血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒转让专利
申请号 : CN201610321018.0
文献号 : CN106053862B
文献日 : 2017-09-15
发明人 : 张伟林 , 黄龙梅 , 王鑫
申请人 : 河北艾驰生物科技有限公司
摘要 :
本发明涉及一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒及其测定方法,属于医学生物检测技术领域。该试剂盒包括试剂1、试剂2、校准品及质控品,试剂1包含Tris‑HCl、叠氮钠、PEG‑6000,试剂2包含Tris‑HCl、包被了抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒、叠氮钠、辛基苯酚聚氧乙烯和尼泊金甲酯,校准品包含血清淀粉样蛋白A抗原、叠氮钠,质控品包含血清淀粉样蛋白A抗原、叠氮钠。本发明提供的一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒及其测定方法,采用胶乳免疫比浊技术,具有分析灵敏度高、结果准确、操作简单、成本适合等优点,便于推广。
权利要求 :
1.一种血清淀粉样蛋白A测定试剂盒,它包括:试剂1、试剂2、校准品及质控品;
所述试剂1为缓冲液,其组成为:Tris 100mM,叠氮钠5g/L,PEG-6000 4g/L,pH值为8.1;
所述试剂2为反应液,其组成为:Tris 100mM,叠氮钠1g/L,辛基苯酚聚氧乙烯1g/L,尼泊金甲酯1g/L,抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L,pH值为6.0;
所述校准品为:水平1含血清淀粉样蛋白A抗原6.25mg/L,叠氮钠5g/L,水平2含血清淀粉样蛋白A抗原12.5mg/L,叠氮钠5g/L,水平3含血清淀粉样蛋白A抗原25mg/L,叠氮钠5g/L,水平4含血清淀粉样蛋白A抗原50mg/L,叠氮钠5g/L;
所述质控品为:血清淀粉样蛋白A抗原10mg/L,叠氮钠5g/L。
说明书 :
血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属医学生物检测技术领域,具体涉及一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒及其使用方法。
背景技术
[0002] 血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A,SAA)是一种急性时限反应蛋白,属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质,相对分子量约12 000。在急性时限反应中,经IL-1、IL-6和TNF刺激,SAA在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成,可升高到最初浓度的100-1000倍,但半衰期极短,只有50分钟左右。血清淀粉样蛋白A与高密度脂蛋白(HDL)有关,它能在炎症期间调节高密度脂蛋白的代谢。血清淀粉样蛋白A一个特别重要的特性是其降解产物能以淀粉样蛋白A(AA)原纤维的方式沉积在不同的器官中,在慢性炎症疾病中这是一种严重的并发症。
[0003] 与C反应蛋白(CRP)类似,血清淀粉样蛋白A的含量浓度是反映感染性疾病早期炎症的敏感指标,有助于诊断炎症、评估其活性、监控其活动及治疗。但是,血清淀粉样蛋白A检测在诊断发生病毒感染、肾移植排斥反应的患者(特别是进行免疫抑制治疗的患者)以及用肾上腺皮质激素治疗的囊性纤维化患者方面,比C反应蛋白更确凿。研究发现,在患炎性关节炎的案例中,血清淀粉样蛋白A与疾病活动性的关系最密切。同时检测C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A能提高对感染的诊断灵敏度。对于淀粉样蛋白A淀粉样变性患者,以将血清淀粉样蛋白A水平回复至正常为宗旨的治疗,能改善病情。
[0004] 目前已知检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒较少,方法也存在较大的缺陷,如测定灵敏度不足,操作繁琐,成本昂贵等,均不利于临床推广使用。
发明内容
[0005] 本发明提供一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒。
[0006] 本发明还提供上述试剂盒的检测方法。
[0007] 为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
[0008] 一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒,它包括:试剂1(缓冲液)、试剂2(反应液)、校准品及质控品。
[0009] 上述血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒,具体包括如下组分:
[0010] (1)试剂1:Tris 100mM,叠氮钠5g/L,PEG-6000 4g/L,PH值为8.1;
[0011] (2)试剂2:Tris 100mM,叠氮钠1g/L,辛基苯酚聚氧乙烯1g/L,尼泊金甲酯1g/L,抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L,PH值为6.0;
[0012] (3)校准品:水平1含血清淀粉样蛋白A抗原6.25mg/L,叠氮钠5g/L,水平2含血清淀粉样蛋白A抗原12.5mg/L,叠氮钠5g/L,水平3含血清淀粉样蛋白A抗原25mg/L,叠氮钠5g/L,水平4含血清淀粉样蛋白A抗原50mg/L,叠氮钠5g/L;
[0013] (4)质控品:血清淀粉样蛋白A抗原10mg/L,叠氮钠5g/L。
[0014] 所述的试剂1、试剂2、校准品及质控品的溶剂为电导率(25℃)不大于0.1mS/m的纯净水。
[0015] 所述的抗人血清淀粉样蛋白A抗体为兔抗人多克隆抗体。
[0016] 所述的胶乳颗粒为粒径为80-100nm。
[0017] 所述的PH值调节试剂为1mM的盐酸溶液。
[0018] 所述检测试剂盒用于定量测定血清中血清淀粉样蛋白A的含量。
[0019] 本发明第二方面提供所述测定试剂盒的检测方法,包括如下步骤:
[0020] 1)准备编号为1、2、3、4的4支反应管;
[0021] 2)同时在第1反应管内加入试剂1 150μL,水平1校准品3μL混合均匀,在第2反应管内加入试剂1 150μL,水平2校准品3μL混合均匀,在第3反应管内加入试剂1 150μL,水平3校准品3μL混合均匀,在第4反应管内加入试剂1 150μL,水平4校准品3μL混合均匀,4支反应管均孵育5分钟;
[0022] 3)5分钟孵育结束后,同时在第1反应管内加入试剂2 150μL混合均匀,在第2反应管内加入试剂2 150μL混合均匀,在第3反应管内加入试剂2 150μL混合均匀,在第4反应管内加入试剂2 150μL混合均匀,均孵育半分钟;
[0023] 4)半分钟孵育结束后,分别读取1、2、3、4反应管吸光度A11,A12,A13,A14;
[0024] 5)继续孵育5分钟后,再次分别读取1、2、3、4反应管吸光度A21,A22,A23,A24;
[0025] 6)分别以4个不同浓度水平校准品浓度为横坐标,以(A21-A11)、(A22-A12)、(A23-A13)、(A24-A14)为纵坐标作一标准曲线图;
[0026] 7)再次准备1支反应管,在反应管内加入试剂1 150μL,检测样本3μL混合均匀并孵育5分钟;
[0027] 8)5分钟孵育结束后,在反应管内加入试剂2 150μL混合均匀并孵育半分钟,读取吸光度A1;
[0028] 9)继续孵育5分钟,读取吸光度A2;
[0029] 10)计算A2-A1,然后在标准曲线上找出对应的浓度值,即为样本中血清淀粉样蛋白A的含量。
[0030] 所述的反应孵育温度为37℃。
[0031] 本发明的有益效果为:
[0032] 本发明所提供的一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒,采用胶乳免疫比浊技术,并提供配套的校准品及质控品,具有测定结果准确、检测灵敏度高、方便快捷、稳定性好、特异性高、成本低廉等优点,利于临床推广使用。
具体实施方式
[0033] 根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0034] 实施例1:抗血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒制备
[0035] 1)配制50mM的MES缓冲液,PH值为6.0;
[0036] 2)用上述MES缓冲液稀释胶乳微球,浓度为1%(v/v);
[0037] 3)在胶乳微球悬浮液中加入EDAC,加入浓度为40mg/ml,在室温孵育40分钟;
[0038] 4)用相同体积的MES缓冲液洗涤胶乳微球,然后13000g/min离心30分钟,再次用相同体积的MES缓冲液洗涤胶乳微球,然后13000g/min离心30分钟,然后再将胶乳微球溶于MES缓冲液中;
[0039] 5)将兔抗人血清淀粉样蛋白A抗体溶于上述MES缓冲液中,浓度为1mg/mL;
[0040] 6)将抗体溶液和胶乳微球悬浮液混合,37℃搅拌反应3小时;
[0041] 7)在混合液中加入乙醇胺,加入量为2.5μL/mL,搅拌反应10分钟;
[0042] 8)除去未结合的抗体,将包被好的抗体胶乳颗粒贮存在MES缓冲液中。
[0043] 实施例2:试剂盒的制备方法
[0044] (1)试剂1:Tris 100mM,叠氮钠5g/L,PEG-6000 4g/L,PH值为8.1;
[0045] (2)试剂2:Tris 100mM,叠氮钠1g/L,辛基苯酚聚氧乙烯1g/L,尼泊金甲酯1g/L,抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L,PH值为6.0;
[0046] (3)校准品:水平1含血清淀粉样蛋白A抗原6.25mg/L,叠氮钠5g/L,水平2含血清淀粉样蛋白A抗原12.5mg/L,叠氮钠5g/L,水平3含血清淀粉样蛋白A抗原25mg/L,叠氮钠5g/L,水平4含血清淀粉样蛋白A抗原50mg/L,叠氮钠5g/L;
[0047] (4)质控品:血清淀粉样蛋白A抗原10mg/L,叠氮钠5g/L。
[0048] 实施例3:检测方法
[0049] 本实施例描述的血清淀粉样蛋白A测定试剂盒,在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪,如日立7180全自动生化分析仪等,利用两点终点法进行测定。将试剂1和试剂2按1:1放于仪器试剂位上,在样本盘相应位置上放置好纯净水、校准品 和样本,操作如下表:
[0050] 表1 实施例2试剂检测方法
[0051]
[0052] 计算:SAA含量(mg/L)=ΔA测定/ΔA测定×C标准
[0053] 实施例4:分析灵敏度验证实验
[0054] 用实施例2试剂盒测定已知浓度的样本,记录吸光度差值。检测结果如表2所示。
[0055] 表2 分析灵敏度实验结果
[0056]测定浓度(mg/L) 实施例1检测结果ΔA
2.0 0.0097
8.0 0.0156
2.0 0.0097
8.0 0.0156
[0057] 全自动生化分析仪在吸光度大于0.001时均可准确的获得检测结果,且仪器噪音对检测结果影响较少。本实验在参考范围下限(2.0mg/L)及参考范围上限(8.0mg/L)均取得了远大于0.001的吸光度,说明本发明试剂盒具有很好的分析灵敏度,能很好的满足临床检测需求。
[0058] 实施例5:稳定性研究
[0059] (1)在2-8℃储存条件下,分别在0个月、12个月和24个月对同一标准品样本(血清淀粉样蛋白A抗原含量2.0mg/L)进行测定,每个样本测定10次,取均值。结果表明(见表3),测值差异非常小,说明实施例2制备的检测试剂盒在2-8度储存条件下至少可以稳定24个月以上。
[0060]
[0061]
[0062] 对比例试剂盒除试剂2组成与实施例2存在区别外,其他均同实施例2,具体如下:
[0063] 对比例1:试剂2组成为:Tris 100mM,叠氮钠2g/L,BSA 1g/L,抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L,PH值为7.5;
[0064] 对比例2:试剂2组成为:Tris 100mM,叠氮钠1g/L,抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L,PH值为6.0;
[0065] 对比例3:试剂2组成为:Tris 100mM,叠氮钠1g/L,尼泊金甲酯1g/L,抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L,PH值为6.0;
[0066] 对比例4:试剂2组成为:Tris 100mM,叠氮钠1g/L,辛基苯酚聚氧乙烯1g/L,抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L,PH值为6.0。
[0067] (2)将上述试剂盒中的试剂2在37℃下放置7天,通过仪器检测放置3天和7天后的试剂2本身的吸光度变化(A检测-A0天),具体如下:
[0068] 3天后吸光度变化 7天后吸光度变化
实施例2 0.0004 0.0007
对比例1 0.0011 0.0024
对比例2 0.0012 0.0019
对比例3 0.0017 0.0028
对比例4 0.0009 0.0018
实施例2 0.0004 0.0007
对比例1 0.0011 0.0024
对比例2 0.0012 0.0019
对比例3 0.0017 0.0028
对比例4 0.0009 0.0018