一种提高拜氏梭菌产电的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种提高拜氏梭菌产电的方法及其应用，该方法为将编码膜蛋白Cbei_3304的基因进行插入失活后，使此基因在拜氏梭菌中不能正常表达即可。本发明所得的高产电重组菌株葡萄糖种子液中，以甲基紫精为电子介体时，最大输出电压高达409mV，最大输出功率密度为144.4mW/m2。本发明的工艺简单、操作方便、无污染、成本低，其燃料利用普较广，电子回收率较高，缓解了能源危机；本发明高产电拜氏梭菌是一株适合于微生物燃料电池研究及应用的优良菌株。

权利要求

1.一种提高拜氏梭菌产电的方法，其特征在于，将拜氏梭菌蛋白Cbei_3304的功能进行缺失，编码蛋白Cbei_3304的碱基序列如SEQ ID No：1所示，所述拜氏梭菌为Clostridium beijerinckii NCIMB 8052。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使拜氏梭菌中编码蛋白Cbei_3304的基因不能正常表达。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将拜氏梭菌中编码蛋白Cbei_3304的基因进行插入失活。

4.一种高产电拜氏梭菌在产电中的应用，所述高产电拜氏梭菌为缺失正常蛋白Cbei_

3304功能的拜氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052，编码蛋白Cbei_3304的碱基序列如SEQ ID No：1所示。

5.一种高产电拜氏梭菌在制备微生物燃料电池中的应用，所述高产电拜氏梭菌为缺失正常蛋白Cbei_3304功能的拜氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052，编码蛋白Cbei_3304的碱基序列如SEQ ID No：1所示。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述高产电拜氏梭菌为权利要求1 3任一~所述方法制备得到的拜氏梭菌。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述高产电拜氏梭菌以葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖或淀粉为电子供体。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述高产电拜氏梭菌以甲基紫精、亚甲基蓝、或蒽醌-2,6-二磺酸钠作为电子介体。

说明书

一种提高拜氏梭菌产电的方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于环境与新能源技术领域，具体涉及一种提高拜氏梭菌产电的方法及其应用。

背景技术

[0002] 随着经济全球化的快速发展，各国对能源需求日益扩大，能源枯竭成为世界的难题，在面临这一问题时，科学家已经将眼光投入一个庞大家族——微生物。利用微生物产电，来解决能源短缺问题。目前，微生物燃料电池（Microbial Fuel Cell，MFC）技术日益成熟，并得到重视。

[0003] 然而，微生物的产电能力相差甚远，产电微生物却决定中微生物燃料电池的功能及应用。经报道，高产电的微生物依旧主要集中在希瓦氏菌属（Shewanella）和地杆菌属（Geobacter）（Energy Environ. Sci., 2011, 4, 4366–4379）等一些革兰氏阴性菌。而在拜氏梭菌等革兰氏阳性菌中报道甚少，Sophie  Peguin等人（Biotechnology and Bioengineering, Vol. 51, Pp. 342-348 (1996)）利用三电极系统研究了丙酮丁醇梭菌在甲基紫精作为电子介体的情况下的微生物燃料电池产电情况；Liu  Jun等人（Biotechnology Lett  ,2015,37:95-100）也利用0.15g/L甲基紫精作为电子介体，1g/L葡萄糖作为碳源时获得最大电压230mV，最大输出功率密度79.2 mW/m2。可见，拜氏梭菌等革兰氏阳性菌在微生物燃料电池中的应用日益引起了重视。

[0004] 已知微生物的自身产电能力严重阻碍了MFC技术的发展，然而通过基因工程改造菌体，能够加速细胞的代谢，提高电子传递速率及数量。基于此，基因工程手段对促进微生物燃料电池的发展及产业化应用将具有可观前景。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种提高拜氏梭菌产电的方法。

[0006] 本发明的另一目的在于提供一种高活性产电能力的拜氏梭菌在制备微生物燃料电池中的应用。

[0007] 本发明所采取的技术方案是：

[0008] 一种提高拜氏梭菌产电的方法，将拜氏梭菌蛋白Cbei_3304的功能进行缺失。

[0009] 进一步的，上述所述方法，使拜氏梭菌中编码蛋白Cbei_3304的基因不能正常表达。

[0010] 进一步的，上述所述方法，将拜氏梭菌中编码蛋白Cbei_3304的基因进行插入失活。

[0011] 进一步的，上述所述方法，将编码蛋白Cbei_3304的碱基序列如SEQ ID No：1所示。

[0012] 进一步的，上述拜氏梭菌为Clostridium beijerinckii NCIMB 8052。

[0013] 一种高产电拜氏梭菌在产电中的应用，所述高产电拜氏梭菌为缺失正常蛋白Cbei_3304功能的拜氏梭菌。

[0014] 一种高产电拜氏梭菌在制备微生物燃料电池中的应用，所述高产电拜氏梭菌为缺失正常蛋白Cbei_3304功能的拜氏梭菌。

[0015] 进一步的，所述高产电拜氏梭菌为上述所述方法制备得到的拜氏梭菌。

[0016] 进一步的，上述高产电拜氏梭菌以葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖或淀粉为电子供体，[0017] 进一步的，上述高产电拜氏梭菌以甲基紫精、亚甲基蓝、或蒽醌-2,6-二磺酸钠作为电子介体。

[0018] 本发明的有益效果是：

[0019] 本发明通过将拜氏梭菌中编码膜蛋白的Cbei_3304基因进行插入失活，使得此基因不能正常表达，从而达到提高拜氏梭菌产电能力的目的。本发明提供了一种简单、高效的提高拜氏梭菌产电的方法，借助此方法得到的重组菌株在1 g/L葡萄糖种子液中，0.4 g/L（最佳浓度）甲基紫精（MV）为电子介体时，最大输出电压高达409mV，比初始菌株2
Clostridium beijerinckii NCIMB 8052提高了3.13倍，最大输出功率密度为144.4mW/m ，比初始菌株Clostridium beijerinckii NCIMB 8052提高了1.71倍（8052-MFC中最佳甲基紫精浓度为0.1g/L）。

[0020] 本发明的工艺简单、操作方便、无污染、成本低，其燃料利用普较广，电子回收率较高，缓解了能源危机，本发明高产电拜氏梭菌是一株适合于微生物燃料电池研究及应用的优良菌株。

附图说明

[0021] 图1为本发明插入失活载体pWJ的质粒图谱；

[0022] 图2为本发明使用二型内含子插入失活的机理图；

[0023] 图3为转化子菌落PCR电泳图；

[0024] 图4为本发明拜氏梭菌3304在1g/L葡萄糖中的产电活性图；

[0025] 图5为初始菌株NCIMB 8052在1g/L葡萄糖中的产电活性图；

[0026] 图6为本发明高产电拜氏梭菌与初始菌株NCIMB 8052利用1g/L葡萄糖为燃料的产电情况。

具体实施方式

[0027] 一种提高拜氏梭菌产电的方法，将拜氏梭菌蛋白Cbei_3304的功能进行缺失。

[0028] 优选的，上述所述方法，使拜氏梭菌中编码蛋白Cbei_3304的基因不能正常表达。

[0029] 优选的，上述所述方法，将拜氏梭菌中编码蛋白Cbei_3304的基因进行插入失活。

[0030] 优选的，上述所述方法，将编码蛋白Cbei_3304的碱基序列如SEQ ID No：1所示。

[0031] 优选的，上述拜氏梭菌为Clostridium beijerinckii NCIMB 8052。

[0032] 一种高产电拜氏梭菌在产电中的应用，所述高产电拜氏梭菌为缺失正常蛋白Cbei_3304功能的拜氏梭菌。

[0033] 优选的，所述高产电拜氏梭菌为上述所述方法制备得到的拜氏梭菌。

[0034] 一种高产电拜氏梭菌在制备微生物燃料电池中的应用，所述高产电拜氏梭菌为缺失正常蛋白Cbei_3304功能的拜氏梭菌。

[0035] 优选的，所述高产电拜氏梭菌为上述所述方法制备得到的拜氏梭菌。

[0036] 优选的，上述高产电拜氏梭菌以葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖或淀粉为电子供体，[0037] 优选的，上述高产电拜氏梭菌以甲基紫精、亚甲基蓝、或蒽醌-2,6-二磺酸钠作为电子介体。

[0038] 优选的，上述高产电拜氏梭菌经过双室MFC进行产电。

[0039] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

[0040] 实施例1

[0041] 拜氏梭菌Cbei_3304基因插入失活突变株的构建

[0042] 构建拜氏梭菌Cbei_3304基因插入失活突变株的原理如图2所示，具体构建过程包括以下步骤：

[0043] （1）Cbei_3304插入失活载体的构建

[0044] 1）设计内含子

[0045] 根据NCBI数据库收录的拜氏梭菌的Cbei_3304基因序列（如SEQ ID No：1所示），借助软件设计合适的插入基因位点（http://www.clostron.com），选择插入在第101-102个碱基之间，并生成内含子序列，合成内含子序列S-304（其序列如SEQ ID NO：2所示），并设计以下引物。

[0046] 克隆引物：

[0047] pWJ-OSC-304-S：5’- ggagtgtcgaggatcctcgagataattatccttacacttcgcc -3’，其序列如SEQ ID NO：3所示；

[0048] pWJ-OSC-304-A：5’- ggttctcctacagattgtacaaatgtggtgataacagataag -3’，其序列如SEQ ID NO：4所示。

[0049] 验证引物：

[0050] Cbei-3304-T-S：5’-taaattacctacagcaaaactgtg-3’， 序列如SEQ ID NO：5所示；

[0051] Cbei-3304-T-A：5’-ggaattaagaaccttgaatctatc-3’， 序列如SEQ ID NO：6所示。

[0052] 引物pWJ-OSC-304-S引入XhoⅠ酶切位点(下划线部分)，引物pWJ-OSC-304-A引入BsrGⅠ酶切位点(下划线部分)。

[0053] 2）Cbei_3304-pWJ-304重组载体构建

[0054]  用XhoⅠ和BsrGⅠ双酶切载体pWJ，pWJ质粒图谱如图1所示，其序列如SEQ ID NO：7所示。酶切产物经纯化试剂盒（Takara）纯化后，与内含子序列S-304通过一步克隆（ClonExpress）连接。将一步克隆连接的重组质粒转化到大肠杆菌E.coli DH5a，涂布到含有50μg/ml 氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养12～16h，挑取转化子，接到液体含有50μg/ml 氨苄霉素LB培养基中，37℃、200rpm培养12h，提取重组质粒（AXYGEN），测序验证，获得Cbei_3304-pWJ-304重组载体。

[0055] 3）Cbei_3304-pWJ-304重组载体的甲基化

[0056] 制备E.coli Top 10/pAN2的化学感受态，将测序成功的Cbei_3304-pWJ-304重组载体转化到大肠杆菌E.coli Top 10，由于pAN2质粒具有四环素抗性，故涂布到含有50μg/ml氨苄霉素和10μg/ml四环素双抗性LB平板，37℃培养12～16h，挑取转化子，接到液体含有50μg/ml 氨苄霉素和10µg/ml四环素LB培养基中，37℃、200rpm培养12h，提取甲基化的Cbei_3304-pWJ-304重组载体（pAN2质粒含有一个枯草芽孢杆菌噬菌体基因，能编码甲基转移酶，能实现外源质粒在大肠杆菌中的甲基化），即Cbei_3304插入失活载体。

[0057] （2）Cbei_3304插入失活载体转化拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052)

[0058]  1）将Clostridium beijerinckii NCIMB 8052接种至YPS培养基（酵母粉 3g/L，蛋白胨 5g/L，葡萄糖1g/L，乙酸铵 2g/L，氯化钠 3g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸亚铁0.1g/L，pH=6。）37℃过夜培养，次日以5%比例接种到YPS培养基，37℃培养6-8h，以10%接种到2×YTG培养基（酵母粉16 g/L，蛋白胨 10 g/L，葡萄糖 5 g/L，氯化钠 5 g/L）37℃培养3h，OD600nm=1；

[0059] 2）取50ml拜氏梭菌菌液，5000rpm，4℃离心10 min，弃上清。在以ETM缓冲液（270mM蔗糖，0.6mM Na2HPO4，4.4mM Na2HPO4，10mM MgCl2）重悬；同上离心，去上清，再次以ETM缓冲液重悬，同上离心，彻底取上清；

[0060] 3）以1ml ET 缓冲液（270mM蔗糖，0.6mM Na2HPO4，4.4mM NaH2PO4重悬，取200µl，加入1ug Cbei_3304插入失活载体，加入0.2cm预冷的电转杯，轻轻混匀；

[0061] 4）使用MicroPulserTM电转仪电转，条件为电压1.8kV，电阻200Ω，电容2.5µF，电击后立刻加入1mL 2×YTG 培养基，转移到无菌离心管中复苏2～3h；

[0062] 5）取200µl上述菌液，涂布到含有10 µg/ml红霉素的 YPS 固体培养基，培养2～3天。

[0063] （3）Cbei_3304插入失活突变株的筛选

[0064] 挑取上述步骤5）中培养2～3天的转化子，使用引物Cbei-3304-T-S和Cbei-3304-T-A对转化子进行菌落PCR验证，筛选出内含子插入基因组的突变株（插入后，PCR扩增出基因条带电泳图上比野生型大约1Kbp），如图3所示，将正确插入的突变株传代三次，同时涂布在含有红霉素抗性和没有红霉素抗性的YPS固体培养基上，筛选出敲除质粒丢失的突变株（在红霉素抗性平板上不能生长的突变株），即得本发明高产电拜氏梭菌。

[0065] 实施例2

[0066] 本实施例说明上述构建的高产电拜氏梭菌作为阳极催化剂利用1g/L葡萄糖的产电实验。

[0067] （1）构建微生物燃料电池

[0068] 本实施例按照现有的技术和方法建立了利用拜氏梭菌为阳极催化剂发电的微生物燃料电池，包括阳极室、阴极室、质子交换膜和外电路四个部分。阳极电极和阴极电极均为PAN基石墨软毡（5×5cm），以钛丝作为外接电路，外接电阻为1000Ω，质子交换膜为杜邦NafionN117，采用数据采集器为Keithley系列。

[0069] (2) 培养基配方：

[0070] YPS种子培养基：酵母粉 3g/L，蛋白胨 5g/L，葡萄糖1g/L，乙酸铵 2g/L，氯化钠 3g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸亚铁0.1g/L，pH=
6。

[0071] 双室MFC中阳极液：酵母粉 3g/L，蛋白胨 5g/L，葡萄糖1g/L，乙酸铵 2g/L，氯化钠 3g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸亚铁0.1g/L，甲基紫精 (3304-MFC中MV浓度为0.4g/L，8052-MFC中MV浓度为0.1g/L)，pH=6。

[0072] 双室MFC中阴极液：二水合磷酸二氢钠2.772g/L，十二水合磷酸氢二钠11.5g/L，氯化钾0.13g//l，铁氰化钾40mM，pH=7。

[0073] （3）在YPS种子液中分别活化高产电重组菌株3304（实施例1构建的高产电拜氏梭菌）和初始菌株8052（Clostridium beijerinckii NCIMB 8052），培养温度37℃，厌氧培养时间12h。然后进行250mL双室MFC技术，向阳极室中接入阳极液225mL，甲基紫精（MV），通入N2 3分钟，再接入25mL的拜氏梭菌（接种量10%（v/v）），通入N2 3分钟，排出溶液中的氧，迅速密封阳极室，向阴极室加入阴极液，迅速密封阴极室，培养温度30℃，产电检测时间33h，最终得到结果如1表和图4 6所示。~

[0074]

[0075] 根据输出电压数据，计算电子回收率与获得产电的极化曲线图，实验结果如表1和图4 6所示；其中，图4为本发明高产电拜氏梭菌在1g/L葡萄糖中的产电活性图；图5为初始~菌株NCIMB 8052在1g/L葡萄糖中的产电活性图；图6为本发明高产电拜氏梭菌与初始菌株NCIMB 8052利用1g/L葡萄糖为燃料的产电情况。从中可以看出本发明高产电拜氏梭菌最大输出电压高达409mV，比初始菌株NCIMB 8052提高了3.13倍，最大输出功率密度为144.4mW/m2，比初始菌株NCIMB 8052提高了1.71倍。

[0076] 本发明在研究过程中，还发现将葡萄糖替换为木糖、蔗糖、果糖或淀粉作为电子供体，本发明高产电拜氏梭菌同样也能产生类似效果的最大输出电压高、最大输出功率密度；将甲基紫精替换为亚甲基蓝、蒽醌-2,6-二磺酸钠作为电子介体，本发明高产电拜氏梭菌同样也能发挥类似效果的产电性能。

[0077] 上述结果说明本发明提供了一种简单、高效的提高拜氏梭菌产电的方法，所得到的高产电拜氏梭菌可用于产电，尤其是用于微生物燃料电池的产电中；故可将本发明高产电拜氏梭菌用于微生物燃料电池的制备。

[0078] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。