癌的检测方法

摘要

本发明涉及癌的检测方法，具体涉及一种以特定多肽的表达为指标的癌的检测方法。所述多肽是通过使用了源自犬睾丸的cDNA文库和罹癌犬的血清的SEREX法，作为与存在于源自罹癌生物体的血清中的抗体结合的多肽被分离得到的。由于所述多肽与癌患者血清中特异性存在的抗体反应，所以如果测定试样中的该抗体，则可以检测生物体内的癌。另外，通过测定该抗体的抗原蛋白质本身或者编码该抗原蛋白质的mRNA，也可以检测生物体内的癌。

权利要求

1.用于测定以下(d)多肽的表达的药剂在下述癌检测试剂的制造中的用途，所述癌检测试剂用于对从生物体中分离的试样进行癌检测，(d)甲状腺激素受体相互作用因子11，

所述试样为血清、腹水、胸水或组织试样，

其中，甲状腺激素受体相互作用因子11的表达量显著高于来自健康生物体的试样中的表达量时，则检测为患有癌。

2.如权利要求1所述的用途，其中，所述生物体为犬、人或猫。

3.如权利要求2所述的用途，其中，所述生物体为犬，需要测定的所述多肽为具有序列号45所示的氨基酸序列的多肽。

4.如权利要求2所述的用途，其中，所述生物体为人，需要测定的所述多肽为具有序列号47所示的氨基酸序列的多肽。

5.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，用于测定所述多肽的表达的药剂是用于对下述抗体进行免疫测定的药剂，所述抗体是针对能够包含在所述试样中的、需要测定的所述多肽的抗体、且在所述生物体内被诱导。

6.如权利要求5所述的用途，其中，所述免疫测定是使用了以下(h)多肽作为抗原的免疫测定，所述(h)多肽为含有序列号45所示的氨基酸序列中的237号～1023号氨基酸区域、由1000个以下的氨基酸构成的多肽，或者为含有序列号47所示的氨基酸序列中236号～

1023号氨基酸区域、由1000个以下的氨基酸构成的多肽。

7.如权利要求6所述的用途，其中，所述(h)多肽为具有序列号54或者55所示的氨基酸序列的多肽。

8.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，用于测定所述(d)多肽的表达的药剂是用于对能够包含在所述试样中的所述多肽进行免疫测定的药剂。

9.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，所述试样为血清、腹水或者胸水。

10.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，用于测定所述(d)多肽的表达的药剂是用于对能够包含在所述试样中的、编码所述多肽的mRNA进行测定的药剂。

11.如权利要求10所述的用途，其中，通过使用与所述mRNA碱基序列特异性杂交的多核苷酸，研究所述试样中所述mRNA的存在量来测定所述mRNA。

12.如权利要求11所述的用途，其中，所述生物体为犬，所述多核苷酸为与序列号44所示的碱基序列特异性杂交的多核苷酸。

13.如权利要求11所述的用途，其中，所述生物体为人，所述多核苷酸为与序列号46所示的碱基序列特异性杂交的多核苷酸。

14.如权利要求11所述的用途，其中，所述多核苷酸的碱基序列由序列号48或者49所示。

15.如权利要求11至14中任一项所述的用途，其中，所述多核苷酸为引物或者探针。

16.如权利要求10所述的用途，其中，所述试样为组织试样。

17.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，所述癌为选自下述癌中的至少一种癌：头部、颈部、子宫或食道的鳞状上皮癌、黑色素瘤、肾癌、恶性混合肿瘤、基底细胞癌、肛门囊肿、塞尔托利细胞瘤、阴道前庭癌、大肠癌、腺癌、纤维肉瘤、骨肉瘤、粘液肉瘤、未分化肉瘤、肺癌、肥大细胞瘤、平滑肌瘤、淋巴瘤、肾上腺髓质肿瘤、粒层细胞瘤、嗜铬细胞瘤、膀胱癌、肝癌、浆细胞瘤、血管肉瘤、口腔癌、恶性肌上皮瘤、恶性睾丸上皮瘤、多发性骨髓瘤、间叶组织恶性肿瘤、脂肪肉瘤、起因不明的肉瘤、软组织肉瘤、低分化肉瘤、滑膜肉瘤、转移性恶性上皮肿瘤、生殖细胞瘤、白血病及浸润性毛发上皮瘤。

18.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，所述癌为选自下述癌中的至少一种癌：脑肿瘤、棘细胞瘤样龈瘤、血管外皮细胞瘤、软骨肉瘤。

19.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，所述癌为选自下述癌中的至少一种癌：组织细胞肉瘤、恶性血管外膜细胞瘤。

20.如权利要求17所述的用途，其中，所述腺癌为选自由肺或子宫的腺癌、肛门周围腺癌、皮脂腺癌、汗腺癌、鼻腺癌、甲状腺癌、支气管腺癌、腺管癌、乳腺癌、大肠腺癌、胃腺癌、耳垢腺癌、顶泌腺癌组成的组中的至少一种癌。

21.如权利要求17所述的用途，其中，所述腺癌为皮脂腺上皮瘤。

22.如权利要求17所述的用途，其中，所述腺癌为脂腺腺瘤。

23.如权利要求17所述的用途，其中，所述腺癌为低度皮脂腺癌。

24.如权利要求20所述的用途，其中，所述乳腺癌为选自由复合型乳腺癌、乳腺恶性混合肿瘤、乳管内乳头状腺癌、管状乳腺腺癌、乳腺导管癌、炎性乳癌组成的组中的至少一种癌。

25.如权利要求20所述的用途，其中，所述鼻腺癌为鼻腔内腺癌。

26.如权利要求17所述的用途，其中，所述腺癌为肛门囊腺癌。

27.如权利要求20所述的用途，其中，所述顶泌腺癌为选自由肛门囊顶泌腺癌、低分化型顶泌腺癌组成的组中的至少一种癌。

28.如权利要求17所述的用途，其中，所述肺癌为选自由肺的鳞状上皮癌、肺的腺癌组成的组中的至少一种癌。

29.如权利要求17所述的用途，其中，所述黑色素瘤为选自由转移性恶性黑色素瘤、无黑色素性恶性黑色素瘤、皮肤恶性黑色素瘤组成的组中的至少一种癌。

30.如权利要求17所述的用途，其中，所述肝癌为肝细胞癌。

31.如权利要求17所述的用途，其中，所述肝癌为腹腔内肝脏肿瘤。

32.如权利要求17所述的用途，其中，所述口腔癌为口腔内肿瘤。

33.如权利要求17所述的用途，其中，所述大肠癌为大肠腺癌。

34.如权利要求17所述的用途，其中，所述骨肉瘤为乳腺骨肉瘤。

35.如权利要求17所述的用途，其中，所述平滑肌瘤为选自由皮肤平滑肌瘤、腹腔内平滑肌瘤、平滑肌肉瘤组成的组中的至少一种癌。

36.如权利要求17所述的用途，其中，所述白血病为慢性淋巴细胞性白血病。

37.如权利要求17所述的用途，其中，所述淋巴瘤为选自由消化管型淋巴瘤、消化器型淋巴瘤、小细胞型淋巴瘤、中细胞型淋巴瘤、多中心型淋巴瘤组成的组中的至少一种癌。

38.如权利要求17所述的用途，其中，所述生殖细胞瘤为精原细胞瘤。

39.如权利要求17所述的用途，其中，所述膀胱癌为移行细胞癌。

40.如权利要求17所述的用途，其中，所述软组织肉瘤为纺锤形细胞肿瘤。

41.如权利要求17所述的用途，其中，所述肥大细胞瘤为选自PatnaikII型肥大细胞瘤、GradeII肥大细胞瘤组成的组中的至少一种癌。

42.如权利要求19所述的用途，其中，所述组织细胞肉瘤为恶性纤维性组织细胞瘤。

43.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，所述癌检测包括根据在所述(d)多肽的表达量多的情况下癌的恶性程度升高，进一步检测癌的恶性程度。

44.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，所述癌检测包括根据在所述(d)多肽的表达量多的情况下癌的进展程度发展，进一步检测癌的进展程度。

45.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，所述癌检测包括根据所述(d)多肽的表达量是否降低，进一步监控癌的治疗效果。

说明书

癌的检测方法

[0001] 本申请是申请日为2008年10月23日、发明名称为“癌的检测方法”的中国发明专利申请200880113140.2(PCT申请号为PCT/JP2008/069275)的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明涉及一种新型的癌的检测方法。

背景技术

[0003] 癌是在全部死亡原因中占第一位的疾病，目前进行的治疗主要是以手术疗法为主、组合使用放射疗法和化学疗法的对症疗法。目前为止随着医疗技术的进步，如果能够早期发现则癌逐渐变为治疗可能性高的疾病。因此，寻求一种癌患者无体力、经济负担，能够使用血清或尿等简便地进行检查的癌的检测方法。

[0004] 作为使用血液或尿的癌诊断方法，最近测定肿瘤标记物等肿瘤生产物的方法正日益普及。所谓肿瘤生产物是指与肿瘤相关的抗原、酶、特定蛋白质、代谢产物、肿瘤基因、肿瘤基因生产物及肿瘤抑制基因等，癌胚抗原CEA、糖蛋白质CA19－9、CA125、前列腺特异抗原PSA、作为由甲状腺产生的肽类激素的降钙素等在一部分癌中作为肿瘤标记物被活用于癌诊断。但是在多种癌中，不存在对癌诊断有用的肿瘤标记物。另外，由于目前所知的大部分肿瘤标记物仅以极微量(pg/mL级程度)存于体液中，所以为了检测它们需要高灵敏度的测定方法及特殊的技术。在这种现状中如果提供能够以简便操作高灵敏度地检测各种癌的新型癌检查方法，则可期待开发出针对各种癌的诊断用途。

[0005] 另外，如果不仅能够检测癌，还能够对在看不见的部分产生的癌进行诊断、进行癌的进展程度诊断、癌的恶性程度及术后追踪诊断、复发诊断、转移诊断、治疗监控等，那么将非常有用。

[0006] 具体而言，如果能够对在看不见的部分产生的癌进行诊断，则对腹腔内等不易察觉部分的癌的早期发现来说有用。另外，在肿瘤尚未达到肉眼能确认程度的大小时，能够呈现出即使通过超声波检查·CT(计算机化断层显像)·MRI(核磁共振成像)也不能发现的癌。

[0007] 另外，关于癌的进展程度，基于肿瘤在原发部位的扩散程度、和向所属淋巴结·远位器官的转移的有无进行分类。通常，将称为“stage”的病期分类为5个阶段，数字越大癌进展得越明显。严密地划分时其定义根据脏器而不同，例如病期0是指存留在上皮内的癌，病期IV是指引起远位转移的癌。在明确了这种癌进展程度的情况下，可以决定适合的治疗方针，还可以诊断抗癌剂治疗效果。作为决定治疗方针的具体例子，存在前立腺癌等恶性程度非常低、基本不发展无需治疗的癌，另一方面也存在引起向骨等转移、伴随疼痛直至患者死亡的进行性癌。由于激素疗法及摘除手术等治疗分别伴随着副作用，所以需要适当判断并决定治疗方法。另外，如果能够判断抗癌剂的选择是否适合，适当判断结束给与抗癌剂的时机等，则还可以减轻患者体力上、经济上的负担。因此，能够诊断癌症进展程度是重要的。

[0008] 癌细胞的特征之一是具有幼化即去分化的性质。除去一部分癌，低分化或者未分化等分化度越低的癌细胞其转移后的增殖以及早期治疗预后均不良。认为这种癌的恶性程度高。相反，高分化的癌细胞即细胞分化度越高的癌细胞中残存脏器的结构·功能性质，一般认为其恶性程度较低。在明确了这种癌的恶性程度的情况下，即使肿瘤小，但如果恶性程度高，则在摘除肿瘤时可以确保多些边缘，或者关注周围组织的较大范围并进行追踪观察。

[0009] 在能够进行包括复发、转移的术后追踪诊断时，可以诊断能否通过手术完全摘除肿瘤。由于未完全摘除时引起复发的可能性高，所以可以判断更加重视观察且以短的间隔进行追踪观察、或根据情况尽早再次进行手术。另外，复发时能够早期发现的可能性也高。在引起远位转移时发现往往较晚，但如果能够进行转移诊断，则可以成为除摘除部位及其周边之外扩大检查范围的判断材料。

[0010] 在能够进行治疗监控时，可以从各种治疗方法中选择最适合的治疗方法或其组合，进行最适合的治疗。如果能够呈现抗癌剂的治疗效果则有助于选择抗癌剂的给药时间及种类、量。另外，经治疗监控，能够知道在肿瘤摘除后是否存在残留肿瘤，也能够在追踪观察中获得尽早得知转移·复发的线索，因此可以开始早期治疗。如果能够监控治疗效果，则成为该治疗方法是否适合、是否改为其他治疗方法的判断材料。

[0011] 但是，已知人的寿命大致是犬的7倍。最近，陪伴动物通常作为家族的一员被饲养、具有与饲养人具有相同的生活习惯。因此，根据陪伴动物的患癌，可以预测饲养人将来患癌的危险性高。如果能够简便且正确对陪伴动物进行癌诊断，则期待有助于预防饲养人患癌。

[0012] 现在，据说犬的饲养数在日本约为639万只，另外美国约为1764万只。除接种狂犬病育苗之外通常接种5种、7种、8种等混合疫苗也较为普及，犬细小病毒感染症、犬瘟热病毒感染症、犬副流感(犬舍咳)、犬腺病毒Ⅱ型感染症(犬舍咳)、犬传染性肝炎、犬冠状病毒感染症、钩端螺旋体病等致死率高的感染症已经减少。因此，犬的平均寿命延长，7岁以上的高龄犬占全部饲养数的35.5％。死亡原因也与人相同，即癌及高血压、心脏病等持续增加。据说在美国1年间约有400万只被诊断为癌，日本也有约160万只潜在具有某种肿瘤。

[0013] 但是，目前为止没有简便的动物用癌诊断药，动物医疗中还未普及利用X射线、CT、MRI进行照相等的检查方法。现状是进行触诊及简单的血液检查、利用X射线照相的检查，诊断主要依赖于兽医经验。虽然使用血清的检查方法也已经部分地进行，但由于还未发现犬的肿瘤标记物所以只能使用人的肿瘤标记物。

[0014] 为了正确地进行癌诊断，需要开腹手术，在犬的体力负担、饲养人的费用负担方面存在较大问题。如果能够简便地进行犬及猫等陪伴动物的癌诊断，则期待早期发现及正确诊断对陪伴动物的癌治疗有用。另外，如果可以使用上述血清进行简便地癌诊断，则期待不仅能够进行癌诊断，还对定期健康诊断及手术前诊断、决定治疗方针等具有巨大贡献。

[0015] 由于陪伴动物尚未普及像人那样的健康诊断，所以在很多情况下发现较晚，肿瘤变大饲养人才开始注意并入院就诊。该变大的肿瘤为恶性时，很多情况下即使进行了手术等外科疗法及给与抗癌剂等也已经为时过晚。因此，通常兽医在判断为恶性时不进行手术而进行抗癌剂治疗。即使进行手术时也需要严格实施确保边缘的大小及手术中血液、细胞飞散对策等手术中的对策。优选手术后立即开始抗癌剂治疗，以短的间隔进行追踪观察。如果采取最近日渐普及的称为Dog Dock的犬健康诊断，则期待与早期发现相关。

[0016] 另一方面，为良性肿瘤时，即使肿瘤较大也可以进行手术。手术后只需要护理切除部分，不必进行昂贵的抗癌剂治疗，追踪观察中也不必紧张。

[0017] 由上述现状来看，如果能够提供可以适用于动物癌诊断的、高灵敏度且简便的癌检测方法，则可以进行正确且不白费功夫的治疗，这对于饲养人和兽医来说都是有利的。

[0018] 非专利文献1：2004年度厚生劳动省调查

[0019] 非专利文献2：日经SCIENCE、2007年、3月号、p.p.80－88

[0020] 非专利文献3：临床检查2003年、12月发行、vol.47、No.13、p.1641－1654[0021] 非专利文献4：犬·猫的疾病统计2005年1月发行

[0022] 非专利文献5：Companion Animal Health Products：2006Edition By Tim Wesley，ANIMAL PHARM REPORTS

[0023] 非专利文献6：癌的扩散和进展程度、大阪府立成人病中心调查部津熊秀明[0024] 非专利文献7：蛋白质核酸酶vol.50，No.11，p.1405－1412

[0025] 非专利文献8：J Cell Sci.115：1825－35

[0026] 非专利文献9：Blood.95：1788－96

[0027] 非专利文献10：Mol Endocrinol.9：243－54(1995)

[0028] 非专利文献11：J Cell Biol.145：83－98(1999)

发明内容

[0029] 本发明的目的在于提供一种在癌的诊断中有用的癌的检测方法。

[0030] 本申请发明人等经过潜心研究，结果通过使用了源自犬睾丸的cDNA文库和罹癌犬血清的SEREX法，获得了编码与存在于源自罹癌生物体的血清中的抗体结合的蛋白质的cDNA，基于该cDNA制备具有序列号2所示的氨基酸序列的多肽、具有序列号16所示的氨基酸序列的犬钙镁蛋白(Calmegin)、具有序列号26所示的氨基酸序列的犬中心体蛋白质(centrosomal protein，以下简称为CEP)，及具有序列号45所示的氨基酸序列的犬甲状腺激素受体相互作用因子11(thyroid hormone receptor interactor 11、以下有时记作“TRIP11”)。另外，基于所获得基因的人同源性基因,制备具有序列号4所示的氨基酸序列的多肽、具有序列号18所示的氨基酸序列的人钙镁蛋白质、具有序列号28所示的氨基酸序列的人CEP及具有序列号47所示的氨基酸序列的人TRIP11。发现编码上述蛋白质的基因特异性表达于犬及人的睾丸和恶性癌细胞中(参见实施例A－1、B－1、C－1、D－1)，并发现基于上述蛋白质的氨基酸序列制备的重组多肽仅与罹癌生物体中的血清特异性反应，进一步发现利用使用该重组多肽配制的抗体，可以从罹癌生物体中特异性检测出上述多肽及其同源因子，从而完成了本申请发明。

[0031] 即，本发明提供一种癌的检测方法，所述方法是针对从生物体中分离的试样所进行的方法，包括测定以下(a)～(d)中至少任一种多肽的表达。

[0032] (a)多肽，是在上述生物体内产生的、且具有通过抗原抗体反应与下述抗体结合的反应性，所述抗体是针对具有序列号2或者4所示的氨基酸序列的多肽的抗体，

[0033] (b)钙镁蛋白，

[0034] (c)多肽，具有通过抗原抗体反应与下述抗体结合的反应性，所述抗体是针对具有序列号26、28或者42所示的氨基酸序列的中心体蛋白质的抗体，

[0035] (d)甲状腺激素受体相互作用因子11(thyroid  hormone  receptor interactor11)。

[0036] 另外，本发明提供癌检测试剂，所述癌检测试剂含有与下述抗体进行抗原抗体反应的多肽，所述抗体是在生物体内被诱导的、针对以下(i)～(l)中任一种多肽的抗体。

[0037] (i)具有序列号2或者4所示的氨基酸序列的多肽，

[0038] (j)钙镁蛋白，

[0039] (k)具有序列号26、28或者42所示的氨基酸序列的中心体蛋白质，

[0040] (l)甲状腺激素受体相互作用因子11。

[0041] 进而，本发明提供癌检测试剂，所述癌检测试剂含有与以下(m)～(p)中任一种多肽进行抗原抗体反应的抗体或者其抗原结合性片段。

[0042] (m)多肽，是在生物体内产生的、且具有通过抗原抗体反应与下述抗体结合的反应性，所述抗体是针对具有序列号2或者4所示的氨基酸序列的多肽的抗体，

[0043] (n)钙镁蛋白，

[0044] (o)多肽，是在生物体内产生的、且具有通过抗原抗体反应与下述抗体结合的反应性，所述抗体是针对具有序列号26、28或者42所示的氨基酸序列的中心体蛋白质的抗体，[0045] (p)甲状腺激素受体相互作用因子11。

[0046] 进而，本发明提供癌检测试剂，所述癌检测试剂含有多核苷酸，所述多核苷酸与序列表的序列号1、3、15、17、25、27、41、44及46中任一个所示的碱基序列中的部分区域特异性杂交。

[0047] 根据本发明，可以提供新型的癌检测方法。如下述实施例中的具体说明所示，基于序列号2或者4所示的氨基酸序列、钙镁蛋白的氨基酸序列、序列号26、28或者42所示的CEP氨基酸序列、及TRIP11的氨基酸序列所制备的重组多肽，与癌患者血清中特异性存在的抗体反应。因此，如果根据本发明的方法测定试样中的该抗体，则可以检测出生物体内的癌。另外，通过测定该抗体的抗原蛋白质本身，也可以检测出生物体内的癌。根据本发明的方法，也可以检测出小到肉眼看不见的大小的癌及体内深部的癌，因此也有利于在健康诊断等中早期发现癌症。另外，如果在癌治疗后在对患者的追踪观察中利用本发明的方法，则还可以早期检测出复发的癌。并且，根据本发明的方法，还可以进行肿瘤增大及对周围组织的浸润、癌向淋巴结及远位器官的转移等癌的进展程度诊断。另外，由于恶性程度高的癌患者与恶性程度低的癌患者相比上述抗体的血清中存在量较多，所以根据本发明的方法也可以诊断癌的恶性程度。通过上述抗体的血清中存在量的增减还可以进行治疗监控，经该治疗监控可以获知抗癌剂的治疗效果、及肿瘤摘除后有无残留肿瘤、以及在追踪观察中也能够获得尽早得知转移·复发的线索等，成为该治疗方法是否适合、是否改为其他治疗方法、开始何种治疗等治疗方法选择的判断材料。另外，如下述实施例所述，编码下述多肽的mRNA在睾丸及癌细胞中特异性地高度表达，所述多肽为具有序列号2或者4所示的氨基酸序列的多肽、钙镁蛋白、具有序列号26、28或者42所示的氨基酸序列的CEP及TRIP11。因此，还可以通过测定该mRNA来检测癌。

附图说明

[0048] [图1]表示实施例A－1中鉴定出的基因在正常组织及肿瘤细胞株中的表达谱。标号1：表示鉴定出的基因表达谱，标号2：表示GAPDH基因的表达谱。

[0049] [图2]为用考马斯染色法检测犬重组蛋白的图，所述犬重组蛋白是在实施例A中由大肠杆菌产生并经纯化的、为本发明使用的多肽的一例。标号3：表示犬重组蛋白的条带。

[0050] [图3]为使用实施例A制备的犬重组蛋白进行的罹癌犬的癌诊断结果的一部分。

[0051] [图4]为使用实施例A制备的犬重组蛋白进行的罹癌犬的癌详细诊断结果的一部分。

[0052] [图5]表示编码钙镁蛋白质的基因在正常组织及肿瘤细胞株中的表达谱。标号1：表示编码钙镁蛋白质的基因的表达谱，标号2：表示GAPDH基因的表达谱。

[0053] [图6]为用考马斯染色法检测犬钙镁蛋白的图，所述犬钙镁蛋白是在实施例B中由大肠杆菌制造并经纯化的、为本发明使用的蛋白的一例。标号3：表示犬钙镁蛋白质的条带。

[0054] [图7]为使用实施例B制备的犬钙镁蛋白质进行的罹癌犬的癌诊断结果的一部分。

[0055] [图8]为使用实施例B制备的犬钙镁蛋白质进行的罹癌犬的癌详细诊断结果的一部分。

[0056] [图9]表示编码CEP的基因在正常组织及肿瘤细胞株中的表达谱。标号1：表示编码CEP的基因的表达谱，标号2：表示GAPDH基因的表达谱。

[0057] [图10]为用考马斯染色法检测源自犬CEP的多肽的图，所述源自犬CEP的多肽是在实施例C中用大肠杆菌制造并纯化的、本发明使用的多肽之一例。标号3：表示源自犬CEP的多肽的条带。

[0058] [图11]为使用实施例C制备的源自犬CEP的多肽进行的罹癌犬的癌诊断结果的一部分。

[0059] [图12]为使用实施例C制备的源自犬CEP的多肽进行的罹癌犬的癌详细诊断结果的一部分。

[0060] [图13]表示编码TRIP11蛋白的基因在正常组织及肿瘤细胞株中的表达谱。标号1：表示编码TRIP11蛋白的基因的表达谱，标号2：表示GAPDH基因的表达谱。

[0061] [图14]为用考马斯染色法检测源自犬TRIP11的多肽的图，所述源自犬TRIP11的多肽是在实施例D中用大肠杆菌制造并经纯化的、为本发明使用的多肽的一例。标号3：表示源自犬TRIP11的多肽的条带。

[0062] [图15]为使用实施例D制备的源自犬TRIP11的多肽进行的罹癌犬的癌诊断结果的一部分。

[0063] [图16]为使用实施例D制备的源自犬TRIP11的多肽进行的罹癌犬的癌详细诊断结果的一部分。

具体实施方式

[0064] 本发明的方法中，使用从生物体分离得到的试样测定规定的多肽的表达。作为使用上述试样测定多肽表达的方法，可以举出如下方法：对针对试样中含有的该多肽的抗体进行免疫测定的方法(第1方法)、对试样中含有的该多肽本身进行免疫测定的方法(第2方法)、及对编码试样中含有的该多肽的mRNA进行测定的方法(第3方法)。本发明的方法中，可以采用上述任一种方法测定多肽的表达。需要说明的是，本发明中所称的“测定”这一用语包括检测、定量及半定量中任一种。

[0065] 采用本发明的方法测定表达的上述规定的多肽，为以下(a)～(d)中的至少任一种多肽。

[0066] (a)多肽，是在上述生物体内产生的、且具有通过抗原抗体反应与下述抗体结合的反应性，所述抗体是针对具有序列号2或者4所示的氨基酸序列的多肽的抗体，

[0067] (b)钙镁蛋白，

[0068] (c)多肽，具有通过抗原抗体反应与下述抗体结合的反应性，所述抗体是针对具有序列号26、28或者42所示的氨基酸序列的中心体蛋白质的抗体，

[0069] (d)甲状腺激素受体相互作用因子11(thyroid  hormone  receptor interactor11)。

[0070] 如下述实施例所述，即使仅测定上述多肽中任一种的表达，也可以检测癌。因此，本发明中可以仅研究(a)～(d)中一种的表达，也可以组合两种以上进行研究。如果组合两种以上作为指标，则可以进一步提高癌的检测精度(参见下述实施例E)。

[0071] 上述(a)多肽是生物体内产生的多肽，具有通过抗原抗体反应与下述抗体结合的反应性，所述抗体是针对具有序列号2或者4所示的氨基酸序列的多肽的抗体。换言之，需要测定表达的该规定的多肽，是指与序列号2的源自犬的多肽或者与序列号4的源自人的多肽显示出相同抗原性的多肽。

[0072] 作为上述多肽的具体例，可以举出序列号2的源自犬的多肽、序列号4的源自人的多肽。所述多肽为“针对具有序列号2或者4所示的氨基酸序列的多肽的抗体”的对应抗原本身，包括在上述规定的多肽中。另外，作为其他具体例，可以举出与上述源自犬的多肽或者源自人的多肽具有相同抗原性的、源自其他哺乳动物的多肽(以下将这些多肽记作“同源因子”。另外，有时将上述源自人的多肽记作源自犬的多肽的“人同源因子”)。

[0073] 此处，所谓序列号2所示的氨基酸序列，是指通过使用了源自犬睾丸的cDNA文库和罹癌犬的血清的SEREX法，被鉴定为与特异性存在于源自罹癌犬的血清中的抗体(以下有时称为犬的“癌特异性抗体”)相结合的多肽的、功能未知的多肽的氨基酸序列(参见实施例A－1)。因此，采用上述第1方法测定针对序列号2的多肽的该癌特异性抗体，由此可以检测犬的癌(参见实施例A－3及A－4)。另外，采用上述第2方法测定作为抗原的序列号2的多肽本身，也可以检测犬的癌(参见实施例A－5及A－6)。另外，如下述实施例所述，由于编码该抗原多肽的mRNA在睾丸和癌细胞中显著高地表达(参见实施例A－1)，所以通过测定该mRNA也可以检测犬的癌。需要说明的是，序列号2所示的源自犬的多肽的序列在NCBI数据库中注册为Accession No.XP_535343(蛋白质)及Accession No.XM_535343(编码基因)，但其功能尚无相关报告。

[0074] 序列号4所示的氨基酸序列，为利用BLAST进行同源检索的结果发现的、上述源自犬的多肽的人同源因子的氨基酸序列。编码人同源因子的碱基序列及其氨基酸序列分别如序列表的序列号3及4所示，在NCBI数据库中注册为Accession No.NP_689873(蛋白质)及Accession No.NM_152660(编码基因)。人同源因子与上述源自犬的多肽同样其功能尚无相关报道。如下述实施具体记载所示，编码人同源因子的mRNA与序列号2源自犬的多肽同样，显著高地表达于人的睾丸和癌细胞中，在健康人体中检测不到针对该人同源因子的抗体。因此，通过研究序列号4的多肽在人体中的表达，可以检测出人的癌。

[0075] 作为与上述源自犬的多肽或其人同源因子具有相同抗原性的其他哺乳动物同源因子的具体例，例如可以举出下述实施例中所示的特异性地存在于罹癌猫体内的多肽。该猫多肽与使用序列号2源自犬的多肽作为免疫原制备的抗体进行抗原抗体反应，另外与使用序列号4的人同源因子作为免疫原制备的抗体也进行抗原抗体反应(参见实施例A－5及A－6)。因此，该猫多肽为与上述源自犬的多肽及源自人的多肽具有相同抗原性的猫同源因子，包括在成为本发明中测定表达的对象的“具有通过抗原抗体反应与针对具有序列号2或者4所示的氨基酸序列的多肽的抗体结合的反应性的”多肽的范围内。如下述实施例具体记载所述，在猫体内被诱导的针对猫同源因子的抗体在健康猫内检测不到，仅在罹癌猫中可以检测到。另外，作为抗原的猫同源因子本身也在健康猫内检测不到，仅在罹癌猫体内检测到。因此，通过测定除犬及人之外的哺乳动物同源因子的表达，也可以检测该哺乳动物的癌。

[0076] 优选上述(a)多肽为具有序列表的序列号2所示的氨基酸序列的多肽，或者为与该多肽具有95％以上同源性、并在生物体内产生的多肽。与源自犬的多肽(序列号2)和其人同源因子(序列号4)的同源性在碱基序列中为93％、在氨基酸序列中为99％。在如犬和人之类的遗传远缘的哺乳动物间，同源因子的氨基酸序列的同源性非常高为99％，因此认为在除人之外的哺乳动物之间，序列号2的源自犬的多肽与其同源因子具有95％以上的高同源性。

[0077] 所谓作为上述(b)多肽的钙镁蛋白，被鉴定为在精细胞分化时期特异性表达的蛋白，在体外表现出分子伴侣活性。由于为仅在睾丸内表达，在成熟精子中消失的蛋白质，所以一般认为其具有将精细胞分化相关蛋白质折叠的功能(参见非专利文献7、井上直和·山口亮·伊川正人蛋白质核酸酶vol.50No.11 1405－1412)。但是，目前尚无该蛋白在癌中表达、对癌的诊断等有用的报告。

[0078] 序列号16所示的氨基酸序列为犬的钙镁蛋白的氨基酸序列。具有该氨基酸序列的犬钙镁蛋白通过使用了源自犬睾丸的cDNA文库和罹癌犬的血清的SEREX法，被鉴定为与特异性存在于源自罹癌犬的血清中的抗体结合的多肽(参见实施例B－1)。即，针对具有序列号16所示的氨基酸序列的钙镁蛋白的抗体在罹癌犬体内被特异性诱导。因此，采用上述第1方法测定针对具有序列号16所示的氨基酸序列的钙镁蛋白的上述抗体，由此可以检测犬的癌(参见实施例B－3及B－4)。另外，采用上述第2方法测定作为抗原的序列号16的钙镁蛋白本身，也可以检测犬的癌(参见实施例B－5及B－6)。另外，如下述实施例所述，由于编码钙镁蛋白的mRNA显著高地表达于睾丸和癌细胞中(参见实施例B－1)，所以通过测定该mRNA也可以检测犬的癌。

[0079] 在本发明的方法中，不仅将序列号16的犬钙镁蛋白作为测定对象，还可以将其他哺乳动物的钙镁蛋白(以下，有时称作针对犬钙镁蛋白的“同源因子”。另外，简称为“钙镁蛋白”时不仅包含源自犬还包括源自其他哺乳动物的钙镁蛋白)作为测定对象。如下述实施例中的具体记载所示，编码人钙镁蛋白的mRNA与序列号16的犬钙镁蛋白同样，显著高地表达于人的睾丸和癌细胞中，在健康人体内检测不到针对该人钙镁蛋白的抗体。另外，针对猫钙镁蛋白的抗体在健康猫体内检测不到，仅在罹癌猫体内能够检测到。因此，通过测定除犬之外的哺乳动物中的钙镁蛋白的表达，也可以检测该哺乳动物的癌。作为本发明方法中为测定对象的犬之外的钙镁蛋白，例如可以举出人钙镁蛋白、猫钙镁蛋白等，但不限定于此。需要说明的是，编码人钙镁蛋白的碱基序列及其氨基酸序列分别如序列表的序列号17及18所示，与犬钙镁蛋白的同源性在碱基序列中为90％，在氨基酸序列中为89％。在如犬和人之类的遗传上远缘的哺乳动物之间，各钙镁蛋白的氨基酸序列的同源性非常高为89％，因此认为即使在除人之外的哺乳动物之间，犬钙镁蛋白与其同源因子也具有80％左右以上的高同源性。即，在本发明的方法中测定表达的钙镁蛋白没有特别限定，但优选与序列号16所示的犬钙镁蛋白的氨基酸序列具有80％以上的同源性、较优选具有85％以上的同源性。

[0080] 上述所谓(c)多肽，是指具有通过抗原抗体反应与下述抗体结合的反应性的多肽，所述抗体是针对具有序列号26、28或者42所示的氨基酸序列的中心体蛋白质(CEP)的抗体。换言之，上述所谓(c)多肽是指与序列号26或42的源自犬的CEP或者序列号28的源自人的CEP显示相同抗原性的多肽。

[0081] 作为上述规定的CEP的具体例，可以举出序列号26或者42的源自犬的CEP、序列号28的源自人的CEP。所述CEP为“针对具有序列号26、28或者42所示的氨基酸序列的CEP的抗体”的对应抗原自身，包括在上述规定的CEP中。另外，作为其他具体例，可以举出与上述源自犬的CEP或者源自人的CEP具有相同的抗原性的、源自其他哺乳动物的CEP(以下，将这些CEP表示为“同源因子”。另外有时将上述源自人的CEP称作源自犬的CEP的“人同源因子”)。

[0082] 此处，所谓序列号26所示的氨基酸序列，是指犬CEP的氨基酸序列，通过使用了源自犬睾丸的cDNA文库和罹癌犬的血清的SEREX法，被鉴定为与特异性存在于源自罹癌犬的血清中的抗体(以下，有时称作犬的“癌特异性抗体”)结合的多肽(参见实施例C－1)。因此，采用上述第1方法测定针对具有序列号26所示的氨基酸序列的犬CEP的上述抗体，由此可以检测犬的癌(参见实施例C－3及C－4)。另外，通过采用上述第2方法测定作为抗原的序列号26的CEP本身，也可以检测犬的癌(参见实施例C－5及C－6)。另外，如下述实施例所述，由于编码序列号26的CEP的mRNA显著高地表达于睾丸和癌细胞中(参见实施例C－1)，所以通过测定该mRNA也可以检测犬的癌。需要说明的是，所谓CEP是指中心体为了控制微管所需要的蛋白质，还与中心体的成熟相关。已知在一部分骨髓增殖性疾病中经常引起染色体易位，而在引起该易位的位点上存在CEP基因，因而认为两者存在某种关系。但是，目前尚无关于该蛋白在癌中表达并对癌诊断有用的报告(非专利文献8J Cell Sci.115：1825－35、非专利文献9Blood.95：1788－96)。

[0083] 序列号42所示的氨基酸序列为在数据库中注册的公知的犬CEP氨基酸序列，是通过BLAST检索作为与上述获得的犬CEP具有极高同源性的蛋白质被发现的(参见实施例C－1)。该公知的犬CEP的碱基序列如序列号41所示。一般认为序列号42的犬CEP与序列号26的犬CEP同样，高度地表达于罹癌犬中，如下述实施例中的具体记载所示，通过研究该公知的犬CEP的表达，可以检测犬的癌。

[0084] 序列号28所示的氨基酸序列为利用BLAST进行同源检索结果发现的、上述源自犬的CEP的人同源因子的氨基酸序列。编码人同源因子的碱基序列及其氨基酸序列分别如序列表的序列号27及28所示。如下述实施例中的具体记载所示，编码人同源因子的mRNA与序列号26的源自犬的CEP同样，显著高地表达于人的睾丸和癌细胞中，在健康人中检测不到针对该人同源因子的抗体。因此通过研究序列号28的CEP在人体中的表达，可以检测人的癌。

[0085] 作为与上述源自犬的CEP或者其人同源因子具有相同抗原性的其他哺乳动物同源因子的具体例，例如可以举出下述实施例中所示的特异性存在于罹癌猫体内的CEP。该猫CEP与使用序列号26或者42的源自犬的CEP作为免疫原制备的抗体进行抗原抗体反应，另外也与使用序列号28的人同源因子作为免疫原制备的抗体进行抗原抗体反应(参见实施例C－5及C－6)。因此，该猫CEP为与上述源自犬的CEP及源自人的CEP具有相同抗原性的猫同源因子，包括在于本发明中作为测定表达的对象的“具有通过抗原抗体反应与针对具有序列号26、28或者42所示的氨基酸序列的CEP的抗体结合的反应性的”CEP的范围内。如下述实施例中的具体记载所示，在猫体内被诱导的针对猫同源因子的抗体，在健康猫中检测不到，仅在罹癌猫中被检测到。另外作为抗原的猫同源因子本身也在健康猫中检测不到，仅在罹癌猫中被检测到。因此，通过测定除犬及人之外的哺乳动物同源因子的表达，也可以检测该哺乳动物的癌。

[0086] 优选在本发明的检测方法中需要测定表达的上述CEP，为具有序列表的序列号26或42所示的氨基酸序列的CEP，或者与该CEP具有80％以上的同源性、在生物体内产生的多肽。与源自犬的CEP和其人同源因子的同源性在碱基序列中为87％，在氨基酸序列中为84％。即使在如犬和人之类的遗传远缘的哺乳动物间，同源因子的氨基酸序列的同源性也非常高为84％，因此认为在除与人之外的哺乳动物之间，源自犬的CEP和其同源因子也具有
80％以上的高同源性。

[0087] 作为上述(d)多肽的TRIP11(thyroid hormone receptor interactor11)最初被鉴定为与甲状腺激素受体β相互作用的因子，但还证明其与高尔基体和微管结合，一般认为与高尔基体和微管等连接，发挥出维持上述细胞小器官的形状的作用。但是，目前尚无关于该蛋白在癌中表达并对癌的诊断等有用的报告(非专利文献10Mol Endocrinol.9：243－54(1995)、非专利文献11J Cell Biol.145：83－98(1999))。

[0088] 序列号45所示的氨基酸序列为犬的TRIP11的氨基酸序列。具有该氨基酸序列的犬TRIP11通过使用了源自犬睾丸的cDNA文库和罹癌犬的血清的SEREX法，被鉴定为与特异性存在于源自罹癌犬的的血清中的抗体结合的多肽(参见实施例D－1)。即，针对具有序列号45所示的氨基酸序列的TRIP11的抗体，在罹癌犬体内被特异性诱导。因此，通过采用上述第
1方法测定针对具有序列号45所示的氨基酸序列的TRIP11的上述抗体，可以检测犬的癌(参见实施例D－3及D－4)。另外，通过采用上述第2方法测定作为抗原的序列号45的TRIP11本身，也可以检测犬的癌(参见实施例D－5及D－6)。另外，如下述实施例中的记载所示，由于编码TRIP11的mRNA显著高地表达于睾丸和癌细胞中(参见实施例D－1)，所以通过测定该mRNA，也可以检测犬的癌。

[0089] 本发明的方法中，不仅以序列号45的犬TRIP11作为测定对象，还以其他哺乳动物的TRIP11(以下有时称作针对犬TRIP11的“同源因子”。另外，简称为“TRIP11”时，不仅包括源自犬的TRIP11，还包括源自其他哺乳动物的TRIP11)作为测定对象。如下述实施例中的具体记载所示，编码人TRIP11的mRNA与序列号45的犬TRIP11同样，显著高地表达于人的睾丸和癌细胞中，在健康人体内检测不到针对该人TRIP11的抗体。另外，针对猫TRIP11的抗体在健康猫体内检测不到，仅在罹癌猫中被检测到。因此，通过测定在除犬之外的哺乳动物中TRIP11的表达，也可以检测该哺乳动物的癌。作为为本发明方法中的测定对象的犬之外的TRIP11，例如可以举出人TRIP11、猫TRIP11等，但不限定于此。需要说明的是，编码人TRIP11的碱基序列及其氨基酸序列分别如序列表的序列号46及47所示，与犬TRIP11的同源性在碱基序列中为88％、在氨基酸序列中为86％。即使在如犬和人之类的遗传远缘的哺乳动物间，各TRIP11的氨基酸序列的同源性也非常高为86％，因此一般认为即使在除人之外的哺乳动物之间，犬TRIP11及其同源因子也具有75％左右以上的高同源性。即，在本发明的方法中测定表达的TRIP11，没有特别限定，优选与序列号45所示的犬TRIP11的氨基酸序列具有75％以上的同源性，较优选具有80％以上的同源性。

[0090] 需要说明的是，在本发明中，所谓“具有氨基酸序列”是指氨基酸残基以所述顺序进行排列。因此，例如所谓“具有序列号2所示的氨基酸序列的多肽”，表示具有序列号2所示的Met Ala Ala Leu··(中略)··I1e Thr Ser Pro氨基酸序列、大小为306个氨基酸残基的多肽。另外，例如有时将“具有序列号2所示的氨基酸序列的多肽”简称为“序列号2的多肽”。“具有碱基序列”的表达方式也同样。另外，在本发明中“多肽”是指多个氨基酸通过形成肽键而形成的分子，不仅包括构成的氨基酸数多的多肽分子，还包括氨基酸数少的低分子量分子(寡肽)，及全长蛋白质，本发明中还包括由序列号2、4、16、18、26、28、42、45或者47所示的氨基酸序列的全长形成的蛋白质。

[0091] 在上述第1方法中，可以在试样中存在的上述癌特异性抗体的测定，可以通过使用了与该抗体进行抗原抗体反应的抗原物质的免疫测定而容易地进行。免疫测定方法本身如下所述为公知的常用方法。作为免疫测定的抗原物质，例如可以使用在罹癌犬体内诱导该抗体的、序列号2、16、26、42或者45的多肽。另外，抗体具有交叉反应性，即使实际为作为免疫原的抗原物质之外的分子，但如果分子上存在与免疫原的表位类似的结构，则该分子也可以通过抗原抗体反应与被诱导的针对免疫原的抗体结合。例如，在氨基酸序列的同源性高的多肽之间，很多情况下表位的结构也类似，在这种情况下两者可以显示出相同的抗原性。如下述实施例中的具体记载所示，序列号2、16、26、42或者45的源自犬的多肽，在罹癌犬体内与被诱导的针对该多肽的抗体进行抗原抗体反应，除此之外，在罹癌猫体内与被诱导的针对猫同源因子的抗体进行抗原抗体反应，另外，人同源因子与罹癌犬体内及罹癌猫体内被诱导的上述抗体进行抗原抗体反应。因此，在本发明的第1方法中作为免疫测定的抗原，还可以使用源自任一种哺乳动物的同源因子。

[0092] 通常，如蛋白质等具有复杂结构的分子量大的抗原物质时，在分子上存在结构不同的多个部位。因此，在生物体内针对这种抗原物质，生产出对多个部位分别识别并结合的多种抗体。即，生物体内针对蛋白质等抗原物质生产的抗体，是作为多种抗体的混合物的多克隆抗体。本申请发明人等发现的、特异性存在于源自罹癌生物体的血清中的、与序列号2、16、26、42或者45的多肽或其同源因子通过抗原抗体反应而特异性结合的癌特异性抗体，另外也可以为多克隆抗体。需要说明的是，本发明中“多克隆抗体”是指在源自体内含有抗原物质的生物体的血清中存在的抗体，是在该生物体内被诱导的针对该抗原物质的抗体。

[0093] 作为用于免疫测定罹癌生物体特异性抗体的抗原，在下述实施例A中，制备由序列号2全长区域形成的多肽、及由作为其人同源因子的序列号4全长区域形成的多肽，确认这些多肽与源自罹癌生物体的血清中上述抗体的反应性。在下述实施例B中，制备由序列号16(犬钙镁蛋白)全长区域形成的多肽、及由作为其人同源因子的序列号18(人钙镁蛋白)全长区域形成的多肽，确认这些多肽与源自罹癌生物体的血清中的上述抗体的反应性。在下述实施例C中，制备由序列号26(犬CEP)中的1514号～2339号氨基酸区域形成的多肽、及由序列号28(人CEP)中的1513号～2325号氨基酸的区域形成的多肽，确认这些多肽与源自罹癌生物体的血清中的上述抗体的反应性。在下述实施例D中，制备由序列号45(犬TRIP11)中的237号～1023号氨基酸的区域形成的多肽、及由序列号47(人TRIP11)中的236号～1023号氨基酸的区域形成的多肽，确认这些多肽与源自罹癌生物体的血清中的上述抗体的反应性。
但是，由于上述抗体为多克隆抗体，所以如果为由序列号2、16、26、42或45或者其同源因子的全长形成的多肽则当然可以结合，另外即使为该多肽的片段，由于上述多克隆抗体中可以含有识别该片段的结构的抗体，所以仍然可以与源自罹癌生物体的血清中含有的上述抗体结合。即，无论是由序列号2、16、26、42或45或者其同源因子的全长形成的多肽，还是其片段，均可以同样地用于测定在罹癌生物体血清中特异性含有的上述多克隆抗体，均对癌的检测有用。

[0094] 因此，本发明的第1方法中作为免疫测定的抗原使用的多肽，并不限定为由序列号2、16、26、42或45或者其同源因子(例如序列号4、18、28、47等)的全长形成的多肽，还包括由序列号2、16、26、42或45或者其同源因子的氨基酸序列中的连续7个以上、优选连续10个以上的氨基酸形成的多肽片段，与针对序列号2、16、26、42或45的源自犬的多肽或者其同源因子的多克隆抗体进行抗原抗体反应的多肽(以下，有时简称为“特异反应性部分多肽”)。需要说明的是，已知在该领域中如果为约7氨基酸残基以上的多肽，则发挥抗原性。

[0095] 但是，氨基酸残基的数量太少时，也与针对试样中存在的其他蛋白质的抗体进行交叉反应的可能性增高，所述其他蛋白质即与序列号2、16、26、42或45的源自犬的多肽及其同源因子不同的蛋白质。因此，从提高免疫测定精度的观点考虑，优选作为抗原使用的多肽片段的氨基酸残基的数量较多。例如，为序列号2或者其同源因子时，优选使多肽片段的氨基酸残基数为30以上、较优选为100以上、更优选为200以上、进一步优选为250以上。为序列号16的犬钙镁蛋白或者其同源因子时，优选为30以上、较优选为100以上、更优选为200以上、进一步优选为400以上、更进一步优选为550以上。为序列号26或42的犬CEP或者其同源因子时，优选为30以上、较优选为100以上、更优选为300以上、进一步优选为600以上，进而也可以为1000以上、1500以上、2000以上。为序列号45的犬TRIP11或者其同源因子时，优选为30以上、较优选为100以上、更优选为300以上、进一步优选为600以上、进而也可以为1000以上、1500以上。

[0096] 作为用作抗原的多肽的优选具体例，可以举出以下多肽。

[0097] (e)具有序列号2或者4所示的氨基酸序列的多肽，

[0098] (f)具有序列号16或者18所示的氨基酸序列的多肽，

[0099] (g)多肽，是由序列号26所示的氨基酸序列中连续500个以上的氨基酸构成的多肽，含有1514号～2339号氨基酸区域内连续500个以上的氨基酸；或者是由序列号28所示的氨基酸序列中连续500个以上的氨基酸构成的多肽，含有1513号～2325号氨基酸区域内连续500个以上的氨基酸，

[0100] (h)多肽，是由序列号45所示的氨基酸序列中连续500个以上的氨基酸构成的多肽，含有237号～1023号氨基酸区域内连续500个以上的氨基酸；或者是由序列号47所示的氨基酸序列中连续500个以上的氨基酸构成的多肽，含有236号～1023号氨基酸区域内连续500个以上的氨基酸。

[0101] 上述(g)多肽(序列号26的多肽或其片段、或者序列号28的多肽或其片段)中，作为较优选的具体例，可以举出含有序列号26所示的氨基酸序列中的1514号～2339号氨基酸区域、由1000个以下的氨基酸形成的片段，及含有序列号28所示的氨基酸序列中的1513号～2325号氨基酸区域、由1000个以下的氨基酸形成的片段。作为特别优选的具体例，可以举出由序列号26中的1514号～2339号氨基酸区域(序列号35)形成的片段、及由序列号28所示的氨基酸序列中的1513号～2325号氨基酸区域(序列号36)形成的片段。

[0102] 上述(h)多肽(序列号45的多肽或其片段、或者序列号47的多肽或其片段)中，作为较优选的具体例，可以举出含有序列号45所示的氨基酸序列中237号～1023号氨基酸区域、由1000个以下的氨基酸形成的片段，及含有序列号47所示的氨基酸序列中236号～1023号氨基酸区域、由1000个以下的氨基酸形成的片段。作为特别优选的具体例，可以举出由序列号45中237号～1023号氨基酸的区域(序列号54)形成的片段，及由序列号47所示的氨基酸序列中236号～1023号氨基酸区域(序列号55)形成的片段。

[0103] 通常情况下即使在蛋白质抗原中该蛋白质的氨基酸序列中少数氨基酸残基被取代、缺失或者插入时，有时也具有与原蛋白质基本相同的抗原性，这对于本领域技术人员来说是众所周知的。因此，与上述多肽相同地，如下所述的多肽(以下，有时简称为“特异反应性修饰多肽”)也可以用于癌的检测，所述多肽具有在序列号2、16、26、42或45或者其同源因子的氨基酸序列中少数氨基酸残基被取代、缺失及/或者插入的序列，该多肽与序列号2、16、26、42或45或者其同源因子的序列具有80％以上、优选90％以上、较优选95％以上、更优选98％以上的同源性，并且通过抗原抗体反应与针对具有序列号2、16、26、42或45所示的氨基酸序列的多肽或者其同源因子的多克隆抗体特异性结合。优选该特异反应性修饰多肽具有在序列号2、16、26、42或45或者其同源因子(优选序列号4、18、28、47)的氨基酸序列中1至数个氨基酸残基被取代、缺失及/或者插入的氨基酸序列。

[0104] 此处，氨基酸序列的“同源性”，是指将两氨基酸序列进行整列使需要比较的2个氨基酸序列的氨基酸残基尽量多地一致、用一致的氨基酸残基数除以总氨基酸残基数得到的以百分率表示的数值。上述整列时根据需要在比较的2个序列的一方或者双方中适宜地插入间隔。上述序列的整列化可以使用例如BLAST、FASTA、CLUSTAL W等公知的程序进行。插入间隔时，上述总氨基酸残基数为将一个间隔作为一个氨基酸残基进行计数而得到的残基数。这样计数得到的总氨基酸残基数在比较的2个序列间不同时，同源性(％)是用一致的氨基酸残基数除以较长序列的总氨基酸残基数而计算得到的。需要说明的是，构成天然蛋白质的20种氨基酸可以根据性质的类似性分成如下几组：具有低极性侧链的中性氨基酸(Gly，Ile，Val，Leu，Ala，Met，Pro)、具有亲水性侧链的中性氨基酸(Asn，Gln，Thr，Ser，Tyr，Cys)、酸性氨基酸(Asp，Glu)、碱基性氨基酸(Arg，Lys，His)、芳香族氨基酸(Phe，Tyr，Trp)，已知在它们之间取代时多数情况下多肽的性质不发生变化。因此，将序列号2、16、26、42或45的多肽或者其同源因子中的氨基酸残基进行取代时，通过在上述各组间进行取代，能够维持与对应抗体的结合性的可能性增高。

[0105] 与上述多肽相同地，如下所述的多肽(以下，有时简称为“特异反应性加成多肽”)也可以用于癌的检测，所述多肽含有本发明使用的上述多肽作为部分序列(即，在本发明中使用的多肽的一端或者两端加成其他(多)肽所得的产物)、并且通过抗原抗体反应与针对序列号2、16、26、42或45的多肽或者其同源因子的多克隆抗体特异性结合。

[0106] 本发明中使用的上述多肽可以采用例如Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁基氧基羰基法)等化学合成法进行合成。另外，还可以利用各种市售的肽合成仪通过常用方法进行合成。另外，可以使用公知的基因工程学方法容易地制备。例如，从表达编码序列号2、16、26、42或45的多肽或者其同源因子的基因的组织中提取RNA，由该RNA通过RT－PCR制备该基因的cDNA，将该cDNA的全长或者所希望的一部分整合到表达载体中，导入宿主细胞，可以得到作为目标的多肽。编码序列号2的犬多肽、序列号16的犬钙镁蛋白、序列号26及42的犬CEP、以及序列号45的犬TRIP11的cDNA碱基序列，分别如序列号1、序列号15、序列号25及
41、以及序列号44所示，编码它们的人同源因子的cDNA碱基序列分别如序列号3、序列号17(人钙镁蛋白)、序列号27(人CEP)、及序列号47(人TRIP11)所示，因此RT－PCR中使用的引物可以参照这些碱基序列容易地进行设计。另外，如下述所述，编码人之外的哺乳动物的同源因子的基因，可以通过参照犬的碱基序列及人同源因子的碱基序列设计得到的引物进行扩增，所以例如编码猫同源因子的cDNA也可以通过与上述相同的方法容易地进行制备。RNA的提取、RT－PCR、cDNA向载体中的整合、载体向宿主细胞的导入，例如可以如下所述采用公知的方法进行。另外，使用的载体及宿主细胞也为众所周知的，各种物质已经被市售。

[0107] 作为上述宿主细胞，只要为可以表达上述多肽的细胞即可，可以为任何细胞，作为原核细胞的例子可以举出大肠杆菌等，作为真核细胞的例子可以举出猴肾细胞COS1、中国仓鼠卵巢细胞CHO等哺乳动物培养细胞、出芽酵母、裂殖酵母、蚕细胞、非洲爪蟾卵细胞等。

[0108] 作为宿主细胞使用原核细胞时，作为表达载体可以使用具有在原核细胞中可以复制的起点、启动子、核糖体结合部位、DNA克隆部位、终止子等的表达载体。作为大肠杆菌用表达载体，可以举出pUC系列、pBluescriptII、pET表达系统、pGEX表达系统等。将编码上述多肽的DNA整合到这种表达载体中，用该载体转化原核宿主细胞后，如果培养所得的转化体，则可以使上述DNA编码的多肽在原核宿主细胞中表达。此时，还可以使该多肽以与其他蛋白质的融合蛋白形式进行表达。需要说明的是，编码上述多肽的DNA例如可以如上所述通过RT－PCR制备cDNA，另外还可以如下所述使用市售的核酸合成仪通过常用方法进行合成。需要说明的是，编码序列号2、4、16、18、26、28、42、45及47的多肽的基因的cDNA碱基序列，分别如序列表的序列号1、3、15、17、25、27、41、44及46所示。

[0109] 作为宿主细胞使用真核细胞时，作为表达载体使用具有启动子、剪接区域、聚(A)附加部位等的真核细胞用表达载体。作为所述表达载体，可以举出pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK－CMV、pBK－RSV、EBV载体、pRS、pcDNA3、pMSG、pYES2等。与上述同样，将编码本发明中使用的多肽的DNA整合到上述表达载体中，用该载体将真核宿主细胞转化后，如果对所得的转化体进行培养，则可以使上述DNA编码的多肽在真核宿主细胞中表达。作为表达载体使用pIND/V5－His、pFLAG－CMV－2、pEGFP－N1、pEGFP－C1等时，能够以附加有His标签、FLAG标签、myc标签、HA标签、GFP等各种标签的融合蛋白形式表达上述多肽。

[0110] 表达载体向宿主细胞的导入，可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法等公知的方法。

[0111] 为了从宿主细胞中分离纯化作为目标的多肽，可以组合进行公知的分离操作。例如可以举出利用尿素等改性剂及表面活性剂的处理、超声波处理、酶消化、盐析及溶剂分步沉淀法、透析、离心分离、超滤、凝胶过滤、SDS－PAGE、等点聚焦电泳、离子交换色谱法、疏水色谱法、亲和层析、反相色谱法等。

[0112] 通过以上方法所得的多肽中，还包括以与其他任意蛋白质的融合蛋白形态存在的多肽。例如可以举出与谷胱甘肽－S－转移酶(GST)或His标签形成的融合蛋白等。上述融合蛋白的形态的多肽也包含在上述特异反应性加成多肽中，可以用于本发明的第1的检测方法。进而，已经在转化细胞中表达的多肽，有时被翻译后在细胞内接受各种修饰。上述翻译后被修饰的多肽只要与针对序列号2或者4的多肽的多克隆抗体具有结合性，则也可以在本发明的第1检测方法中使用。作为上述翻译修饰，可以举出N末端蛋氨酸的脱离、N末端乙酰化、附加糖链、利用细胞内蛋白酶的限制分解、肉豆蔻酰化、异戊二烯化、磷酸化等。

[0113] 试样中抗体的测定可以通过使用上述多肽作为抗原的免疫测定容易地进行。免疫测定本身在该领域中是公知的，若按照反应类型分类则有夹层法、竞争法、凝集法、蛋白质印迹法等。另外，如按照标记进行分类则有放射免疫测定、荧光免疫测定、酶免疫测定、生物素免疫测定等，可以使用任意的方法进行上述抗体的免疫测定。没有特别限定，但由于夹层ELISA及凝集法的操作简便且不需要大型装置等，所以优选用作本发明方法中的上述抗体的免疫测定方法。作为抗体的标记使用酶时，作为酶，只要满足：转换数大、即使与抗体结合也稳定、使底物特异性着色等条件即可，没有特别限定，也可以使用通常的酶免疫测定方法中使用的酶，例如过氧化物酶、β－半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖－6－磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。另外还可以使用酶抑制剂及辅酶等。上述酶与抗体的结合可以通过使用马来酰亚胺化合物等交联剂的公知的方法进行。作为底物，可以根据所使用的酶的种类使用公知的物质。例如作为酶使用过氧化物酶时，可以使用3，3’，5，5’－四甲基联苯胺，另外作为酶使用碱性磷酸酶时可以使用对硝基苯酚等。作为放射性同位素可以使用125I及3H等通常放射免疫测定中使用的物质。作为荧光色素，可以使用异硫氰酸荧光素(FITC)及四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)等通常荧光抗体法中使用的物质。

[0114] 需要说明的是，上述免疫测定方法本身是公知的，在本说明书中没有必要对其进行说明，但若简单地记载则为：例如在夹层法中，将作为抗原使用的上述多肽在固相中进行固定化，使其与血清等试样反应，清洗后使适当的第二抗体进行反应，清洗后测定与固相结合的第二抗体。由于通过将抗原多肽在固相中进行固定化，可以容易地除去未结合的第二抗体，所以优选本发明的癌的检测方法的方案。作为第二抗体，例如如果试样为源自犬的抗体则可以使用抗犬IgG抗体。通过用上述示例的标记物质标记第二抗体，可以测定结合于固相的第二抗体。这样测定得到的第二抗体量相当于血清试样中的上述抗体量。作为标记物质使用酶时，加入在酶作用下分解并显色的底物，通过光学方法测定底物的分解量，由此可以测定抗体量。作为标记物质使用放射性同位素时，可以通过闪烁计数器(Scintillation Counter)等测定放射性同位素发出的放射线量。

[0115] 本发明的第2方法，能够测定包含在从生物体得到的试样中的、序列号2的多肽或其同源因子、钙镁蛋白、序列号26或42的CEP或其同源因子、及TRIP11中的至少任一种。如上所述，在癌患者体内，与序列号2的多肽或其同源因子、犬及人等的钙镁蛋白、序列号26或42的CEP或其同源因子、或者犬及人等TRIP11进行抗原抗体反应的癌特异性抗体的量明显较多，这表示在癌患者体内该癌特异性抗体的抗原、即上述多肽或者其同源因子的产生量明显较多。通过测定该抗原本身也可以检测癌，如下述实施例中的具体记载所示。因此，通过测定序列号2的多肽或其同源因子、钙镁蛋白、序列号26或42的CEP或其同源因子、或者TRIP11本身，也可以与上述第1方法同样地检测生物体内的癌。

[0116] 试样中的多肽的测定可以通过公知的免疫测定方法容易地进行。具体而言，例如制备与序列号2、16、26、42或45的多肽或者其同源因子进行抗原抗体反应的抗体或者其抗原结合性片段，使用其进行免疫测定，由此可以测定能够存在于试样中的序列号2、16、26、42或45的多肽或者其同源因子。如上所述，由于抗体具有交叉反应性，所以例如使用与序列号2、16、26、42或45的源自犬的多肽进行抗原抗体反应的抗体或者其抗原结合性片段，不仅可以测定序列号2、16、26、42或45的源自犬的多肽，还可以测定其他哺乳动物同源因子、例如序列号4、18、28或47的人同源因子、及猫同源因子等。免疫测定方法本身为上述公知的常用方法。

[0117] 此处，所谓“抗原结合性片段”表示抗体分子中含有的Fab片段及F(ab’)2片段之类、与抗原具有结合能力的抗体片段。抗体可以为多克隆抗体也可以为单克隆，为了进行免疫测定等优选为重现性高的单克隆抗体。以多肽作为免疫原的多克隆抗体及单克隆抗体的制备方法是公知的，可以通过常用方法容易地进行。例如，以匙孔血蓝蛋白(KLH)及酪蛋白等载体蛋白上结合有多肽的物质作为免疫原，与佐剂一同对动物进行免疫，由此可以诱发针对该多肽的抗体。将从免疫后的动物中采集的脾细胞及淋巴细胞之类抗体产生细胞与骨髓瘤细胞细胞进行融合来制备杂交瘤，选择出产生抗体的杂交瘤，所述抗体是与序列号2、16、26、42或45的蛋白质或者其同源因子结合的抗体，使该杂交瘤增殖，可以从培养上清液中得到以上述蛋白质作为对应抗原的单克隆抗体。需要说明的是，上述方法为公知的常用方法。

[0118] 本发明的第3方法可以测定mRNA，所述mRNA编码能包含在从生物体得到的试样中的、序列号2的多肽或其同源因子、钙镁蛋白、序列号26或42的CEP或其同源因子及TRIP11中的任一种。如下述实施例中的具体记载所式，编码序列号2的源自犬的多肽或序列号4的其人同源因子的mRNA；编码序列号16的犬钙镁蛋白或序列号18的人钙镁蛋白的mRNA；编码序列号26或42的犬CEP或者序列号28的其人同源因子的mRNA；及编码序列号45的犬TRIP11或者序列号47的人TRIP11的mRNA在癌细胞中显著高地表达。因此，通过测定试样中的该mRNA也可以检测生物体内的癌。

[0119] 试样中的mRNA例如可以通过将该mRNA作为模板的实时RT－PCR检测之类常用方法进行定量，通过作为常用方法的RNA印迹中的染色强度等也可以大概地进行定量。由于编码序列号2、4、16、18、26、28、42、45及47的多肽的cDNA的序列分别如序列号1、3、15、17、25、27、41、44及46所示，所以以所述序列作为基础，制备与序列号1、3、15、17、25、27、41、44或者46所示的碱基序列中的部分区域进行特异性杂交的多核苷酸(以下称作“癌检测用多核苷酸”)，使用该多核苷酸作为探针及核酸扩增法中的引物，能够测定该mRNA在试样中的存在量。如下所述，如果为与序列号1或者3所示的碱基序列中的部分区域特异性杂交的多核苷酸，则也可以测定编码除犬及人之外的哺乳动物中的同源因子的mRNA。同样，如果为与序列号15或者17所示的碱基序列中的部分区域特异性杂交的多核苷酸，则也可以测定编码除犬及人之外的哺乳动物中的钙镁蛋白的mRNA。如果为与序列号25、27或者41所示的碱基序列中的部分区域特异性杂交的多核苷酸，则也可以测定编码除犬及人之外的哺乳动物中的同源因子的mRNA。如果为与序列号44或者46所示的碱基序列中的部分区域特异性杂交的多核苷酸，则也可以测定编码除犬及人之外的哺乳动物中的TRIP11的mRNA。需要说明的是，本发明中多核苷酸可以为RNA也可以为DNA。

[0120] 此处，所谓“特异性杂交”表示在通常杂交的条件下，仅与作为对象的部分区域杂交，而与其他区域实质上不杂交。

[0121] 所谓“在通常杂交的条件下”，是指通常PCR在通过退火或探针进行检测中使用的条件下，例如在利用了Taq聚合酶的PCR时，是指使用50mM KCl、10mM Tris－HCl(pH8.3～9.0)、1.5mM MgCl2等通常的缓冲液，在54℃～60℃左右适当的退火温度下进行反应；另外例如在Northern杂交时，是指使用5×SSPE、50％甲酰胺、5×Denhardt’s solution、0.1～
0.5％SDS等通常的杂交溶液，在42℃～65℃左右适当的杂交温度下进行反应。但是，适当的退火温度或者杂交温度不限定于上述示例，可以基于作为引物或者探针使用的癌检测用多核苷酸的Tm值及实验者的经验确定，只要为本领域技术人员，即可容易地确定。

[0122] 所谓“实质上不杂交”是指完全不杂交，或者即使杂交也远远小于与作为对象的部分区域杂交的量，只杂交有微量，为相对而言可以忽视程度。作为在上述条件下特异性杂交的多核苷酸，可以举出与对象的部分区域的碱基序列具有一定以上的同源性的多核苷酸，例如可以举出具有70％以上、优选80％以上、较优选90％以上、更优选93％以上、更优选95％以上、进一步更优选98％以上的同源性的多核苷酸。最优选该多核苷酸与对象的部分区域的碱基序列具有相同的碱基序列。同源性的定义与上述氨基酸序列的同源性相同。需要说明的是，癌检测用多核苷酸的末端即使含有与对象不杂交的区域，为探针时如果杂交的区域占探针总体的约一半以上则也可以用于检测，另外为引物时如果杂交的区域占引物总体的约一半以上且处于3’末端侧，则由于可以正常进行退火并产生延伸反应，所以也可以用于检测。如上所述，在癌检测用多核苷酸的末端包含不杂交的区域的情况下，计算与对象的碱基序列的同源性时，不考虑不杂交的区域，仅着眼于杂交的区域进行计算。

[0123] 需要说明的是，本发明中所谓“部分区域”是指序列号1、3、15、17、25、27、41、44或者46所示的碱基序列中的一部分区域，优选为连续18个碱基以上的区域。需要说明的是，本发明中提到“序列号1所示的碱基序列”时，除序列号1实际表示的碱基序列之外还包含与其互补的序列。因此，例如在提到“具有序列号1所示的碱基序列的多核苷酸”时，包含具有序列号1实际表示的碱基序列的单链多核苷酸、具有其互补的碱基序列的单链多核苷酸、及由它们形成的双链多核苷酸。制备本发明使用的多核苷酸时、及制备编码本发明使用的多肽的多核苷酸时，可以选择适当的任一种碱基序列，只要为本领域技术人员则可以容易地进行选择。

[0124] 癌检测用多核苷酸的碱基数从确保特异性的观点考虑，优选为18个碱基以上。在作为探针使用时，大小优选为18个碱基以上、较优选为20个碱基以上，优选为编码区域的全长以下；作为引物使用时，大小优选为18个碱基以上，优选为50个碱基以下。作为癌检测用多核苷酸的优选例，可以举出由序列号1、3、15、17、25、27、41、44或者46所示的碱基序列中连续18个碱基以上形成的多核苷酸。

[0125] 参照本说明书本领域技术人员可以明确，测定编码序列号2、16、26或者45的犬多肽的mRNA量时，可以使用分别与序列号1、15、25或者44中的部分区域特异性杂交的多核苷酸，另外测定编码序列号4、18、28或者47的人同源因子的mRNA量时，可以分别使用与序列号3、17、27或者46中的部分区域特异性杂交的多核苷酸。但是，同源因子之间通常在碱基序列水平上同源性高，序列号1和3为93％、序列号15和17为90％、序列号25和27为87％、序列号
44和46为88％，同源性均非常高。因此，与序列号1、15、25或者44中的部分区域特异性杂交的多核苷酸可以分别与对应于该部分区域的序列号3、17、27或者46中的部分区域特异性杂交。实际上如下述实施例中的记载所示，例如如果使用具有序列号7及8分别表示的碱基序列的一对引物单元，则由于与序列号1中的部分区域和序列号3中的部分区域均特异性杂交，所以编码序列号2的源自犬的多肽的mRNA、及编码作为其人同源因子的序列号4的多肽的mRNA均可以测定(实施例A)。如果使用具有序列号19及20的碱基序列的一对引物单元，则由于与序列号15中的部分区域和序列号17中的部分区域均特异性杂交，所以编码序列号16的犬钙镁蛋白的mRNA、及编码作为其人同源因子的序列号18的人钙镁蛋白的mRNA均可以测定(实施例B)。如果为具有序列号29及30的碱基序列的一对引物单元，则由于与序列号25中的部分区域和序列号27中的部分区域特异性杂交，另外与序列号41中的部分区域也特异性杂交，所以编码序列号26或者42的犬CEP的mRNA和编码其作为人同源因子的序列号28的人CEP的mRNA均可以测定(实施例C)。如果为具有序列号48及49的碱基序列的一对引物单元，则由于与序列号44中的部分区域和序列号46中的部分区域特异性杂交，所以编码序列号45的犬TRIP11的mRNA及编码作为其人同源因子的序列号47的人TRIP11的mRNA均可以测定(实施例D)。因此，例如使用与序列号1；15；25；或者44的犬的碱基序列中的部分区域特异性杂交的多核苷酸，不仅可以测定编码序列号2；16；26及42；或者45的犬多肽的mRNA，也可以分别测定编码它们的人同源因子即序列号4；18；28；或者47的多肽的mRNA，同样地还可以测定编码猫等其他哺乳动物的同源因子的mRNA。

[0126] 设计癌检测用多核苷酸时，较优选选择序列号1和3之间、序列号15和17之间、序列号25和27之间或者序列号44和46之间同源性特别高的(优选碱基序列相同)部分区域。如果是在犬和人之间同源性特别高的部分区域，则可以预测在其他动物种的同源基因中也存在与该区域的同源性非常高的区域，所以如果如上所述选择部分区域，则还可以提高测定mRNA的精度，所述mRNA是编码除犬及人之外的动物种的同源因子的mRNA。

[0127] 使用与受试核酸的部分区域特异性杂交的多核苷酸作为PCR之类核酸扩增法的引物或者探针来测定受试核酸的方法，其本身是公知的，例如除下述实施例中具体说明的RT－PCR之外，还可以举出RNA印迹、原位杂交等。本发明中测定mRNA量时可以采用所述公知的测定方法中的任一种。

[0128] PCR之类核酸扩增法本身在本领域是公知的，其中使用的试剂盒及装置也有市售，因此可以容易地进行。即，例如可以如下进行：将作为模板的受试核酸(例如编码下述蛋白质的基因的cDNA，所述蛋白质具有序列号2、4、16、18、26、28、45或者47所示的氨基酸序列)和一对癌检测用多核苷酸(引物)在公知的缓冲液中在Taq聚合酶及dNTP存在下，通过改变反应液的温度进行变性、退火、延伸各工序。通常，变性工序在90～95℃下进行，退火工序在模板和引物的Tm或者其附近(优选在±4℃以内)进行，延伸工序在Taq聚合酶最适温度即72℃下进行。各工序可以在30秒～2分钟左右内适当选择。例如将该热循环反复25～40次左右，由此将用一对引物夹持的模板核酸的区域扩增。需要说明的是，核酸扩增法不限定于PCR，还可以使用本领域公知的其他核酸扩增法。如上所述，使用一对癌检测用多核苷酸作为引物、使用受试核酸作为模板进行核酸扩增法时，受试核酸被扩增，但相对于此，试样中不含受试核酸时不引起扩增，因此通过检测扩增产物可以得知试样中是否存在受试核酸。扩增产物的检测可以如下进行，将扩增后的反应溶液进行电泳，将条带用溴化乙锭等染色的方法，及将电泳后的扩增产物在尼龙膜等固相中进行固定化，使其与和受试核酸特异性杂交的标记探针进行杂交，清洗后检测该标记。另外，通过进行使用了猝灭荧光色素(quencher fluorochrome)和报告荧光色素(reporter fluorochrome)的所谓实时PCR检测，也可以定量被测体中受试核酸的量。需要说明的是，实时PCR检测用试剂盒也有市售，所以可以容易地进行。进而，还可以基于电泳条带的强度对受试核酸进行半定量。需要说明的是，受试核酸可以为mRNA，也可以为由mRNA逆转录的cDNA。作为受试核酸将mRNA扩增时，也可以采用使用了上述一对引物的NASBA法(3SR法、TMA法)。NASBA法本身是公知的，其中使用的试剂盒也有市售，所以可以使用上述一对引物容易地进行。

[0129] 作为探针，可以使用在癌检测用多核苷酸中附有荧光标记、放射标记、生物素标记等标记的标记探针。多核苷酸的标记方法本身是公知的。将受试核酸或者其扩增物进行固相化，与标记探针进行杂交，清洗后测定与固相结合的标记，由此可以研究试样中是否存在受试核酸。或者还可以将癌检测用多核苷酸进行固相化，使受试核酸杂交，用标记探针等检测结合于固相上的受试核酸。此时，结合于固相上的癌检测用多核苷酸也称为探针。需要说明的是，使用了多核苷酸探针的受试核酸的测定方法在本领域也是公知的，可以通过如下方法进行：在缓冲液中使多核苷酸探针与受试核酸在Tm或者其附近(优选在±4℃以内)接触由此使其杂交，清洗后测定与杂交的标记探针或者固相探针结合的模板核酸。所述方法中包括例如RNA印迹、原位杂交、DNA印迹法等公知方法。本发明中还可以适用公知的任一种方法。

[0130] 本发明的检测方法基于如上所述测定的多肽的表达量，判断对象生物体是否是癌等。癌的检测可以仅测定对象生物体中多肽的表达，但从提高检测精度的观点考虑，优选如下方案：调查1至多位健康者试样中多肽的表达量(抗体量、多肽量或者mRNA量)，取得健康者基准值，将对象生物体的测定值与该健康者基准值进行比较。在期望进一步提高检测精度的情况下，也可以从已知患癌的多位患者体内取得试样，研究这些试样中多肽表达量，获得癌患者基准值，将对象生物体的测定值与健康者基准值及癌患者基准值两者进行比较。上述基准值例如可以通过将各试样中的多肽表达量数值化、计算其平均值来确定。需要说明的是，可以预先对多位健康者及癌患者研究多肽表达量，来确定健康者基准值与癌患者基准值。因此，本发明的方法中进行与基准值的比较时还可以使用预先确定的基准值。

[0131] 上述4种多肽中如果以两种以上的多肽的表达量作为指标，则根据任一种多肽的表达量检测出癌时，可以判断对象生物体患癌(参见下述实施例E)。

[0132] 本发明的检测方法可以组合使用利用其他癌抗原及癌标记物的诊断。由此，可以进一步提高癌的检测精度。例如，本发明的方法中测定上述癌特异性抗体时，可以与上述多肽相同地组合使用癌组织中较多表达的其他多肽作为抗原。另外，也可以将本发明的方法和利用已知的癌标记物进行的诊断组合进行。

[0133] 根据本发明的检测方法，可以检测出生物体内的癌。特别是，如下述实施例的记载所示，由于根据本发明的方法可以检测小到肉眼看不见的大小的肿瘤及体内深部的肿瘤，所以对癌的早期发现有用。另外，如果对癌治疗后处于追踪观察中的患者使用本发明的检测方法，则在癌复发时可以早期检测出该癌。

[0134] 另外，罹癌生物体中，如果表达作为本发明测定对象的上述规定的多肽的癌细胞数增加，则相应地该生物体内的该多肽及其mRNA的蓄积量增大，血清中产生较多针对上述多肽的抗体。另一方面，如果癌细胞数减少，则相应地生物体内的该多肽及其mRNA的蓄积量减少，血清中的针对上述多肽的抗体减少。因此，上述规定的多肽的表达量较多时，可以判断肿瘤增大及癌转移、即癌的进展程度有所进展。实际上如下述实施例中的具体记载所示，伴随着肿瘤增大及转移等癌的发展，可以观察到罹癌生物体血清中上述抗体量上升。如上所述，根据本发明的方法还可以检测出癌的进展程度。

[0135] 另外，如下述实施例所述，在相同种类的肿瘤中恶性型肿瘤中的上述抗体量显著高于良性型肿瘤中的上述抗体量。因此，上述规定的多肽的表达量较多时，可以判断癌的恶性程度较高。即，根据本发明的方法还可以检测出癌的恶性程度。

[0136] 进而，将上述规定的多肽的表达量的增减作为指标，还可以监控癌的治疗效果。如下述实施例中的记载所示，手术摘除肿瘤后为了防止复发而给与了抗癌剂的个体，其多肽表达量低于罹癌状态。为良性肿瘤时也同样，在切除前确认到多肽的表达时，如果能够完全切除肿瘤则表达量降低。因此，通过观察癌治疗中及治疗后的个体的上述多肽的表达量，可以获得尽早得知抗癌剂的治疗效果、及肿瘤摘除后有无残留肿瘤、以及追踪观察中转移·复发的线索。可以进行适合的治疗时，多肽的表达量低于治疗前罹癌状态，因此可以判断对该生物体进行的(正在进行的)治疗的效果良好。多肽表达量上升或者维持原状时，或者呈现暂时降低后又上升时，可以判断治疗效果不充分，成为对治疗方法的选择有用的判断材料，即判断是否需要变为其他治疗方法及改变抗癌剂给药量等。

[0137] 作为为本发明癌检测方法的对象的癌，为表达序列号2的多肽或其同源因子、钙镁蛋白、序列号26或42的CEP或其同源因子及TRIP11中至少一种的癌，可以举出脑肿瘤、头、颈部、肺、子宫、或食道的鳞状上皮癌、黑色素瘤、肺或子宫的腺癌、肾癌、恶性混合肿瘤、肝细胞癌、基底细胞癌、棘细胞瘤样龈瘤(acanthomatous epulis)、口腔内肿瘤、肛门周围腺癌、肛门囊肿、肛门囊顶泌腺癌、塞尔托利细胞瘤(Sertoli cell tumor)、阴道前庭癌、皮脂腺癌、皮脂腺上皮瘤、脂腺腺瘤、汗腺癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、甲状腺癌、大肠癌、支气管腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、复合型乳腺癌、乳腺恶性混合肿瘤、乳管内乳头状腺癌、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、软组织肉瘤、组织细胞肉瘤、粘液肉瘤、未分化肉瘤、肺癌、肥大细胞瘤、皮肤平滑肌瘤、腹腔内平滑肌瘤、平滑肌瘤、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、消化管型淋巴瘤、消化器型淋巴瘤、小～中细胞型淋巴瘤、肾上腺髓质肿瘤、粒层细胞瘤(granulosa cell tomor)、嗜铬细胞瘤、膀胱癌(移行细胞癌)、化脓性炎症、腹腔内肝脏肿瘤、肝癌、浆细胞瘤、恶性血管外膜细胞瘤、血管肉瘤、肛门囊腺癌、口腔癌、转移性恶性黑色素瘤、无黑色素性恶性黑色素瘤、皮肤恶性黑色素瘤、恶性肌上皮瘤、恶性睾丸上皮瘤、精原细胞瘤(seminoma)、大肠腺癌、胃腺癌、低度皮脂腺癌、耳垢腺癌、顶泌腺癌(Apocrine carcinoma)、低分化型顶泌腺癌、恶性纤维性组织细胞瘤、多发性骨髓瘤、间叶组织恶性肿瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、起因不明的肉瘤、软组织肉瘤(纺锤形细胞肿瘤)、低分化肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、转移性恶性上皮肿瘤、管状乳腺腺癌、乳腺导管癌、炎性乳癌、生殖细胞瘤、白血病、浸润性毛发上皮瘤、中细胞型淋巴瘤、多中心型淋巴瘤、骨肉瘤(乳腺)、肥大细胞瘤(PatnaikII型)、肥大细胞瘤(GradeII)、平滑筋肉瘤等，但不限定于此。另外，作为本发明方法的对象的生物体为哺乳动物，优选为人及犬、猫。

[0138] 作为用于本发明的方法的试样，可以举出血液、血清、血浆、腹水、胸水等体液、组织、细胞。特别是在上述第1方法及第2方法中，可以优选使用血清、血浆、腹水及胸水，另外在测定mRNA的上述第3方法中优选组织试样及细胞试样。

[0139] 第1方法中作为免疫测定的抗原使用的上述多肽(即，序列号2、序列号16、序列号26或42、或者序列号45的源自犬的多肽及其同源因子、特异反应性部分多肽、特异反应性修饰多肽、以及特异反应性加成多肽)可以作为癌检测试剂提供。该试剂可以仅由上述多肽形成，另外也可以含有对该多肽的稳定化等有用的各种添加剂等。另外，该试剂还可以以在板及膜等固相中固定化的状态提供。

[0140] 第2方法中对序列号2、序列号16、序列号26或42、或序列号45的犬多肽或者其同源因子进行免疫测定时使用的、与该犬多肽或者其同源因子进行抗原抗体反应的抗体或者其抗原结合性片段也可以作为癌检测试剂提供。此时的癌检测试剂可以仅由上述抗体或者抗原结合性片段形成，另外也可以含有对该抗体或者抗原结合性片段的稳定化等有用的各种添加剂等。另外，该抗体或者抗原结合性片段也可以为结合有锰及铁等金属的物质。将这种金属结合抗体或者抗原结合性片段给与体内时，由于在抗原蛋白质较多存在的部位中该抗体或者抗原结合性片段较多地积聚，所以如果通过MRI等测定金属，则可以检测出产生抗原蛋白质的癌细胞的存在。

[0141] 进而，第3方法中用于mRNA测定的上述癌检测用多核苷酸也可以作为癌检测试剂提供。此时癌检测用试剂可以仅由该多核苷酸形成，另外也可以含有对该多核苷酸的稳定化等有用的各种添加剂等。该试剂中含有的该癌检测用多核苷酸优选为引物或者探针。癌检测用多核苷酸的条件及优选例如上所述。

[0142] 实施例

[0143] 以下，根据实施例更加具体地说明本发明。

[0144] 实施例A－1：通过SEREX法制取新型癌抗原蛋白

[0145] (1)构建cDNA文库

[0146] 使用酸－胍－苯酚－氯仿法(Acid guanidium－Phenol－Chloroform法)从健康犬的睾丸组织中提取全RNA，使用Oligotex－dT30mRNA purification Kit(宝酒造公司制)按照试剂盒所附的操作说明书纯化polyA RNA。

[0147] 使用该得到的mRNA(5μg)构建犬睾丸cDNA噬菌体文库。构建cDNA噬菌体文库时使用cDNA Synthesis Kit，ZAP－cDNA Synthesis Kit，ZAP－cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE公司制)按照试剂盒所附的操作说明书构建文库。构建的cDNA噬菌体文库大小为1.3×106pfu/ml。

[0148] (2)利用血清筛选cDNA文库

[0149] 使用上述已构建的源自犬睾丸的cDNA噬菌体文库进行免疫筛选。具体而言，在Φ90×15mm的NZY琼脂糖平板上感染宿主大肠杆菌(XL1－Blue MRF’)使其为2340克隆，在42℃下培养3～4小时，形成溶菌斑(plaque)，在37℃下用浸透了IPTG(异丙基－β－D－硫代半乳糖苷)的硝酸纤维素滤膜(Cellulose Nitrate Membranes)(Hybond C Extra：GE Healthecare Bio－Science公司制)覆盖培养板4小时，从而诱导·表达蛋白质，并使蛋白质转印到膜上。之后回收该膜，将其浸渍在含有0.5％脱脂奶粉的TBS(10mM Tris－HCl，
150mM NaCl pH7.5)中，在4℃下振荡一夜，由此抑制非特异性反应。在室温下使此过滤膜与稀释500倍的患病犬血清反应2～3小时。

[0150] 作为上述患病犬血清，使用从患有鳞状上皮癌的患病犬体内采集的血清。将这些血清保存在－80℃下，在即将使用前进行预处理。血清预处理的方法按照以下方法进行。即，用未插入外来基因的λZAP Express噬菌体感染宿主大肠杆菌(XL1－Blue MRF’)后，在NZY培养板的培养基中于37℃下培养一夜。然后向培养板中添加含有0.5M NaCl的0.2M NaHCO3pH8.3的缓冲液，在4℃下静置15小时后，回收上清液作为大肠杆菌/噬菌体提取液。
然后将回收的大肠杆菌/噬菌体提取液通入NHS－柱(GE Healthecare Bio－Science公司制)，将源自大肠杆菌·噬菌体的蛋白质固定化。在此蛋白固定化的柱中使患病犬血清通入·反应，从血清中除去吸附在大肠杆菌和噬菌体上的抗体。将只是仅仅通过柱子的血清馏分用含有0.5％脱脂奶粉的TBS稀释500倍，将其作为免疫筛选材料。

[0151] 将经上述处理血清和上述融合蛋白印迹的膜用TBS－T(0.05％Tween20/TBS)清洗4次后，将用含有0.5％脱脂奶粉的TBS稀释5000倍的山羊抗犬IgG(Goat anti Dog IgG－h+I HRP conjugated：BETHYL Laboratories公司制)作为第二抗体在室温下反应1小时，使用NBT/BCIP反应液(Roche公司制)通过酶显色反应检测，从Φ90×15mm的NZY琼脂糖平板上采集与显色反应阳性部位相一致的菌落，使其溶解于500μl SM缓冲液(100mM NaCl、10mM MgClSO4、50mM Tris－HCl、0.01％明胶pH7.5)中。采用与上述相同的方法将显色反应呈阳性的菌落反复筛选二次、三次，直至菌落单一化，筛选出与血清中IgG反应的30940个噬菌体克隆，分离出一个阳性克隆。

[0152] (3)分离抗原基因的同源性检索

[0153] 为了将通过上述方法分离所得的一个阳性克隆用于碱基序列解析，进行操作将噬菌体载体转换为质粒载体。具体而言，将宿主大肠杆菌(XL1－Blue MRF’)制成吸光度OD600为1.0的溶液，将上述溶液200μl和100μl经纯化的噬菌体溶液以及1μl ExAssist helper phage(STRATAGENE公司制)混合后，在37℃下反应15分钟，然后添加3ml LB培养基并在37℃下培养2.5～3小时，立即置于70℃水浴中保持温度20分钟，之后在4℃下以1000×g离心15分钟，回收上清液作为噬菌粒溶液。然后将噬菌粒宿主大肠杆菌(SOLR)制成吸光度OD600为1.0的溶液，将200μl上述溶液和10μl经纯化的噬菌体溶液混合后，在37℃下反应15分钟，取
50μl接种于含有氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的LB琼脂培养基中，在37℃下培养一夜。采集经转化的SOLR单菌落，用含有氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的LB培养基在37℃下培养后，使用QIAGEN plasmid Miniprep Kit(Qiagen公司制)纯化含有目标插入片段的质粒DNA。

[0154] 经纯化的质粒使用序列号5所示的T3引物和序列号6所示的T7引物，通过引物步测法来解析插入片段的全长序列。通过该序列解析获得序列号1所示的基因序列。通过该序列解析获得了序列号1所示的基因序列。使用该基因的碱基序列及氨基酸序列，运行同源性检索程序BLAST搜索(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，进行与已知基因同源性的检索，结果表明所得的基因是编码未知功能蛋白质(Accession No.XP_535343)的基因(Accession No.XM_535343)。另外，该基因的人同源因子也为编码未知功能蛋白质(Accession No.NP_689873)的基因(Accession No.NM_152660)(同源性：碱基序列93％、氨基酸序列99％)。人同源因子的碱基序列如序列号3所示，氨基酸序列如序列号4所示。

[0155] (4)在各种组织中的表达解析

[0156] 对于通过上述方法所得的基因，通过RT－PCR(Reverse Transcription－PCR)法研究其在犬及人的正常组织及各种细胞株中的表达。逆转录反应如下进行。即，使用TRIZOL试剂(invitrogen公司制)按照所附的操作说明书从50－100mg各种组织及各种细胞株5－10×106个细胞中提取全RNA。通过Superscript First－Strand Synthesis System for RT－PCR(invitrogen公司制)按照所附的操作说明书，用上述全RNA合成cDNA。人正常组织(脑、海马、睾丸、结肠、胎盘)的cDNA，使用Gene Pool cDNA(invitrogen公司制)、QUICK－Clone cDNA(Clontech公司制)及Large－Insert cDNA Library(Clontech公司制)。PCR反应使用对获得的犬基因及其人同源基因具有特异性的引物(如序列号7及8所示)按照下列方法进行。即，加入各试剂和附加缓冲液使总量为25μl，其中使通过逆转录反应配制的样品为0.25μl，上述引物各为2μM，各dNTP为0.2mM，ExTaq聚合酶(宝酒造公司制)为0.65U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制)，以94℃－30秒、55℃－30秒、72℃－1分钟为一个循环，将该循环重复进行30次。需要说明的是，对具有上述序列号7及8所示碱基序列的基因具有特异性的引物是扩增下述区域的引物，所述区域是序列号1所示碱基序列中87号～606号及序列号3所示碱基序列中173号～695号碱基所在的区域，使用该引物也可以研究犬基因及其人同源基因中任一种的表达。为了比较对照，同时也使用了GAPDH特异性的引物(如序列号9及10所示)。其结果如图1所示，获得的犬基因在健康犬组织中显著表达于睾丸，另一方面发现该基因在犬乳癌细胞株中显著表达。人同源基因的表达也与犬基因相同，在人正常组织中能够确认其表达的部位仅限于睾丸，但在人癌细胞中则于脑肿瘤、白血病、乳癌、肺癌中均检测出其表达，因此可以确认人同源基因也特异性地表达于睾丸和癌细胞中。

[0157] 需要说明的是，在图1中纵轴上标号1表示上述鉴定的基因表达谱，标号2表示作为比较对照的GAPDH基因表达谱。

[0158] 实施例A－2：新型癌抗原蛋白的制备

[0159] (1)重组蛋白质的制备

[0160] 基于实施例A－1中所得的序列号1的基因，通过以下方法制备重组蛋白质。PCR如下进行：加入各试剂和附加缓冲液使总量为50μl，其中，使由实施例A－1中所得的噬菌粒溶液配制的供序列解析的载体为1μl，使含有NdeI及XhoI限制性酶切断序列的两种引物(如序列号11及12所示)各为0.4μM、dNTP为0.2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造公司制)为1.25U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制)，以98℃－10秒、55℃－15秒、72℃－1分钟为一个循环，将该循环重复进行30次。需要说明的是，由上述两种引物可以得到编码序列号2的氨基酸序列全长的区域。PCR之后，用1％琼脂糖凝胶对经扩增的DNA进行电泳，用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制)纯化约930bp的DNA片段。

[0161] 将经纯化的DNA片段与克隆载体pCR－Blunt(invitrogen公司制)连接。将其转化至大肠杆菌中后回收质粒，通过测序确认了经扩增的基因片段与靶序列一致。用NdeI及XhoI限制性酶处理与靶序列一致的质粒，用QIAquick Gel Extraction Kit纯化后，将靶基因序列插入到经NdeI、XhoI限制性酶处理的大肠杆菌用表达载体pET16b(Novagen公司制)中。通过使用该载体可产生His标签融合型重组蛋白质。将该质粒转化至表达用大肠杆菌BL21(DE3)，通过进行利用1mM IPTG的表达诱导，能够使靶蛋白在大肠杆菌内表达。

[0162] 另外，基于序列号3的基因，使用以下方法制备人同源基因的重组蛋白质。PCR如下进行：加入各试剂和附加缓冲液使总量为50μl，其中，使实施例A－1制备的各种组织·细胞cDNA中已确认通过RT－PCR法表达的cDNA为1μl，使含有EcoRV及EcoRI限制性酶切断序列的两种引物(如序列号13及14所示)各为0.4μM、dNTP为0.2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造公司制)为1.25U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制)，以98℃－10秒、55℃－15秒、72℃－1分钟为一个循环，将该循环重复进行30次。需要说明的是，从上述两种引物可以得到编码序列号4的氨基酸序列全长的区域。PCR之后，用1％琼脂糖凝胶对经扩增的DNA进行电泳，用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制)纯化约930bp的DNA片段。

[0163] 将经纯化的DNA片段与克隆载体pCR－Blunt(invitrogen公司制)连接。将其转化至大肠杆菌中后回收质粒，通过测序确认了经扩增的基因片段与靶序列一致。用EcoRV及EcoRI限制性酶处理与靶序列一致的质粒，用QIAquick Gel Extraction Kit纯化后，将靶基因序列插入到经EcoRV、EcoRI限制性酶处理的大肠杆菌用表达载体pET30a(Novagen公司制)中。通过使用该载体可产生His标签融合型重组蛋白质。将该质粒转化至表达用大肠杆菌BL21(DE3)，通过利用1mM IPTG的表达诱导，能够使靶蛋白在大肠杆菌内表达。

[0164] (2)重组蛋白质的纯化

[0165] 将上述得到的、表达序列号1及序列号3的各个重组大肠杆菌在含有氨苄青霉素(终浓度100μg/m1)的LB培养基中在37℃下进行培养直至600nm处的吸光度为0.7左右，然后添加IPTG至终浓度为1mM，进一步在37℃下培养4小时。之后以4800rpm离心10分钟进行集菌。将此菌体球状物悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中，进而以4800rpm离心10分钟，清洗菌体。

[0166] 将上述菌体悬浮于50mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)中，在冰上进行超声裂解。将大肠杆菌超声裂解液以6000rpm离心分离20分钟，所得上清液为可溶性馏分，沉淀为不溶性馏分。

[0167] 将不溶性馏分悬浮于50mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)中，以6000rpm离心15分钟。重复该操作2次，除去蛋白酶。

[0168] 将该残渣悬浮于含有6M胍盐酸盐(Sigma－Aldrich Japan公司制)、0.15M氯化钠的50mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)中，在4℃下静置15小时使蛋白质变性。该变性操作后，以6000rpm离心30分钟，将所得可溶性馏分添加到按照通用方法制得的镍螯合柱(载体Chelateing Sepharose(商标)Fast Flow(GE Health Care公司制)，柱容量5mL，平衡缓冲液：含有6M胍盐酸盐、0.15M氯化钠的50mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0))中，进一步在4℃下静置一夜，使其被吸附到经镍螯合化的载体上。将该柱载体以1500rpm离心5分钟，回收上清液，将柱载体悬浮在磷酸盐缓冲生理盐水中后，再次填充到柱中。

[0169] 将未被柱吸附的馏分用为柱容量10倍量的含0.5M氯化钠的0.1M酢酸缓冲液(pH4.0)清洗处理后，立即用含有0.5M氯化钠的0.1M酢酸缓冲液(pH3.0)洗脱。采集柱容量6倍量的各洗脱馏分。靶蛋白的洗脱根据按照通用方法进行的考马斯染色法确认，根据该结果将洗脱馏分脱盐、浓缩，作为诊断用固相化材料。

[0170] 实施例A－3：使用犬重组蛋白的癌诊断

[0171] (1)犬的癌诊断

[0172] 从确认患有恶性或良性肿瘤的486只犬和6只健康犬体内采集血液，分离血清。使用实施例A－2制备的犬重组蛋白、抗犬IgG抗体按照ELISA法测定与该蛋白特异性反应的血清中的IgG抗体效价。

[0173] 制备的蛋白如下进行固相化：将用磷酸盐缓冲生理盐水稀释为50μg/mL的重组蛋白质溶液按照100μL/孔添加到96孔Immobilizer Amino Plate(NUNC公司制)中，在4℃下静置一夜。封闭如下进行：按照100μL/孔加入含有0.5％BSA(bovine serum albumin(牛血清白蛋白)、Sigma－Aldrich Japan公司制)的50mM碳酸氢钠缓冲溶液(pH8.3)(以下称为封闭溶液)，室温下振荡1小时。按照100μL/孔添加使用了封闭溶液进行稀释的500倍稀释血清，室温下振荡3小时进行反应。用含有0.05％Tween20(和光纯药工业公司制)的磷酸盐缓冲生理盐水(以下称为PBS－T)清洗3次，按照100μL/孔加入用封闭溶液稀释了3000倍的HRP修饰犬IgG抗体(Goat anti Dog IgG－h+I HRP conjugated：BETHYL Laboratories公司制)，室温下振荡1小时进行反应。用PBS－T清洗3次，按照100μl/孔添加HRP底物TMB(1－Step Turbo TMB(四甲基联苯胺)、PIERCE公司制)，室温下进行酶底物反应30分钟。之后，按照100μl/孔加入0.5M硫酸溶液(Sigma－Aldrich Japan公司制)停止反应后，用微孔板读数仪测定450nm处的吸光度。作为对照，未将制备的重组蛋白质固相化的物质、不使罹癌犬血清反应的物质与上述同样地操作进行比较。

[0174] 使用被摘除的肿瘤组织进行病理诊断，结果上述癌诊断中使用的全部486个样品中有311个样品确诊为恶性。

[0175] 具体而言，上述样品接受了下述癌诊断，所述癌为：恶性黑色素瘤、恶性混合肿瘤、肝细胞癌、基底细胞癌、棘细胞瘤样龈瘤、口腔内肿瘤、肛门周围腺癌、肛门囊肿、肛门囊顶泌腺癌、塞尔托利细胞瘤、阴道前庭癌、皮脂腺癌、皮脂腺上皮瘤、脂腺腺瘤、汗腺癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、甲状腺癌、大肠癌、支气管腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、复合型乳腺癌、乳腺恶性混合肿瘤、乳管内乳头状腺癌、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、软组织肉瘤、组织细胞肉瘤、粘液肉瘤、未分化肉瘤、肺癌、肥大细胞瘤、皮肤平滑肌瘤、腹腔内平滑肌瘤、平滑肌瘤、鳞状上皮癌、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、消化管型淋巴瘤、消化器型淋巴瘤、小～中细胞型淋巴瘤、肾上腺髓质肿瘤、粒层细胞瘤、嗜铬细胞瘤、膀胱癌(移行细胞癌)、化脓性炎症、腹腔内肝脏肿瘤、肝癌、浆细胞瘤、恶性血管外膜细胞瘤、血管肉瘤、肛门囊腺癌、口腔癌、转移性恶性黑色素瘤、无黑色素性恶性黑色素瘤、皮肤恶性黑色素瘤、恶性肌上皮瘤、恶性睾丸上皮瘤、精原细胞瘤(seminoma)、大肠腺癌、胃腺癌、低度皮脂腺癌、耳垢腺癌、顶泌腺癌、低分化型顶泌腺癌、恶性纤维性组织细胞瘤、多发性骨髓瘤、间叶组织恶性肿瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、起因不明的肉瘤、软组织肉瘤(纺锤形细胞肿瘤)、低分化肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、转移性恶性上皮肿瘤、管状乳腺腺癌、乳腺导管癌、炎性乳癌、生殖细胞瘤、白血病、浸润性毛发上皮瘤、中细胞型淋巴瘤、多中心型淋巴瘤、骨肉瘤(乳腺)、肥大细胞瘤(PatnaikII型)、肥大细胞瘤(GradeII)、平滑筋肉瘤等。

[0176] 来自上述罹癌犬生物体的血清如图3所示针对重组蛋白质的抗体效价明显高。为健康犬平均值的2倍以上即可根据本诊断方法判断为恶性时，可知有192个样品可以诊断为恶性，为61.7％。该192个样品的癌的种类如下所述。需要说明的是，根据样品，存在患多种癌的样品，以下所示的数值为每种癌的累计值。

[0177] 恶性黑色素瘤10例、淋巴瘤9例、嗜铬细胞瘤1例、粒层细胞瘤1例、肝细胞癌3例、血管瘤1例、恶性睾丸肿瘤9例、口腔内肿瘤4例、肛门周围腺癌7例、骨肉瘤3例、纤维肉瘤8例、腺管癌19例、软骨肉瘤1例、乳腺癌35例、复合型乳腺癌24例、肺癌1例、皮脂腺癌2例、鼻腺癌2例、肥大细胞瘤26例、肾上腺髓质肿瘤1例、平滑筋肉瘤2例、鳞状上皮癌7例、慢性淋巴细胞性白血病1例、未分化肉瘤1例、恶性混合瘤2例、血管外膜细胞瘤1例、左膝关节部肿瘤1例、左肺后叶肿瘤1例、膀胱癌(移行细胞癌)1例、软组织肉瘤(纺锤形细胞肿瘤)1例、耳垢腺癌1例、多中心型淋巴瘤2例、脂肪肉瘤1例、滑膜肉瘤1例、浸润性毛发上皮瘤1例、肛门囊腺癌1例。

[0178] 进而，使用从末期癌患病犬体内采集的胸水、腹水，进行相同的诊断，结果可以检测出与使用血清的本诊断方法的结果相同的值，可以诊断为癌。

[0179] 另外，可知通过采用本诊断方法还可以进行肉眼不可见部分的癌诊断、进展程度诊断、恶性程度诊断、术后的追踪诊断、复发诊断、转移诊断等。以下举出数例图4所示的详细诊断的具体例子。

[0180] (2)－1肉眼不可见肿瘤的癌诊断

[0181] 患病犬1(FLAT COATED RETRIEVER)在2007年6月7日时间点未确认到肿瘤，但在其约20日后即2007年6月24日在左上颚犬齿根的齿龈中发现了蒂状的直径2mm的肿瘤。在发现之日将蒂部结扎并切除。在肉眼可以确认肿瘤以前，可以确认到450nm处的吸光度为0.32，为明显高的值，与肿瘤发现时的0.37比较变化不大。由该结果可知通过使用本方法还可以诊断腹腔内等肉眼不可见部分的癌。

[0182] 另外，可以确认从能够用肉眼确认肿瘤以前值上升，一般认为显示出肿瘤发生的前兆。由此可知，其对定期健康检查等健康诊断也有用

[0183] 在切除肿瘤2周后再次对该患病犬1进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0.07，显著降低。所以，还可以确认引起抗体效价上升的癌抗原表达的肿瘤被完全切除。((2)－4术后的追踪诊断)

[0184] (2)－2癌的进展程度诊断

[0185] 癌的进展程度通过肿瘤的大小及深度、对周围组织带来何种影响、是否发生转移等进行判断。一般认为转移即癌发展时可以检测出比以前高的值。进而作为又一例，以下对根据给与抗癌剂的具体例进行的进展程度诊断详细说明。

[0186] 患病犬2(杂种)是于2006年10月13日通过右后肢断足摘除肿瘤的患病犬。使用摘除的肿瘤进行病理诊断，结果为稍接近3级的2级高恶性程度肥大细胞瘤。于2007年3月12日在右腹股沟和肝脏确认到转移·复发，此时未作手术开始利用抗癌剂(长春花碱·脱氢皮质醇)进行治疗。自确认到转移·复发的时间点开始给与抗癌剂，1周后、2周后、4周后、8周后再次给与抗癌剂。每次给药的血清诊断结果为450nm处的吸光度分别为0.36、0.37、0.26、0.20、0.29。从给药开始后至第4周以短的间隔给与抗癌剂，值慢慢降低，因此可知可以抑制癌的发展。但是，在自上次给药间隔1个月的、8周后，确认到值再次上升，表明癌再次发展。
此时临床上也确认到肿瘤变大。从患病犬2的结果可知还可以对癌进展程度进行诊断。进而，可知作为其一例，如上所述还可以诊断抗癌剂治疗效果。

[0187] (2)－3癌的恶性程度诊断

[0188] 基底细胞瘤包括恶性型和良性型，近年来新WHO中存在以恶性型为基底细胞癌、以良性型为毛芽瘤进行分类的倾向。

[0189] 被诊断为基底细胞癌(恶性)的患病犬3(比格犬)在手术时进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0.35。另一方面，被诊断为毛芽瘤(良性)的患病犬4(杂种)在手术时进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0完全未检测出。由此可知，即使相同的基底细胞瘤也可以诊断出为恶性型基底细胞癌和良性型毛芽瘤。

[0190] 接下来，举出乳腺肿瘤的例子。乳腺肿瘤包括乳腺癌及乳腺恶性混合肿瘤等恶性肿瘤、和未表现出恶性症状的良性乳腺肿瘤。患病犬5(约克犬)为于2006年5月17日因乳腺恶性混合肿瘤和乳腺癌接受了摘除手术的患病犬。通常，乳腺的混合肿瘤即使为恶性由于缺乏向周围的浸润性，所以也容易完全切除，切除后的追踪诊断大多良好。但是使用被摘除的组织进行的病理诊断中，患病犬5标本的一部分成分中呈现浸润性，诊断为恶性程度高的肿瘤。另外，乳腺癌通常为向周围的浸润性强且容易引起复发及转移的肿瘤。在患病犬5标本上肿瘤细胞未呈现浸润性，但由于部分材料的存在使在其他区域恶性程度高的成分也可能增殖。因此，病理诊断结果表明患病犬5为恶性程度高的乳癌。该手术时采集的血清诊断结果为450nm处的吸光度为0.39。另一方面，患病犬6(约克夏犬，Yorkshire Terrier)为于2007年1月28日接受了乳腺肿瘤摘除手术的患病犬。在使用了此时的摘除组织的病理诊断中，细胞异型性为轻度，诊断是未见恶性症状的良性乳腺肿瘤。该手术时采集的血清诊断的结果为450nm处的吸光度为0.05。由以上2个样品的结果也可知恶性程度高的肿瘤与恶性程度低即良性肿瘤相比，值较大。

[0191] (2)－4术后的追踪诊断

[0192] 患病犬7(西施犬)因口腔内肿瘤入院就诊并于2007年3月22日进行了摘除手术。此时进行的血清诊断的结果为450nm处的吸光度为0.40。另外，在使用摘除组织的病理诊断中，诊断为恶性棘细胞瘤样龈瘤。该肿瘤具有远位转移少但若切除不充分则容易复发的特征。因此能否通过手术完全切除肿瘤是重要的。2007年5月18日追踪观察时确认到450nm处的吸光度为0.25且抗体效价降低。2007年8月之前未确认到复发。由此可以认为患病犬7由于能够完全切除肿瘤所以血清诊断结果与手术时相比降低。

[0193] (2)－5复发诊断

[0194] 患病犬8(哈士奇犬)于2007年5月8日进行乳腺癌摘除手术。此时进行的血清诊断的结果为450nm处的吸光度为0.08。使用摘除组织的病理诊断中，异型性强的上皮系细胞主要形成腺管结构、并增殖，诊断为乳腺原发性腺癌。此时已经确认到多数癌细胞进入淋巴管内，向淋巴结及远位部的转移、复发的风险高。手术后约一个半月于2007年6月28日在相同部位确认到复发。此时血清诊断的结果，该值为0.08完全未降低。一般认为患病犬8由于肿瘤未被完全切除或者复发，所以在5月上旬和6月下旬诊断结果未发生变化。

[0195] (2)－6转移诊断

[0196] 患病犬9(苏格兰梗)为反复出现转移·复发的患病犬：2003年2月乳腺肿瘤、2003年8月口腔内恶性黑色素瘤、2005年1月嘴唇中恶性黑色素瘤、2005年4月13日口腔内黑色素瘤，且上述肿瘤均已通过手术被切除。2005年4月口腔内黑色素瘤复发后，因追踪观察再次入院就诊于2006年12月17日进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0.3。其半年后2007年6月20日颈部淋巴结、颧淋巴结肥大再次入院就诊。如果为淋巴瘤则全身淋巴结均肿但患病犬9只有2处肿，因此临床诊断为很可能是因转移引起的淋巴瘤。通过利用本方法的诊断也可知，450nm处的吸光度为0.75显著升高，为以前存在的肿瘤的转移。

[0197] (2)－7治疗监控

[0198] 患病犬11(迷你腊肠犬)为2007年4月19日进行了肿瘤摘除的患病犬。使用摘除的肿瘤进行病理诊断，结果为复合型乳腺癌，为浸润性、转移性发生可能性高的中等度的恶性程度。此时血清诊断的结果为450nm处的吸光度为0.26。摘除手术后约1年即2008年6月3日进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0.13显著降低。此时肉眼未确认到癌的复发，但为了防止复发在其后的2个月内以每周一次的间隔给与抗癌剂(Intercat)，维持不复发的状态。开始给与抗癌剂2周后、4周后、6周后进行血清诊断，结果450nm处的吸光度分别为0.09、0.07、0.08。由患病犬11的结果可知，如果完全切除肿瘤则与罹癌状态相比值降低，如果在抗癌剂治疗中也能抑制癌复发，则不会见到值升高，遵循治疗的经时变化。另外，如患病犬8所示由于也可以诊断复发，所以也可以进行治疗监控。

[0199] (2)－8复发时的恶性诊断

[0200] 患病犬12(吉娃娃犬)为2007年4月27日进行了肿瘤摘除的患病犬。使用摘除的肿瘤进行病理诊断，结果来自乳管上皮的腺管癌，即恶性乳癌。由于在约1年后即2008年6月29日再次发现了肿瘤，所以进行了摘除手术。使用其摘除的肿瘤进行病理组织诊断，结果确认来自乳管上皮的肿瘤细胞形成不规则的腺腔，还确认到向内腔进行多层化形成的部分，但构成细胞具有基本均一的卵圆形核，细胞的异型性为轻度，据此诊断为良性乳腺癌。此时血清诊断的结果为450nm处的吸光度为0.02，基本上未检测。由患病犬8、12的结果可知，复发时在为恶性的情况下血清诊断值不降低或维持原状，在为良性的情况下基本检测不到。

[0201] (2)－9良性肿瘤患病犬的预后诊断

[0202] 患病犬13(玩具贵宾犬)为2007年10月9日进行了肿瘤摘除的患病犬。使用摘除的肿瘤进行病理诊断，结果形成乳腺上皮细胞和筋上皮细胞两成分增殖的肿瘤，但两成分均未表现出恶性症状，诊断为乳腺良性混合肿瘤。此时血清诊断的结果为450nm处的吸光度仅仅检测到0.07。8个月后即2008年6月5日进行再次采血，结果450nm处的吸光度为0完全检测不到。临床上此时也未确认到复发。因此，可知即使为良性肿瘤患病犬，如果在存在肿瘤的状态时检测到血清诊断值，则切除肿瘤时值降低，且可以进行预后诊断。

[0203] (3)猫的诊断

[0204] 接下来进行罹癌猫及健康猫的诊断。使用上述利用的犬重组蛋白和抗猫IgG抗体，与上述同样地测定与该多肽特异性反应的猫血清中的IgG抗体效价。第二抗体是将HRP修饰抗猫IgG抗体(PEROXIDASE－CONJUGATED GOAT IgG FRACTION TO CAT IgG(WHOLE MOLECULE)：CAPPEL RESERCH REAGENTS公司制)用封闭溶液稀释8000倍进行使用。

[0205] 患病猫1(金吉拉猫)为2005年8月17日因乳腺癌而接受了肿瘤摘除手术的患病猫。患病猫1在450nm处的吸光度为0.32。另外，2006年10月17日因腺管癌接受了摘除手术的、患病猫2(喜马拉雅猫)在450nm处的吸光度为0.18。另一方面，健康猫中完全未检测到。

[0206] 因此可知为猫的情况下与犬同样地在患癌样品中检测出值，而在健康样品中基本检测不到，所以与犬同样地猫也可以通过使用了犬重组蛋白的本方法进行癌诊断。

[0207] (4)健康人的诊断

[0208] 使用上述利用的犬重组蛋白和抗人IgG抗体，与上述同样地测定与该蛋白特异性反应的健康人血清中的IgG抗体效价。第二抗体是将HRP修饰抗人IgG抗体(HRP－Goat Anti－Human IgG(H+L)Conjugate：Zymed Laboratories公司制)用封闭溶液稀释10000倍进行使用。作为阳性对照，使用将用磷酸盐缓冲生理盐水调整为50μg/m1的卵白蛋白抗原进行固相化的产物。结果，卵白蛋白抗原在健康人1中450nm处的吸光度为0.25。另一方面，该重组蛋白质为0完全未检测到。另外，健康人2中卵白蛋白抗原450nm处的吸光度为0.18，另一方面，该重组蛋白质为0完全未检测到。

[0209] 实施例A－4：使用人重组蛋白的癌诊断

[0210] 使用实施例A－2制备的人重组蛋白，与实施例A－3同样操作，测定与该蛋白反应的人、犬及猫血清中的IgG抗体效价。

[0211] 使用健康人血清进行诊断，结果与实施例A－3(4)同样地使用卵白蛋白抗原作为阳性对照的情况下，将卵白蛋白固相化时可以检测到值，将人重组蛋白固相化时基本检测不到。

[0212] 另外，在健康犬·猫中将该蛋白固相化时450nm处的吸光度也基本不能检测到。

[0213] 另一方面，患病犬10(西施犬)为2007年6月21日接受了乳腺癌摘除手术的患病犬。使用摘除的组织的病理诊断中，具有强异型性和浸润性的乳腺组织，以大小的块状进行腺样增殖，诊断为恶性。该患病犬10在450nm处的吸光度为0.29。使用在其他病理诊断中诊断为恶性的310个样品的血清进行恶性诊断。为健康犬平均值的2倍以上即判断为恶性时，可知有189个样品可以诊断为恶性，为60.8％。患病猫3(杂种)于2007年4月3日接受了乳腺癌摘除手术，但该患病猫在450nm处的吸光度为0.14。

[0214] 由以上可知，即使使用人重组蛋白，人、犬、猫均可以相同地诊断。

[0215] 进而，与犬重组蛋白同样地使用人重组蛋白，对从末期癌患病犬采集的胸水、腹水进行诊断，结果可以检测到与使用血清的结果相同的值，可以诊断为癌。

[0216] 实施例A－5：通过测定抗原多肽的癌诊断(1)

[0217] 用实施例A－2制备的犬重组蛋白对小鼠、家兔进行免疫，制备、获得该抗原特异性抗体。使用该多克隆抗体，通过夹层ELISA法检测罹癌生物体血清中含有的该抗原多肽本身。对于与制备的该蛋白特异性多克隆抗体特异性反应的、血清中的该蛋白量，使用抗小鼠IgG抗体通过夹层ELISA法进行测定。

[0218] 第一抗体的固相化如下进行：将用磷酸盐缓冲生理盐水稀释20倍的家兔抗血清按照100μL/孔添加到96孔Immobilizer Amino Plate(NUNC公司制)中，室温下振荡2小时。如下进行封闭：按照100μL/孔加入含有0.5％BSA(bovine serum albumin(牛血清白蛋白)、Sigma－Aldrich Japan公司制)的50mM碳酸氢钠缓冲溶液(pH8.3)(以下封闭溶液)，室温下振荡1小时。之后，按照100μL/孔添加用封闭溶液稀释的来自罹癌生物体的血清，室温下振荡3小时进行反应。此时将稀释倍率调整为10－1000倍的10倍稀释系列。用含有0.05％Tween20(和光纯药工业公司制)的磷酸盐缓冲生理盐水(以下称为PBS－T)清洗3次，按照100μL/孔加入用封闭溶液稀释200倍的小鼠抗血清作为第二抗体，室温下振荡1小时进行反应。用PBS－T清洗3次，按照100μL/孔加入用封闭溶液稀释2000倍的HRP修饰小鼠IgG抗体(Stabilized Goat Anti Mouse HRP conjugated：PIERCE公司制)作为第三抗体，室温下振荡1小时进行反应。用PBS－T清洗3次，按照100μl/孔添加HRP底物TMB(1－Step Turbo TMB(四甲基联苯胺)、PIERCE公司制)，室温下进行酶底物反应30分钟。之后，按照100μl/孔加入
0.5M硫酸溶液(Sigma－Aldrich Japan公司制)停止反应后，用微孔板读数仪测定450nm处的吸光度。作为对照，未将家兔抗血清固相化的物质、不使来自罹癌生物体的血清反应的物质与上述同样地操作进行比较。

[0219] 结果，在患有皮肤平滑筋肉瘤、乳癌、恶性黑色素瘤等罹癌犬及罹癌猫中检测到多肽的值，在健康犬、健康猫及健康人中未检测到。因此，在使用以源自犬的重组多肽作为免疫原配制的抗体检测抗原多肽的该方法中也可以诊断癌。

[0220] 实施例A－6：通过测定抗原多肽的癌诊断(2)

[0221] 用实施例A－2制备的人重组蛋白对小鼠、家兔进行免疫，制备、获得该抗原特异性抗体。与实施例5同样地，通过使用该多克隆抗体的夹层ELISA法，检测罹癌生物体血清中含有的该抗原多肽本身。

[0222] 结果，在患有皮肤平滑筋肉瘤、乳癌、恶性黑色素瘤等罹癌犬及罹癌猫中检测到多肽的值，在健康犬、健康猫及健康人中未检测到。因此，使用以来自人的重组多肽作为免疫原配制的抗体检测抗原多肽的该方法中也可以诊断癌。

[0223] 实施例B－1：通过SEREX法获得新型癌抗原蛋白

[0224] (1)构建cDNA文库

[0225] 通过酸－胍－苯酚－氯仿法(Acid guanidium－Phenol－Chloroform法)自健康犬的睾丸组织中提取全RNA，使用Oligotex－dT30mRNA purification Kit(宝酒造公司制)按照试剂盒所附的操作说明书纯化polyA RNA。

[0226] 使用上述所得的mRNA(5μg)构建犬睾丸cDNA噬菌体文库。在cDNA噬菌体文库的制备中使用cDNA Synthesis Kit，ZAP－cDNA Synthesis Kit，ZAP－cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE公司制)，按照试剂盒所附的操作说明书构建文库。构建的cDNA噬菌体文库大小为1.3×106pfu/ml。

[0227] (2)利用血清筛选cDNA文库

[0228] 使用上述构建的源自犬睾丸的cDNA噬菌体文库进行免疫筛选。具体而言，在Φ90×15mm的NZY琼脂糖平板中感染宿主大肠杆菌(XL1－BlueMRF’)使其为2340克隆，42℃下培养3～4小时，形成溶菌斑(plaque)，在37℃下用浸透了IPTG(异丙基－β－D－硫代半乳糖苷)的硝酸纤维素滤膜(Hybond C Extra：GE Healthecare Bio－Science公司制)覆盖培养板4小时，从而诱导·表达蛋白质，将蛋白质转印到膜上。之后回收膜，将其浸在含有0.5％脱脂奶粉的TBS(10mM Tris－HCl，150mM NaCl pH7.5)中，在4℃下振荡一夜，由此抑制非特异性反应。在室温下使此过滤膜与稀释500倍的患病犬血清反应2～3小时。

[0229] 作为上述患病犬血清，使用从患有肛门近位肿瘤的犬体内采集的血清。这些血清保存在－80℃，在即将使用前进行预处理。血清的预处理方法按照以下方法进行。即，用未插入外来基因的λZAP Express噬菌体感染宿主大肠杆菌(XL1－BLueMRF’)后，在NZY板培养基中在37℃下培养一夜。然后，向培养板中加入含有0.5M NaCl的0.2M NaHCO3pH8.3的缓冲液，在4℃下静置15小时后，回收上清液作为大肠杆菌/噬菌体提取液。然后将回收的大肠杆菌/噬菌体提取液通入NHS－柱(GE Healthecare Bio－Science公司制)，将来自大肠杆菌·噬菌体的蛋白质固定化。在该蛋白固定化柱中使患病犬血清通入·反应，从血清中除去吸附在大肠杆菌和噬菌体上的抗体。将只是仅仅通过柱子的血清馏分用含有0.5％脱脂奶粉的TBS稀释500倍，将其作为免疫筛选材料。

[0230] 将经上述处理血清和上述融合蛋白印迹的膜用TBS－T(0.05％Tween20/TBS)清洗4次后，将用含有0.5％脱脂奶粉的TBS稀释5000倍的山羊抗犬IgG(Goat anti Dog IgG－h+I HRP conjugated：BETHYL Laboratories公司制)作为第二抗体，在室温下反应1小时，使用NBT/BCIP反应液(Roche公司制)通过酶显色反应检测，从Φ90×15mm的NZY琼脂糖平板上采集与显色反应阳性部位相一致的菌落，使其溶解在500μl SM缓冲液(100mM NaCl、10mM MgClSO4、50mM Tris－HCl、0.01％明胶pH7.5)中。采用与上述相同的方法将显色反应呈阳性的菌落反复筛选二次、三次，直至菌落单一化，筛选出与血清中IgG反应的30940个噬菌体克隆，分离出一个阳性克隆。

[0231] (3)分离抗原基因的同源性检索

[0232] 为了将通过上述方法分离所得的一个阳性克隆用于碱基序列解析，进行操作将噬菌体载体转换为质粒载体。具体而言，将宿主大肠杆菌(XL1－Blue MRF’)制成吸光度OD600为1.0的溶液，将上述溶液200μl与100μl经纯化的噬菌体溶液以及1μl ExAssist helper phage(STRATAGENE公司制)混合后，在37℃下反应15分钟，之后添加3ml LB培养基在37℃下培养2.5～3小时，立即置于70℃水浴中保持温度20分钟后，在4℃下以1000×g离心15分钟，回收上清液作为噬菌粒溶液。然后，将噬菌粒宿主大肠杆菌(SOLR)制成吸光度OD600为1.0的溶液，将上述溶液200μl与10μl经纯化的噬菌体溶液混合后，在37℃下反应15分钟，取50μl接种于含有氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的LB琼脂培养基中，在37℃下培养一夜。采集经转化的SOLR单菌落，用含有氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的LB培养基在37℃下培养后，使用QIAGEN plasmid Miniprep Kit(Qiagen公司制)纯化含有目标插入片段的质粒DNA。

[0233] 经纯化的质粒，使用序列号5所示的T3引物和序列号6所示的T7引物，通过引物步测法来解析插入片段的全长序列。通过该序列解析获得了序列号15所示的基因序列。使用该基因的碱基序列及氨基酸序列，运行同源性检索程序BLAST搜索(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，进行与已知基因同源性的检索，结果表明所得的基因是钙镁蛋白(calmegin)基因。犬钙镁蛋白的人同源因子为人钙镁蛋白(同源性：碱基序列
90％、氨基酸序列89％)。人钙镁蛋白的碱基序列如序列号17所示，氨基酸序列如序列号18所示。

[0234] (4)在各种组织中的表达解析

[0235] 对于通过上述方法所得的基因，通过RT－PCR(Reverse Transcription－PCR)法研究其在犬及人正常组织及各种细胞株中的表达。逆转录反应如下进行。即，使用TRIZOL试剂(invitrogen公司制)按照所附的操作说明书从50－100mg各种组织及各种细胞株5－10×106个细胞中提取全RNA。通过Superscript First－Strand Synthesis System for RT－PCR(invitrogen公司制)按照所附的操作说明书使用上述全RNA合成cDNA。人正常组织(脑、海马、睾丸、结肠、胎盘)的cDNA，使用Gene Pool cDNA(invitrogen公司制)、QUICK－Clone cDNA(Clontech公司制)及Large－Insert cDNA Library(Clontech公司制)。PCR反应使用对获得的基因具有特异性的引物(如序列号19及20所示)如下进行。即，加入各试剂和附加缓冲液使总量为25μl，其中使通过逆转录反应配制的样品为0.25μl，上述引物各为2μM，各dNTP为0.2mM，ExTaq聚合酶(宝酒造公司制)为0.65U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制)，以94℃－30秒、55℃－30秒、72℃－1分钟为一个循环，将该循环重复进行30次。需要说明的是，上述基因特异性的引物是扩增下述区域的引物，所述区域是序列号15的碱基序列(犬钙镁蛋白基因)中的755号～1318号及序列号17的碱基序列(人钙镁蛋白基因)中的795号～1358号碱基所在的区域，使用该引物还可以研究犬钙镁蛋白基因及人钙镁蛋白基因中任一者的表达。为了比较对照，同时也使用了GAPDH特异性的引物(如序列号9及10所示)。其结果如图5所示，在健康犬组织中显著表达于睾丸，另一方面发现其在犬肿瘤细胞株中显著表达。人钙镁蛋白基因的表达也与犬钙镁蛋白基因同样地，在正常组织中能够确认其表达的部位仅限于睾丸，但在癌细胞中则于脑肿瘤、白血病、食道癌中均检测出其表达，因此可以确定人钙镁蛋白基因也特异性地表达于睾丸和癌细胞中。

[0236] 需要说明的是，图5中纵轴的标号1表示钙镁蛋白基因的表达谱，标号2表示作为比较对照的GAPDH基因的表达谱。

[0237] 实施例B－2：犬及人钙镁蛋白质的制备

[0238] (1)重组蛋白质的制备

[0239] 基于实施例B－1中获得的序列号15的基因，通过以下方法制备重组蛋白质。PCR如下进行：加入各试剂和附加缓冲液使总量为50μl，使由实施例B－1中所得的噬菌粒溶液配制的供序列解析的载体为1μl、含有BamHI及EcoRI限制性酶切断序列的两种引物(如序列号21及22所示)各为0.4μM、dNTP为0.2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造公司制)为1.25U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制)，以98℃－10秒、55℃－15秒、72℃－2分钟为一个循环，将该循环重复进行30次。需要说明的是，由上述两种引物可以得到编码序列号16的氨基酸序列全长的区域。PCR后用1％琼脂糖凝胶对经扩增的DNA进行电泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制)纯化约1.9kbp的DNA片段。

[0240] 将经纯化后的DNA片段与克隆载体pCR－Blunt(invitrogen公司制)连接。将其转化至大肠杆菌中后回收质粒，通过测序确认了经扩增的基因片段与靶序列一致。将与靶序列一致的质粒用BamHI及EcoRI限制性酶处理，用QIAquick Gel Extraction Kit纯化后，将靶基因序列插入用BamHI、EcoRI限制性酶处理的大肠杆菌用表达载体pET30a(Novagen公司制)中。通过使用该载体可产生His标签融合型重组蛋白质。将该质粒转化至表达用大肠杆菌BL21(DE3)，通过利用1mM IPTG的表达诱导，能够使靶蛋白在大肠杆菌内表达。

[0241] 另外，基于序列号17的基因，通过以下方法制备人同源基因的重组蛋白质。PCR如下进行：加入各试剂和附加缓冲液使总量为50μl，其中，从实施例B－1制备的各种组织·细胞cDNA中取出已确认通过RT－PCR法表达的cDNA1μl、含有EcoRI及XhoI限制性酶切断序列的两种引物(如序列号23及24所示)各为0.4μM、dNTP为0.2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造公司制)为1.25U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制)，以98℃－10秒、55℃－15秒、72℃－2分钟为一个循环，将该循环重复进行30次。需要说明的是，由上述两种引物可以得到编码序列号18的氨基酸序列全长的区域。PCR后，用1％琼脂糖凝胶对经扩增的DNA进行电泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制)纯化约1.9kbp的DNA片段。

[0242] 将经纯化后的DNA片段与克隆载体pCR－Blunt(invitrogen公司制)连接。将其转化至大肠杆菌中后回收质粒，通过测序确认了经扩增的基因片段与靶序列一致。将与靶序列一致的质粒用EcoRI及XhoI限制性酶处理，用QIAquick Gel Extraction Kit纯化后，将靶基因序列插入用EcoRI、XhoI限制性酶处理后的大肠杆菌用表达载体pET30a(Novagen公司制)中。通过使用该载体可产生His标签融合型重组蛋白质。将该质粒转化至表达用大肠杆菌BL21(DE3)，通过利用1mM IPTG的表达诱导，能够使靶蛋白在大肠杆菌内表达。

[0243] (2)重组蛋白质的纯化

[0244] 将上述得到的、表达序列号15及序列号17的各重组大肠杆菌在37℃下用含有卡那霉素(终浓度30μg/m1)的LB培养基培养至600nm处的吸光度为0.7左右，之后添加IPTG至其终浓度为1mM，进而在37℃下培养4小时。之后以4800rpm离心10分钟进行集菌。将该菌体块悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中，进而以4800rpm离心10分钟，清洗菌体。

[0245] 将所得的菌体块悬浮于20mM磷酸缓冲液(pH7.0)中，在冰上进行超声裂解。将大肠杆菌超声裂解液以6000rpm离心分离20分钟，所得上清液为可溶性馏分，沉淀为不溶性馏分。

[0246] 将可溶性馏分添加到阳离子交换柱(载体SP Sepharose(商标)Fast Flow(GE Health Care公司)中，柱容量为5mL，平衡缓冲液为20mM磷酸缓冲液(pH7.0))。用柱容量10倍量的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)清洗后，立即用含有0.3M－1.0M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)通过盐的阶段浓度梯度进行洗脱。分别采集柱容量的6倍量的各洗脱馏分。

[0247] 将该洗脱馏分中含有0.3M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)的全部馏分和含有1.0M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)馏分的第1馏分合并，通过2次柱进一步进行纯化操作。

[0248] 2次柱的柱载体使用Bio gel HT Type II(BioRad社)，柱容量为5mL。使用10倍柱容量的含有0.3M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)进行平衡化后，添加上述洗脱馏分。用柱容量的10倍量的含有0.3M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)和0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)清洗柱未吸附馏分。之后立即用0.2M磷酸缓冲液(pH7.0)进行洗脱。采集柱容量的6倍量的洗脱馏分。靶蛋白的洗脱根据按照通用方法进行的考马斯染色法确认，根据该结果将洗脱馏分脱盐、浓缩，作为诊断用固相化材料。

[0249] 实施例B－3：使用犬钙镁蛋白质的癌诊断

[0250] (1)犬的癌诊断

[0251] 从被确认患有恶性或良性肿瘤的486只犬和6只健康犬体内采集血液，分离血清。使用实施例B－2制备的犬钙镁蛋白质、抗犬IgG抗体，通过ELISA法测定与该蛋白特异性反应的血清中的IgG抗体效价。

[0252] 制备的蛋白如下进行固相化：将用磷酸盐缓冲生理盐水稀释为50μg/mL的重组蛋白质溶液按照100μL/孔添加到96孔Immobilizer Amino Plate(NUNC公司制)中，在4℃下静置一夜。封闭如下进行：按照100μL/孔加入含有0.5％BSA(bovine serum albumin(牛血清白蛋白)、Sigma－Aldrich Japan公司制)的50mM碳酸氢钠缓冲溶液(pH8.3)(以下称为封闭溶液)，室温下振荡1小时。按照100μL/孔添加用封闭溶液稀释至1000倍的稀释血清，室温下振荡3小时进行反应。用含有0.05％Tween20(和光纯药工业公司制)的磷酸盐缓冲生理盐水(以下称为PBS－T)清洗3次，按照100μL/孔加入用封闭溶液稀释3000倍的HRP修饰犬IgG抗体(Goat anti Dog IgG－h+I HRP conjugated：BETHYL Laboratories公司制)，室温下振荡1小时进行反应。用PBS－T清洗3次，按照100μl/孔添加HRP底物TMB(1－Step Turbo TMB(四甲基联苯胺)、PIERCE公司)，室温下进行酶底物反应30分钟。之后，按照100μl/孔加入0.5M硫酸溶液(Sigma－Aldrich Japan公司制)停止反应后，用微孔板读数仪测定450nm处的吸光度。作为对照，未将制备的重组蛋白质固相化的物质、不使罹癌犬血清反应的物质与上述同样地操作进行比较。

[0253] 使用被摘除的肿瘤组织进行病理诊断，结果上述癌诊断中使用的全部486个样品中有311个样品被确诊为恶性。

[0254] 具体而言，上述样品接受了下述癌诊断，所述癌为：恶性黑色素瘤、恶性混合肿瘤、肝细胞癌、基底细胞癌、棘细胞瘤样龈瘤、口腔内肿瘤、肛门周围腺癌、肛门囊肿、肛门囊顶泌腺癌、塞尔托利细胞瘤、阴道前庭癌、皮脂腺癌、皮脂腺上皮瘤、脂腺腺瘤、汗腺癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、甲状腺癌、大肠癌、支气管腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、复合型乳腺癌、乳腺恶性混合肿瘤、乳管内乳头状腺癌、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、软组织肉瘤、组织细胞肉瘤、粘液肉瘤、未分化肉瘤、肺癌、肥大细胞瘤、皮肤平滑肌瘤、腹腔内平滑肌瘤、平滑肌瘤、鳞状上皮癌、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、消化管型淋巴瘤、消化器型淋巴瘤、小～中细胞型淋巴瘤、肾上腺髓质肿瘤、粒层细胞瘤、嗜铬细胞瘤、膀胱癌(移行细胞癌)、化脓性炎症、腹腔内肝脏肿瘤、肝癌、浆细胞瘤、恶性血管外膜细胞瘤、血管肉瘤、肛门囊腺癌、口腔癌、转移性恶性黑色素瘤、无黑色素性恶性黑色素瘤、皮肤恶性黑色素瘤、恶性肌上皮瘤、恶性睾丸上皮瘤、精原细胞瘤(seminoma)、大肠腺癌、胃腺癌、低度皮脂腺癌、耳垢腺癌、顶泌腺癌、低分化型顶泌腺癌、恶性纤维性组织细胞瘤、多发性骨髓瘤、间叶组织恶性肿瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、起因不明的肉瘤、软组织肉瘤(纺锤形细胞肿瘤)、低分化肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、转移性恶性上皮肿瘤、管状乳腺腺癌、乳腺导管癌、炎性乳癌、生殖细胞瘤、白血病、浸润性毛发上皮瘤、中细胞型淋巴瘤、多中心型淋巴瘤、骨肉瘤(乳腺)、肥大细胞瘤(PatnaikII型)、肥大细胞瘤(GradeII)、平滑筋肉瘤等。

[0255] 来自上述罹癌犬生物体的血清，如图7所示针对重组蛋白质的抗体效价非常高。为健康犬平均值的2倍以上即可根据本诊断方法判断为恶性时，可知有177个样品可以诊断为恶性，为56.9％。该177个样品的癌的种类如下所述。需要说明的是，根据样品不同，存在患有多种癌的样品，以下所示的数值为每种癌的累计值。

[0256] 恶性黑色素瘤10例、淋巴瘤10例、嗜铬细胞瘤1例、粒层细胞瘤1例、肝细胞癌4例、汗腺癌5例、血管瘤1例、恶性睾丸肿瘤7例、口腔内肿瘤4例、肛门周围腺癌11例、骨肉瘤4例、纤维肉瘤7例、软骨肉瘤2例、乳腺癌35例、复合型乳腺癌27例、肺癌2例、皮脂腺癌2例、鼻腺癌2例、肥大细胞瘤25例、肾上腺髓质肿瘤1例、平滑筋肉瘤1例、鳞状上皮癌5例、慢性淋巴细胞性白血病1例、生殖细胞瘤1例、恶性纤维性组织细胞瘤1例、转移性恶性上皮肿瘤1例、乳腺导管癌1例、血管肉瘤1例、管状乳腺腺癌1例、浸润性毛发上皮瘤1例、前立腺癌1例、支气管腺癌1例。

[0257] 进而，使用从末期癌患病犬体内采集的胸水、腹水，进行相同的诊断，结果可以检测出与通过使用血清的本诊断方法所得的结果相同的值，可以诊断为癌。

[0258] 另外，可知通过采用本诊断方法，还可以进行肉眼不可见部分的癌诊断、进展程度诊断、恶性程度诊断、术后的追踪诊断、复发诊断、转移诊断等诊断。以下举出数例图8所示的详细诊断的具体例。

[0259] (2)－1肉眼不可见的肿瘤的癌诊断

[0260] 患病犬1(FLAT COATED RETRIEVER)在2007年6月7日时间点未确认到肿瘤，但在此约20日后即2007年6月24日在左上颚犬齿的根的牙龈处发现了蒂状的直径为2mm的肿瘤。在发现之日将蒂部结扎并切除。在用肉眼可以确认到肿瘤以前，可以确认450nm处的吸光度为0.31，是显著高的值，与发现肿瘤时的0.33比较变化不大。由该结果可知通过使用本方法还可以诊断腹腔内等肉眼不可见部分的癌。

[0261] 另外，在可以用肉眼确认到肿瘤以前，能够确认到值升高，一般认出显示出肿瘤发生的前兆。因此，可知对定期健康检查等健康诊断也有用。

[0262] 在切除肿瘤2周后再次对该患病犬1进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0.17，显著降低。因此，还可以确认引起抗体效价上升的癌抗原表达的肿瘤被完全切除。((2)－4术后的追踪诊断)

[0263] (2)－2癌的进展程度诊断

[0264] 癌的进展程度通过肿瘤的大小及深度、对周围组织带来何种影响、是否发生转移等进行判断。一般认为转移即癌发展时可以检测出比以前高的值。进而作为又一例，以下对根据给与抗癌剂的具体例进行的进展程度诊断详细地说明。

[0265] 患病犬2(迷你腊肠犬)于2007年2月21日因恶心和越来越瘦而入院就诊，腹腔内发现2处大型肿瘤。2007年2月23日进行肿瘤摘除，右肾肥大为433g，附近淋巴结也富含血管为42g。使用此时摘除的组织进行病理诊断，诊断为多中心型恶性淋巴瘤。可以确认肿瘤细胞向脂肪组织中弥散性扩散，诊断可能也向腹腔内的其他脏器扩散。肿瘤摘除手术后从2007年3月1日开始给与抗癌剂(Oncovin)，在之后的2个月后、3个月后共进行三次血清诊断。其结果450nm处的吸光度分别为0.18、0.16、0.14。从开始给药的时间点开始值慢慢降低，可以确认表现出抗癌剂效果。即，认为能够抑制癌的发展。从患病犬2的结果可知也可以诊断癌进展程度。进而，可知作为其一例如上所述还可以诊断抗癌剂治疗效果。

[0266] (2)－3癌的恶性程度诊断

[0267] 基底细胞瘤包括恶性型和良性型，近年来在新WHO中存在以恶性型为基底细胞癌、以良性型为毛芽瘤进行分类的倾向。

[0268] 诊断为基底细胞癌(恶性)的患病犬3(比格犬)在手术时进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0.13。另一方面，诊断为毛芽瘤(良性)的患病犬4(杂种)在手术时进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0完全检测不到。因此，可知即使为相同的基底细胞瘤也可以诊断出恶性型基底细胞癌和良性型毛芽瘤。

[0269] 接下来，举出乳腺肿瘤的例子。乳腺肿瘤包括乳腺癌或乳腺恶性混合肿瘤等恶性肿瘤、和未表现出恶性症状的良性乳腺肿瘤。患病犬5(约克犬)为于2006年5月17日因乳腺恶性混合肿瘤和乳腺癌接受了摘除手术的患病犬。通常，乳腺的混合肿瘤即使为恶性，但由于缺乏向周围的浸润性，所以也容易完全切除，切除后的追踪诊断大多良好。但是在使用摘除的组织进行的病理诊断中，患病犬5标本的一部分成分中可见浸润性，诊断为恶性程度高的肿瘤。另外，乳腺癌通常为向周围的浸润性强、容易引起复发或转移的肿瘤。患病犬5的标本上肿瘤细胞中未见浸润性，但由于部分材料，所以在其他区域中恶性程度高的成分可能增殖。因此，由病理诊断结果表明患病犬5为恶性程度高的乳癌。该手术时采集的血清诊断结果为450nm处的吸光度为0.57。另一方面，患病犬6(约克夏犬)为于2007年1月28日接受了乳腺肿瘤摘除手术的患病犬。在使用此时的摘除组织进行的病理诊断中，细胞异型性为轻度，诊断为未见恶性症状的良性乳腺癌。该手术时采集的血清诊断结果，450nm处的吸光度为0。从以上2个样品的结果也可知恶性程度高的肿瘤与恶性程度低即良性肿瘤相比值大。

[0270] (2)－4术后的追踪诊断

[0271] 患病犬7(西施犬)因口腔内肿瘤入院就诊于2007年3月22日进行摘除手术。此时进行的血清诊断的结果为450nm处的吸光度为0.70。另外，使用摘除的组织进行的病理诊断中，诊断为恶性棘细胞瘤样龈瘤。该肿瘤具有远位转移少但切除不充分时容易复发的特征。因此能否通过手术完全切除肿瘤是重要的。在2007年5月18日追踪观察时，确认到450nm处的吸光度的为0.47，值降低。至2007年8月未确认到复发。由此可以认为患病犬7由于完全切除了肿瘤所以血清诊断结果与手术时相比降低。

[0272] (2)－5复发诊断

[0273] 患病犬8(哈士奇犬)于2007年5月8日进行乳腺癌摘除手术。此时进行的血清诊断的结果为450nm处的吸光度为0.11。使用摘除的组织进行的病理诊断中，异型性强的上皮系细胞主要形成腺管结构、并增殖，被诊断为乳腺原发性腺癌。此时已经确认到多数癌细胞进入淋巴管内，向淋巴结及远位部的转移、复发的风险高。在手术后约一个半月后即2007年6月28日在相同部位确认到复发。此时血清诊断结果为0.12，可确认值升高。患病犬8由于肿瘤未被完全切除或者复发，所以血清诊断结果与5月上旬相比6月下旬较大地被检测到。

[0274] 患病犬9(喜乐蒂牧羊犬)于2006年10月24日进行腺管癌摘除手术。此时进行的血清诊断的结果为450nm处的吸光度约为0基本检测不到。在约3个月后即2007年1月31日复发，再次入院就诊再次进行摘除手术。使用此时摘除的组织进行的病理诊断中，具有卵圆形异型核的癌细胞侵袭多数淋巴管，腹股沟淋巴结转移，因此诊断为可能发生远位转移的腺管癌(乳癌)。此时进行的血清诊断的结果为450nm处的吸光度为0.10，升高。可知患病犬9中同样由于肿瘤未被完全切除或复发，所以血清诊断结果在3个月后较大地被检测到。

[0275] (2)－6转移诊断

[0276] 患病犬10(苏格兰梗)为反复出现转移·复发的患病犬：2003年2月乳腺肿瘤、2003年8月口腔内恶性黑色素瘤、2005年1月嘴唇恶性黑色素瘤、2005年4月13日口腔内黑色素瘤,且上述肿瘤均已通过手术被切除。2005年4月口腔内黑色素瘤复发后，因追踪观察再次入院就诊于2006年12月17日进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0.39。半年后即2007年6月20日颈部淋巴结、颧淋巴结肥大，再次入院就诊。如果为淋巴瘤则全身的淋巴结均肿，但患病犬10仅有2处肿，所以临床诊断为很可能是因转移引起的淋巴瘤。根据利用本方法的诊断也可知，450nm处的吸光度为0.80明显上升，为以前存在的肿瘤的转移。

[0277] 患病犬11(柴犬)为于2006年3月11日因右唇部口腔恶性黑色素瘤进行了肿瘤摘除的患病犬。自2006年6月10日至同年9月26日给与抗癌剂(环磷酰胺)进行治疗，自2006年5月23日继续给与有机锗主成分的Biremo S。认为该肿瘤的转移于2007年3月20日肿瘤摘除时进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0.06。使用此时摘除的组织进行的病理诊断中，诊断为转移性恶性黑色素瘤。但是，转移后的黑色种在手术后3个月的2007年6月27日再次引起转移。虽然2007年3月20日在右颈部产生肿瘤，但此次在其相反侧产生，肿瘤的形状也形成与前次类似的黑色块。大小为3.1×3.2×0.8cm，临床诊断也为转移。此时进行的血清诊断的结果，确认到450nm处的吸光度为0.19，升高，可知其转移。

[0278] (2)－7治疗监控

[0279] 患病犬11(迷你腊肠犬)为于2007年4月19日进行了肿瘤摘除的患病犬。使用摘除的肿瘤进行病理诊断，结果为复合型乳腺癌，为浸润性、转移性发生可能性高的中等程度的恶性程度。此时血清诊断的结果为450nm处的吸光度为0.30。自摘除手术后约1年即2008年6月3日血清诊断的结果为450nm处的吸光度为0.25，降低。此时肉眼未确认到癌的复发，但为了防止复发在其后的2个月内以每周一次的间隔给与抗癌剂(Intercat)，维持不复发的状态。在开始给与抗癌剂2周后、4周后、6周后进行血清诊断，结果450nm处的吸光度分别为0.25、0.19、0.19。由患病犬11的结果可知，如果完全切除肿瘤则与罹癌状态相比值降低，如果在抗癌剂治疗中也可以抑制癌复发，则不会见到值升高，遵循治疗的经时变化。另外，可知如患病犬8所示由于也可以诊断复发，所以也可以进行治疗监控。

[0280] (2)－8复发时的恶性诊断

[0281] 患病犬12(吉娃娃犬)于2007年4月27日进行了肿瘤摘除的患病犬。使用摘除的肿瘤进行病理诊断，结果为来自乳管上皮的腺管癌，即恶性乳癌。由于在此约1年后即2008年6月29日再次发现了肿瘤，所以进行了摘除手术。使用其摘除的肿瘤进行病理组织诊断，结果来自乳管上皮的肿瘤细胞形成不规则的腺腔，还确认到向内腔进行多层化形成的部分，但构成细胞具有基本均一的卵圆形核，细胞的异型性为轻度，据此诊断为良性乳腺癌。此时血清诊断的结果为450nm处的吸光度为0完全检测不到。由患病犬8、12的结果可知，复发时在为恶性的情况下血清诊断值升高或者被维持，在为良性的情况下未检测到。

[0282] (2)－9良性肿瘤患病犬的预后诊断

[0283] 患病犬13(玩具贵宾犬)为2007年10月9日进行了肿瘤摘除的患病犬。使用摘除的肿瘤进行病理诊断，结果形成乳腺上皮细胞和筋上皮细胞两成分增殖的肿瘤，但两成分均未表现出恶性症状，诊断为乳腺良性混合肿瘤。此时血清诊断的结果为450nm处的吸光度仅检测到为0.13。其8个月后即2008年6月5日进行再次采血，结果450nm处的吸光度为0完全检测不到。临床上此时也未确认到复发。因此，可知即使为良性肿瘤患病犬，如果在存在肿瘤的状态时检测到血清诊断值，则切除肿瘤时值降低，且可以进行预后诊断。

[0284] (3)猫的诊断

[0285] 接下来，对罹癌猫及健康猫进行诊断。使用上述使用的犬钙镁蛋白质和抗猫IgG抗体，与上述同样地测定与该多肽特异性反应的猫血清中的IgG抗体效价。第二抗体是将HRP修饰抗猫IgG抗体(PEROXIDASE－CONJUGATED GOAT IgG FRACTION TO CAT IgG(WHOLEMOLECULE)：CAPPEL RESERCH REAGENTS公司制)用封闭溶液稀释8000倍进行使用的。

[0286] 患病猫1(金吉拉猫)为2005年8月17日因乳腺癌接受了肿瘤摘除手术的患病猫。患病猫1在450nm处的吸光度为0.22。另外，2006年10月17日因腺管癌接受了摘除手术的、患病猫2(喜马拉雅猫)在450nm处的吸光度为0.21。而健康猫中完全未检测到。

[0287] 因此，与犬同样地在为猫的情况下在患有癌的样品中也能检测出值，而在健康样品中完全未检测到，因此，与犬同样，猫也可以通过使用犬钙镁蛋白质的本方法进行癌诊断。

[0288] (4)健康人的诊断

[0289] 使用上述使用的犬钙镁蛋白质和抗人IgG抗体，与上述同样地测定与该蛋白特异性反应的健康人血清中的IgG抗体效价。第二抗体是将HRP修饰抗人IgG抗体(HRP－Goat Anti－Human IgG(H+L)Conjugate：Zymed Laboratories公司制)用封闭溶液稀释10000倍进行使用的。作为阳性对照使用将用磷酸盐缓冲生理盐水调整为50μg/m1的卵白蛋白抗原进行固相化的产物。结果，卵白蛋白抗原在健康人1中450nm处的吸光度为0.25。另一方面，该重组蛋白质于450nm处的吸光度为0.03基本未检测到。

[0290] 实施例B－4：使用了人钙镁蛋白质的癌诊断

[0291] 使用实施例B－2制备的人钙镁蛋白质，与实施例B－3同样地操作，测定与该蛋白反应的人、犬及猫血清中的IgG抗体效价。

[0292] 使用健康人血清进行诊断，结果，与实施例B－3(4)同样地使用卵白蛋白抗原作为阳性对照的情况下，将卵白蛋白固相化时可以检测到值，将人钙镁蛋白质固相化时基本未检测到。

[0293] 另外，健康犬·猫中也同样地在将该蛋白固相化时450nm处的吸光度基本未检测到。

[0294] 另一方面，患病犬12(西施犬)为2007年6月21日接受了乳腺癌摘除手术的患病犬。使用摘除的组织进行的病理诊断中，具有强异型性和浸润性的乳腺组织，以大小的块状进行腺样增殖，诊断为恶性。该患病犬12在450nm处的吸光度为0.70。使用在其他病理诊断中诊断为恶性的310个样品的血清进行恶性诊断。将为健康犬平均值的2倍以上判断为恶性时，可知有171个样品能够诊断为恶性，为55.0％。患病猫3(杂种)于2007年4月3日接受了乳腺癌摘除手术，但在该患病猫中450nm处的吸光度为0.38。

[0295] 由以上可知，即使使用人钙镁蛋白质，人、犬、猫也都可以进行相同的诊断。

[0296] 进而，与犬重组蛋白同样地使用人重组蛋白，对从末期癌患病犬体内采集的胸水、腹水进行诊断，结果可以检测到与使用血清的结果相同的值，可以诊断为癌。

[0297] 实施例B－5：通过测定抗原多肽的癌诊断(1)

[0298] 用实施例B－2制备的犬重组蛋白对小鼠、家兔进行免疫，制备、获得该抗原特异性抗体。使用该多克隆抗体，通过夹层ELISA法检测罹癌生物体血清中含有的该抗原多肽本身。对于与制备的该蛋白特异性多克隆抗体特异性反应的、血清中的该蛋白量，使用抗小鼠IgG抗体通过夹层ELISA法进行测定。

[0299] 第一抗体如下进行固相化：将用磷酸盐缓冲生理盐水稀释20倍的家兔抗血清按照100μL/孔添加到96孔Immobilizer Amino Plate(NUNC公司制)中，室温下振荡2小时。如下进行封闭：按照100μL/孔加入含有0.5％BSA(bovine serum albumin(牛血清白蛋白)、Sigma－Aldrich Japan公司制)的50mM碳酸氢钠缓冲溶液(pH8.3)(以下称为封闭溶液)，室温下振荡1小时。之后，按照100μL/孔添加用封闭溶液稀释的来自罹癌生物体的血清，室温下振荡3小时进行反应。此时将稀释倍率调整为10－1000倍的10倍稀释系列。用含有0.05％Tween20(和光纯药工业公司制)的磷酸盐缓冲生理盐水(以下PBS－T)清洗3次，按照100μL/孔加入用封闭溶液稀释200倍的小鼠抗血清作为第二抗体，室温下振荡1小时进行反应。用PBS－T清洗3次，按照100μL/孔加入用封闭溶液稀释2000倍的HRP修饰小鼠IgG抗体(Stabilized Goat Anti Mouse HRP conjugated：PIERCE公司制)作为第三抗体，室温下振荡1小时进行反应。用PBS－T清洗3次，按照100μl/孔添加HRP底物TMB(1－Step Turbo TMB(四甲基联苯胺)、PIERCE公司制)，室温下进行酶底物反应30分钟。之后，按照100μl/孔加入
0.5M硫酸溶液(Sigma－Aldrich Japan公司制)停止反应后，用微孔板读数仪测定450nm处的吸光度。作为对照，未将家兔抗血清固相化的物质、不使来自罹癌生物体的血清反应的物质与上述同样地操作进行比较。

[0300] 其结果，在患有皮肤平滑筋肉瘤、乳癌、恶性黑色素瘤等罹癌犬、罹癌猫中检测出多肽的值，在健康犬、健康猫及健康人中未检测到。因此，在使用以源自犬的重组多肽作为免疫原配制的抗体检测抗原多肽的该方法中，也可以诊断癌。

[0301] 实施例B－6：通过测定抗原多肽的癌诊断(2)

[0302] 用实施例B－2制备的人重组蛋白对小鼠、家兔进行免疫，制备、获得该抗原特异性抗体。与实施例B－5同样地，通过使用该多克隆抗体的夹层ELISA法检测罹癌生物体血清中含有的该抗原多肽本身。

[0303] 其结果在患有皮肤平滑筋肉瘤、乳癌、恶性黑色素瘤等罹癌犬、罹癌猫中可以检测到多肽的值，在健康犬、健康猫及健康人中未检测到。因此，使用以来自人的重组多肽作为免疫原配制的抗体检测抗原多肽的该方法中，也可以诊断癌。

[0304] 实施例C－1：通过SEREX法获得新型癌抗原蛋白

[0305] (1)构建cDNA文库

[0306] 通过酸－胍－苯酚－氯仿法(Acid guanidium－Phenol－Chloroform法)自健康犬的睾丸组织中提取全RNA，使用Oligotex－dT30mRNA purification Kit(宝酒造公司制)按照试剂盒所附的操作说明书纯化polyARNA。

[0307] 使用该所得的mRNA(5μg)构建犬睾丸cDNA噬菌体文库。在cDNA噬菌体文库的制备中使用cDNA Synthesis Kit，ZAP－cDNA Synthesis Kit，ZAP－cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE公司制)，按照试剂盒所附的操作说明书构建文库。构建的cDNA噬菌体文库大小为1.3×106pfu/ml。

[0308] (2)利用血清筛选cDNA文库

[0309] 使用上述构建的源自犬睾丸的cDNA噬菌体文库进行免疫筛选。具体而言，在Φ90×15mm的NZY琼脂糖平板中感染宿主大肠杆菌(XL1－BlueMRF’)使其为2340克隆，42℃下培养3～4小时，形成溶菌斑(plaque)，用浸透了IPTG(异丙基－β－D－硫代半乳糖苷)的硝酸纤维素滤膜(Hybond C Extra：GE Healthecare Bio－Science公司制)在37℃下覆盖培养板4小时，由此诱导·表达蛋白质，将蛋白质转印到膜上。之后回收膜，将其浸在含有0.5％脱脂奶粉的TBS(10mM Tris－HCl，150mM NaCl pH7.5)中，在4℃下振荡一夜，由此抑制非特异性反应。在室温下使此过滤膜与稀释500倍的患病犬血清反应2～3小时。

[0310] 作为上述患病犬血清使用从患有乳癌的患病犬中采集的血清。这些血清保存在－80℃，在即将使用前进行预处理。血清的预处理方法按照以下方法进行。即，用未插入外来基因的λZAP Express噬菌体感染宿主大肠杆菌(XL1－BLueMRF’)后，在NZY板培养基中在37℃下培养一夜。然后将含有0.5M NaCl的0.2M NaHCO3pH8.3的缓冲液加入培养板上，在4℃下静置15小时后，回收上清液作为大肠杆菌/噬菌体提取液。接下来，将回收的大肠杆菌/噬菌体提取液通入NHS－柱(GE Healthecare Bio－Science公司制)，将来自大肠杆菌·噬菌体的蛋白质固定化。使患病犬血清在该蛋白固定化柱中通入·反应，从血清中除去吸附在大肠杆菌和噬菌体上的抗体。将只是仅仅通过柱子的血清馏分用含有0.5％脱脂奶粉的TBS稀释500倍，将其作为免疫筛选材料。

[0311] 将经上述处理血清和上述融合蛋白印迹的膜用TBS－T(0.05％Tween20/TBS)清洗4次后，将用含有0.5％脱脂奶粉的TBS稀释5000倍的山羊抗犬IgG(Goat anti Dog IgG－h+I HRP conjugated：BETHYL Laboratories公司制)作为第二抗体，在室温下反应1小时，使用NBT/BCIP反应液(Roche公司制)通过酶显色反应检测，从Φ90×15mm的NZY琼脂糖平板上采集与显色反应阳性部位相一致的菌落，使其溶解在500μl SM缓冲液(100mM NaCl、10mM MgClSO4、50mM Tris－HCl、0.01％明胶pH7.5)中。用与上述相同的方法重复筛选二次、三次直至显色反应阳性菌落单一化，筛选出与血清中IgG反应的30940个噬菌体克隆，分离出一个阳性克隆。

[0312] (3)分离抗原基因的同源性检索

[0313] 为了将通过上述方法分离所得的一个阳性克隆用于碱基序列解析，进行操作将噬菌体载体转换为质粒载体。具体而言，将宿主大肠杆菌(XL1－Blue MRF’)制成吸光度OD600为1.0的溶液，将上述溶液200μl和100μl经纯化的噬菌体溶液以及1μl ExAssist helper phage(STRATAGENE公司制)混合后，在37℃下反应15分钟，之后添加3ml LB培养基在37℃下培养2.5～3小时，立即置于70℃水浴中保持温度20分钟后，在4℃下以1000×g离心15分钟，回收上清液作为噬菌粒溶液。然后，将噬菌粒宿主大肠杆菌(SOLR)制成吸光度OD600为1.0的溶液，将上述溶液200μl和经纯化的噬菌体溶液10μl混合后，在37℃下反应15分钟，取50μl接种于含有氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的LB琼脂培养基中，在37℃下培养一夜。采集经转化的SOLR单菌落，用含有氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的LB培养基在37℃下培养后，使用QIAGEN plasmid Miniprep Kit(Qiagen公司制)纯化含有目标插入片段的质粒DNA。

[0314] 经纯化的质粒使用序列号5所示的T3引物和序列号6所示的T7引物，通过引物步测法来解析插入片段的全长序列。通过该序列解析获得序列号25所示的基因序列。使用该基因的碱基序列及氨基酸序列，运行同源性检索程序BLAST搜索(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，进行与已知基因同源性的检索，结果表明所得的基因是与序列号41所示的被注册的CEP基因在碱基序列·氨基酸序列(其中，仅以重叠区域计算)上具有99％同源性的基因，判断该基因为CEP基因。获得的犬CEP的人同源因子为人CEP(与序列号25所示的CEP基因的同源性：碱基序列87％、氨基酸序列84％)。人CEP的碱基序列如序列号27所示，氨基酸序列如序列号28所示。

[0315] (4)在各种组织中的表达解析

[0316] 对于通过上述方法所得的基因，通过RT－PCR(Reverse Transcription－PCR)法研究其在犬及人正常组织及各种细胞株中的表达。逆转录反应如下进行。即，使用TRIZOL试剂(invitrogen公司制)按照所附的操作说明书从50－100mg各种组织及各种细胞株5－10×106个细胞中提取全RNA。通过Superscript First－Strand Synthesis System for RT－PCR(invitrogen公司制)按照所附的操作说明书使用上述全RNA合成cDNA。人正常组织(脑、海马、睾丸、结肠、胎盘)的cDNA，使用Gene Pool cDNA(invitrogen公司制)、QUICK－Clone cDNA(Clontech公司制)及Large－Insert cDNA Library(Clontech公司制)。PCR反应使用对获得的基因具有特异性的引物(如序列号29及30所示)如下进行。即，加入各试剂和附加缓冲液使总量为25μl，其中使通过逆转录反应配制的样品为0.25μl，上述引物各为2μM，各dNTP为0.2mM，ExTaq聚合酶(宝酒造公司制)为0.65U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制)，以94℃－30秒、55℃－30秒、72℃－30秒为一个循环，将该循环重复进行30次。需要说明的是，上述基因特异性引物是扩增下述区域的引物，所述区域是序列号25及序列号41的碱基序列(犬CEP基因)中的4582号～5124号以及序列号27的碱基序列(人CEP基因)中的4610号～5152号碱基的区域，使用该引物也可以研究犬CEP基因及人CEP基因中任一者的表达。为了比较对照，同时也使用了GAPDH特异性的引物(如序列号9及10所示)。其结果，如图9所示犬CEP基因在健康犬组织中显著表达于睾丸中，另一方面也发现该基因在犬乳癌细胞中显著表达。人CEP基因的表达也与犬CEP基因同样，在人正常组织中能够确认其表达的部位仅限于睾丸，但在人癌细胞中则于脑肿瘤、白血病、食道癌中均检测出其表达，特别是由于其在白血病细胞株中表现出显著表达，所以可以确认人CEP基因也特异性地表达于睾丸和癌细胞中。

[0317] 需要说明的是，图9中纵轴的标号1表示CEP基因的表达谱，标号2表示作为比较对照的GAPDH基因的表达谱。

[0318] 实施例C－2：来自犬及人CEP的多肽的制备

[0319] (1)重组蛋白质的制备

[0320] 基于实施例C－1中获得的序列号25的基因，按照以下方法制备重组蛋白质。PCR如下进行：加入各试剂和附加缓冲液使总量为50μl，使由实施例C－1中得到的噬菌粒溶液配制并供序列解析的载体为1μl、含有BamHI及SalI限制性酶切断序列的两种引物(如序列号31及32所示)各为0.4μM、dNTP为0.2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造公司制)为1.25U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制)，以98℃－10秒、55℃－5秒、72℃－7分钟为一个循环，将上述循环重复30次。需要说明的是，通过上述两种引物可以得到编码序列号26的氨基酸序列中的1514号～2339号氨基酸区域(序列号35)的区域。PCR后，用1％琼脂糖凝胶对经扩增的DNA进行电泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制)纯化约2.5kbp的DNA片段。

[0321] 同样地，使用序列号37及38所示的两种引物进行PCR，得到编码序列号26的氨基酸序列全长的区域。PCR后，用1％琼脂糖凝胶对经扩增的DNA进行电泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制)纯化约7.0kbp的DNA片段。

[0322] 进而，使用序列号37及43所示的两种引物进行PCR，得到编码序列号42的氨基酸序列全长的区域。PCR后，用1％琼脂糖凝胶对经扩增的DNA进行电泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制)纯化约7.8kbp的DNA片段。

[0323] 将经纯化的各DNA片段与克隆载体pCR－Blunt(invitrogen公司制)连接。将其转化至大肠杆菌中后回收质粒，通过测序确认了经扩增的基因片段与靶序列一致。用BamHI及SalI限制性酶处理与靶序列一致的质粒，用QIAquick Gel Extraction Kit纯化后，将靶基因序列插入用BamHI、SalI限制性酶处理后的大肠杆菌用表达载体pET30a(Novagen公司制)中。通过使用该载体可产生His标签融合型重组蛋白质。将该质粒转化至表达用大肠杆菌BL21(DE3)，通过利用1mM IPTG的表达诱导，能够使靶蛋白在大肠杆菌内表达。

[0324] 另外，基于序列号27的基因，采用以下方法制备人同源基因的重组蛋白质。PCR如下进行：加入各试剂和附加缓冲液使总量为50μl，其中，实施例C－1制备的各种组织·细胞cDNA中已确认通过RT－PCR法表达的cDNA为1μl、含有BamHI及SalI限制性酶切断序列的两种引物(如序列号33及34所述)各为0.4μM、dNTP为0.2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造公司制)为1.25U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制)，以98℃－10秒、55℃－5秒、72℃－7分钟为一个循环，将上述循环重复30次。需要说明的是，由上述两种引物可以得到编码序列号28的氨基酸序列中的1513号～2325号氨基酸的区域(序列号36)的区域。PCR后，用1％琼脂糖凝胶对经扩增的DNA进行电泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制)纯化约2.5kbp的DNA片段。

[0325] 同样地，使用序列号39及40所示的两种引物进行PCR，得到编码序列号28的氨基酸序列全长的区域。PCR后，用1％琼脂糖凝胶对经扩增的DNA进行电泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制)纯化约7.0kbp的DNA片段。

[0326] 将经纯化的各DNA片段与克隆载体pCR－Blunt(invitrogen公司制)连接。将其转化至大肠杆菌中后回收质粒，通过测序确认了经扩增的基因片段与靶序列一致。用BamHI及SalI限制性酶处理与靶序列一致的质粒，用QIAquick Gel Extraction Kit纯化后，将靶基因序列插入用BamHI、SalI限制性酶处理后的大肠杆菌用表达载体pET30a(Novagen公司制)中。通过使用该载体可产生His标签融合型重组蛋白质。将该质粒转化至表达用大肠杆菌BL21(DE3)，通过利用1mM IPTG的表达诱导，能够使靶蛋白在大肠杆菌内表达。

[0327] (2)重组蛋白质的纯化

[0328] 在37℃下用含有卡那霉素(终浓度30μg/m1)的LB培养基培养上述所得的、表达序列号26的一部分及序列号28的一部分的各重组大肠杆菌，至600nm处的吸光度约为0.7后，添加IPTG使其终浓度为1mM，在30℃下培养20小时。之后以4800rpm离心10分钟进行集菌。将此菌体球状物悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中，进而以4800rpm离心10分钟，清洗菌体。

[0329] 将该菌体悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中，在冰上进行超声裂解。将大肠杆菌超声裂解液以7000rpm离心分离20分钟，所得上清液为可溶性馏分，沉淀为不溶性馏分。将不溶性馏分悬浮于4％TritonX－100溶液中，以7000rpm离心20分钟。重复该操作2次，除去蛋白酶。之后，将残渣悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中，进行脱表面活性剂操作。将该残渣悬浮于含有8M尿素(Sigma－Aldrich Japan公司制)的10mMTris盐酸、100mM磷酸缓冲溶液(以下称为8M尿素溶液)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒溶液(Protease Inhibitor Cocktail)中，在4℃下静置15小时，使蛋白质变性。

[0330] 该变性操作后以7000rpm离心20分钟将所得的可溶性馏分添加到按照通用方法调整的镍螯合柱(载体Chelateing Sepharose(商标)Fast Flow(GE Health Care公司)中，柱容量为5mL，平衡缓冲液为8M尿素溶液)，进而在4℃下静置一夜。将该柱载体以1500rpm离心5分钟，回收上清液，将柱载体悬浮在磷酸盐缓冲生理盐水中后，再次填充到柱中。将未吸附馏分用柱容量5倍量的8M尿素溶液和柱容量10倍量含有0.5M氯化钠的0.1M酢酸缓冲液(pH5.0)和含有10mM咪唑的20mM磷酸缓冲液(pH8.0)进行清洗操作，立即用分为5阶段的
100mM－500mM咪唑阶段浓度梯度进行洗脱。采集柱容量5倍量的各洗脱馏分。靶蛋白的洗脱根据按照通用方法进行的考马斯染色法确认，根据该结果将洗脱馏分浓缩作为诊断用固相化材料。

[0331] 与上述相同地，培养在实施例C－2(1)中得到的、表达序列号26的全长及序列号28的全长、序列号42的全长的各重组大肠杆菌，进行靶蛋白的纯化，得到诊断用固相化材料。

[0332] 实施例C－3：使用了来自犬CEP的多肽的癌诊断

[0333] (1)犬的癌诊断

[0334] 从被确认患有恶性或良性肿瘤的486只犬和6只健康犬体内采集血液，分离血清。使用实施例C－2制备的犬CEP的部分多肽(序列号26的氨基酸序列中：1514号～2339号、序列号35)和抗犬IgG抗体，通过ELISA法测定与该多肽特异性反应的血清中IgG抗体效价。

[0335] 制备的多肽如下进行固相化：按照100μL/孔将用磷酸盐缓冲生理盐水稀释为50μg/mL的重组蛋白质溶液添加到96孔Immobilizer Amino Plate(NUNC公司制)中，在4℃下静置一夜。如下进行封闭：按照100μL/孔加入含有0.5％BSA(bovine serum albumin(牛血清白蛋白)、Sigma－Aldrich Japan公司制)的50mM碳酸氢钠缓冲溶液(pH8.3)(以下称为封闭溶液)，室温下振荡1小时。按照100μL/孔添加使用了封闭溶液进行稀释的500倍稀释血清，室温下振荡3小时进行反应。用含有0.05％Tween20(和光纯药工业公司制)的磷酸盐缓冲生理盐水(以下称为PBS－T)清洗3次，按照100μL/孔加入用封闭溶液稀释3000倍的HRP修饰犬IgG抗体(Goat anti Dog IgG－h+I HRP conjugated：BETHYL Laboratories公司制)，室温下振荡1小时进行反应。用PBS－T清洗3次，按照100μl/孔添加HRP底物TMB(1－Step Turbo TMB(四甲基联苯胺)、PIERCE公司)，室温下进行酶底物反应30分钟。之后，按照100μl/孔加入0.5M硫酸溶液(Sigma－Aldrich Japan公司制)停止反应后，用微孔板读数仪测定450nm处的吸光度。作为对照，未将制备的重组蛋白质固相化的物质、不使罹癌犬血清反应的物质与上述同样地操作进行比较。

[0336] 使用被摘除的肿瘤组织进行病理诊断，结果上述癌诊断中使用的全部486个样品中有311个样品被确诊为恶性。

[0337] 具体而言，上述样品接受了下述癌诊断，所述癌为：恶性黑色素瘤、恶性混合肿瘤、肝细胞癌、基底细胞癌、棘细胞瘤样龈瘤、口腔内肿瘤、肛门周围腺癌、肛门囊肿、肛门囊顶泌腺癌、塞尔托利细胞瘤、阴道前庭癌、皮脂腺癌、皮脂腺上皮瘤、脂腺腺瘤、汗腺癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、甲状腺癌、大肠癌、支气管腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、复合型乳腺癌、乳腺恶性混合肿瘤、乳管内乳头状腺癌、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、软组织肉瘤、组织细胞肉瘤、粘液肉瘤、未分化肉瘤、肺癌、肥大细胞瘤、皮肤平滑肌瘤、腹腔内平滑肌瘤、平滑肌瘤、鳞状上皮癌、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、消化管型淋巴瘤、消化器型淋巴瘤、小～中细胞型淋巴瘤、肾上腺髓质肿瘤、粒层细胞瘤、嗜铬细胞瘤、膀胱癌(移行细胞癌)、化脓性炎症、腹腔内肝脏肿瘤、肝癌、浆细胞瘤、恶性血管外膜细胞瘤、血管肉瘤、肛门囊腺癌、口腔癌、转移性恶性黑色素瘤、无黑色素性恶性黑色素瘤、皮肤恶性黑色素瘤、恶性肌上皮瘤、恶性睾丸上皮瘤、精原细胞瘤(seminoma)、大肠腺癌、胃腺癌、低度皮脂腺癌、耳垢腺癌、顶泌腺癌、低分化型顶泌腺癌、恶性纤维性组织细胞瘤、多发性骨髓瘤、间叶组织恶性肿瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、起因不明的肉瘤、软组织肉瘤(纺锤形细胞肿瘤)、低分化肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、转移性恶性上皮肿瘤、管状乳腺腺癌、乳腺导管癌、炎性乳癌、生殖细胞瘤、白血病、浸润性毛发上皮瘤、中细胞型淋巴瘤、多中心型淋巴瘤、骨肉瘤(乳腺)、肥大细胞瘤(PatnaikII型)、肥大细胞瘤(GradeII)、平滑筋肉瘤等。

[0338] 来自上述罹癌犬生物体的血清，如图11所示，针对重组蛋白质的抗体效价非常高。为健康犬平均值的2倍以上即可根据本诊断方法判断为恶性时，可知有197个样品被诊断为恶性，为63.3％。该197个样品的癌的种类如下所述。需要说明的是，根据样品不同，存在患有多种癌的样品，以下所示的数值为每种癌的累计值。

[0339] 恶性黑色素瘤8例、淋巴瘤9例、嗜铬细胞瘤1例、化脓性炎症1例、粒层细胞瘤1例、肝细胞癌5例、血管瘤1例、恶性睾丸肿瘤6例、口腔内肿瘤5例、肛门周围腺癌12例、骨肉瘤4例、纤维肉瘤8例、腺管癌10例、软骨肉瘤2例、乳腺癌35例、复合型乳腺癌24例、肺癌2例、皮脂腺癌2例、鼻腺癌2例、肥大细胞瘤24例、肾上腺髓质肿瘤1例、平滑筋肉瘤1例、鳞状上皮癌4例、慢性淋巴细胞性白血病1例、未分化肉瘤1例、恶性混合瘤1例、左肺后叶肿瘤1例、右腋下部肿瘤1例、右前肢肘部肿瘤1例、膀胱癌(移行细胞癌)1例、转移性恶性黑色素瘤3例、无黑色素性恶性黑色素瘤1例、大肠腺癌1例、浆细胞瘤1例、组织细胞肉瘤1例、脂肪肉瘤1例、低分化肉瘤1例、滑膜肉瘤1例、恶性血管外膜细胞瘤1例、顶泌汗腺癌3例、支气管腺癌1例。

[0340] 进而，使用从末期癌患病犬体内采集的胸水、腹水，进行相同的诊断，结果可以检测出与通过使用血清的本诊断方法所得的结果相同的值，可以诊断为癌。

[0341] 另外，可知通过采用本诊断方法还可以进行肉眼不可见部分的癌诊断、进展程度诊断、恶性程度诊断、术后的追踪诊断、复发诊断、转移诊断等诊断。以下举出数例图12所示的详细诊断的具体例。

[0342] (2)－1肉眼不可见肿瘤的癌诊断

[0343] 患病犬1(FLAT COATED RETRIEVER)在2007年6月7日时间点未确认到肿瘤，但在其约20日后即2007年6月24日在左上颚犬齿根的牙龈处发现了蒂状的直径2mm的肿瘤。在发现之日将蒂部结扎并切除。在可以肉眼确认到肿瘤以前，可以确认在450nm处的吸光度为0.41，是显著高的值，与发现肿瘤时的0.43比较变化不大。由该结果可知，通过使用本方法还可以诊断腹腔内等肉眼不可见部分的癌。

[0344] 另外，在可以肉眼确认肿瘤以前，可以确认该值上升，一般认为显示出了肿瘤发生的前兆。因此，可知对定期健康检查等健康诊断也有用。

[0345] 在切除肿瘤2周后再次对该患病犬1进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0.06，显著降低。所以，还可以确认引起抗体效价上升的癌抗原表达的肿瘤被完全切除。(参见(2)－4术后的追踪诊断)

[0346] (2)－2癌的进展程度诊断

[0347] 癌的进展程度通过肿瘤的大小及深度、对周围组织带来何种影响、是否发生转移等进行判断。可知转移即癌发展时可以检测出比以前高的值。进而作为又一例，以下对通过给与抗癌剂的具体例进行的进展程度诊断详细说明。

[0348] 患病犬2(迷你腊肠犬)于2007年2月21日因恶心和越来越瘦入院就诊，在腹腔内发现2处大型肿瘤。2007年2月23日进行肿瘤摘除，右肾肥大为433g，附近淋巴结也富含血管为42g。使用此时摘除的组织进行的病理诊断中，诊断为多中心型恶性淋巴瘤。确认到肿瘤细胞向脂肪组织中弥散性扩散，诊断为可能向腹腔内的其他的脏器扩散。肿瘤摘除手术后自
2007年3月1日开始给与抗癌剂(Oncovin)，在之后的2个月后、3个月后共进行三次血清诊断。其结果450nm处的吸光度分别为0.15、0.15、0.07。自给药开始时刻，值慢慢降低，可以确认表现出抗癌剂效果。即可知能够抑制癌的发展。由患病犬2的结果可知，还可以诊断癌进展程度。进而，认为作为其一例如上所述也可以诊断抗癌剂治疗效果。

[0349] (2)－3癌的恶性程度诊断

[0350] 基底细胞瘤包括恶性型和良性型，近年来在新WHO中存在以恶性型为基底细胞癌、以良性型为毛芽瘤进行分类的倾向。

[0351] 诊断为基底细胞癌(恶性)的患病犬3(比格犬)在手术时进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0.14。另一方面，诊断为毛芽瘤(良性)的患病犬4(杂种)在手术时进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0完全检测不到。因此，认为即使为相同的基底细胞瘤也可以诊断出恶性型基底细胞癌和良性型毛芽瘤。

[0352] 接下来，举出乳腺肿瘤的例子。乳腺肿瘤包括乳腺癌或乳腺恶性混合肿瘤等恶性肿瘤、和未表现出恶性症状的良性乳腺肿瘤。患病犬5(约克犬)为于2006年5月17日因乳腺恶性混合肿瘤和乳腺癌接受了摘除手术的患病犬。通常，乳腺的混合肿瘤即使为恶性，由于缺乏向周围的浸润性，所以也容易完全切除，切除后的追踪诊断多为良好。但是在使用摘除的组织进行的病理诊断中，患病犬5标本的一部分成分中可见浸润性，诊断为恶性程度高的肿瘤。另外，乳腺癌通常为向周围的浸润性强、容易引起复发或转移的肿瘤。患病犬5的标本上肿瘤细胞中未见浸润性，但由于部分材料，所以其他区域中恶性程度高的成分也可能增殖。因此，由病理诊断结果表明患病犬5为恶性程度高的乳癌。该手术时采集的血清诊断的结果为450nm处的吸光度为0.77。另一方面，患病犬6(约克夏犬)为于2007年1月28日接受了乳腺肿瘤摘除手术的患病犬。在使用此时的摘除组织进行的病理诊断中，细胞异型性为轻度，诊断为未见恶性症状的良性乳腺癌。该手术时采集的血清诊断结果为450nm处的吸光度为0。从以上2个样品的结果也可知，恶性程度高的肿瘤与恶性程度低即良性肿瘤相比值大。

[0353] (2)－4术后的追踪诊断

[0354] 患病犬7(杂种)为于2003年8月和2006年8月9日接受了肛门周围腺瘤摘除手术的患病犬。2006年8月9日因在相同部位再次发生相同的肿瘤所以临床诊断为复发。在使用复发手术时的组织进行的病理诊断中，认为与通常的肛门周围腺瘤比大小不同、或核异型等细胞异型或浸润性强，另外核分裂像也多，因此诊断为恶性肿瘤。按照病理诊断医生的建议需要注意再次局部复发及转移形成。此时血清诊断结果为450nm处的吸光度为0.43。该手术后约4个月即2006年12月19日进行术后追踪观察时再次进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0.32，值降低。至2007年8月之前未确认到复发、转移。因此可以认为患病犬7由于完全切除了肿瘤所以血清诊断结果与手术时相比降低。

[0355] (2)－5复发诊断

[0356] 患病犬8(哈士奇犬)于2007年5月8日进行乳腺癌摘除手术。此时进行的血清诊断的结果为450nm处的吸光度为0.09。使用摘除的组织进行的病理诊断中，异型性强的上皮系细胞主要形成腺管结构、并增殖，被诊断为乳腺原发性腺癌。此时可以确认多数癌细胞已经进入淋巴管内，向淋巴结及远位部转移、复发的风险高。手术后约一个半月后即2007年6月28日在相同部位确认到复发。此时血清诊断结果为0.10，值升高。认为患病犬8由于肿瘤未被完全切除或者复发，所以血清诊断结果与5月上旬相比6月下旬较大地被检测到。

[0357] 患病犬9(喜乐蒂牧羊犬)于2006年10月24日进行腺管癌摘除手术。此时进行的血清诊断的结果为450nm处的吸光度为0.02。约3个月后即2007年1月31日复发，再次入院就诊再次进行摘除手术。使用此时摘除的组织进行的病理诊断中，由于具有卵圆形异型核的癌细胞侵袭多数淋巴管，腹股沟淋巴结转移，所以诊断为可能发生远位转移的腺管癌(乳癌)。此时进行的血清诊断的结果，可以确认450nm处的吸光度升高，为0.09。可知患病犬9同样地由于肿瘤不确定是否被完全切除或复发，所以血清诊断结果在3个月后较大地被检测到。

[0358] (2)－6转移诊断

[0359] 患病犬10(苏格兰梗)为反复出现转移·复发的患病犬：2003年2月乳腺肿瘤、2003年8月口腔内恶性黑色素瘤、2005年1月嘴唇恶性黑色素瘤、2005年4月13日口腔内黑色素瘤，且且上述肿瘤均已通过手术被切除。2005年4月口腔内黑色素瘤复发后，因追踪观察再次入院就诊于2006年12月17日进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0.42。其半年后即2007年6月20日颈部淋巴结、颧淋巴结肥大，再次入院就诊。如果为淋巴瘤则全身的淋巴结均肿，但患病犬10仅有2处肿，临床诊断为很可能是因转移引起的淋巴瘤。根据利用本方法的诊断也可知，450nm处的吸光度显著升高，为0.91，以前存在的肿瘤发生转移。

[0360] (2)－7治疗监控

[0361] 患病犬12(杂种)为2007年7月27日进行了肿瘤摘除的患病犬。使用摘除的肿瘤进行病理诊断，结果确认到乳癌向乳管内进展性增殖，诊断为腺管癌。此时血清诊断的结果为450nm处的吸光度为0.24。自摘除手术13个月后的现在未确认到癌复发。自摘除手术约1个月后即2007年9月3日、2个月后即2007年10月12日、10个月后即2008年6月1日再次进行了血清诊断，结果450nm处的吸光度分别为0.18、0.18、0.12。

[0362] 由患病犬12的结果可知，如果完全切除肿瘤则与罹癌状态相比值降低，如果未引起癌的复发则不会出现值升高，遵循治疗的经时变化。另外，可知由于如患病犬8所示也可以诊断复发，所以也可以进行治疗监控。(2)－8复发时的恶性诊断

[0363] 患病犬13(金毛寻回犬)为2005年5月1日进行了肿瘤摘除的患病犬。使用摘除的肿瘤进行病理诊断，结果来自乳管上皮的恶性肿瘤性病变，即为恶性乳腺管癌及向乳管内进展并增生的恶性乳头状癌。约3年后即2008年6月28日由于再次发现肿瘤，所以进行摘除手术。使用其摘除的肿瘤进行病理组织诊断，结果仅发现在可见前次手术创伤的皮下缝合线周围有嗜中性粒细胞及小噬细胞、浆细胞等的明显的炎症细胞浸润，故诊断为无肿瘤性病变。此时血清诊断的结果为450nm处的吸光度为0完全检测不到。由患病犬8、9、13的结果可知，复发时为恶性的情况下血清诊断值升高或维持原状，为良性的情况下检测不到。

[0364] (2)－9良性肿瘤患病犬的预后诊断

[0365] 患病犬14(玩具贵宾犬)为2007年10月9日进行了肿瘤摘除的患病犬。使用摘除的肿瘤进行病理诊断，结果形成乳腺上皮细胞和筋上皮细胞两成分增殖的肿瘤，但两成分均未表现出恶性症状，诊断为乳腺良性混合肿瘤。此时进行血清诊断的结果，450nm处的吸光度仅检测到为0.05。其8个月后即2008年6月5日进行再次采血，结果450nm处的吸光度为0完全检测不到。临床上此时也未确认到复发。因此，可知即使为良性肿瘤患病犬，如果在存在肿瘤的状态时检测到血清诊断值，则切除肿瘤时值降低，且可以进行预后诊断。

[0366] (3)猫的诊断

[0367] 接下来，进行罹癌猫及健康猫的诊断。使用上述使用的犬CEP的部分多肽和抗猫IgG抗体，与上述同样地测定与该多肽特异性反应的猫血清中的IgG抗体效价。第二抗体是将HRP修饰抗猫IgG抗体(PEROXIDASE－CONJUGATED GOAT IgG FRACTION TO CAT IgG(WHOLEMOLECULE)：CAPPEL RESERCH REAGENTS公司制)用封闭溶液稀释8000倍进行使用的。

[0368] 患病猫1(金吉拉猫)为2005年8月17日因乳腺癌接受了肿瘤摘除手术的患病猫。患病猫1在450nm处的吸光度为0.48。另外，2006年10月17日因腺管癌接受了摘除手术的、患病猫2(喜马拉雅猫)在450nm处的吸光度为0.18。而健康猫中完全未检测到。

[0369] 因此，为猫的情况下也与犬同样地在患有癌的样品中检测出值，而在健康样品中完全未检测到，因此可知，与犬同样，猫也可以根据使用来自犬CEP的多肽的本方法进行癌诊断。

[0370] (4)健康人的诊断

[0371] 使用上述使用的犬CEP的部分多肽和抗人IgG抗体，与上述同样地测定与该多肽特异性反应的健康人血清中的IgG抗体效价。第二抗体是将HRP修饰抗人IgG抗体(HRP－Goat Anti－Human IgG(H+L)Conjugate：Zymed Laboratories公司制)用封闭溶液稀释10000倍进行使用。作为阳性对照使用将用磷酸盐缓冲生理盐水调整为50μg/m1的卵白蛋白抗原进行固相化的产物。结果，卵白蛋白抗原在健康人1中450nm处的吸光度为0.25。另一方面，该重组蛋白质中为0.02，基本检测不到。另外，健康人2中卵白蛋白抗原450nm处的吸光度为0.18，而该重组蛋白质中为0.03，基本未检测到。

[0372] 另外，使用实施例C－2制备的序列号26所示的犬CEP的全长多肽，与上述同样地进行诊断，结果可知人、犬、猫也都可以进行相同的诊断。

[0373] 进而，使用实施例C－2制备的序列号42所示的犬CEP的全长多肽，与上述同样地进行诊断，结果可知人、犬、猫也都可以进行相同的诊断。

[0374] 实施例C－4：使用来自人CEP的多肽的癌诊断

[0375] 使用实施例C－2制备的人CEP的部分多肽(序列号28的氨基酸序列中：1513号～2325号、序列号36)，与实施例C－3同样地操作，测定与该多肽反应的、在人、犬及猫血清中的IgG抗体效价。

[0376] 使用健康人血清进行诊断，结果，在与实施例C－3(4)同样地使用卵白蛋白抗原作为阳性对照的情况下，将卵白蛋白固相化时可以检测到值，将人CEP的部分多肽固相化时基本检测不到。

[0377] 另外，在健康犬·猫中也同样，将该多肽固相化时450nm处的吸光度基本检测不到。

[0378] 另一方面，患病犬11(西施犬)为2007年6月21日接受了乳腺癌摘除手术的患病犬。使用摘除的组织进行的病理诊断中，具有强异型性和浸润性的乳腺组织以大小的块状进行腺样增殖，故诊断为恶性。该患病犬11在450nm处的吸光度为0.33。使用在其他病理诊断中诊断为恶性的310个样品的血清，进行恶性诊断。将为健康犬平均值的2倍以上判断为恶性时，可知有185样品能够诊断为恶性，为59.5％。

[0379] 另外，患病猫3(杂种)于2007年4月3日接受了乳腺癌摘除手术，但该患病猫在450nm处的吸光度为0.15。

[0380] 由以上可知，即使使用来自人CEP的多肽，在人、犬、猫中也均可以进行相同的诊断。

[0381] 进而，与犬重组蛋白同样地使用人重组蛋白，对从末期癌患病犬体内采集的胸水、腹水进行诊断，结果可以检测到与使用血清的结果相同的值，可以诊断为癌。

[0382] 另外，使用实施例C－2制备的序列号28所示的人CEP的全长多肽，与上述同样地诊断，结果可知在人、犬、猫中也均可以进行相同的诊断。

[0383] 实施例C－5：通过测定抗原多肽的癌诊断(1)

[0384] 用实施例C－2制备的序列号35所示的犬重组蛋白对小鼠、家兔进行免疫，制备、获得该抗原特异性抗体。使用该多克隆抗体，通过夹层ELISA法检测罹癌生物体血清中含有的该抗原多肽本身。对于与制备的该蛋白特异性多克隆抗体特异性反应的、血清中的该蛋白量，使用抗小鼠IgG抗体通过夹层ELISA法进行测定。

[0385] 第一抗体如下进行固相化：将用磷酸盐缓冲生理盐水稀释20倍的家兔抗血清按照100μL/孔添加到96孔Immobilizer Amino Plate(NUNC公司制)中，室温下振荡2小时。如下进行封闭：按照100μL/孔加入含有0.5％BSA(bovine serum albumin(牛血清白蛋白)、Sigma－Aldrich Japan公司制)的50mM碳酸氢钠缓冲溶液(pH8.3)(以下称为封闭溶液)，室温下振荡1小时。之后，按照100μL/孔添加用封闭溶液稀释的来自罹癌生物体的血清，室温下振荡3小时进行反应。此时将稀释倍率调整为10－1000倍的10倍稀释系列。用含有0.05％Tween20(和光纯药工业公司制)的磷酸盐缓冲生理盐水(以下称为PBS－T)清洗3次，按照
100μL/孔加入用封闭溶液稀释200倍的小鼠抗血清作为第二抗体，室温下振荡1小时进行反应。用PBS－T清洗3次，按照100μL/孔加入用封闭溶液稀释2000倍的HRP修饰小鼠IgG抗体(Stabilized Goat Anti Mouse HRP conjugated：PIERCE公司制)作为第三抗体，室温下振荡1小时进行反应。用PBS－T清洗3次，按照100μl/孔添加HRP底物TMB(1－Step Turbo TMB(四甲基联苯胺)、PIERCE公司制)，室温下进行酶底物反应30分钟。之后，按照100μl/孔加入
0.5M硫酸溶液(Sigma－Aldrich Japan公司制)停止反应后，用微孔板读数仪测定450nm处的吸光度。作为对照，未将家兔抗血清固相化的物质、不使来自罹癌生物体的血清反应的物质与上述同样地操作进行比较。

[0386] 结果，在患有皮肤平滑筋肉瘤、乳癌、恶性黑色素瘤等罹癌犬、罹癌猫中检测到多肽的值，在健康犬、健康猫及健康人中未检测到。因此，在使用以源自犬的重组多肽作为免疫原配制的抗体检测抗原多肽的该方法中也可以诊断癌。

[0387] 另外，使用将实施例C－2制备的序列号26所示的犬CEP的全长多肽作为免疫原配制的抗体，与上述同样地进行诊断。

[0388] 结果，犬、猫，均可以通过使用将犬CEP的全长多肽作为免疫原配制的抗体测定抗原多肽的该方法，同样地诊断癌。

[0389] 进而，使用将实施例C－2制备的序列号42所示的犬CEP的全长多肽作为免疫原配制的抗体，与上述同样地进行诊断。

[0390] 结果，犬、猫均可以通过使用将犬CEP的全长多肽作为免疫原配制的抗体检测抗原多肽的该方法，同样地诊断癌。

[0391] 实施例C－6：通过测定抗原多肽的癌诊断(2)

[0392] 用实施例C－2制备的序列号36所示的人重组蛋白对小鼠、家兔进行免疫，制备、获得该抗原特异性抗体。与实施例C－5同样地，通过使用该多克隆抗体的夹层ELISA法检测罹癌生物体血清中含有的该抗原多肽本身。

[0393] 结果，在患有皮肤平滑筋肉瘤、乳癌、恶性黑色素瘤等罹癌犬、罹癌猫中检测到多肽的值，在健康犬、健康猫及健康人中未检测到。因此，使用以来自人的重组多肽作为免疫原配制的抗体检测抗原多肽的该方法中也可以诊断癌。

[0394] 另外，使用将实施例C－2制备的序列号28所示的人CEP的全长多肽作为免疫原配制的抗体，与上述同样地进行诊断。

[0395] 结果，犬、猫均可以通过使用将人CEP的全长多肽作为免疫原配制的抗体检测抗原多肽的该方法，同样地诊断癌。

[0396] 实施例D－1：通过SEREX法获得新型癌抗原蛋白

[0397] (1)构建cDNA文库

[0398] 通过酸－胍－苯酚－氯仿法(Acid guanidium－Phenol－Chloroform法)自健康犬的睾丸组织中提取全RNA，使用Oligotex－dT30mRNA purification Kit(宝酒造公司制)按照试剂盒所附的操作说明书纯化polyARNA。

[0399] 使用该所得的mRNA(5μg)构建犬睾丸cDNA噬菌体文库。在cDNA噬菌体文库的制备中使用cDNA Synthesis Kit，ZAP－cDNA Synthesis Kit，ZAP－cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE公司制)，按照试剂盒所附的操作说明书构建文库。构建的cDNA噬菌体文库大小为1.3×106pfu/ml。

[0400] (2)利用血清筛选cDNA文库

[0401] 使用上述构建的源自犬睾丸的cDNA噬菌体文库进行免疫筛选。具体而言，在Φ90×15mm的NZY琼脂糖平板中感染宿主大肠杆菌(XL1－BlueMRF’)使其为2340克隆，42℃下培养3～4小时，形成溶菌斑(plaque)，用浸透了IPTG(异丙基－β－D－硫代半乳糖苷)的硝酸纤维素滤膜(Hybond C Extra：GE Healthecare Bio－Science公司制)在37℃下覆盖培养板4小时，由此使蛋白质诱导·表达，将蛋白质转印到膜上。之后回收膜，将其浸在含有0.5％脱脂奶粉的TBS(10mM Tris－HCl，150mM NaCl pH7.5)中，在4℃下振荡一夜，由此抑制非特异性反应。在室温下使此过滤膜与稀释500倍的患病犬血清反应2～3小时。

[0402] 作为上述患病犬血清使用从患有乳癌的患病犬中采集的血清。这些血清保存在－80℃，在即将使用前进行预处理。血清的预处理方法按照以下方法进行。即，用未插入外来基因的λZAP Express噬菌体感染宿主大肠杆菌(XL1－BLueMRF’)后，在NZY板培养基中在37℃下培养一夜。然后将含有0.5M NaCl的0.2M NaHCO3pH8.3的缓冲液加入培养板中，4℃下静置15小时后，回收上清液作为大肠杆菌/噬菌体提取液。接下来，将回收的大肠杆菌/噬菌体提取液通入NHS－柱(GE Healthecare Bio－Science公司制)，将来自大肠杆菌·噬菌体的蛋白质固定化。在该蛋白固定化柱中使患病犬血清通入·反应，从血清中除去吸附在大肠杆菌和噬菌体上的抗体。将只是仅仅通过柱子的血清馏分用含有0.5％脱脂奶粉的TBS稀释500倍，将其作为免疫筛选材料。

[0403] 将经上述处理血清和上述融合蛋白印迹的膜用TBS－T(0.05％Tween20/TBS)清洗4次后，将用含有0.5％脱脂奶粉的TBS稀释5000倍的山羊抗犬IgG(Goat anti Dog IgG－h+I HRP conjugated：BETHYL Laboratories公司制)作为第二抗体在室温下与其反应1小时，使用NBT/BCIP反应液(Roche公司制)通过酶显色反应检测，从Φ90×15mm的NZY琼脂糖平板上采集与显色反应阳性部位相一致的菌落，使其溶解在500μl SM缓冲液(100mM NaCl、10mM MgClSO4、50mM Tris－HCl、0.01％明胶pH7.5)中。按照与上述相同的方法重复二次、三次筛选，至显色反应阳性菌落单一化，筛选出与血清中IgG反应的30940个噬菌体克隆，分离出一个阳性克隆。

[0404] (3)分离抗原基因的同源性检索

[0405] 为了将通过上述方法分离所得的一个阳性克隆用于碱基序列解析，进行操作将噬菌体载体转换为质粒载体。具体而言，将宿主大肠杆菌(XL1－Blue MRF’)制成吸光度OD600为1.0的溶液，将该溶液200μl和经纯化的噬菌体溶液100μl以及ExAssist helper phage(STRATAGENE公司制)1μl混合后，在37℃下反应15分钟，之后添加3ml LB培养基在37℃下培养2.5～3小时，立即置于70℃水浴中保持温度20分钟后，在4℃下以1000×g离心15分钟，回收上清液作为噬菌粒溶液。然后，将噬菌粒宿主大肠杆菌(SOLR)制成吸光度OD600为1.0的溶液，将该溶液200μl和经纯化的噬菌体溶液10μl混合后，在37℃下反应15分钟，取50μl接种于含有氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的LB琼脂培养基中，在37℃下培养一夜。采集经转化的SOLR单菌落，用含有氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的LB培养基在37℃下培养后，使用QIAGEN plasmid Miniprep Kit(Qiagen公司制)纯化含有目标插入片段的质粒DNA。

[0406] 经纯化的质粒使用序列号5所示的T3引物和序列号6所示的T7引物，通过引物步测法来解析插入片段的全长序列。通过该序列解析获得序列号44所示的基因序列。使用该基因的碱基序列及氨基酸序列，运行同源性检索程序BLAST搜索(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，进行与已知基因同源性的检索，结果证明所得的基因为TRIP11基因。犬TRIP11的人同源因子为人TRIP11(同源性：碱基序列88％、氨基酸序列
86％)。人TRIP11的碱基序列如序列号46所示，氨基酸序列如序列号47所示。

[0407] (4)在各种组织中的表达解析

[0408] 对于通过上述方法所得的基因，通过RT－PCR(Reverse Transcription－PCR)法研究其在犬及人正常组织及各种细胞株中的表达。逆转录反应如下进行。即，使用TRIZOL试剂(invitrogen公司制)按照所附的操作说明书从50－100mg各种组织及各种细胞株5－10×106个细胞中提取全RNA。通过Superscript First－Strand Synthesis System for RT－PCR(invitrogen公司制)按照所附的操作说明书使用上述全RNA合成cDNA。人正常组织(脑、海马、睾丸、结肠、胎盘)的cDNA，使用Gene Pool cDNA(invitrogen公司制)、QUICK－Clone cDNA(Clontech公司制)及Large－Insert cDNA Library(Clontech公司制)。PCR反应使用所获得基因的特异性引物(如序列号48及49所示)如下进行。即，加入各试剂和附加缓冲液使总量为25μl，其中使通过逆转录反应配制的样品为0.25μl，上述引物各为2μM，各dNTP为0.2mM，ExTaq聚合酶(宝酒造公司制)为0.65U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制)，以94℃－30秒、55℃－30秒、72℃－1.5分钟为一个循环，将该循环重复进行30次。需要说明的是，上述基因特异性的引物为扩增下述区域的引物，所述区域为序列号44的碱基序列(犬TRIP11基因)中的1519号～2957号及序列号46的碱基序列(人TRIP11基因)中的1872号～3310号碱基的区域，使用该引物也可以研究犬TRIP11基因及人TRIP11基因中任一者的表达。为了比较对照，同时也使用了GAPDH特异性的引物(如序列号9及10所示)。结果如图13所示，可见犬TRIP11基因在健康犬组织中显著表达于睾丸，另一方面可见其在犬乳癌细胞株中显著表达。已经确认人TRIP11基因的表达也与犬TRIP11基因同样，在正常组织中能够确认其表达的部位仅限于睾丸，但在癌细胞中在脑肿瘤、白血病、乳癌、肺癌、食道癌细胞株等多种类癌细胞株中可检测到表达，人TRIP11基因也特异性地表达于睾丸和癌细胞。

[0409] 需要说明的是，图13中纵轴的标号1表示TRIP11基因的表达谱，标号2表示作为比较对照的GAPDH基因的表达谱。

[0410] 实施例D－2：犬及人TRIP11蛋白的制备

[0411] (1)重组蛋白质的制备

[0412] 基于实施例D－1获得的序列号44的基因，按照以下方法制备重组蛋白质。PCR如下进行：加入各试剂和附加缓冲液使总量为50μl，使由实施例D－1所得的噬菌粒溶液配制并供序列解析的载体为1μl、使含有SalI及XhoI限制性酶切断序列的两种引物(如序列号50及51所示)各为0.4μM、dNTP为0.2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造公司制)为1.25U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制)，以98℃－10秒、55℃－5秒、72℃－6分钟为一个循环，重复上述循环30次。需要说明的是，由上述两种引物可以得到编码序列号45的氨基酸序列中的237号～1023号氨基酸的区域(序列号54)的区域。PCR后，用1％琼脂糖凝胶对经扩增的DNA进行电泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制)纯化约2.4kbp的DNA片段。

[0413] 同样地，使用序列号56及57所示的两种引物进行PCR，得到编码序列号45的氨基酸序列全长的区域。PCR后，用1％琼脂糖凝胶对经扩增的DNA进行电泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制)纯化约6.0kbp的DNA片段。

[0414] 将经纯化的各DNA片段与克隆载体pCR－Blunt(invitrogen公司制)连接。将其转化至大肠杆菌中后回收质粒，通过测序确认了经扩增的基因片段与靶序列一致。用SalI及XhoI限制性酶处理与靶序列一致的质粒，用QIAquick Gel Extraction Kit纯化后，将靶基因序列插入用SalI、XhoI限制性酶处理后的大肠杆菌用表达载体pET30b(Novagen公司制)中。通过使用该载体可产生His标签融合型重组蛋白质。将该质粒转化至表达用大肠杆菌BL21(DE3)，通过利用1mM IPTG的表达诱导，能够使靶蛋白在大肠杆菌内表达。

[0415] 另外，基于序列号46的基因，按照以下方法制备人同源基因的重组蛋白质。PCR如下进行：加入各试剂和附加缓冲液使总量为50μl，其中，使实施例D－1制备的各种组织·细胞cDNA中已确认通过RT－PCR法表达的cDNA为1μl、含有NdeI及KpnI限制性酶切断序列的两种引物(如序列号52及53所示)各为0.4μM、dNTP为0.2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造公司制)为1.25U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制)，将98℃－10秒、55℃－5秒、72℃－6分钟为一个循环，重复上述循环30次。需要说明的是，由上述两种引物可以得到编码序列号47的氨基酸序列中的236号～1023号氨基酸的区域(序列号55)的区域。PCR后，用1％琼脂糖凝胶对经扩增的DNA进行电泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制)纯化约2.4kbp的DNA片段。

[0416] 同样地，使用序列号58及59所示的两种引物进行PCR，得到编码序列号47的氨基酸序列全长的区域。PCR后，用1％琼脂糖凝胶对经扩增的DNA进行电泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制)纯化约6.0kbp的DNA片段。

[0417] 将经纯化的各DNA片段与克隆载体pCR－Blunt(invitrogen公司制)连接。将其转化至大肠杆菌中后回收质粒，通过测序确认了经扩增的基因片段与靶序列一致。用NdeI及KpnI限制性酶处理与靶序列一致的质粒，用QIAquick Gel Extraction Kit纯化后，将靶基因序列插入用NdeI、KpnI限制性酶处理后的大肠杆菌用表达载体pET30b(Novagen公司制)中。通过使用该载体可产生His标签融合型重组蛋白质。将该质粒转化至表达用大肠杆菌BL21(DE3)，通过利用1mM IPTG的表达诱导，能够使靶蛋白在大肠杆菌内表达。

[0418] (2)重组蛋白质的纯化

[0419] 将上述所得的、表达序列号44的一部分及序列号46的一部分的各重组大肠杆菌用含有卡那霉素(终浓度30μg/m1)的LB培养基在37℃下培养至600nm处的吸光度为0.7左右，之后添加IPTG使其终浓度为1mM，在30℃下培养20小时。之后以4800rpm离心10分钟进行集菌。将此菌体球状物悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中，进而以4800rpm离心10分钟，清洗菌体。

[0420] 将该菌体悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中，在冰上进行超声裂解。将大肠杆菌超声裂解液以7000rpm离心分离15分钟，所得上清液为可溶性馏分，沉淀为不溶性馏分。

[0421] 将不溶性馏分悬浮于4％TritonX－100溶液中以7000rpm离心10分钟。重复该操作2次，除去蛋白酶。之后，将残渣悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中，进行脱表面活性剂操作。

[0422] 将该残渣悬浮于含有6M胍盐酸盐(Sigma－Aldrich Japan公司制)的20mM磷酸缓冲液(pH8.0)中，4℃下静置15小时使蛋白质变性。该变性操作后，以7000rpm离心20分钟，将所得的可溶性馏分添加到按照通用方法调整的镍螯合柱(载体Chelateing Sepharose(商标)Fast Flow(GE Health Care公司)中，柱容量为5mL、平衡缓冲液为含有6M胍盐酸盐的20mM磷酸缓冲液(pH8.0))。将未吸附馏分用柱容量10倍量的含有6M胍盐酸盐的20mM磷酸缓冲液(pH8.0)和含有10mM咪唑的20mM磷酸缓冲液(pH8.0)进行清洗操作，之后立即用分为4阶段的50mM－500mM咪唑阶段浓度梯度进行洗脱。采集柱容量5倍量的各洗脱馏分。靶蛋白的洗脱根据按照通用方法进行的考马斯染色法确认，根据该结果将洗脱馏分浓缩作为诊断用固相化材料。

[0423] 同样地操作，培养在实施例D－2(1)得到的、表达序列号45的全长及序列号47的全长的各重组大肠杆菌，进行靶蛋白的纯化，得到诊断用固相化材料。

[0424] 实施例D－3：使用来自犬TRIPll的多肽的癌诊断

[0425] (1)犬的癌诊断

[0426] 从被确认患有恶性或良性肿瘤的486只犬和6只健康犬体内采集血液，分离血清。使用实施例D－2制备的犬TRIP11的部分多肽(序列号45的氨基酸序列中：237号～1023号、序列号54)抗犬IgG抗体，按照ELISA法测定与该多肽特异性反应的血清中的IgG抗体效价。

[0427] 制备的多肽如下进行固相化：按照100μL/孔将用磷酸盐缓冲生理盐水稀释为100μg/mL的重组蛋白质溶液添加到96孔Immobilizer Amino Plate(NUNC公司制)中，在4℃下静置一夜。如下进行封闭：按照100μL/孔加入含有0.5％BSA(bovine serum albumin(牛血清白蛋白)、Sigma－Aldrich Japan公司制)的50mM碳酸氢钠缓冲溶液(pH8.3)(以下称为封闭溶液)，室温下振荡1小时。按照100μL/孔添加使用封闭溶液稀释至1000倍的稀释血清，室温下振荡3小时进行反应。用含有0.05％Tween20(和光纯药工业公司制)的磷酸盐缓冲生理盐水(以下称为PBS－T)清洗3次，按照100μL/孔加入用封闭溶液稀释3000倍的HRP修饰犬IgG抗体(Goat anti Dog IgG－h+I HRP conjugated：BETHYL Laboratories公司制)，室温下振荡1小时进行反应。用PBS－T清洗3次，按照100μl/孔添加HRP底物TMB(1－StepTurboTMB(四甲基联苯胺)、PIERCE公司)，室温下进行酶底物反应30分钟。之后，按照100μl/孔加入0.5M硫酸溶液(Sigma－Aldrich Japan公司制)停止反应后，用微孔板读数仪测定450nm处的吸光度。作为对照，未将制备的重组蛋白质固相化的物质、不使罹癌犬血清反应的物质与上述同样地操作进行比较。

[0428] 使用被摘除的肿瘤组织进行病理诊断，结果上述癌诊断中使用的全部486个样品中有311个样品被确诊为恶性。

[0429] 具体而言，上述样品接受了下述癌诊断，所述癌为：恶性黑色素瘤、恶性混合肿瘤、肝细胞癌、基底细胞癌、棘细胞瘤样龈瘤、口腔内肿瘤、肛门周围腺癌、肛门囊肿、肛门囊顶泌腺癌、塞尔托利细胞瘤、阴道前庭癌、皮脂腺癌、皮脂腺上皮瘤、脂腺腺瘤、汗腺癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、甲状腺癌、大肠癌、支气管腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、复合型乳腺癌、乳腺恶性混合肿瘤、乳管内乳头状腺癌、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、软组织肉瘤、组织细胞肉瘤、粘液肉瘤、未分化肉瘤、肺癌、肥大细胞瘤、皮肤平滑肌瘤、腹腔内平滑肌瘤、平滑肌瘤、鳞状上皮癌、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、消化管型淋巴瘤、消化器型淋巴瘤、小～中细胞型淋巴瘤、肾上腺髓质肿瘤、粒层细胞瘤、嗜铬细胞瘤、膀胱癌(移行细胞癌)、化脓性炎症、腹腔内肝脏肿瘤、肝癌、浆细胞瘤、恶性血管外膜细胞瘤、血管肉瘤、肛门囊腺癌、口腔癌、转移性恶性黑色素瘤、无黑色素性恶性黑色素瘤、皮肤恶性黑色素瘤、恶性肌上皮瘤、恶性睾丸上皮瘤、精原细胞瘤(seminoma)、大肠腺癌、胃腺癌、低度皮脂腺癌、耳垢腺癌、顶泌腺癌、低分化型顶泌腺癌、恶性纤维性组织细胞瘤、多发性骨髓瘤、间叶组织恶性肿瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、起因不明的肉瘤、软组织肉瘤(纺锤形细胞肿瘤)、低分化肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、转移性恶性上皮肿瘤、管状乳腺腺癌、乳腺导管癌、炎性乳癌、生殖细胞瘤、白血病、浸润性毛发上皮瘤、中细胞型淋巴瘤、多中心型淋巴瘤、骨肉瘤(乳腺)、肥大细胞瘤(PatnaikII型)、肥大细胞瘤(GradeII)、平滑筋肉瘤等。

[0430] 来自上述罹癌犬生物体的血清，如图15所示针对重组蛋白质的抗体效价非常高。为健康犬平均值的2倍以上即可根据本诊断方法判断为恶性时，可知有78个样品可以诊断为恶性，为25.1％。该78个样品的癌的种类如下所述。需要说明的是，根据样品不同，存在患有多种癌的样品，以下所示的数值为每种癌的累计值。

[0431] 恶性黑色素瘤4例、淋巴瘤5例、化脓性炎症1例、粒层细胞瘤1例、肝细胞癌2例、恶性睾丸肿瘤2例、口腔内肿瘤3例、肛门周围腺瘤5例、骨肉瘤2例、腺管癌6例、乳腺癌16例、复合型乳腺癌8例、肺癌1例、皮脂腺癌2例、肥大细胞瘤6例、平滑筋肉瘤2例、鳞状上皮癌4例、恶性混合瘤1例、转移性恶性黑色素瘤1例、乳腺导管癌1例、顶泌腺癌1例、胃腺癌1例、多中心型淋巴瘤1例、精原细胞瘤(seminoma)1例、浆细胞瘤1例。

[0432] 进而，使用从末期癌患病犬采集的胸水、腹水，进行相同的诊断，结果可以检测出与通过使用血清的本诊断方法所得的结果相同的值，可以诊断为癌。

[0433] 另外，可知通过采用本诊断方法，还可以进行肉眼不可见部分的癌诊断、进展程度诊断、恶性程度诊断、术后的追踪诊断、复发诊断、转移诊断等诊断。以下举出数例图4所示的详细诊断的具体例。

[0434] (2)－1肉眼不可见肿瘤的癌诊断

[0435] 患病犬1(FLAT COATED RETRIEVER)在2007年6月7日时间点未确认到肿瘤，但在其约20日后即2007年6月24日在左上颚犬齿根的齿龈处发现了蒂状的直径2mm的肿瘤。在发现之日将蒂部结扎并切除。在可以用肉眼确认肿瘤以前，可以确认到在450nm处的吸光度为0.15，为显著高的值，与肿瘤发现时的0.14比较变化不大。由该结果可知，通过使用本方法还可以诊断腹腔内等肉眼不可见部分的癌。

[0436] 另外，在可以肉眼确认肿瘤以前，可以确认到值上升，一般认为显示出肿瘤发生的前兆。因此，可知对定期健康检查等健康诊断也有用。

[0437] 在切除肿瘤2周后再次对该患病犬1进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0检测不到。所以，还可以确认引起抗体效价上升的癌抗原表达的肿瘤被完全切除。((2)－4术后的追踪诊断)

[0438] (2)－2癌的进展程度诊断

[0439] 癌的进展程度通过肿瘤的大小及深度、对周围组织带来何种影响、是否发生转移等进行判断。可知转移即癌发展时可以检测出比以前高的值。

[0440] (2)－3癌的恶性程度诊断

[0441] 基底细胞瘤包括恶性型和良性型，近年来在新WHO中存在以恶性型为基底细胞癌、以良性型为毛芽瘤进行分类的倾向。

[0442] 诊断为基底细胞癌(恶性)的患病犬2(比格犬)在手术时进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0.15。另一方面，诊断为毛芽瘤(良性)的患病犬3(杂种)在手术时进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0完全检测不到。因此，可知即使为相同的基底细胞瘤也可以诊断出为恶性型基底细胞癌和良性型毛芽瘤。

[0443] 接下来，举出乳腺肿瘤的例子。乳腺肿瘤包括乳腺癌或乳腺恶性混合肿瘤等恶性肿瘤、和未表现出恶性症状的良性乳腺肿瘤。患病犬4(约克犬)为2006年5月17日因乳腺恶性混合肿瘤和乳腺癌接受了摘除手术的患病犬。通常，乳腺的混合肿瘤即使为恶性，但由于缺乏向周围的浸润性，所以也容易完全切除，切除后的追踪诊断也大多良好。但是在使用摘除的组织进行的病理诊断中，在患病犬4标本的一部分成分中可见浸润性，诊断为恶性程度高的肿瘤。另外，乳腺癌通常为向周围的浸润性强、容易引起复发或转移的肿瘤。在患病犬4标本上在肿瘤细胞中未见浸润性，但由于部分材料所以在其他区域中恶性程度高的成分可能增殖。因此由病理诊断结果表明患病犬4为恶性程度高的乳癌。该手术时采集的血清诊断的结果在450nm处的吸光度为0.20。另一方面，患病犬5(约克夏犬)为2007年1月28日接受了乳腺肿瘤摘除手术的患病犬。在使用此时的摘除组织进行的病理诊断中，细胞异型性为轻度，诊断为未见恶性症状的良性乳腺癌。该手术时采集的血清诊断结果为450nm处的吸光度为0。从以上2个样品的结果也可知恶性程度高的肿瘤与恶性程度低即良性肿瘤相比值大。

[0444] (2)－4术后的追踪诊断

[0445] 患病犬6(西施犬)因口腔内肿瘤入院就诊于2007年3月22日进行摘除手术。此时进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0.12。另外，使用摘除的组织进行的病理诊断中，诊断为恶性棘细胞瘤样龈瘤。该肿瘤具有远位转移少但切除不充分时容易复发的特征。因此能否通过手术完全切除肿瘤是重要的。2007年5月18日进行追踪观察时确认到450nm处的吸光度为0.02且抗体效价降低。至2007年8月未确认到复发。因此，可以说患病犬6中由于完全切除了肿瘤，所以血清诊断结果比手术时降低。

[0446] 患病犬7(约克犬)对在手术时即2006年5月17日采集的血清进行诊断，结果450nm处的吸光度为0.20。2006年12月16日因追踪观察再次入院就诊时再次进行了血清诊断，结果450nm处的吸光度为0。至2007年8月未确认到转移及复发。因此患病犬7可以说由于完全切除了肿瘤所以血清诊断结果比手术时降低。

[0447] (2)－5复发诊断

[0448] 患病犬8(哈士奇犬)于2007年5月8日进行乳腺癌摘除手术。此时进行的血清诊断的结果为450nm处的吸光度为0.04。使用摘除的组织进行的病理诊断中，异型性强的上皮系细胞主要形成腺管结构、并增殖，被诊断为乳腺原发性腺癌。此时已经确认到多数癌细胞进入淋巴管内，向淋巴结及远位部的转移、复发的风险高。自手术约一个半月后即2007年6月28日在相同部位确认到复发。确认到此时血清诊断的结果为0.07，值升高。可知患病犬8由于不确定肿瘤被完全切除或复发，所以诊断结果与5月上旬相比，在6月下旬较大地被检测到。

[0449] (2)－6转移诊断

[0450] 患病犬9(苏格兰梗)为反复发生转移·复发的患病犬：2003年2月乳腺肿瘤、2003年8月口腔内恶性黑色素瘤、2005年1月嘴唇恶性黑色素瘤、2005年4月13日口腔内黑色素瘤，且上述肿瘤均已通过手术被切除。2005年4月口腔内黑色素瘤复发后，因追踪观察再次入院就诊即2006年12月17日的血清诊断结果在450nm处的吸光度为0。其半年后即2007年6月20日颈部淋巴结、颧淋巴结肥大再次入院就诊。如果为淋巴瘤则全身淋巴结均肿，但患病犬9只有2处肿，因此临床诊断很可能是因转移引起的淋巴瘤。根据利用本方法的诊断也可知，450nm处的吸光度显著升高，为0.27，以前存在的肿瘤发生转移。

[0451] 患病犬10(柴犬)为于2006年3月11日因右嘴唇部口腔恶性黑色素瘤进行了肿瘤摘除的患病犬。具有自2006年6月10日至同年9月26日给与抗癌剂(环磷酰胺)的治疗史，自2006年5月23日继续给与有机锗主成分的Biremo S。认为该肿瘤的转移时即于2007年3月20日进行肿瘤摘除，此时进行的血清诊断的结果为450nm处的吸光度约为0基本检测不到。使用此时摘除的组织进行的病理诊断中，诊断为转移性恶性黑色素瘤。但是，转移后的黑色种在手术后3个月即2007年6月27日再次引起转移。虽然2007年3月20日在右颈部产生了肿瘤，但在2007年6月27日在其反对侧产生，肿瘤的形状也形成与前次类似的黑色块。大小为3.1×3.2×0.8cm，经临床诊断也判断为转移。此时进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为
0.02，升高，可知为以前存在的肿瘤的转移。

[0452] (2)－7治疗监控

[0453] 患病犬12(迷你腊肠犬)为2007年4月19日进行了肿瘤摘除的患病犬。使用摘除的肿瘤进行病理诊断，结果为复合型乳腺癌，为浸润性、转移性发生可能性高的中等度的恶性程度。此时血清诊断的结果为450nm处的吸光度为0.03。自摘除手术约1年后即2008年6月3日进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0完全检测不到。此时肉眼未确认到癌的复发，但为了防止复发，在其后的2个月内以每周一次的间隔给与抗癌剂(Intercat)，维持不复发的状态。在开始给与抗癌剂2周后、4周后、6周后进行血清诊断，结果450nm处的吸光度均为0完全检测不到。由患病犬12的结果可知，如果完全切除肿瘤则与罹癌状态相比值降低，如果在抗癌剂治疗中也可以抑制癌复发，则不会出现值升高，遵循治疗的经时变化。另外，可知如患病犬8所示由于也可以诊断复发，所以也可以进行治疗监控。

[0454] (2)－8复发时的恶性诊断

[0455] 患病犬13(金毛寻回犬)为2005年5月1日进行了肿瘤摘除的患病犬。使用摘除的肿瘤进行病理诊断，结果为来自乳管上皮的恶性肿瘤性病变，即恶性乳腺管癌及向乳管内进展并增生的恶性乳头状癌。在此约3年后即2008年6月28日因为再次发现肿瘤所以进行了摘除手术。使用其摘除的肿瘤进行的病理组织诊断结果，仅发现在可见前次手术创伤的皮下缝合线周围有嗜中性粒细胞及小噬细胞、浆细胞等显著炎症细胞浸润，诊断为无肿瘤性病变。此时血清诊断的结果为450nm处的吸光度为0完全检测不到。由患病犬8、13的结果可知，复发时在为恶性的情况下血清诊断值上升或维持原状，在为良性的情况下检测不到。

[0456] (3)猫的诊断

[0457] 接下来，进行罹癌猫及健康猫的诊断。使用上述采用的犬TRIP11的部分多肽和抗猫IgG抗体，与上述同样地测定与该多肽特异性反应的猫血清中的IgG抗体效价。第二抗体是将HRP修饰抗猫IgG抗体(PEROXIDASE－CONJUGATED GOAT IgG FRACTION TO CAT IgG(WHOLEMOLECULE)：CAPPEL RESERCH REAGENTS公司制)用封闭溶液稀释8000倍进行使用。

[0458] 患病猫1(金吉拉猫)为2005年8月17日因乳腺癌接受了肿瘤摘除手术的患病猫。患病猫1在450nm处的吸光度为0.05。另外，2006年10月17日因腺管癌接受了摘除手术的、患病猫2(喜马拉雅猫)中在450nm处的吸光度为0.34。而在健康猫中完全未检测到。

[0459] 因此，在为猫的情况下，也与犬同样地在患有癌的样品中检测出值，而在健康样品中完全未检测到，因此猫也与犬同样，按照本方法可以进行癌诊断。

[0460] (4)健康人的诊断

[0461] 使用上述采用的犬TRIP11的部分多肽和抗人IgG抗体，与上述同样地测定与该多肽特异性反应的健康人血清中的IgG抗体效价。第二抗体是将HRP修饰抗人IgG抗体(HRP－Goat Anti－Human IgG(H+L)Conjugate：Zymed Laboratories公司制)用封闭溶液稀释10000倍进行使用。作为阳性对照使用将用磷酸盐缓冲生理盐水调整为50μg/m1的卵白蛋白抗原进行固相化的产物。结果，卵白蛋白抗原在健康人1中450nm处的吸光度为0.25。另一方面，该重组蛋白质于450nm处的吸光度为0，完全未检测到。另外，健康人2中卵白蛋白抗原
450nm处的吸光度为0.18，而该重组蛋白质为0完全未检测到。

[0462] 另外，使用实施例D－2制备的序列号45所示的犬TRIP11的全长多肽与上述同样地进行诊断，结果可知人、犬、猫也都可以进行相同的诊断。

[0463] 实施例D－4：使用来自人TRIP11的多肽的癌诊断

[0464] 使用实施例D－2制备的人TRIP11的部分多肽(序列号47的氨基酸序列中：236号～1023号、序列号55)，与实施例D－3同样地测定与该多肽反应的、在人、犬及猫血清中的IgG抗体效价。

[0465] 使用健康人血清进行诊断，结果，与实施例D－3(4)同样，使用卵白蛋白抗原作为阳性对照时，将卵白蛋白固相化时可以检测到值，将人TRIP11的部分多肽固相化时基本检测不到。

[0466] 另外，在健康犬·猫中将该多肽固相化时，450nm处的吸光度基本检测不到。

[0467] 另一方面，患病犬11(西施犬)为2007年6月21日接受了乳腺癌摘除手术的患病犬。在使用摘除的组织进行的病理诊断中，具有强异型性和浸润性的乳腺组织以大小的块状进行腺样增殖，诊断为恶性。该患病犬11在450nm处的吸光度为0.19。使用在其他病理诊断中诊断为恶性的310个样品的血清，进行恶性诊断。将为健康犬平均值的2倍以上判断为恶性时，可知有74个样品可以诊断为恶性，为23.8％。患病猫3(杂种)于2007年4月3日接受了乳腺癌摘除手术，但该患病猫在450nm处的吸光度为0.06。

[0468] 由以上可知，即使使用来自人TRIP11的多肽，人、犬、猫也都可以进行相同的诊断。

[0469] 进而，与犬重组蛋白同样地使用人重组蛋白，对从末期癌患病犬采集的胸水、腹水进行诊断，结果可以检测到与使用血清的结果相同的值，可以诊断为癌。

[0470] 另外，使用实施例D－2制备的序列号47所示的人TRIP11的全长多肽，与上述同样地进行诊断，结果可知人、犬、猫也都可以进行相同的诊断。

[0471] 实施例D－5：通过测定抗原多肽的癌诊断(1)

[0472] 用实施例D－2制备的序列号54所示的犬重组蛋白对小鼠、家兔进行免疫，制备、获得该抗原特异性抗体。使用该多克隆抗体，通过夹层ELISA法检测罹癌生物体血清中含有的该抗原多肽本身。对于与制备的该蛋白特异性多克隆抗体特异性反应的、血清中的该蛋白量，使用抗小鼠IgG抗体通过夹层ELISA法进行测定。

[0473] 第一抗体如下进行固相化：将用磷酸盐缓冲生理盐水稀释20倍的家兔抗血清按照100μL/孔添加到96孔Immobilizer Amino Plate(NUNC公司制)中，室温下振荡2小时。如下进行封闭：按照100μL/孔加入含有0.5％BSA(bovine serum albumin(牛血清白蛋白)、Sigma－Aldrich Japan公司制)的50mM碳酸氢钠缓冲溶液(pH8.3)(以下称为封闭溶液)，室温下振荡1小时。之后，按照100μL/孔添加用封闭溶液稀释的来自罹癌生物体的血清，室温下振荡3小时进行反应。此时将稀释倍率调整为10－1000倍的10倍稀释系列。用含有0.05％Tween20(和光纯药工业公司制)的磷酸盐缓冲生理盐水(以下称为PBS－T)清洗3次，按照
100μL/孔加入用封闭溶液稀释200倍的小鼠抗血清作为第二抗体，室温下振荡1小时进行反应。用PBS－T清洗3次，按照100μL/孔加入用封闭溶液稀释2000倍的HRP修饰小鼠IgG抗体(Stabilized Goat Anti Mouse HRP conjugated：PIERCE公司制)作为第三抗体，室温下振荡1小时进行反应。用PBS－T清洗3次，按照100μl/孔添加HRP底物TMB(1－Step Turbo TMB(四甲基联苯胺)、PIERCE公司制)，室温下进行酶底物反应30分钟。之后，按照100μl/孔加入
0.5M硫酸溶液(Sigma－Aldrich Japan公司制)停止反应后，用微孔板读数仪测定450nm处的吸光度。作为对照，未将家兔抗血清固相化的物质、不使来自罹癌生物体的血清反应的物质与上述同样地操作进行比较。

[0474] 结果，在患有皮肤平滑筋肉瘤、乳癌、恶性黑色素瘤等罹癌犬、罹癌猫中检测到多肽的值，在健康犬、健康猫及健康人中检测不到。因此，在使用以源自犬的重组多肽作为免疫原配制的抗体检测抗原多肽的该方法中也可以诊断癌。

[0475] 另外，使用以实施例D－2制备的序列号45所示的犬TRIP11的全长多肽作为免疫原配制的抗体，按照与上述相同的方法进行诊断。

[0476] 结果，在犬、猫中，均可以按照使用将犬TRIP11的全长多肽作为免疫原配制的抗体的检测抗原多肽的该方法，同样地进行诊断癌。

[0477] 实施例D－6：通过测定抗原多肽的癌诊断(2)

[0478] 用实施例D－2制备的序列号55所示的人重组蛋白对小鼠、家兔进行免疫，制备、获得该抗原特异性抗体。与实施例D－5同样地通过使用该多克隆抗体的夹层ELISA法检测罹癌生物体血清中含有的该抗原多肽本身。

[0479] 结果，在患有皮肤平滑筋肉瘤、乳癌、恶性黑色素瘤等罹癌犬、罹癌猫中检测到多肽的值，在健康犬、健康猫及健康人中检测不到。因此，使用以来自人的重组多肽作为免疫原配制的抗体检测抗原多肽的该方法中也可以诊断癌。

[0480] 另外，使用以实施例D－2制备的序列号47所示的人TRIP11的全长多肽作为免疫原配制的抗体，与上述同样地进行诊断。

[0481] 结果，在犬、猫中，均可以按照使用以人TRIP11的全长多肽作为免疫原配制的抗体测定抗原多肽的该方法，同样地进行诊断癌。

[0482] 实施例E－1：使用4种抗原多肽的组合的癌诊断(1)

[0483] (1)犬的癌诊断

[0484] 使用实施例A－2制备的犬重组蛋白(序列号2)、实施例B－2制备的犬钙镁蛋白质(序列号16)、实施例C－2制备的犬CEP的全长(序列号26或42)或部分多肽(序列号26的氨基酸序列中：1514号～2339号、序列号35)、实施例D－2制备的犬TRIP11的全长(序列号45)或部分多肽(序列号45的氨基酸序列中：237号～1023号、序列号54)和抗犬IgG抗体，与上述同样地测定与该蛋白或该多肽特异性反应的血清中的IgG抗体效价。

[0485] 为健康犬平均值的2倍以上即可根据本诊断方法判断为恶性时，可知有272个样品可以诊断为恶性，为87.5％。需要说明的是，4种蛋白或多肽中针对任一种被判断为恶性时，将该对象生物体诊断为恶性肿瘤(以下相同)。该272个样品的癌的种类如下所述。需要说明的是，根据样品不同，存在患有多种癌的样品，以下所示的数值为每种癌的累计值。

[0486] 恶性黑色素瘤10例、淋巴瘤13例、嗜铬细胞瘤1例、化脓性炎症1例、粒层细胞瘤1例、肝细胞癌5例、血管瘤1例、恶性睾丸肿瘤8例、口腔内肿瘤4例、肛门周围腺癌14例、骨肉瘤5例、纤维肉瘤9例、腺管癌10例、软骨肉瘤2例、乳腺癌56例、复合型乳腺癌26例、肺癌2例、皮脂腺癌2例、鼻腺癌2例、肥大细胞瘤37例、肾上腺髓质肿瘤1例、平滑筋肉瘤2例、鳞状上皮癌11例、慢性淋巴细胞性白血病1例、未分化肉瘤2例、恶性混合瘤2例、左肺后叶肿瘤1例、右腋下部肿瘤1例、右前肢肘部肿瘤1例、膀胱癌(移行细胞癌)1例、转移性恶性黑色素瘤3例、无黑色素性恶性黑色素瘤1例、大肠腺癌1例、浆细胞瘤1例、组织细胞肉瘤1例、脂肪肉瘤1例、低分化肉瘤1例、滑膜肉瘤1例、恶性血管外膜细胞瘤1例、顶泌汗腺癌3例、支气管腺癌1例、生殖细胞瘤1例、恶性纤维性组织细胞瘤1例、转移性恶性上皮肿瘤1例、乳腺导管癌1例、血管肉瘤1例、管状乳腺腺癌1例、浸润性毛发上皮瘤1例、前立腺癌1例、软组织肉瘤(纺锤形细胞肿瘤)1例、耳垢腺癌1例、多中心型淋巴瘤2例、浸润性毛发上皮瘤1例、肛门囊腺癌1例、顶泌腺癌1例、胃腺癌1例、精原细胞瘤(seminoma)1例、基底细胞癌1例、血管外皮细胞瘤4例、粘液肉瘤1例、皮脂腺上皮瘤1例、脾脏肿瘤1例。

[0487] (2)猫的癌诊断

[0488] 接下来，进行罹癌猫及健康猫的诊断。使用上述4种类的犬抗原多肽和抗猫IgG抗体，与上述同样地测定与该多肽特异性反应的猫血清中的IgG抗体效价。第二抗体是将HRP修饰抗猫IgG抗体(PEROXIDASE－CONJUGATED GOAT IgG FRACTION TO CAT IgG(WHOLEMOLECULE)：CAPPEL RESERCH REAGENTS公司制)用封闭溶液稀释8000倍进行使用。

[0489] 使用被摘除的肿瘤组织进行病理诊断，结果在用于癌诊断的全部17个样品中有11个样品被确诊为恶性。为健康猫平均值的2倍以上即可根据本诊断方法判断为恶性时，可知有9个样品可以诊断为恶性，为81.8％。

[0490] 实施例E－2：使用了4种抗原多肽的组合的癌诊断(2)

[0491] (1)犬的癌诊断

[0492] 使用实施例A－2制备的人重组蛋白(序列号4)、实施例B－2制备的人钙镁蛋白质(序列号18)、实施例C－2制备的人CEP的全长(序列号28)或部分多肽(序列号28的氨基酸序列中：1513号～2325号、序列号36)、实施例D－2制备的人TRIP11的全长(序列号47)或部分多肽(序列号47的氨基酸序列中：236号～1023号、序列号55)和抗犬IgG抗体，与上述同样地测定与该蛋白或该多肽特异性反应的血清中的IgG抗体效价。

[0493] 为健康犬平均值的2倍以上即可根据本诊断方法判断为恶性时，可知有268个样品可以诊断为恶性，为86.2％。

[0494] (2)猫的癌诊断

[0495] 接下来，进行罹癌猫及健康猫的诊断。使用上述4种人抗原多肽和抗猫IgG抗体，与上述同样地测定与该多肽特异性反应的猫血清中的IgG抗体效价。第二抗体是将HRP修饰抗猫IgG抗体(PEROXIDASE－CONJUGATED GOAT IgG FRACTION TO CAT IgG(WHOLEMOLECULE)：CAPPEL RESERCH REAGENTS公司制)用封闭溶液稀释8000倍进行使用。

[0496] 使用被摘除的肿瘤组织进行病理诊断，结果在用于癌诊断的全部17个样品中有11个样品被确诊为恶性。为健康猫平均值的2倍以上即可根据本诊断方法判断为恶性时，可知有7个样品可以诊断为恶性，为63.6％。

[0497] 实施例E－3：利用测定4种抗原多肽的组合的癌诊断(1)

[0498] 用实施例A－2制备的犬重组蛋白(序列号2)、实施例B－2制备的犬钙镁蛋白质(序列号16)、实施例C－2制备的犬CEP的全长(序列号26或42)或部分多肽(序列号26的氨基酸序列中：1514号～2339号、序列号35)、实施例D－2制备的犬TRIP11的全长(序列号45)或部分多肽(序列号45的氨基酸序列中：237号～1023号、序列号54)对小鼠、家兔进行免疫，制备、获得该抗原特异性抗体。与实施例A，B，C，D－5同样，通过使用该多克隆抗体的夹层ELISA法检测罹癌生物体血清中含有的该抗原多肽本身。

[0499] 结果，可知在使用以犬抗原多肽作为免疫原配制的抗体检测抗原多肽的该方法中，为健康犬平均值的2倍以上即可根据本诊断方法判断为恶性时，可知有252个样品可以诊断为恶性，为81.0％。为猫的情况下也与上述同样，为健康猫平均值的2倍以上即可根据本诊断方法判断为恶性时，可知有8个样品可以诊断为恶性，为72.7％。

[0500] 实施例E－4：通过测定4种抗原多肽的组合的癌诊断(2)

[0501] 用实施例A－2制备的人重组蛋白(序列号4)、实施例B－2制备的人钙镁蛋白质(序列号18)、实施例C－2制备的人CEP的全长(序列号28)或部分多肽(序列号28的氨基酸序列中：1513号～2325号、序列号36)、实施例D－2制备的人TRIP11的全长(序列号47)或部分多肽(序列号47的氨基酸序列中：236号～1023号、序列号55)对小鼠、家兔进行免疫，制备、获得该抗原特异性抗体。与实施例A，B，C，D－5同样，通过使用该多克隆抗体的夹层ELISA法检测罹癌生物体血清中含有的该抗原多肽本身。

[0502] 结果，可知在使用以人抗原多肽作为免疫原配制的抗体检测抗原多肽的该方法中，为健康犬平均值的2倍以上即可根据本诊断方法判断为恶性时，可知有248个样品可以诊断为恶性，为79.7％。为猫的情况下也与上述同样，为健康猫平均值的2倍以上即可根据本诊断方法判断为恶性时，可知有7个样品可以诊断为恶性，为63.6％。