(无菌去离子水与发酵产物的体积比为10：1)，在28℃、180rpm浸提1h，得到浸提产物，将浸提产物离心(8,000g离心15min)，收集上清液，该上清液即为粗酶液。

[0177] 3.收集粗酶液，分别对不同温度下培养得到的粗酶液进行滤纸酶活力、CMC酶活力、Avicel酶活力、木聚糖酶活力、pNPC酶活力和pNPG酶活力的测定。

[0178] 结果见图2，结果表明，草酸青霉EU2101产滤纸酶活力(图2中A)、CMC酶活力(图2中B)、Avicel酶活力(图2中C)、木聚糖酶活力(图2中D)、pNPG酶活力(图2中E)和pNPC酶活力(图2中F)的培养最适温度均为28℃。

[0179] 四、培养基固液比的优化

[0180] 1.配制不同固液比的发酵培养基

[0181] 不同固液比的培养基均由麦麸与步骤二的盐溶液组成，pH均为5.0，均121℃高压灭菌30min，其中，固液比为1:0.5的培养基的麦麸与盐溶液的配比为10g：5mL，固液比为1:1的培养基的麦麸与盐溶液的配比为10g：10mL，固液比为1:1.5的培养基的麦麸与盐溶液的配比为10g：15mL，固液比为1:2的培养基的麦麸与盐溶液的配比为10g：20mL，固液比为1:2.5的培养基的麦麸与盐溶液的配比为10g：25mL，固液比为1:3的培养基的麦麸与盐溶液的配比为10g：30mL。

[0182] 2.发酵培养

[0183] 将步骤一的孢子悬浮液按10％(v/w)接种至上述不同固液比的培养基中，置于28℃静置培养5天，得到发酵产物；向发酵产物中加入无菌去离子水(无菌去离子水与发酵产物的体积比为10：1)，在28℃、180rpm浸提1h，得到浸提产物，将浸提产物离心(8,000g离心15min)，收集上清液，该上清液即为粗酶液。

[0184] 3.酶活力测定

[0185] 收集粗酶液，分别对不同固液比的培养基得到的粗酶液进行滤纸酶活力、CMC酶活力、Avicel酶活力、木聚糖酶活力、pNPC酶活力和pNPG酶活力的测定。

[0186] 结果见图3，结果表明，草酸青霉EU2101产滤纸酶活力(图3中A)和pNPG酶活力(图3中E)的培养基最适固液比均为1:1.5，草酸青霉EU2101产CMC酶活力(图3中B)和pNPC酶活力(图3中F)的培养基最适固液比均为1:2，草酸青霉EU2101产Avicel酶活力(图3中C)和木聚糖酶活力(图3中D)的培养基最适固液比均为1:0.5。

[0187] 五、培养基最佳碳源的确定

[0188] 1.配制不同碳源的发酵培养基

[0189] 不同碳源的培养基pH均为5.0，121℃高压灭菌30min，其中，麦麸培养基的各组分及含量与步骤二的基本培养基相同；甘蔗渣培养基由甘蔗渣与步骤二的盐溶液组成，其中，甘蔗渣与盐溶液的配比为10.0g：20mL；KOH处理的甘蔗渣培养基由KOH处理的甘蔗渣与步骤二的盐溶液组成，其中，KOH处理的甘蔗渣与盐溶液的配比为10.0g：20mL；NaOH处理的甘蔗渣培养基由NaOH处理的甘蔗渣与步骤二的盐溶液组成，其中，NaOH处理的甘蔗渣与盐溶液的配比为10.0g：20mL；米糠培养基由米糠与步骤二的盐溶液组成，其中，米糠与盐溶液的配比为10.0g：20mL；稻秆培养基由稻秆与步骤二的盐溶液组成，其中，稻秆与盐溶液的配比为10.0g：20mL；玉米芯培养基由玉米芯与步骤二的盐溶液组成，其中，玉米芯与盐溶液的配比为10.0g：20mL。

[0190] 其中，KOH处理的甘蔗渣按照如下方式制备：按料液比1g:10mL的比例将甘蔗渣与含质量浓度为9.87％的KOH、质量浓度为2.5％的H202溶液混合后，在50℃下浸泡处理24h，纱布过滤，滤渣用水洗至中性，50℃烘干。

[0191] NaOH处理的甘蔗渣按照如下方式制备：按料液比1g:10mL的比例将甘蔗渣与含质量浓度为8.0％的NaOH、质量浓度为2.48％的H202溶液混合后，在40℃下浸泡处理24h，纱布过滤，滤渣用水洗至中性，50℃烘干。

[0192] 2.发酵培养

[0193] 将步骤一的孢子悬浮液按10％(v/w)接种至上述各不同碳源的发酵培养基中，置于28℃静置培养5天，得到发酵产物；向发酵产物中加入无菌去离子水(无菌去离子水与发酵产物的体积比为10：1)，在28℃、180rpm浸提1h，得到浸提产物，将浸提产物离心(8,000g离心15min)，收集上清液，该上清液即为粗酶液。

[0194] 3.酶活力测定

[0195] 收集粗酶液，分别对上述各不同碳源的发酵培养基得到的粗酶液进行滤纸酶活力、CMC酶活力、Avicel酶活力、木聚糖酶活力、pNPC酶活力和pNPG酶活力的测定。

[0196] 结果见图4，结果表明，麦麸是草酸青霉EU2101产滤纸酶活力(图4中A)、CMC酶活力(图4中B)、Avicel酶活力(图4中C)、木聚糖酶活力(图4中D)、pNPC酶活力(图4中E)和pNPG酶活力(图4中F)的最佳碳源。

[0197] 六、最佳碳源颗粒大小的确定

[0198] 1.配制不同颗粒大小的最佳碳源的发酵培养基

[0199] 不同碳源颗粒大小的培养基pH均为5.0，121℃高压灭菌30min。其中，碳源颗粒大小的设置如下：大于0.9mm、0.45-0.9mm(包含0.45mm和0.9mm)、0.3-0.45mm(包含0.3mm，不包含0.45mm)、0.2-0.3mm(包含0.2mm，不包含0.3mm)、小于0.2mm。不同碳源颗粒大小的培养基的各组分及含量与步骤二的基本培养基相同(即碳源为麦麸)。

[0200] 其中，不同颗粒大小的碳源为将麦麸过不同大小筛孔的筛子得到的。

[0201] 2.发酵培养

[0202] 将步骤一的孢子悬浮液按10％(v/w)接种至上述各不同碳源颗粒大小的培养基中，置于28℃静置培养5天，得到发酵产物；向发酵产物中加入无菌去离子水(无菌去离子水与发酵产物的体积比为10：1)，在28℃、180rpm浸提1h，得到浸提产物，将浸提产物离心(8,000g离心15min)，收集上清液，该上清液即为粗酶液。

[0203] 3.酶活力测定

[0204] 收集粗酶液，分别对上述各不同碳源颗粒大小的培养基得到的粗酶液进行滤纸酶活力、CMC酶活力、Avicel酶活力、木聚糖酶活力、pNPC酶活力和pNPG酶活力的测定。

[0205] 结果图5表明，草酸青霉EU2101产滤纸酶活力(图5中A)、Avicel酶活力(图5中C)、木聚糖酶活力(图5中D)、pNPC酶活力(图5中F)和pNPG酶活力(图5中E)的培养基的最佳碳源颗粒大小均为0.3-0.45mm，草酸青霉EU2101产CMC酶活力(图5中B)的培养基的最佳碳源颗粒大小为0.3-0.9mm。

[0206] 七、培养基组合碳源最佳浓度的确定

[0207] 1.配制各种碳源组合浓度的培养基

[0208] 不同麦麸和稻秆质量比的培养基均由麦麸、稻秆和步骤二的盐溶液组成，pH均为5.0，121℃高压灭菌30min。麦麸和稻秆质量比设置如下：5:0,4:1,3:2,2:3,1:4,0:5。麦麸和稻秆质量比为5:0的培养基中麦麸、稻秆和盐溶液的配比为麦麸10g：0g：20mL，麦麸和稻秆质量比为4:1的培养基中麦麸、稻秆和盐溶液的配比为麦麸8g：2g：20mL，麦麸和稻秆质量比为3:2的培养基中麦麸、稻秆和盐溶液的配比为麦麸6g：4g：20mL，麦麸和稻秆质量比为2:
3的培养基中麦麸、稻秆和盐溶液的配比为麦麸4g：6g：20mL，麦麸和稻秆质量比为1:4的培养基中麦麸、稻秆和盐溶液的配比为麦麸2g：8g：20mL，麦麸和稻秆质量比为0:5的培养基中麦麸、稻秆和盐溶液的配比为麦麸0g：10g：20mL。

[0209] 2.发酵培养

[0210] 将步骤一的孢子悬浮液按10％(v/w)接种至上述不同麦麸和稻秆质量比的培养基中，置于28℃静置培养5天，得到发酵产物；向发酵产物中加入无菌去离子水(无菌去离子水与发酵产物的体积比为10：1)，在28℃、180rpm浸提1h，得到浸提产物，将浸提产物离心(8,000g离心15min)，收集上清液，该上清液即为粗酶液。

[0211] 3.酶活力测定

[0212] 收集粗酶液，分别对上述各不同麦麸和稻秆质量比的培养基得到的粗酶液进行滤纸酶活力、CMC酶活力、Avicel酶活力、木聚糖酶活力、pNPC酶活力和pNPG酶活力的测定。

[0213] 结果见图6，结果表明，麦麸：稻秆质量比为2:3是草酸青霉EU2101产滤纸酶活力(图6中A)、Avicel酶活力(图6中C)和木聚糖酶活力(图6中D)培养基的最佳组合碳源浓度，麦麸：稻秆质量比为4:1是草酸青霉EU2101产CMC酶活力(图6中B)和pNPC酶活力(图6中F)培养基的最佳组合碳源浓度，麦麸：稻秆质量比为5:0是草酸青霉EU2101产pNPG酶活力(图6中E)培养基的最佳组合碳源浓度。

[0214] 八、培养基最佳氮源的确定

[0215] 1.配制含不同氮源的培养基：

[0216] 不同氮源的培养基pH均为5.0，121℃高压灭菌30min，其中，硫酸铵培养基的各组分及含量与步骤二的基本培养基相同；对照培养基为将步骤二的基本培养基中的硫酸铵删除得到的培养基；尿素培养基为将步骤二的基本培养基中的(NH4)2SO4 5.0g替换为尿素5.0g得到的培养基；蛋白胨培养基为将步骤二的基本培养基中的(NH4)2SO4 5.0g替换为蛋白胨5.0g得到的培养基；硝酸钠培养基为将步骤二的基本培养基中的(NH4)2SO4 5.0g替换为硝酸钠5.0g得到的培养基；硝酸铵培养基为将步骤二的基本培养基中的(NH4)2SO4 5.0g替换为硝酸铵5.0g得到的培养基；酵母提取物培养基为将步骤二的基本培养基中的(NH4)
2SO4 5.0g替换为酵母提取物5.0g得到的培养基；氯化铵培养基为将步骤二的基本培养基中的(NH4)2SO4 5.0g替换为氯化铵5.0g得到的培养基。

[0217] 2.发酵培养

[0218] 将步骤一的孢子悬浮液按10％(v/w)接种至上述不同氮源的培养基中，置于28℃静置培养5天，得到发酵产物；向发酵产物中加入无菌去离子水(无菌去离子水与发酵产物的体积比为10：1)，在28℃、180rpm浸提1h，得到浸提产物，将浸提产物离心(8,000g离心15min)，收集上清液，该上清液即为粗酶液。

[0219] 3.酶活力测定

[0220] 收集粗酶液，分别对各不同氮源的培养基得到的粗酶液进行滤纸酶活力、CMC酶活力、Avicel酶活力、木聚糖酶活力、pNPC酶活力和pNPG酶活力的测定。

[0221] 结果图7表明，酵母提取物是草酸青霉EU2101产滤纸酶活力、CMC酶活力、Avicel酶活力、木聚糖酶活力、pNPC酶活力和pNPG酶活力的最佳氮源。

[0222] 九、最佳培养时间的确定

[0223] 1.配制最优培养基：

[0224] 最优培养基由麦麸、稻秆与盐溶液1组成，其中，麦麸、稻秆与盐溶液1的配比为4.0g：6.0g：20mL。盐溶液1由水、KH2PO4、酵母提取物、MgSO4·7H2O、吐温80和微量元素母液组成，每升盐溶液含KH2PO4 2.5g、酵母提取物5.0g、MgSO4.7H2O 2.5g、吐温80 1.0g、步骤二的微量元素母液0.1mL。调节其pH为5，121℃高压灭菌30min。

[0225] 2.发酵培养

[0226] 将步骤一的孢子悬浮液按10％(v/w)接种至上述最优培养基中，分别置于28℃静置培养3、4、5、6、7、8天，得到发酵产物；向发酵产物中加入无菌去离子水(无菌去离子水与发酵产物的体积比为10：1)，在28℃、180rpm浸提1h，得到浸提产物，将浸提产物离心(8,000g离心15min)，收集上清液，该上清液即为粗酶液。

[0227] 3.酶活力测定

[0228] 收集粗酶液，分别对培养不同时间得到的粗酶液进行滤纸酶活力、CMC酶活力、Avicel酶活力、木聚糖酶活力、pNPC酶活力和pNPG酶活力的测定。

[0229] 结果见图8，结果表明，草酸青霉EU2101产滤纸酶活力(图8中A)、Avicel酶活力(图8中C)、木聚糖酶活力(图8中D)和pNPG酶活力(图8中E)的最佳培养时间均为6天，在培养3-8天时，草酸青霉EU2101产CMC酶活力和pNPC酶活力的最佳培养时间均为8天。

[0230] 实施例3、利用草酸青霉EU2101制备纤维素酶制剂

[0231] 1、配制发酵培养基

[0232] 配制实施例2步骤九的最优培养基。

[0233] 2、孢子液的制备

[0234] (1)将PDA固体培养基115℃灭菌30min，得到PDA平板。

[0235] (2)将草酸青霉EU2101接种到PDA固体平板上，置于28℃恒温培养箱培养5天。用0.1％(体积百分比浓度)吐温80水溶液洗下在PDA平板上培养5天的草酸青霉EU2101孢子，转移至含有数颗玻璃珠的50mL离心管中。在显微镜下，血球板计数并调节孢子浓度至108个/mL，按10％(v/w)的接种量接种至上述最优培养基中。

[0236] 3、纤维素酶制剂的制备

[0237] (1)将步骤2已接种了草酸青霉EU2101孢子悬浮液的发酵培养基置于28℃恒温培养箱静置培养6天，得到发酵产物。

[0238] (2)向发酵产物中加入无菌去离子水(无菌去离子水与发酵产物的体积比为10：1)，在28℃、180rpm浸提1h，得到浸提产物，将浸提产物用4层纱布过滤，得到过滤液体，将过滤液体12000rpm离心10分钟去除培养物和菌体，收集上清液，该上清液即为纤维素酶制剂，测定纤维素酶制剂的纤维素酶活力。

[0239] 结果如下：纤维素酶制剂的滤纸酶活力为41.7±1.0U/gds；Avicel酶活力为14.3±0.8U/gds；CMC酶活力为267.7±38.6U/gds；pNPG酶活力为103.7±4.5U/gds；pNPC酶活力为10.2±0.8U/gds；木聚糖酶活力为1257.1±102.1U/gds。

[0240] 比较已公开的青霉属与本发明的草酸青霉EU2101的固态发酵产纤维素酶活力(滤纸酶活力)，结果如表4所示，在碳源为麦麸与稻杆时，草酸青霉EU2101的滤纸酶活力为草酸青霉HP7-1的4.01倍，二者具有显著差异；在碳源为麦麸与Avicel时，草酸青霉EU2101的滤纸酶活力为草酸青霉EU2106的1.16倍，二者具有显著差异。表明，与野生型草酸青霉HP7-1和草酸青霉突变体EU2106相比，本发明的草酸青霉EU2101产滤纸酶活力最高，即纤维素酶产量最高。

[0241] 表4、草酸青霉菌株固态发酵产纤维素酶活力对比

[0242]

[0243] 表4中，草酸青霉EU2106为授权公告号为CN 102876590B的中国专利中的草酸青霉EU2106，草酸青霉HP7-1为草酸青霉(Penicillium oxalicum)野生型菌株HP7-1。碳源为麦麸+稻杆的培养基为实施例2步骤九的最优培养基，碳源为麦麸+Avicel的培养基将实施例2步骤九的最优培养基中的稻杆替换为Avicel得到的培养基，碳源为麦麸+甘蔗渣的培养基将实施例2步骤九的最优培养基中的稻杆替换为甘蔗渣得到的培养基。各菌株的培养方法如下：将各菌株的孢子浓度为1×108个/mL的孢子悬浮液按10％(v/w)接种至相应培养基中，置于28℃静置培养5天，得到发酵产物；向发酵产物中加入无菌去离子水(无菌去离子水与发酵产物的体积比为10：1)，在28℃、180rpm浸提1h，得到浸提产物，将浸提产物离心(8,000g离心15min)，收集上清液，该上清液即为粗酶液。然后按照上文中滤纸酶活力的测定方法测定各菌株粗酶液的滤纸酶活力。

[0244] 实施例4、利用纤维素酶制剂水解木薯渣

[0245] 1、预处理的木薯渣的制备：按料液比1g:10mL的比例将木薯渣与溶液甲(溶液甲为向去离子水中加入NaOH和H202得到的NaOH质量浓度为8.0％、H202质量浓度为2.48％的溶液)混合后，在40℃下浸泡处理24h，纱布过滤，滤渣用水洗至中性，50℃烘干，得到预处理的木薯渣(即NaOH与H202处理后的木薯渣)。根据修改的美国国家可再生能源实验室的方法测定得知预处理木薯渣中纤维素的含量为41.95±3.78％。

[0246] 2、不同底物浓度

[0247] 反应体系为100mL，底物(预处理的木薯渣)浓度设置为20、40、60和80g/L四个浓度梯度，纤维素酶上样量为20U/g底物(具体上样为纤维素酶制剂，纤维素酶酶活力以滤纸酶活力来计)。

[0248] 反应体系具体制备方法为：向pH 5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中加入预处理的木薯渣与实施例3的纤维素酶制剂。

[0249] 反应条件为50℃，180rpm，共反应96小时。分别在反应0、3、6、12、24、48、72和96h取样，检测反应体系中还原糖的含量，计算纤维素转化率，纤维素转化率＝葡萄糖的重量×0.9/木薯渣中纤维素的重量×100％。

[0250] 结果见图9，表明在底物浓度为60g/L时，木薯渣纤维素的转化率最高，在反应96小时的转化率为95.4±1.1％。

[0251] 3、不同酶添加量

[0252] 反应体系为100mL，底物(预处理的木薯渣)浓度设置为60g/L，纤维素酶上样量设置为1、5、10、20和30FPU/g底物五个梯度(具体上样为纤维素酶制剂，纤维素酶酶活力以滤纸酶活力来计)。

[0253] 反应体系具体制备方法为：向pH 5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中加入预处理的木薯渣与实施例3的纤维素酶制剂。

[0254] 反应条件为50℃，180rpm，共反应96小时。分别在反应0、3、6、12、24、48、72和96h取样，检测反应体系中葡萄糖的含量，纤维素转化率，纤维素转化率＝葡萄糖的重量×0.9/木薯渣中纤维素的重量×100％。

[0255] 结果见图10，表明酶添加量为30FPU/g底物时，在反应48小时时，纤维素转化率达到了100％，酶添加量为20FPU/g底物时，在反应96小时时，纤维素转化率达到了100％。

[0256] 表5、预处理木薯渣中纤维素转化率(％)

[0257]