用于抑制植物种子发芽的混合菌株及其作为除草剂的用途

摘要

本发明提供一种用于抑制杂草植物种子发芽的混合菌株，所述混合菌株由乳酸菌菌株和酵母菌株组成；还提供一种除草剂，其特征为，所述除草剂包含所述菌株、所述菌株的培养物或所述菌株的培养液的浓缩液和农药学上可接受的载体；还提供一种除草剂的制备方法，所述制备方法包括培养所述混合菌株的步骤；还提供一种杂草的去除方法，所述方法通过用所述菌株、所述菌株的培养物或所述菌株的培养液的浓缩液对土壤进行处理来实现。

权利要求

1.一种用于抑制杂草植物种子发芽的混合菌株，所述混合菌株由乳酸菌菌株和酵母菌株组成，其中，所述乳酸菌为乳杆菌属(Lact obacillus sp.)菌株，所述乳杆菌属菌株为选自保藏号为KCTC  12710BP的植物乳杆菌亚种LPT30(Lactobacillus plantarum subsp.plant arum LPT30)菌株、保藏号为KCTC 12711BP的短乳杆菌LBV-61(Lactobacillus  brevis LBV-61)、保藏号为KCTC 12712BP的布氏乳杆菌LBN62(Lactobacillus buchneri LBN62)菌株及保藏号为KCTC 12713BP的类干酪乳杆菌坚韧亚种LPC63(Lactobacillus paracase i subsp.tolerans LPC63)菌株中的一种以上的菌株，所述酵母菌株为选自保藏号为KCTC 12714BP的库德里阿兹威毕赤酵母PKD-51(Pichia kudriavzevii PKD-51)菌株、保藏号为KCTC 12715BP的德尔布有孢圆酵母TDB-34(Torulaspora delbrueckii TDB-34)菌株、保藏号为KCTC 12716BP的拜耳接合酵母ZBA-22(Zygosaccharomy ces bailii ZBA-22)菌株及保藏号为KCTC 12717BP的双孢接合酵母ZBP-52(Zygosaccharomyces bisporus ZBP-52)菌株中的一种以上的菌株。

2.根据权利要求1所述的用于抑制杂草植物种子发芽的混合菌株，其特征在于，所述混合菌株由保藏号为KCTC 12711BP的短乳杆菌LBV-61(Lactobacillus brevis LBV-61)菌株、保藏号为KCTC 12710BP的植物乳杆菌亚种LPT30(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum LPT30)菌株及保藏号为KCTC 12715BP的德尔布有孢圆酵母TDB-34(Torulaspora delbrueckii TDB-34)菌株组成。

3.根据权利要求1所述的用于抑制杂草植物种子发芽的混合菌株，其特征在于，所述混合菌株由保藏号为KCTC 12713BP的类干酪乳杆菌坚韧亚种LPC63(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans LPC63)菌株、保藏号为KCTC 12712BP的布氏乳杆菌LBN62(Lact obacillus buchneri LBN62)菌株、保藏号为KCTC 12714BP的库德里阿兹威毕赤酵母PKD-51(Pichia kudriavzevii PKD-51)菌株及保藏号为KCTC 12716BP的拜耳接合酵母ZBA-22(Zygosaccharomyce s bailii ZBA-22)菌株组成。

4.根据权利要求1所述的用于抑制杂草植物种子发芽的混合菌株，其特征在于，所述混合菌株由保藏号为KCTC 12713BP的类干酪乳杆菌坚韧亚种LPC63(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans LPC63)菌株、保藏号为KCTC 12712BP的布氏乳杆菌LBN62(Lact obacillus buchneri LBN62)菌株、保藏号为KCTC 12714BP的库德里阿兹威毕赤酵母PKD-51(Pichia kudriavzevii PKD-51)菌株及保藏号为KCTC 12717BP的双孢接合酵母ZBP-52(Zygosaccharomyces bisporus ZBP-52)菌株组成。

5.根据权利要求1所述的用于抑制杂草植物种子发芽的混合菌株，其特征在于，所述杂草植物为禾本科杂草或阔叶杂草。

6.一种除草剂，其特征在于，所述除草剂包含权利要求1至5中任一项所述的混合菌株、所述菌株的培养物或所述菌株的培养液的浓缩液和农药学上可接受的载体。

7.根据权利要求6所述的除草剂，其特征在于，所述除草剂进一步包含由糖蜜和西红柿果汁组成的微生物营养剂。

8.一种除草剂的制备方法，所述制备方法包括培养权利要求1至5中任一项所述的混合菌株的步骤。

9.一种杂草的去除方法，所述方法包括用权利要求1至5中任一项所述的混合菌株、所述菌株的培养物或所述菌株的培养液的浓缩液对土壤进行处理的步骤。

说明书

用于抑制植物种子发芽的混合菌株及其作为除草剂的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于抑制植物种子发芽的混合菌株及其作为除草剂的用途，更详细地，涉及一种用于抑制杂草植物种子发芽的混合菌株，其由乳酸菌菌株和酵母菌株组成；还提供一种除草剂，其特征为，其包含所述菌株、所述菌株的培养物或所述菌株的培养液的浓缩液和农药学上可接受的载体；还提供一种除草剂的制备方法，其包括培养所述混合菌株的步骤；还提供一种杂草的去除方法，其通过用所述菌株、所述菌株的培养物或所述菌株的培养液的浓缩液对土壤进行处理来实现。

背景技术

[0002] 农业生态系统中杂草种的种类非常多，并且，其危害巨大。杂草与作物争夺作物在生长中所必需的水分、营养及太阳光线，从而降低作物的质量和数量，因此成为降低作物生产性的重要限制因素。目前，为了防治杂草，尽管使用各种有机合成除草剂，但是由杂草引起的作物的生产损失仍然很大，这是由于除草剂的持续使用会引起杂草菌落的生态学变化，以及会诱发对于除草剂的耐性所致。至今，为了防治杂草而大量使用的有机合成除草剂，即发芽抑制剂或茎叶处理剂所引起的环境污染及人畜毒性的问题非常严重，因此，一直需要开发出毒性低、环保的新微生物除草剂。

[0003] 这种微生物除草剂作为可以代替现有的合成除草剂的环保防治方法法而被人们接受。最近，为了防治杂草，正在进行很多应用微生物衍生植物毒素(phytotoxins)的研究。

[0004] 另外，虽然韩国公开专利第2004-0034764号公开了一种新菌株链霉菌属8E12及利用其的除草剂，韩国公开专利第2009-0005917号公开了一种种子发芽抑制组合物及其生产方法，但没有公开本发明中所述的“用于抑制植物种子发芽的混合菌株及其作为除草剂的用途”。

发明内容

[0005] 要解决的技术问题

[0006] 本发明是根据上述要求而提出的，本发明人用处理于植物的微生物营养剂对植物种子进行处理的结果，确认了发芽被抑制后，从所述微生物营养剂中纯系分离出4种乳杆菌属菌株和4种酵母。并且，在这些菌株中，使用作为由短乳杆菌LBV-61菌株、植物乳杆菌亚种LPT30菌株及德尔布有孢圆酵母TDB-34菌株组成的混合菌株的培养液的DAG-A培养液和作为由类干酪乳杆菌坚韧亚种LPC63菌株、布氏乳杆菌LBN62菌株、库德里阿兹威毕赤酵母PKD-51菌株及拜耳接合酵母ZBA-22菌株组成的混合菌株的培养液的DAG-B培养液，分别对作为杂草植物的稗子、马唐、反枝苋、一年蓬及苘麻植物的种子进行处理的结果，确认了与使用混合其它乳杆菌属菌株和酵母菌株而培养的培养液进行处理时相比，各杂草植物种子的发芽显著被抑制。由此确认了本发明的两套混合菌株分别抑制杂草植物种子的发芽，从而能够作为除草剂非常有效地使用，并且完成了本发明。

[0007] 技术方案

[0008] 为了解决上述问题，本发明提供一种用于抑制杂草植物的种子发芽的混合菌株，其由乳酸菌菌株和酵母菌株组成。

[0009] 并且，本发明提供一种除草剂，其特征为，所述除草剂包含所述混合菌株、所述菌株的培养物或所述菌株的培养液的浓缩液和农药学上可接受的载体。

[0010] 并且，本发明提供一种除草剂的制备方法，所述制备方法包括培养所述混合菌株的步骤。

[0011] 并且，本发明提供一种杂草的去除方法，所述方法通过用所述混合菌株、所述菌株的培养物或所述菌株的培养液的浓缩液对土壤进行处理来实现。

[0012] 有益效果

[0013] 本发明中，确认了由乳酸菌菌株和酵母菌株组成的两套混合菌株培养液分别抑制杂草植物种子的发芽，从而杂草植物的除草效果优异。因此，本发明的包含混合菌株作为有效成分的除草剂可以作为环保型生物农药剂广泛有用地使用。

附图说明

[0014] 图1示出用DAG-A处理1周后的稗子杂草植物种子的发芽形态(左边的无处理表示DAG-A无处理；右边的25表示将DAG-A培养液稀释为1/4而进行的处理)。

[0015] 图2示出用DAG-B处理1周后的马唐杂草植物种子的发芽形态(左边的无处理表示DAG-B无处理；右边的12.5表示将DAG-B培养液稀释为1/8而进行的处理)。

[0016] 图3示出用DAG-A处理1周后的反枝苋杂草植物种子的发芽形态(左边的无处理表示DAG-A无处理；右边的12.5表示将DAG-A培养液稀释为1/8而进行的处理)。

[0017] 图4示出用DAG-A处理1周后的一年蓬杂草植物种子的发芽形态(左边的无处理表示DAG-A无处理；右边的12.5表示将DAG-A培养液稀释为1/8而进行的处理)。

[0018] 图5示出用DAG-A处理1周后的苘麻杂草植物种子的发芽形态(左边的无处理表示DAG-A无处理；右边的3.13表示将DAG-A培养液稀释为1/32而进行的处理)。

[0019] 图6示出插秧2周后的混合菌株培养液无处理区左侧田和混合菌株培养液处理区右侧田的样子(B和C为混合菌株培养液无处理区左侧田(B)和混合菌株培养液处理区右侧田(C)的放大图)。

具体实施方式

[0020] 为了实现本发明的目的，本发明提供一种用于抑制杂草植物种子发芽的混合菌株，其由乳酸菌菌株和酵母菌株组成。

[0021] 在本发明的一具体例的混合菌株中，所述乳酸菌菌株可以为乳杆菌属(Lactobacillus sp.)菌株，优选为选自植物乳杆菌亚种LPT30(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum LPT30)菌株(KCTC12710BP)、短乳杆菌LBV-61(Lactobacillus brevis LBV-61)菌株(KCTC 12711BP)、布氏乳杆菌LBN62(Lactobacillus buchneri LBN62)菌株(KCTC 12712BP)及类干酪乳杆菌坚韧亚种LPC63(Lactobacillus paracasei 
subsp.tolerans LPC63)菌株(KCTC12713BP)中的一种以上的菌株，但不限定于此。

[0022] 在本发明的一具体例的混合菌株中，所述酵母菌株可以为选自库德里阿兹威毕赤酵母PKD-51(Pichia kudriavzevii PKD-51)菌株(KCTC 12714BP)、德尔布有孢圆酵母TDB-34(Torulaspora delbrueckii TDB-34)菌株(KCTC 12715BP)、拜耳接合酵母ZBA-22(Zygosaccharomyces bailii ZBA-22)菌株(KCTC 12716BP)及双孢接合酵母ZBP-52(Zygosaccharomyces bisporus ZBP-52)菌株(KCTC 12717BP)中的一种以上的菌株，但不限定于此。

[0023] 所述四种乳杆菌属菌株和四种酵母菌株于2014年11月13日，分别保藏在韩国典型培养物保藏中心 保藏编号为各菌株名后括号内所示出的编号。

[0024] 在本发明的一具体例的混合菌株中，所述混合菌株可以优选由短乳杆菌LBV-61(Lactobacillus brevis LBV-61)菌株(KCTC 12711BP)、植物乳杆菌亚种LPT30(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum LPT30)菌株(KCTC 12710BP)及德尔布有孢圆酵母TDB-34(Torulaspora delbrueckii TDB-34)菌株(KCTC 12715BP)组成，但不限定于此。

[0025] 在本发明的一具体例的混合菌株中，所述混合菌株可以优选由类干酪乳杆菌坚韧亚种LPC63(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans LPC63)菌株(KCTC 12713BP)、布氏乳杆菌LBN62(Lactobacillus buchneri LBN62)菌株(KCTC 12712BP)、库德里阿兹威毕赤酵母PKD-51(Pichia kudriavzevii PKD-51)菌株(KCTC 12714BP)及拜耳接合酵母ZBA-22(Zygosaccharomyces bailii ZBA-22)菌株(KCTC 12716BP)组成，或者可以由类干酪乳杆菌坚韧亚种LPC63(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans LPC63)菌株(KCTC 
12713BP)、布氏乳杆菌LBN62(Lactobacillus buchneri LBN62)菌株(KCTC 12712BP)、库德里阿兹威毕赤酵母PKD-51(Pichia kudriavzevii PKD-51)菌株(KCTC 12714BP)及双孢接合酵母ZBP-52(Zygosaccharomyces bisporus ZBP-52)菌株(KCTC 12717BP)组成，但不限定于此。

[0026] 在本发明的一具体例的混合菌株中，所述杂草植物作为一年生的杂草植物，其可以为禾本科杂草或阔叶杂草，可以优选为选自稗子、马唐、反枝苋、一年蓬及苘麻中的一种以上的杂草植物，但并不限定于此。

[0027] 尤其，对耕作预定地点的土壤进行耕耘时预先使用，因此，不会影响欲时机性栽培的特定作物种子的发芽，在通常使用种子公司供应的涂覆种子时更是如此。

[0028] 本发明的混合菌株除了对所述的稗子、马唐、反枝苋、一年蓬及苘麻以外，对任何一年生的杂草植物种子均可以示出发芽抑制活性。尤其是在欲栽培的特定作物种子的情况下，由于种子公司在通常情况下已经通过种子涂覆等操作来实施了病害虫防治处理，因此，即使使用本发明的混合菌株进行处理，还是能够对杂草植物种子显示出特异性发芽抑制活性。

[0029] 另外，本发明提供一种除草剂，其特征为，所述除草剂包含所述混合菌株、所述菌株的培养物或所述菌株的培养液的浓缩液和农药学上可接受的载体。这种载体不受特别的限制，其选自药剂学或营养学上可接受的载体及稀释剂。

[0030] 将从本发明的培养菌株的步骤中获得的所述菌株或所述菌株的培养物或所述菌株的培养液的浓缩液作为添加物使用时，可以直接添加所述菌株或所述菌株的培养物或所述菌株的培养液的浓缩液而使用，或者也可以与其它添加剂一起使用，并且，可以根据常规的方法适当使用。有效成分的混合量可以根据其的使用目的而适当地进行确定。添加剂优选为由糖蜜及西红柿果汁组成的所述菌株的营养剂，最优选地，可以为将500g糖蜜(白利糖度(Brix)79.8°)、50g西红柿果汁溶解于1L水中而制备的微生物营养剂，但并不限定于此。

[0031] 另外，本发明提供一种除草剂的制备方法，所述制备方法包括培养所述混合菌株的步骤。

[0032] 本发明的培养菌株的方法，可以根据本领域通常利用的方法培养。

[0033] 另外，本发明提供一种杂草的去除方法，所述方法通过用所述混合菌株、所述菌株的培养物或所述菌株的培养液的浓缩液对土壤进行处理来实现。下面根据实施例对本发明进行更加详细地说明。然而，下述实施例仅是用于例示本发明，本发明的范围并不限定于此。

[0034] 材料及方法

[0035] 菌株的分离及鉴定

[0036] 用使用生理盐水对施用于园艺作物耕地的微生物营养剂进行稀释后，将0.1ml的其悬浮液分别涂抹于BCP培养基(BCP，Eiken公司的BCP平板计数琼脂板(Plate Count Agar Plate))和PDA培养基(PDA，Difco公司的蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂板(Bacto Potato Dextrose Agar Plate))上，BCP在37℃下培养、PDA在30℃下培养，并观察了繁育的菌落。在BCP中采集使菌落周围变成黄色的菌落，并再次在BCP中进行传代培养，从而分离了乳酸菌，另外，对在PDA中繁育的菌落进行传代培养，从而分离了酵母。

[0037] 根据16S rDNA序列，对乳酸菌进行了系统学分类。从在37℃下，在MRS培养基(MRS,Difco公司的蛋白胨乳酸杆菌MRS琼脂平板(Bacto Lactobacilli MRS Agar Plate))中培养72小时的菌体中提取了DNA，用PCR(引物：27F，5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'(SEQ ID No：9)及1492R，5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'(SEQ ID No：10)/30周期：95℃15分钟，95℃20秒，55℃40秒，72℃1分钟30秒，72℃5分钟，之后10℃无限)对其进行扩增而精制，然后使用DNA分析仪ABI 3730XL(美国应用生物系统公司(Applied Biosystems))分析碱基序列后，用序列比对(CLUSTAL)X(Thomson et al.,1994)和MEGA程序确认了系统学位置。

[0038] 另外，根据18S rDNA序列，对酵母进行了分类。即从在30℃下在PDA中培养48小时的菌体中，提取了DNA，用PCR(引物：ITS1，5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'(SEQ ID No：11)及ITS4，5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'(SEQ ID No：12)/30周期：95℃15分钟，95℃20秒，55℃40秒，72℃1分钟30秒，72℃5分钟，之后10℃无限)对其进行扩增而精制，然后用如上的方法分析碱基序列后，确认了系统学位置。

[0039] 微生物的培养方法

[0040] 将乳酸菌类分别接种于MRS(MRS，Difco公司的蛋白胨乳酸杆菌MRS肉汤(Bacto Lactobacilli MRS Broth))培养基中，并在32℃下静置培养96～120小时，从而获得了活菌数为108c.f.u.ml-1水平的完全培养液 将酵母类分别接种于PDB(PDB，Difco公司的蛋白胨马铃薯葡萄糖肉汤(Bacto Potato Dextrose Broth))培养基中，并在30℃下振荡培养48～72小时，从而获得了活菌数为108c.f.u.ml-1水平的完全培养液。将在前面获得的各菌株的完全培养液分别以0.5％接种于糖蜜培养基(Molasses Broth)中，并在24±2℃下静置培养4～6周，从而实施了本培养。将5g酵母提取物、50g糖蜜(白利糖度79.8°)以及
10g西红柿果汁溶解于1L水中，从而制备了用于本培养的糖蜜培养基(pH6.5±0.2，25℃)。

[0041] 培养液的回收

[0042] 培养期间，微生物的活菌数被控制为，在培养初期上升，在中期以后减少，与乳酸菌类的活菌数相比，酵母类的活菌数一直低。培养后期的活菌数中，乳酸菌类为106cfu/ml水平，酵母类为104cfu/ml水平。培养期间，培养液的pH从pH 6.5逐渐减少，直到末期pH达到3.2～4.2范围。

[0043] 混合培养液DAG-A及DAG-B的制备

[0044] 首先，根据前述微生物培养方法，分别将短乳杆菌LBV-61(Lactobacillus brevis LBV-61)菌株(KCTC 12711BP)及植物乳杆菌亚种LPT30(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum LPT30)菌株(KCTC 12710BP)在MRS培养基中静置培养120小时，并将德尔布有孢圆酵母TDB-34(Torulaspora delbrueckii TDB-34)菌株(KCTC12715BP)在PDB培养基中振荡培养60小时。将由此获得的培养液分别以0.5％接种于糖蜜培养基中，并再次静置培养6周，并由此回收了混合培养液DAG-A。

[0045] 分别将类干酪乳杆菌坚韧亚种LPC63(Lactobacillus  paracasei subsp.tolerans LPC63)菌株(KCTC 12713BP)及布氏乳杆菌LBN62(Lactobacillus buchneri LBN62)菌株(KCTC 12712BP)在MRS培养基中静置培养120小时，并将库德里阿兹威毕赤酵母PKD-51(Pichia kudriavzevii PKD-51)菌株(KCTC 12714BP)、拜耳接合酵母ZBA-22(Zygosaccharomyces bailii ZBA-22)菌株(KCTC 12716BP)或双孢接合酵母ZBP-52(Zygosaccharomyces bisporus ZBP-52)菌株(KCTC 12717BP)在PDB培养基中振荡培养60小时。将由此获得的培养液分别以0.5％接种于糖蜜培养基中，并再次静置培养6周，并由此回收了混合培养液DAG-B。

[0046] 发芽抑制活性的测定

[0047] 对象杂草植物种子为禾本科杂草的稗、马唐种子、阔叶杂草的反枝苋、一年蓬、苘麻的种子。对于处理浓度，以试验药剂即培养液原液100作为基准，每次将其稀释为1/2倍而使用。即，按100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0.05等依次进行稀释而试验。在60×15mm培养皿上铺上两张55mm滤纸，并将10-20个杂草种子接种到上面后，按照混合培养液的浓度分别处理5ml，并且，用5ml蒸馏水来代替培养液进行处理，从而进行了对照试验(无处理区)。将培养皿用石蜡膜密封之后放入生长箱中保管并观察。此时，生长箱调节成光条件12小时(30℃)/暗条件12小时(25℃)。将处理一周后发芽的个体数即产生幼根的数字进行观察计数，并用百分率表示相对于无处理区中的发芽率的处理区发芽率。

[0048] 包含微生物营养剂的混合菌株培养液的制备

[0049] 为了施用混合培养液，对于田面积1段步( 韩国土地面积单位，一段步为300坪，即1.48亩)(10a)准备300L的水，在其中加入500ml的DAG-B和1,000ml营养剂并进行混合之后喷洒在表面。此时，营养剂是将500g糖蜜(白利糖度79.8°)、50g西红柿果汁溶解于1L水中而制得(pH 6.5±0.2，25℃)。添加营养剂是为了提高混合培养液的稀释过程和喷洒后的混合菌株的土壤扎根的稳定性。

[0050] 利用混合菌株的培养液的田间试验

[0051] 为了确认对于畓作 的除草效果，2014年春天在位于韩国忠清南道论山市练武邑阳地里的田里进行了试验。田的管理遵守了商法。即在4月中旬对田的土壤进行耕耘后，5月10日左右进行了浇灌和耙地和插秧(三光稻)。以南北向的田埂作为中心进行了区分，即左侧为无处理区，右侧为处理区(参见图6)，对于处理区，在4月中旬对田的土壤进行耕耘后，立即施用了混合培养液DAG-B和营养液。将500ml的DAG-B和1,000ml的营养剂稀释于300L水后，均匀喷洒到土壤表面的每段步(10a)上。进行插秧后，对于无处理区和处理区的杂草产生状态进行了比较观察。

[0052] 实施例1：菌株的分离及鉴定结果

[0053] 根据前述的方法，分离四种乳酸菌、四种酵母，并分析它们的rDNA碱基序列(参见SEQ ID No：1至8)，并进行系统学分类。其结果，乳酸菌LBV-61菌株被鉴定为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、LPT30被鉴定为植物乳杆菌亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)、LPC63被鉴定为类干酪乳杆菌坚韧亚种(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans)、LBN62被鉴定为布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)。并且，酵母TDB-34菌株被鉴定为德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、PKD-51被鉴定为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia  kudriavzevii)、ZBA-22被鉴定为拜耳接合酵母
(Zygosaccharomyces bailii)、ZBP-52被鉴定为双孢接合酵母(Zygosaccharomyces bisporus)。

[0054] 实施例2：具有发芽抑制活性的混合菌株的筛选

[0055] 确认了将本发明中分离的四种乳杆菌属菌株和四种酵母进行混合而培养时具有发芽抑制活性，并由此分别组合为下述表1所示的12种情况并制备了混合菌株，从而获得了混合培养液。

[0056] 对这些混合培养液对于禾本科杂草(稗子)、阔叶杂草(反枝苋)种子的发芽抑制活性进行了比较，并在表1中示出了其结果。其中，用示出0％发芽率的混合培养液的稀释倍数来表示种子发芽抑制浓度。即100表示用培养液原液进行试验，50表示将培养液稀释为1/2而进行试验。如表1中所示，根据菌株的组合，发芽抑制活性有差异。在3号组合(短乳杆菌LBV-61(Lactobacillus brevis LBV-61)+植物乳杆菌亚种LPT30(Lactobacillus plantarum  subsp.plantarum LPT30)+德尔布有孢圆酵母TDB-34(Torulaspora 
delbrueckii TDB-34))菌株和10号组合(类干酪乳杆菌坚韧亚种LPC63(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans LPC63)+布氏乳杆菌LBN62(Lactobacillus buchneri LBN62)+库德里阿兹威毕赤酵母PKD-51(Pichia kudriavzevii PKD-51)+拜耳接合酵母ZBA-22(Zygosaccharomyces bailii ZBA-22))菌株中的活性较高。并且，在10号组合中，用双孢接合酵母ZBP-52(Zygosaccharomyces bisporus ZBP-52)菌株代替拜耳接合酵母ZBA-22也示出了相同的结果。

[0057] 总而言之，本发明中分离的四种乳杆菌属菌株和四种酵母进行混合的混合菌株在种子发芽抑制活性方面虽然有一定的差异，但在所有组合中都具有种子发芽抑制活性。

[0058] 表1 混合培养菌株的组合和种子发芽抑制浓度(稀释倍数)

[0059]

[0060] *种子发芽抑制浓度用示出0％发芽率的混合培养液的稀释倍数表示。即100：使用培养液原液；50：将培养稀释为1/2而使用。

[0061] 实施例3：被筛选的混合菌株培养液的发芽抑制活性

[0062] 对实施例2中示出较高活性的3号及10号组合进行了进一步的试验。将3号组合的培养液命名为DAG-A，将10号组合的培养液命名为DAG-B，并扩大对象杂草植物，即对稗子、马唐(禾本科杂草)以及反枝苋，一年蓬、苘麻(阔叶杂草)的种子进行了发芽抑制活性试验。

[0063] 将根据DAG-A及DAG-B的浓度的杂草种子发芽率表示在表2至表6中，将处理1周后的发芽形态以照片的形式表示在图1至图5中。DAG-A及DAG-B混合菌株虽然在根据浓度的种子发芽抑制活性方面具有差异，但对于所有禾本科杂草及阔叶杂草的种子发芽抑制活性优异。

[0064] 表2 根据DAG-A及DAG-B的浓度的稗子的发芽率

[0065]DAG浓度 DAG-A DAG-B
50.00 0.0* 0.0
25.00 0.0 0.0
12.50 82.6 0.0
6.25 87.0 77.8
3.13 95.7 105.6
1.56 100.0 111.1
0.78 104.3 100.0
0.39 104.3 94.4
0.20 95.7 105.6
0.10 95.7 111.1
0.05 91.3 100.0

[0066] *相对于无处理区中的发芽率的处理区的发芽率

[0067] 表3 根据DAG-A及DAG-B的浓度的马唐的发芽率

[0068]DAG浓度 DAG-A DAG-B
50.00 0.0* 0.0
25.00 0.0 0.0
12.50 0.0 0.0
6.25 87.5 0.0
3.13 81.3 75.0
1.56 81.3 100.0
0.78 93.8 80.1
0.39 106.3 90.0
0.20 81.3 85.3
0.10 93.8 100.0
0.05 100.0 95.0

[0069] *相对于无处理区中的发芽率的处理区的发芽率

[0070] 表4 根据DAG-A及DAG-B的浓度的反枝苋的发芽率

[0071]

[0072]

[0073] *相对于无处理区中的发芽率的处理区的发芽率

[0074] 表5 根据DAG-A及DAG-B的浓度的一年蓬的发芽率

[0075]DAG浓度 DAG-A DAG-B
50.00 0.0* 0.0
25.00 0.0 0.0
12.50 40.0 0.0
6.25 87.5 62.5
3.13 95.2 62.5
1.56 100.0 105.0
0.78 81.0 100.0
0.39 100.0 87.5
0.20 104.8 97.5
0.10 95.2 105.0
0.05 104.8 110.0

[0076] *相对于无处理区中的发芽率的处理区的发芽率

[0077] 表6 根据DAG-A及DAG-B的浓度的苘麻的发芽率

[0078]DAG浓度 DAG-A DAG-B
50.00 0.0* 0.0
25.00 0.0 0.0
12.50 0.0 0.0
6.25 83.4 0.0
3.13 110.0 52.1
1.56 104.0 106.0
0.78 96.0 94.0
0.39 98.2 102.6
0.20 104.0 100.0
0.10 94.4 98.0
0.05 100.0 100.0

[0079] *相对于无处理区中的发芽率的处理区的发芽率

[0080] 实施例4：利用混合菌株的培养液的包干试验结果

[0081] 4月中旬试验药剂的处理后至插秧为止，由于4月17日有20mm的降雨，27-29日有60mm的降雨，因此，维持了土壤的湿润状态，由于浇灌后的5月11日有10mm以上的降雨，因此，于13日进行了插秧。插秧之后，对于处理区和无处理区的杂草产生状态进行了比较观察。拍摄插秧15日之后的样子并表示在图6中。如图6中所示，左侧无处理区中的杂草萌芽，使整体田呈绿色，相反，右侧处理区中的杂草产生显著减少，并且田地也看起来比较干净。
并且，在处理区中不再锄草也没有产生影响，并一直持续到出穗期。

[0082] [保藏号]

[0083] 保藏机构名：韩国典型培养物保藏中心

[0084]

[0085] 保藏号：KCTC12710BP

[0086] 保藏日：20141113

[0087] 保藏机构名：韩国典型培养物保藏中心

[0088]

[0089] 保藏号：KCTC12711BP

[0090] 保藏日：20141113

[0091] 保藏机构名：韩国典型培养物保藏中心

[0092]

[0093] 保藏号：KCTC12712BP

[0094] 保藏日：20141113

[0095] 保藏机构名：韩国典型培养物保藏中心

[0096]

[0097] 保藏号：KCTC12713BP

[0098] 保藏日：20141113

[0099] 保藏机构名：韩国典型培养物保藏中心

[0100]

[0101] 保藏号：KCTC12714BP

[0102] 保藏日：20141113

[0103] 保藏机构名：韩国典型培养物保藏中心

[0104] 保藏号：KCTC12715BP

[0105] 保藏日：20141113

[0106] 保藏机构名：韩国典型培养物保藏中心

[0107] 保藏号：KCTC12716BP

[0108] 保藏日：20141113

[0109] 保藏机构名：韩国典型培养物保藏中心

[0110] 保藏号：KCTC12717BP

[0111] 保藏日：20141113