一种鱼油甘油三酯脂肪酸位置分布的测定方法

摘要

本发明公开了一种鱼油甘油三酯脂肪酸位置分布的测定方法，其包括，采用硅胶柱层析对甘油三酯进行分离；利用脂肪酶Lipozyme RM IM结合微波辅助酯交换所述甘油三酯得到酯交换产物；所述酯交换产物直接进高温气相色谱，测定甘油三酯中sn‑1,3位脂肪酸的组成及含量。本发明无需衍生化，直接检测，时间大大缩短，操作步骤也十分简易。

权利要求

1.一种鱼油甘油三酯脂肪酸位置分布的测定方法，其特征在于：包括，

采用硅胶柱层析对甘油三酯进行分离，所述分离，按体积计柱层析洗脱液为石油醚:乙醚＝80～90:10～15，吸取油样，沿层析柱壁加入，然后用3～25倍于所述油样的洗脱液进行洗脱，洗脱完毕，收集物即为甘油三酯，氮吹除去有机溶剂，所述石油醚的沸程30～60℃；

利用脂肪酶Lipozyme RM IM结合微波辅助酯交换所述甘油三酯得到酯交换产物，将所述甘油三酯溶于乙酸乙酯中，然后加入脂肪酶Lipozyme RM IM，微波功率450W，保持反应20～40min，再加入乙醚，4000～5000r/min离心2～5min分离；

所述酯交换产物直接进高温气相色谱，测定甘油三酯中sn-1,3位脂肪酸的组成及含量，所述高温气相色谱的测定条件为：初始温度为80℃～100℃，保持1min～3min，以5～15℃/min升至320℃～380℃，保持10min～20min；载气为纯度＞99.99％的氮气，载气流速为

0.8～1.4mL/min；分流比为50～100:1；气化室温度为320℃～380℃，FID检测器温度为320～380℃。

说明书

一种鱼油甘油三酯脂肪酸位置分布的测定方法

技术领域

[0001] 本发明涉及酶法酯交换产物检测技术领域，尤其指一种利用气相色谱检测鱼油甘油三酯中sn-1,3位脂肪酸的方法。

背景技术

[0002] Ω-3PUFA(Ω-3多不饱和脂肪酸)是第一个双键位于脂肪酸碳链甲基端的第三个碳原子上的一系列多不饱和脂肪酸，因其特殊的分子结构使得它们在人体中发挥着许多特殊的生理功能。其中，DHA是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20％，在视网膜中所占比例最大，约占60％以上，具有维持大脑和眼睛正常生理功能的作用，促进胎婴幼儿大脑和视力发育，预防老年痴呆；EPA具有抑制血栓，预防心肌梗塞和脑梗塞，治疗动脉粥样硬化和辅助降血压的功效；另外，EPA和DHA还具有抗癌、消炎及免疫调节等作用。

[0003] 鱼类是Ω-3多不饱和脂肪酸的主要食物来源。鱼油由95％以上的甘三酯组成，它是中性脂的主要组分，如下结构简式所示，其由一分子的甘油和三分子的脂肪酸分别酯化在甘油骨架的三个位置上生成的，酰基可位于sn-2和sn-1,3：

[0004]

[0005] 脂肪酸在甘三酯中的位置分布是评价其营养价值的重要指标，决定着甘三酯的消化、吸收、代谢及其应用价值。一方面，sn-2位的脂肪酸更利于人体的消化和吸收。Christensen等人采用灌胃SD大鼠，考察sn-2-EPA+DHA和sn-1,3-EPA+DHA两种M-n3-M结构脂的消化吸收，实验发现：摄取sn-2-EPA+DHA甘三酯比sn-1,3-EPA+DHA甘三酯，在淋巴转运过程中有更高的DHA积累量，说明位于sn-2位的EPA和DHA更容易被吸收利用，具有更高的营养和功效价值。另一方面，sn-2位脂肪酸的氧化稳定性更高。Wijesundera等人采用加速氧化法和顶空微萃取的方法，分析PPD和PDP，OOD和ODO两组DHA分别位于sn-2位和sn-1or 3位的结构甘三酯的丙醛，反式二烯醛等二级氧化指标及过氧化值(PV)，结果发现：PPD和OOD比PDP和ODO更快产生以上二级氧化产物，过氧化值更高，说明位于sn-1or 3的DHA比sn-2位的DHA更易被氧化。

[0006] 目前，常用的测定甘三酯中脂肪酸位置分布的方法有胰脂酶水解法和烯丙基溴化镁降解法。胰脂酶水解法是根据胰脂酶的sn-1,3特异性，通过水解甘三酯sn-1,3位上的脂肪酸，对sn-2-单甘酯进行测定，分析脂肪酸的位置分布的一种常用的酶解方法。然而，研究表明胰脂酶无法有效地水解长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，例如：EPA和DHA，因此，这种方法对富含EPA和DHA的鱼油存在局限性。另一种方法是烯丙基溴化镁降解法，依据格氏降解反应将甘三酯sn-1or 3位酯化脂肪酸降解，对生成的sn-1,2or sn-2,3甘二酯进行测定，从而计算出脂肪酸位置分布的一种化学方法。此方法可以避免胰脂酶对脂肪酸的选择性水解，但是，烯丙基溴化镁遇水极易失活，且具有毒性。另外，酰基转移也是影响结果准确性的重要因素。因此，寻找一种适合测定富含LC-PUFA甘三酯的脂肪酸位置分布的绿色、高效、准确的方法成为亟待解决的问题。

发明内容

[0007] 本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或者省略以避免本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

[0008] 鉴于现有鱼油甘油三酯脂肪酸位置分布的测定方法、制备方法和应用中存在的问题，提出了本发明。

[0009] 因此，本发明的目的是提供一种绿色、高效、准确的测定鱼油甘油三酯脂肪酸位置分布的方法。

[0010] 为解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：一种鱼油甘油三酯脂肪酸位置分布的测定方法，其包括，采用硅胶柱层析对甘油三酯进行分离；利用脂肪酶Lipozyme RM IM结合微波辅助酯交换所述甘油三酯得到酯交换产物；所述酯交换产物直接进高温气相色谱，测定甘油三酯中sn-1,3位脂肪酸的组成及含量。

[0011] 作为本发明所述一种鱼油甘油三酯脂肪酸位置分布的测定方法的优选方案，其中：所述分离，按体积计柱层析洗脱液为石油醚:乙醚＝80～90:10～15，吸取油样，沿层析柱壁加入，然后用3～25倍于所述油样的洗脱液进行洗脱，洗脱完毕，收集物即为甘油三酯，氮吹除去有机溶剂。

[0012] 作为本发明所述一种鱼油甘油三酯脂肪酸位置分布的测定方法的优选方案，其中：所述石油醚的沸程30～60℃。

[0013] 作为本发明所述一种鱼油甘油三酯脂肪酸位置分布的测定方法的优选方案，其中：所述利用脂肪酶Lipozyme RM IM结合微波辅助酯交换所述甘油三酯得到酯交换产物中，将所述甘油三酯溶于乙酸乙酯中，然后加入脂肪酶Lipozyme RM IM，微波功率450W，保持反应20～40min，再加入乙醚，4000～5000r/min离心2～5min分离。

[0014] 作为本发明所述一种鱼油甘油三酯脂肪酸位置分布的测定方法的优选方案，其中：所述甘油三酯与所述米黑根毛霉源固定化脂肪酶的质量比为1:50～150。

[0015] 作为本发明所述一种鱼油甘油三酯脂肪酸位置分布的测定方法的优选方案，其中：所述脂肪酶Lipozyme RM IM为利用米黑根毛霉发酵产的sn-1,3特异性固定化脂肪酶。

[0016] 作为本发明所述一种鱼油甘油三酯脂肪酸位置分布的测定方法的优选方案，其中：所述高温气相色谱的测定条件为：初始温度为80℃～100℃，保持1min～3min，以5～15℃/min升至320℃～380℃，保持10min～20min；载气为纯度＞99.99％的氮气，载气流速为0.8～1.4mL/min；分流比为50～100:1；气化室温度为320℃～380℃；FID检测器温度为320～380℃。

[0017] 本发明的有益效果在于：

[0018] 本发明先采用硅胶柱色谱对甘三酯进行分离，再进行酶法酯交换反应和产物分析检测，排除杂质干扰，提高了检测的灵敏度，可以实现对甘三酯中sn-1,3位脂肪酸含量的高效检测；

[0019] 本方法采用酶法酯交换结合微波辅助，可以大大提高反应效率，而且避免酰基转移造成的结果不准确性；传统的薄层层析检测法需要耗费数个小时，后期还需要分离、提取等步骤，操作也十分繁琐；本发明无需衍生化，直接检测，时间大大缩短，操作步骤也十分简易。

附图说明

[0020] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

[0021] 图1为采用本发明测定方法得到的脂肪酸乙酯标品气相图谱图。

具体实施方式

[0022] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面通过本发明的具体实施方式做详细的说明。

[0023] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

[0024] 实施例1

[0025] 步骤1凤尾鱼油中甘油三酯的分离提取

[0026] 采用硅胶柱层析的方法分离获取甘油三酯。柱层析洗脱液为石油醚:乙醚(80～90:10～15，V/V)。称取油脂样品约1～5g，转移至10～50ml容量瓶中，用洗脱液定容。取层析柱(尺寸规格1～3cm×30～50cm)，在底部放少许玻璃棉或海砂，将洗脱液和硅胶搅拌均匀混合，加入装柱。吸取油样20～30ml，沿层析柱壁缓缓加入，然后用100～500ml洗脱液进行洗脱，速度约为1～3ml/min，洗脱完毕，收集物即为甘油三酯，氮吹除去有机溶剂。

[0027] 步骤2脂肪酶Lipozyme RM IM微波辅助酯交换

[0028] 称取分离所得甘油三酯0.2g于10mL具塞试管中，加入2mL乙酸乙酯震荡混合均匀，再加入Lipozyme RM IM脂肪酶10mg，盖上塞子小心摇动，微波功率450W，保持反应25min，取出，加入1mL乙醚，5000r/min离心2min分离，吸取乙醚层，用0.45μm滤膜过滤到样品瓶中；

[0029] 步骤3GC法测定sn-1,3位脂肪酸组成及含量

[0030] 采用气相色谱分析sn-1,3位脂肪酸组成，分析条件为：安捷伦GC-7820A气相色谱仪，色谱柱DB-3ht(0.32mm×0.1μm×50m；Agilent)毛细管柱，采用程序升温，初始温度80℃，保持2min，以10℃/min升至360℃，保持10min；载气为高纯氮气(≥99.99％)；载气流速为2.0mL/min；分流比100～50∶1；气化室温度360℃；FID检测器温度为360℃；进样体积1.0μL。通过保留时间来鉴定脂肪酸种类，相对含量表示为mol％。

[0031] 实施例2

[0032] 步骤1金枪鱼油中甘油三酯的分离提取

[0033] 采用硅胶柱层析的方法分离获取甘油三酯。柱层析洗脱液为石油醚:乙醚(80～90:10～15，V/V)。称取油脂样品约1～5g，转移至10～50ml容量瓶中，用洗脱液定容。取层析柱(尺寸规格1～3cm×30～50cm)，在底部放少许玻璃棉或海砂，将洗脱液和硅胶搅拌均匀混合，加入装柱。吸取油样20～30ml，沿层析柱壁缓缓加入，然后用100～500ml洗脱液进行洗脱，速度约为1～3ml/min，洗脱完毕，收集物即为甘油三酯，氮吹除去有机溶剂。

[0034] 步骤2脂肪酶Lipozyme RM IM微波辅助酯交换

[0035] 称取分离所得甘油三酯0.2g于10mL具塞试管中，加入2mL乙酸乙酯震荡混合均匀，再加入Lipozyme RM IM脂肪酶20mg，盖上塞子小心摇动，微波功率600W，保持反应30min，取出，加入2mL乙醚，5000r/min离心2min分离，吸取乙醚层，用0.45μm滤膜过滤到样品瓶中；

[0036] 步骤3GC法测定sn-1,3位脂肪酸组成及含量

[0037] 采用气相色谱分析sn-1,3位脂肪酸组成，分析条件为：安捷伦GC-7820A气相色谱仪，色谱柱DB-3ht(0.32mm×0.1μm×50m；Agilent)毛细管柱，采用程序升温，初始温度80℃，保持2min，以10℃/min升至360℃，保持10min；载气为高纯氮气(≥99.99％)；载气流速为2.0mL/min；分流比100～50∶1；气化室温度360℃；FID检测器温度为360℃；进样体积1.0μL。通过保留时间来鉴定脂肪酸种类，相对含量表示为mol％。

[0038] 实施例3

[0039] 步骤1三文鱼油中甘油三酯的分离提取

[0040] 采用硅胶柱层析的方法分离获取甘油三酯。柱层析洗脱液为石油醚:乙醚(80～90:10～15，V/V)。称取油脂样品约1～5g，转移至10～50ml容量瓶中，用洗脱液定容。取层析柱(尺寸规格1～3cm×30～50cm)，在底部放少许玻璃棉或海砂，将洗脱液和硅胶搅拌均匀混合，加入装柱。吸取油样20～30ml，沿层析柱壁缓缓加入，然后用100～500ml洗脱液进行洗脱，速度约为1～3ml/min，洗脱完毕，收集物即为甘油三酯，氮吹除去有机溶剂。

[0041] 步骤2脂肪酶Lipozyme RM IM微波辅助酯交换

[0042] 称取分离所得甘油三酯0.2g于10mL具塞试管中，加入2mL乙酸乙酯震荡混合均匀，再加入Lipozyme RM IM脂肪酶5mg，盖上塞子小心摇动，微波功率450W，保持反应20min，取出，加入2mL乙醚，5000r/min离心2min分离，吸取乙醚层，用0.45μm滤膜过滤到样品瓶中；

[0043] 步骤3GC法测定sn-1,3位脂肪酸组成及含量

[0044] 采用气相色谱分析sn-1,3位脂肪酸组成，分析条件为：安捷伦GC-7820A气相色谱仪，色谱柱DB-3ht(0.32mm×0.1μm×50m；Agilent)毛细管柱，采用程序升温，初始温度80℃，保持2min，以10℃/min升至360℃，保持10min；载气为高纯氮气(≥99.99％)；载气流速为2.0mL/min；分流比100～50∶1；气化室温度360℃；FID检测器温度为360℃；进样体积1.0μL。通过保留时间来鉴定脂肪酸种类，相对含量表示为mol％。

[0045] 实施例4

[0046] 步骤1沙丁鱼油中甘油三酯的分离提取

[0047] 采用硅胶柱层析的方法分离获取甘油三酯。柱层析洗脱液为石油醚:乙醚(80～90:10～15，V/V)。称取油脂样品约1～5g，转移至10～50ml容量瓶中，用洗脱液定容。取层析柱(尺寸规格1～3cm×30～50cm)，在底部放少许玻璃棉或海砂，将洗脱液和硅胶搅拌均匀混合，加入装柱。吸取油样20～30ml，沿层析柱壁缓缓加入，然后用100～500ml洗脱液进行洗脱，速度约为1～3ml/min，洗脱完毕，收集物即为甘油三酯，氮吹除去有机溶剂。

[0048] 步骤2脂肪酶Lipozyme RM IM微波辅助酯交换

[0049] 称取分离所得甘油三酯0.2g于10mL具塞试管中，加入2mL乙酸乙酯震荡混合均匀，再加入Lipozyme RM IM脂肪酶10mg，盖上塞子小心摇动，微波功率500W，保持反应30min，取出，加入2mL乙醚，5000r/min离心2min分离，吸取乙醚层，用0.45μm滤膜过滤到样品瓶中；

[0050] 步骤3GC法测定sn-1,3位脂肪酸组成及含量

[0051] 采用气相色谱分析sn-1,3位脂肪酸组成，分析条件为：安捷伦GC-7820A气相色谱仪，色谱柱DB-3ht(0.32mm×0.1μm×50m；Agilent)毛细管柱，采用程序升温，初始温度80℃，保持2min，以10℃/min升至360℃，保持10min；载气为高纯氮气(≥99.99％)；载气流速为2.0mL/min；分流比100～50∶1；气化室温度360℃；FID检测器温度为360℃；进样体积1.0μL。通过保留时间来鉴定脂肪酸种类，相对含量表示为mol％。

[0052] 实施例5

[0053] 步骤1鳕鱼肝油中甘油三酯的分离提取

[0054] 采用硅胶柱层析的方法分离获取甘油三酯。柱层析洗脱液为石油醚:乙醚(80～90:10～15，V/V)。称取油脂样品约1～5g，转移至10～50ml容量瓶中，用洗脱液定容。取层析柱(尺寸规格1～3cm×30～50cm)，在底部放少许玻璃棉或海砂，将洗脱液和硅胶搅拌均匀混合，加入装柱。吸取油样20～30ml，沿层析柱壁缓缓加入，然后用100～500ml洗脱液进行洗脱，速度约为1～3ml/min，洗脱完毕，收集物即为甘油三酯，氮吹除去有机溶剂。

[0055] 步骤2脂肪酶Lipozyme RM IM微波辅助酯交换

[0056] 称取分离所得甘油三酯0.2g于10mL具塞试管中，加入2mL乙酸乙酯震荡混合均匀，再加入Lipozyme RM IM脂肪酶15mg，盖上塞子小心摇动，微波功率550W，保持反应20min，取出，加入2mL乙醚，5000r/min离心2min分离，吸取乙醚层，用0.45μm滤膜过滤到样品瓶中；

[0057] 步骤3GC法测定sn-1,3位脂肪酸组成及含量

[0058] 采用气相色谱分析sn-1,3位脂肪酸组成，分析条件为：安捷伦GC-7820A气相色谱仪，色谱柱DB-3ht(0.32mm×0.1μm×50m；Agilent)毛细管柱，采用程序升温，初始温度80℃，保持2min，以10℃/min升至360℃，保持10min；载气为高纯氮气(≥99.99％)；载气流速为2.0mL/min；分流比100～50∶1；气化室温度360℃；FID检测器温度为360℃；进样体积1.0μL。通过保留时间来鉴定脂肪酸种类，相对含量表示为mol％。

[0059] 本检测方法稳定性高，利用其检测鱼油中甘油三酯的sn-1,3位脂肪酸含量，从而计算sn-2位脂肪酸含量，重现性达到RSD≤5％，下表是同一样品sn-2位EPA和DHA占总脂肪酸的百分比10次检测结果及RSD：

[0060]

[0061]

[0062] 对比实例：不同微波辅助Lipozyme RM IM催化酯交换反应对比

[0063]

[0064] 由此可见，酶法sn-1,3特异性酯交换中酶专一性强，有效作用于LC-PUFA，可以避免酰基转移。同时结合微波辅助极大地提高酯交换反应效率。微波照射到油脂分子，极性酰基有较强的微波吸收能力，以极高的频率振荡，引起分子的电磁振荡等作用，增加分子的运动，提高分子活化能。洗脱液选择特定沸程的石油醚，洗脱效果更好，而且酯交换反应正是发生在酯基位置，因此微波具有类似定向聚能作用，能够极大地加速酯交换反应。

[0065] 上述说明已经充分揭露了本发明的具体实施方式。需要指出的是，熟悉该领域的技术人员对本发明的具体实施方式所做的任何改动均不脱离本发明的权利要求书的范围。相应地，本发明的权利要求的范围也并不仅仅局限于前述具体实施方式。