手性设计转让专利
申请号 : CN201580011393.9
文献号 : CN106068325B
文献日 : 2021-07-09
发明人 : 米纳 , 大卫·巴特勒 , 岩本直树 , 内纳德·斯夫尔齐卡帕 , 格雷戈里·L·韦尔迪 , 伊万·兹洛泰夫
申请人 : 波涛生命科学有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种手性控制的寡核苷酸组合物,其包含通过具有以下来定义的寡核苷酸:
1)共同碱基序列和长度;
2)共同骨架键联样式;和
3)共同骨架手性中心样式,
所述组合物是单一寡核苷酸的基本上纯的制备物,其中所述组合物中至少约10%的所述寡核苷酸具有所述共同碱基序列和长度、所述共同骨架键联样式和所述共同骨架手性中心样式;其中:
所述单一寡核苷酸具有翼区‑核心‑翼区结构,其中所述第一翼区独立地具有一个或更多个碱基的长度,并且所述第二翼区独立地具有一个或更多个碱基的长度;
所述共同碱基序列具有至少10个核苷碱基;
所述共同骨架手性中心样式包含至少50%的Sp构象的骨架手性中心;并且所述核心区域从5’至3’包含(Rp)(Sp)2的核苷酸间键联立体化学样式。
2.一种手性控制的寡核苷酸组合物,其包含特定寡核苷酸类型的寡核苷酸,所述寡核苷酸的特征在于:
1)共同碱基序列和长度;
2)共同骨架键联样式;和
3)共同骨架手性中心样式;
所述组合物是手性控制的,其中相对于具有相同碱基序列和长度的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物,所述组合物富含所述特定寡核苷酸类型的寡核苷酸,其中:所述特定寡核苷酸类型的寡核苷酸各自包含翼区‑核心‑翼区结构,其中所述第一翼区独立地具有一个或更多个碱基的长度,并且所述第二翼区独立地具有一个或更多个碱基的长度;
所述共同碱基序列具有至少10个核苷碱基;
所述共同骨架手性中心样式包含至少50%的Sp构象的骨架手性中心;并且所述核心区域从5’至3’包含(Rp)(Sp)2的核苷酸间键联立体化学样式。
3.权利要求1所述的组合物,其中所述寡核苷酸各自包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19或20个手性核苷酸间键联。
4.权利要求3所述的组合物,其中所述核心区域从5’至3’包含(Rp)(Sp)m的核苷酸间键联立体化学样式,其中m是3。
5.权利要求4所述的组合物,其中所述核心区域从5’至3’包含(Rp)(Sp)m的核苷酸间键联立体化学样式,其中m是4。
6.权利要求5所述的组合物,其中所述核心区域从5’至3’包含(Rp)(Sp)m的核苷酸间键联立体化学样式,其中m是5。
7.权利要求6所述的组合物,其中所述核心区域从5’至3’包含(Rp)(Sp)m的核苷酸间键联立体化学样式,其中m是6。
8.权利要求7所述的组合物,其中所述核心区域从5’至3’包含(Rp)(Sp)m的核苷酸间键联立体化学样式,其中m是7。
9.权利要求2所述的组合物,其中所述寡核苷酸各自包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19或20个手性核苷酸间键联。
10.权利要求9所述的组合物,其中所述核心区域从5’至3’包含(Rp)(Sp)m的核苷酸间键联立体化学样式,其中m是3。
11.权利要求10所述的组合物,其中所述核心区域从5’至3’包含(Rp)(Sp)m的核苷酸间键联立体化学样式,其中m是4。
12.权利要求11所述的组合物,其中所述核心区域从5’至3’包含(Rp)(Sp)m的核苷酸间键联立体化学样式,其中m是5。
13.权利要求12所述的组合物,其中所述核心区域从5’至3’包含(Rp)(Sp)m的核苷酸间键联立体化学样式,其中m是6。
14.权利要求13所述的组合物,其中所述核心区域从5’至3’包含(Rp)(Sp)m的核苷酸间键联立体化学样式,其中m是7。
15.一种手性控制的寡核苷酸组合物,其包含特定寡核苷酸类型的寡核苷酸,所述寡核苷酸的特征在于:
1)共同碱基序列和长度;
2)共同骨架键联样式;和
3)共同骨架手性中心样式;
所述组合物是手性控制的,其中相对于具有相同碱基序列和长度的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物,所述组合物富含所述特定寡核苷酸类型的寡核苷酸;
其中:
所述共同碱基序列具有至少15个核苷碱基;并且所述特定寡核苷酸类型的骨架手性中心样式包含(Sp)t(Rp)n(Sp)m,其中t是1、2、3、4、
5、6、7或8,n是1,并且m是2、3、4、5、6、7或8。
16.权利要求15所述的组合物,其中所述特定寡核苷酸类型的寡核苷酸各自具有翼区‑核心‑翼区基序,其中所述核心区域的所述骨架手性中心样式包含(Np)t(Rp)n(Sp)m,其中Np是Rp或Sp。
17.权利要求15所述的组合物,其中t是2、3、4、5、6、7或8。
18.权利要求17所述的组合物,其中t和m中的至少一个大于5。
19.权利要求18所述的组合物,其中t大于5。
20.权利要求16所述的组合物,其中t是2、3、4、5、6、7或8。
21.权利要求20所述的组合物,其中t和m中的至少一个大于5。
22.权利要求21所述的组合物,其中t大于5。
23.权利要求1至22中任一项所述的组合物,其中一个或更多个碱基不是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。
24.权利要求1至22中任一项所述的组合物,其中所述碱基选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)、5‑甲基胞嘧啶(5mC)和胸腺嘧啶(T)。
25.权利要求1至22中任一项所述的组合物,其中所述寡核苷酸具有15个碱基的长度。
26.权利要求1至22中任一项所述的组合物,其中所述寡核苷酸具有16个碱基的长度。
27.权利要求1至22中任一项所述的组合物,其中所述寡核苷酸具有17个碱基的长度。
28.权利要求1至22中任一项所述的组合物,其中所述寡核苷酸具有18个碱基的长度。
29.权利要求1至22中任一项所述的组合物,其中所述寡核苷酸具有19个碱基的长度。
30.权利要求1至22中任一项所述的组合物,其中所述寡核苷酸具有20个碱基的长度。
31.权利要求1至22中任一项所述的组合物,其中所述寡核苷酸具有至少21个碱基的长度。
32.权利要求1至22中任一项所述的组合物,其中所述寡核苷酸具有15个、16个、17个、
18个、19个、20个碱基的长度或至少21个碱基的长度,其中所述碱基选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)、5‑甲基胞嘧啶(5mC)和胸腺嘧啶(T)。
33.权利要求1至22中任一项所述的组合物,其中所述寡核苷酸具有20个碱基的长度,其中所述碱基选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)、5‑甲基胞嘧啶(5mC)和胸腺嘧啶(T)。
34.权利要求1至22中任一项所述的组合物,其中所述寡核苷酸具有至少21个碱基的长度,其中所述碱基选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)、5‑甲基胞嘧啶(5mC)和胸腺嘧啶(T)。
35.权利要求1至22中任一项所述的组合物,其中所述组合物中至少约20%的寡核苷酸具有所述共同碱基序列和长度、所述共同骨架键联样式和所述共同骨架手性中心样式。
36.权利要求35所述的组合物,其中所述组合物中至少约50%的寡核苷酸具有所述共同碱基序列和长度、所述共同骨架键联样式和所述共同骨架手性中心样式。
37.权利要求32所述的组合物,其中所述组合物中至少约20%的寡核苷酸具有所述共同碱基序列和长度、所述共同骨架键联样式和所述共同骨架手性中心样式。
38.权利要求37所述的组合物,其中所述组合物中至少约50%的寡核苷酸具有所述共同碱基序列和长度、所述共同骨架键联样式和所述共同骨架手性中心样式。
39.权利要求36至38中任一项所述的组合物,其中所述组合物中至少约80%的寡核苷酸具有所述共同碱基序列和长度、所述共同骨架键联样式和所述共同骨架手性中心样式。
40.权利要求1至22和36至38中任一项所述的组合物,其中每个翼区任选地包含手性核苷酸间键联。
41.权利要求1至22和36至38中任一项所述的组合物,其中每个翼区中的手性核苷酸间键联独立地具有相同的立体化学。
42.权利要求1至22和36至38中任一项所述的组合物,其中两个翼区的手性核苷酸间键联具有相同的立体化学。
43.权利要求1至22和36至38中任一项所述的组合物,其中每个翼区中的手性核苷酸间键联独立地具有相同的立体化学,并且第一翼区的立体化学与第二翼区的立体化学不同。
44.权利要求1至22和36至38中任一项所述的组合物,其中第一翼区独立地具有两个或更多个碱基的长度。
45.权利要求44所述的组合物,其中第一翼区独立地具有三个或更多个碱基的长度。
46.权利要求44所述的组合物,其中第一翼区独立地具有四个或更多个碱基的长度。
47.权利要求44所述的组合物,其中第一翼区独立地具有五个或更多个碱基的长度。
48.权利要求44所述的组合物,其中第一翼区独立地具有小于八个碱基的长度。
49.权利要求1至22、36至38和45至48中任一项所述的组合物,其中第二翼区独立地具有两个或更多个碱基的长度。
50.权利要求49所述的组合物,其中第二翼区独立地具有三个或更多个碱基的长度。
51.权利要求49所述的组合物,其中第二翼区独立地具有四个或更多个碱基的长度。
52.权利要求49所述的组合物,其中第二翼区独立地具有五个或更多个碱基的长度。
53.权利要求49所述的组合物,其中第二翼区独立地具有小于八个碱基的长度。
54.权利要求1至22、36至38、45至48和50至53中任一项所述的组合物,其中所述核心区域具有五个或更多个碱基的长度。
55.权利要求54所述的组合物,其中所述核心区域具有六个或更多个碱基的长度。
56.权利要求54所述的组合物,其中所述核心区域具有七个或更多个碱基的长度。
57.权利要求54所述的组合物,其中所述核心区域具有八个或更多个碱基的长度。
58.权利要求54所述的组合物,其中所述核心区域具有九个或更多个碱基的长度。
59.权利要求54所述的组合物,其中所述核心区域具有10个或更多个碱基的长度。
60.权利要求54所述的组合物,其中所述核心区域具有15个或更多个碱基的长度。
61.权利要求1至22和36至38中任一项所述的组合物,其中每个翼区独立地具有2个、3个、4个、5个或更多个碱基的长度,并且所述核心区域具有5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或更多个碱基的长度。
62.权利要求1至22、36至38、45至48和50至53中任一项所述的组合物,其中每个翼区包含一个或更多个具有特定修饰的残基,所述修饰在核心区域不存在。
63.权利要求62所述的组合物,其中每个翼区包含一个或更多个具有2’修饰的残基,所述2’修饰不存在于核心部分中。
64.权利要求61所述的组合物,其中每个翼区包含一个或更多个具有特定修饰的残基,所述修饰在核心区域不存在。
65.权利要求64所述的组合物,其中每个翼区包含一个或更多个具有2’修饰的残基,所述2’修饰不存在于核心部分中。
66.权利要求1至22、36至38、45至48、50至53和63至65中任一项所述的组合物,其中所述核心区域具有核苷酸间键联立体化学的重复样式。
67.权利要求66所述的组合物,其中所述核苷酸间键联立体化学的重复样式是(Rp)(Sp)m,其中每个m独立地是2、3、4、5、6、7或8。
68.权利要求1至22、36至38、45至48、50至53、63至65和67中任一项所述的组合物,其中所述核心区域的50%百分比或更多的手性核苷酸间键联具有Sp构型。
69.权利要求68所述的组合物,其中所述核心区域的60%百分比或更多的手性核苷酸间键联具有Sp构型。
70.权利要求1至22、36至38、45至48、50至53、63至65、67和69中任一项所述的组合物,其中所述寡核苷酸中50%‑90%的所述核苷酸间键联是Sp构型的硫代磷酸酯核苷酸间键联。
71.权利要求70所述的组合物,其中所述寡核苷酸的至少90%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联是Sp。
72.权利要求1至22、36至38、45至48、50至53、63至65、67、69和71中任一项所述的组合物,其中所述共同碱基序列是或包含与靶序列互补的序列,其中当与包含所述靶序列的核酸聚合物接触时,所述手性控制的寡核苷酸组合物提供了与来自参照寡核苷酸组合物的参照切割样式相比改变的切割样式。
73.权利要求72所述的组合物,其中所述核酸聚合物是RNA,并且参照寡核苷酸组合物是共有所述共同序列和长度的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物。
74.权利要求72所述的组合物,其中所述核酸聚合物是RNA,并且参照寡核苷酸组合物是共有所述共同序列和长度的寡核苷酸的手性未控制的寡核苷酸组合物。
75.权利要求72所述的组合物,其中所述改变的切割样式具有比参照切割样式更少的切割位点。
76.权利要求73所述的组合物,其中所述改变的切割样式具有比参照切割样式更少的切割位点。
77.权利要求74所述的组合物,其中所述改变的切割样式具有比参照切割样式更少的切割位点。
78.权利要求1至22、36至38、45至48、50至53、63至65、67、69、71和73至77中任一项所述的组合物,其中所述寡核苷酸的所述共同碱基序列是或包含与相对于群体中存在的同一靶基因的其他等位基因限定靶基因的特定等位基因的特征序列元件互补的序列,所述组合物的特征在于,当使其与表达所述靶基因之转录物的体系相接触时,所述组合物显示出对所述特定等位基因之转录物表达的以下抑制水平:a)为至少2倍,其中检测到来自所述特定等位基因之转录物的量在所述组合物存在时比其不存在时低2倍;
b)比对于同一基因的另一等位基因所观察到的抑制水平高至少2倍;或c)既为至少2倍,其中检测到来自所述特定等位基因之转录物的量在所述组合物存在时比其不存在时低2倍;又比对于同一基因的另一等位基因所观察到的抑制水平高至少2倍。
79.权利要求76所述的组合物,其中所述寡核苷酸各自包含经修饰碱基。
80.权利要求78所述的组合物,其中所述寡核苷酸各自包含经修饰糖。
81.权利要求1至22、36至38、45至48、50至53、63至65、67、69、71、73至77和79至80中任一项所述的组合物,其中所述寡核苷酸各自具有仅一个Rp,并且每个其他核苷酸间键联是Sp。
82.权利要求1至22、36至38、45至48、50至53、63至65、67、69、71、73至77和79至80中任一项所述的组合物,其中每个所述寡核苷酸的至少约10%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。
83.权利要求1至22、36至38、45至48、50至53、63至65、67、69、71、73至77和79至80中任一项所述的组合物,其中所述寡核苷酸中的每个手性核苷酸间键联独立地具有式I的结构:其中:
P*是不对称磷原子,并且是Rp或Sp;
W是O、S或Se;
1
X、Y和Z各自独立地是‑O‑、‑S‑、‑N(‑L‑R)‑或L;
L是共价键或任选地经取代的直链或支链C1‑C10亚烷基,其中L的一个或更多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换:任选地经取代的C1‑C6亚烷基、C1‑C6亚烯基、‑C≡C‑、‑C(R′)2‑、‑Cy‑、‑O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N(R′)‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR′)‑、‑C(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)‑、‑N(R′)C(O)O‑、‑OC(O)N(R′)‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2N(R′)‑、‑N(R′)S(O)2‑、‑SC(O)‑、‑C(O)S‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑;
1
R是卤素、R或任选地经取代的C1‑C50脂族,其中一个或更多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换:任选地经取代的C1‑C6亚烷基、C1‑C6亚烯基、‑C≡C‑、‑C(R′)2‑、‑Cy‑、‑O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N(R′)‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR′)‑、‑C(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)‑、‑N(R′)C(O)O‑、‑OC(O)N(R′)‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2N(R′)‑、‑N(R′)S(O)2‑、‑SC(O)‑、‑C(O)S‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑;
R′各自独立地是‑R、‑C(O)R、‑CO2R或‑SO2R,或:同一氮上的两个R′与其间插原子一起形成任选地经取代的杂环或杂芳环,或同一碳上的两个R′与其间插原子一起形成任选地经取代的芳环、碳环、杂环或杂芳环;
‑Cy‑是选自亚苯基、亚碳环基、亚芳基、亚杂芳基或亚杂环基的任选地经取代的二价环;
R各自独立地是氢或选自C1‑C6脂族、苯基、碳环基、芳基、杂芳基或杂环基的任选地经取代的基团;并且
各自独立地表示与核苷的连接。
84.权利要求83所述的组合物,其中在一个或更多个核苷酸间键联中,X是S,并且Y和Z是O。
1
85.权利要求83所述的组合物,其中在一个或更多个核苷酸间键联中,‑L‑R不是‑H。
86.权利要求83所述的组合物,其中每个具有式I结构的核苷酸间键联是硫代磷酸酯键联。
87.权利要求1至22、36至38、45至48、50至53、63至65、67、69、71、73至77、79至80和84至
86中任一项所述的组合物,其中所述寡核苷酸的一个核苷碱基是胞嘧啶。
88.权利要求1至22、36至38、45至48、50至53、63至65、67、69、71、73至77、79至80和84至
86中任一项所述的组合物,其中所述寡核苷酸的一个核苷碱基是鸟嘌呤。
89.权利要求1至22、36至38、45至48、50至53、63至65、67、69、71、73至77、79至80和84至
86中任一项所述的组合物,其中所述寡核苷酸的一个核苷碱基是尿嘧啶。
90.权利要求1至22、36至38、45至48、50至53、63至65、67、69、71、73至77、79至80和84至
86中任一项所述的组合物,其中所述寡核苷酸的共同碱基序列包含存在于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列,其中所述序列与GCCTCAGTCTGCTTCGCACC具有超过50%的同一性。
91.权利要求90所述的组合物,其中所述寡核苷酸的碱基序列包含存在于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列,其中所述序列与GCCTCAGTCTGCTTCGCACC具有不多于95%的同一性。
92.权利要求1至22、36至38、45至48、50至53、63至65、67、69、71、73至77、79至80、84至
86和91中任一项所述的组合物,其中所述寡核苷酸的碱基序列包含与突变或SNP位点互补的序列。
93.权利要求1至22、36至38、45至48、50至53、63至65、67、69、71、73至77、79至80、84至
86和91中任一项所述的组合物,其中当在合适条件下与靶等位基因的转录物接触时,所述寡核苷酸在限定靶等位基因的序列差异下游或上游5、4、3、2或1个碱基对以内的位点处切割所述转录物。
94.权利要求93所述的组合物,其中当在合适条件下与靶等位基因的转录物接触时,所述寡核苷酸在限定靶等位基因的序列差异的紧邻上游或下游的核苷酸间键联处切割所述转录物。
95.权利要求93所述的组合物,其中所述序列差异是突变或SNP。
96.权利要求94所述的组合物,其中所述序列差异是突变或SNP。
97.权利要求92所述的组合物,其中所述SNP与亨廷顿病相关。
98.药物组合物,其包含有效量的前述权利要求中任一项所述的组合物以及至少一种选自可药用稀释剂、可药用赋形剂和可药用载体的可药用非活性成分。
99.前述权利要求中任一项所述的手性控制的寡核苷酸组合物在制造用于控制切割核酸聚合物之药物中的用途,所述控制切割包括以下步骤:使核苷酸序列包含靶序列的核酸聚合物与前述权利要求中任一项所述的手性控制的寡核苷酸组合物相接触,其中所述共同碱基序列是或包含与存在于所述核酸聚合物中的靶序列互补的序列。
100.前述权利要求中任一项所述的手性控制的寡核苷酸组合物在制造用于改变当其核苷酸序列包含靶序列的核酸聚合物与参照寡核苷酸组合物相接触时所观察到的切割样式之药物中的用途,所述参照寡核苷酸组合物包含具有特定碱基序列和长度的寡核苷酸,所述特定碱基序列是或包含与所述靶序列互补的序列,所述改变包括:使所述核酸聚合物与前述权利要求中任一项所述的手性控制的寡核苷酸组合物相接触,其中所述共同碱基序列和长度是所述特定碱基序列和长度。
101.权利要求99或100所述的用途,其中通过手性控制的寡核苷酸组合物的切割包括与所述寡核苷酸互补的RNA在基序下游两个核苷酸间键联的RNA的核苷酸间键联处的切割,所述基序的互补基序在所述寡核苷酸中具有RpSpSp骨架手性中心样式。
102.权利要求101所述的用途,其中当通过位点处的切割百分比测量时,通过手性控制的寡核苷酸组合物在RpSpSp下游两个核苷酸间键联位点处的切割是参照寡核苷酸组合物的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500或1000倍。
103.权利要求102所述的用途,其中所述参照寡核苷酸组合物是共有所述共同序列和长度的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物。
104.权利要求103所述的用途,其中由所述手性控制的寡核苷酸组合物提供的切割样式与参照切割样式的差异在于,与所述参照切割样式相比,所述由所述手性控制的寡核苷酸组合物提供的切割样式在存在于所述核酸聚合物中的所述靶序列中具有更少的切割位点。
105.权利要求104所述的用途,其中与所述参照切割样式相比,由所述手性控制的寡核苷酸组合物提供的切割样式在存在于所述核酸聚合物中的所述靶序列中具有单一切割位点。
106.权利要求104所述的用途,其中与参照寡核苷酸组合物相比,所述手性控制的寡核苷酸组合物提供更高的靶核酸聚合物切割速率。
107.权利要求102所述的用途,其中与参照寡核苷酸组合物相比,所述手性控制的寡核苷酸组合物提供更高的靶核酸聚合物切割速率。
108.权利要求106所述的用途,其中与参照寡核苷酸组合物相比,所述切割速率高至少
5倍。
109.权利要求102至105和107至108中任一项所述的用途,其中与参照寡核苷酸组合物相比,所述手性控制的寡核苷酸组合物提供更低水平的剩余的未切割靶核酸聚合物。
110.权利要求109所述的用途,其中所述剩余的未切割靶核酸聚合物低至少5倍。
111.前述权利要求中任一项所述的手性控制的寡核苷酸组合物在制造用于等位基因特异性抑制来自靶核酸序列之转录物的药物中的用途,所述靶核酸序列在群体中存在多个等位基因,每个所述等位基因包含相对于同一靶核酸序列的其他等位基因限定该等位基因的特异性核苷酸特征序列元件,所述抑制包括以下步骤:使包含所述靶核酸序列之转录物的样品与前述权利要求中任一项所述的手性控制的寡核苷酸组合物相接触,
其中所述特定寡核苷酸类型的所述寡核苷酸的所述共同碱基序列是或包含与限定特定等位基因的特征序列元件互补的序列,所述组合物的特征在于,当使其与包含靶等位基因和同一核酸序列的另一等位基因二者之转录物的体系相接触时,所述特定等位基因之转录物的抑制水平大于对于同一核酸序列的另一等位基因所观察到的抑制水平。
112.权利要求111所述的用途,其中所述组合物的特征在于,当使其与包含靶等位基因和同一基因的另一等位基因二者之转录物的体系相接触时,所述特定等位基因之转录物的抑制水平比对于同一基因的另一等位基因所观察到的抑制水平高至少2倍。
113.权利要求112所述的用途,其中所述特定等位基因之转录物的抑制水平比对于同一基因的另一等位基因所观察到的抑制水平高至少5、10、20、50、100、200或500倍。
114.权利要求111所述的用途,其中所述组合物的特征在于,当使其与包含同一靶核酸序列之转录物的体系相接触时,所述组合物显示出对所述特定等位基因之转录物的以下抑制水平:
a)大于当所述组合物不存在时的抑制水平;
b)大于对于同一核酸序列的另一等位基因所观察到的抑制水平;或c)既大于当所述组合物不存在时的抑制水平,又大于对于同一核酸序列的另一等位基因所观察到的抑制水平。
115.权利要求111所述的用途,其中所述组合物的特征在于,当使其与表达所述靶核酸序列之转录物的体系相接触时,所述组合物显示出对所述特定等位基因之转录物表达的以下抑制水平:
a)为至少2倍,其中检测到来自所述特定等位基因之转录物的量在所述组合物存在时比其不存在时低2倍;
b)比对于同一基因的另一等位基因所观察到的抑制水平高至少2倍;或c)既为至少2倍,其中检测到来自所述特定等位基因之转录物的量在所述组合物存在时比其不存在时低2倍;又比对于同一基因的另一等位基因所观察到的抑制水平高至少2倍。
116.权利要求114所述的用途,其中所述特定等位基因之转录物的抑制水平比对于同一基因的另一等位基因所观察到的抑制水平高至少5、10、20、50、100、200或500倍。
117.权利要求115所述的用途,其中所述特定等位基因之转录物的抑制水平比对于同一基因的另一等位基因所观察到的抑制水平高至少5、10、20、50、100、200或500倍。
118.权利要求111所述的用途,其中所述体系是体外体系或体内体系。
119.权利要求111所述的用途,其中所述体系包含一个或更多个细胞、组织或器官。
120.权利要求111所述的用途,其中所述体系包含一个或更多个生物体。
121.权利要求111所述的用途,其中所述体系包含一个或更多个对象。
122.权利要求111至121中任一项所述的用途,其中所述特异性核苷酸特征序列元件存在于所述靶核酸序列的内含子或外显子中。
123.权利要求111至121中任一项所述的用途,其中所述特异性核苷酸特征序列元件存在于所述靶核酸序列的内含子中或者跨越所述靶核酸序列的外显子和内含子。
124.权利要求112所述的用途,其中所述特异性核苷酸特征序列元件存在于所述靶核酸序列的内含子中。
125.权利要求122所述的用途,其中所述特异性核苷酸特征序列元件存在于所述靶核酸序列的外显子中。
126.权利要求123所述的用途,其中所述特异性核苷酸特征序列元件跨越所述靶核酸序列的外显子和内含子。
127.权利要求111至121和124至126中任一项所述的用途,其中所述特异性核苷酸特征序列元件包含突变或SNP,并且其中所述样品包含来自在突变或SNP位点彼此不同的等位基因的转录物。
128.权利要求127所述的用途,其中所述特异性核苷酸特征序列元件包含突变,并且其中所述样品包含来自在突变位点彼此不同的等位基因的转录物。
129.权利要求127所述的用途,其中所述特异性核苷酸特征序列元件包含SNP,并且其中所述样品包含来自在SNP位点彼此不同的等位基因的转录物。
130.权利要求99、100、102至105、107至108、110至121、124至126和128至129中任一项所述的用途,其中所述手性控制的寡核苷酸组合物施用于对象。
131.权利要求99、100、102至105、107至108、110至121、124至126和128至129中任一项所述的用途,其中所述靶核酸聚合物或转录物是RNA。
132.权利要求99、100、102至105、107至108、110至121、124至126和128至129中任一项所述的用途,其中所述手性控制的寡核苷酸组合物中的所述寡核苷酸与所述核酸聚合物或转录物形成双链体。
133.权利要求99、100、102至105、107至108、110至121、124至126和128至129中任一项所述的用途,其中通过酶切割所述核酸聚合物或转录物,其中所述酶是RNase H。
说明书 :
手性设计
背景技术
渗透性和分布而受到限制。另外,体外研究表明,反义寡核苷酸的性质例如结合亲和性、与
互补RNA的序列特异性结合(Cosstick和Eckstein,1985;LaPlanche等,1986;Latimer等,
1989;Hacia等,1994;Mesmaeker等,1995)以及对核酸酶的稳定性可受磷原子绝对立体化学
构型的影响(Cook等,US005599797A)。因此,需要新的改进的寡核苷酸和寡核苷酸组合物,
例如新的反义和siRNA寡核苷酸和寡核苷酸组合物。
结构。另外,本发明涵盖以下见解:立构无规寡核苷酸制备物通常不可能包含相关核苷酸的
每种可能的立体异构体。因此,本发明尤其提供作为目标寡核苷酸的特定立体异构体的新
化学实体。也就是说,本发明提供了单一核苷酸化合物的基本上纯的制备物,其中特定寡核
苷酸化合物可以通过其碱基序列、其长度、其骨架键联样式及其骨架手性中心样式定义。
稳定性改善可比得上或甚至优于通过使用某些经修饰骨架键联、碱基和/或糖(例如,通过
使用某些类型的经修饰磷酸酯、2’‑修饰、碱基修饰等)实现的那些。
架手性中心样式,其出人意料地极大提高了所述寡核苷酸的稳定性和/或生物活性。在一些
实施方案中,骨架手性中心样式提供了提高的稳定性。在一些实施方案中,骨架手性中心样
式提供了出人意料地提高的活性。在一些实施方案中,骨架手性中心样式提供了提高的稳
定性和活性。在一些实施方案中,当寡核苷酸用于切割核酸聚合物时,寡核苷酸的骨架手性
中心样式本身出人意料地改变了靶核酸聚合物的切割样式。在一些实施方案中,骨架手性
中心样式有效地阻止了第二位点的切割。在一些实施方案中,骨架手性中心样式产生了新
切割位点。在一些实施方案中,骨架手性中心样式使切割位点数目最小化。在一些实施方案
中,骨架手性中心样式使切割位点数目最小化,使得在靶核酸聚合物与寡核苷酸互补的序
列内的仅一个位点切割靶核苷酸聚合物。在一些实施方案中,骨架手性中心样式提高了切
割位点的切割效率。在一些实施方案中,寡核苷酸的骨架手性中心样式改善了靶核酸聚合
物的切割。在一些实施方案中,骨架手性中心样式提高了选择性。在一些实施方案中,骨架
手性中心样式使脱靶效应(off‑target effect)最小化。在一些实施方案中,骨架手性中心
样式提高了选择性,例如,差异仅在于单核苷酸多态性(single nucleotide
polymorphism,SNP)的两个靶序列之间的切割选择性。
有一个或更多个不饱和单元但非芳族的、与分子其余部分具有单一连接点的单环烃或者双
环或多环烃(在本文中也称为“碳环”、“脂环”或“环烷基”)。在一些实施方案中,脂族基团含
有1‑50个脂族碳原子。除非另外规定,否则脂族基团含有1‑10个脂族碳原子。在一些实施方
案中,脂族基团含有1‑6个脂族碳原子。在一些实施方案中,脂族基团含有1‑5个脂族碳原
子。在另一些实施方案中,脂族基团含有1‑4个脂族碳原子。在另一些实施方案中,脂族基团
含有1‑3个脂族碳原子,并且在另一些实施方案中,脂族基团含有1‑2个脂族碳原子。在一些
实施方案中,“环脂族”(或“碳环”或“环烷基”)是指完全饱和或含有一个或更多个不饱和单
元但非芳族的、与分子的其余部分具有单一连接点的单环或双环C3‑C10烃。在一些实施方案
中,“环脂族”(或“碳环”或“环烷基”)是指完全饱和或含有一个或更多个不饱和单元但非芳
族的、与分子的其余部分具有单一连接点的单环C3‑C6烃。合适的脂族基团包括但不限于直
链或支链的、经取代或未经取代的烷基、烯基、炔基及其混杂物(hybrid),例如(环烷基)烷
基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。
氢原子被取代基替换的聚亚甲基。合适的取代基包括以下对于经取代脂族基团所述的那
些。
基团所述的那些。
动物。在某些实施方案中,非人动物是哺乳动物(例如,啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、
绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中,动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬
行动物、两栖动物、鱼类和/或蠕虫。在一些实施方案中,动物可以是转基因动物、基因工程
动物(genetically‑engineered animal)和/或克隆。
20%的范围内的数值(除非这样的数值将小于可能值的0%或超过可能值的100%)。在一些
实施方案中,关于剂量使用术语“约”是指±5mg/kg/天。
的至少一个环是芳族,并且其中体系中的每个环含有3至7个环成员。术语“芳基”可与术语
“芳基环”互换使用。在本发明的某些实施方案中,“芳基”是指可携带一个或更多个取代基
的芳族环体系,其包括但不限于苯基、联苯基、萘基、蒽基等。在本文中所用的术语“芳基”的
范围内也包括其中芳族环与一个或更多个非芳族环稠合的基团,如茚满基、邻苯二甲酰亚
胺基、萘酰亚胺基、菲啶基或四氢萘基等。
含有至少两个氨基酸。此外,本领域普通技术人员将了解蛋白质的特征通常需要至少5、10、
15、20个或更多个氨基酸。一般来说,特征部分是除以上指定的序列特性(sequence
identity)之外,也与相关完整蛋白质共有至少一种功能特征的部分。
等),并且因此可被本领域普通技术人员用于确定所述家族的成员。
情况的特征为多种基本上相同特征和一种或少数不同特征。本领域普通技术人员将理解,
条件组在具有以下特征时是彼此相当的:足够数目和类型的基本上相同特征以保证得出以
下合理结论:在不同组的条件或情况下获得的结果或观察到的现象的差异是由那些不同特
征的变化引起或指示那些不同特征的变化。
及一个或更多个剂量的推荐给药方案。在一些实施方案中,给药方案包括各自彼此相隔相
同时长的一段时间的多个剂量;在一些实施方案中,给药方案包括多个剂量和分隔各自剂
量的至少两个不同时间段。在一些实施方案中,给药方案内的所有剂量都具有相同单位给
药量。在一些实施方案中,给药方案内的不同剂量具有不同量。在一些实施方案中,给药方
案包括第一给药量的第一剂量,之后是一个或更多个不同于所述第一给药量的第二给药量
的额外剂量。在一些实施方案中,给药方案包括第一给药量的第一剂量,之后是一个或更多
个与所述第一给药量相同的第二给药量的额外剂量。
性剂通常具有由核心和连接的侧基部分组成的结构,并且还将了解所述核心和/或侧基部
分的简单变化形式可不显著改变药剂的活性。例如,在一些实施方案中,用具有相当的三维
结构和/或化学反应性特征的基团取代一个或更多个侧基部分可产生与母体参照化合物或
部分等效的经取代化合物或部分。在一些实施方案中,添加或移除一个或更多个侧基部分
可产生与母体参照化合物等效的经取代化合物。在一些实施方案中,例如通过添加或移除
少数键(通常不超过5、4、3、2或1个键,并且常常仅单个键)来改变核心结构可产生与母体参
照化合物等效的经取代化合物。在许多实施方案中,可使用可易于获得的原料、试剂和常规
或提供的合成操作,通过如例如以下所述的一般反应方案中例示的方法,或通过其修改形
式来制备等效化合物。在这些反应中,也有可能利用自身已知,但未在此未提及的变体。
明,所述剂量被视为彼此“等效”。在一些实施方案中,使用如本文中所述的体外和/或体内
测定来确定用于根据本发明使用的不同药用剂的等效剂量。在一些实施方案中,用于根据
本发明使用的一种或更多种溶酶体活化剂在与参照溶酶体活化剂的剂量等效的剂量下使
用;在一些所述实施方案中,用于所述目的的参照溶酶体活化剂选自:小分子别构活化剂
(例如吡唑并嘧啶)、亚氨基糖(例如异法戈明(isofagomine))、抗氧化剂(例如n‑乙酰基‑半
胱氨酸)和细胞运输调控剂(例如Rabla多肽)。
脂族基团是杂烯基。
或14个在环状阵列(cyclic array)中共有的π电子;并且除碳原子之外具有1至5个杂原子
的基团。术语“杂原子”是指氮、氧或硫,并且包括氮或硫的任何氧化形式以及碱性氮的任何
季铵化形式。杂芳基包括但不限于:噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑
基、 唑基、异 唑基、 二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、
吡嗪基、吲哚嗪基(indolizinyl)、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。本文中使用的术语“杂芳基”和
“杂芳‑”也包括其中杂芳族环与一个或更多个芳基、环脂族或杂环基环稠合的基团,其中连
接基团或点在杂芳族环上。非限制性实例包括:吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃
基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹
唑啉基、喹喔啉基、4H‑喹嗪基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩 嗪基、四氢喹啉基、
四氢异喹啉基和吡啶并[2,3‑b]‑1,4‑ 嗪‑3(4H)‑酮。杂芳基可以是单环或双环的。术语
“杂芳基”可与术语“杂芳基环”、“杂芳基基团”或“杂芳族”互换使用,所述术语中的任一个
都包含任选地经取代的环。术语“杂芳烷基”是指被杂芳基取代的烷基,其中烷基和杂芳基
部分独立地被任选地取代。
+
(如在3,4‑二氢‑2H‑吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)或NR(如在N‑取代的吡咯烷基中))。
的杂原子的稳定3至7元单环或7‑10元双环杂环部分。当关于杂环的环原子使用时,术语
“氮”包括经取代的氮。例如,在具有0‑3个选自氧、硫或氮的杂原子的饱和或部分不饱和环
+
中,氮可以是N(如在3,4‑二氢‑2H‑吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)、或 NR(如在N‑取代的
吡咯烷基中)。
氢噻吩基(tetrahydrothiophenyl)吡咯烷基、哌啶基、吡咯啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉
基、十氢喹啉基、 唑烷基、哌嗪基、二氧杂环己烷基(dioxanyl)、二氧杂环戊烷基
(dioxolanyl)、二氮杂 基(diazepinyl)、氧氮杂 基(oxazepinyl)、硫氮杂 基
(thiazepinyl)、吗啉基和奎宁环基(quinuclidinyl)。术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基环”、
“杂环基团(heterocyclic group)”、“杂环部分”和“杂环基团(heterocyclic radical)”在
本文中可互换使用,并且也包括其中杂环基与一个或更多个芳基、杂芳基或环脂族环稠合
的基团,例如二氢吲哚基、3H‑吲哚基、色烷基(chromanyl)、菲啶基或四氢喹啉基,其中连接
基团或点在杂环基环上。杂环基可以是单环或双环的。术语“杂环基烷基”是指被杂环基取
代的烷基,其中烷基和杂环基部分独立地被任选地取代。
对象的腹膜中施用化合物或组合物。
适的取代基替换。除非另有说明,否则“任选地经取代的”基团可在基团的每个可取代位置
处具有合适的取代基,并且当任何给定结构中的超过一个位置可被选自指定组的超过一个
取代基取代时,在每个位置处的取代基可相同或不同。本发明考虑的取代基组合优选是导
致形成稳定的或化学可行的化合物的那些。本文中使用的术语“稳定”是指化合物在经受允
许其生产、检测以及在某些实施方案中其回收、纯化以及用于本文中公开的一个或更多个
目的条件时基本上不改变。
(CH2)0‑4R ;‑(CH2)0‑4OR ;‑O(CH2)0‑4R 、‑O‑(CH2)0‑4C(O)OR ;‑(CH2)0‑4CH(OR)2;‑(CH2)0‑
o o o o
4SR ;‑(CH2)0‑4Ph,其可被R取代;‑(CH2)0‑4O(CH2)0‑1Ph,其可被R取代;‑CH=CHPh,其可被R
o o
取代;‑(CH2)0‑4O(CH2)0‑1‑吡啶基,其可被R 取代;‑NO2;‑CN;‑N3;‑(CH2)0‑4N(R)2;‑(CH2)0‑4N
o o o o o o o o o
(R)C(O)R ;‑N(R)C(S)R ;‑(CH2)0‑4N(R)C(O)NR 2;‑N(R)C(S)NR 2;‑(CH2)0‑4N(R)C(O)
o o o o o o o o o o o
OR ;‑N(R)N(R)C(O)R ;‑N(R)N(R)C(O)NR2;‑N(R)N(R)C(O)OR ;‑(CH2)0‑4C(O)R ;‑C(S)
o o o o o
R ;‑(CH2)0‑4C(O)OR ;‑(CH2)0‑4C(O)SR ;‑(CH2)0‑4C(O)OSiR 3;‑(CH2)0‑4OC(O)R ;‑OC(O)
o o o o o
(CH2)0‑4SR‑,SC(S)SR ;‑(CH2)0‑4SC(O)R ;‑(CH2)0‑4C(O)NR2;‑C(S)NR2;‑C(S)SR ;‑SC(S)
o o o o o o o o
SR ,‑(CH2)0‑4OC(O)NR 2;‑C(O)N(OR)R ;‑C(O)C(O)R ;‑C(O)CH2C(O)R ;‑C(NOR)R ;‑
o o o o o
(CH2)0‑4SSR ;‑(CH2)0‑4S(O)2R;‑(CH2)0‑4S(O)2OR ;‑(CH2)0‑4OS(O)2R ;‑S(O)2NR2;‑(CH2)0‑4S
o o o o o o o o o o
(O)R ;‑N(R)S(O)2NR2;‑N(R)S(O)2R ;‑N(OR)R ;‑C(NH)NR2;‑P(O)2R ;‑P(O)R 2;‑OP(O)
o o o o
R2;‑OP(O)(OR)2;‑SiR3;‑(C1‑4直链或支链亚烷基)O‑N(R)2;或‑(C1‑4直链或支链亚烷基)C
o o
(O)O‑N(R)2,其中各R 可如下所定义被取代,并且独立地是氢、C1‑6脂族、‑CH2Ph、‑O(CH2)0‑
1Ph、‑CH2‑(5‑6元杂芳基环),或具有0‑4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5‑6元饱和、部
o
分不饱和或芳基环,或尽管具有以上定义,但两个独立出现的R 与其一个或更多个间插原
子一起形成可如下所定义被取代的具有0‑4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3‑12元饱
和、部分不饱和或芳基单环或双环。
地是卤素、‑(CH2)0‑2R 、‑(卤代R )、‑(CH2)0‑2OH、‑(CH2)0‑2OR 、‑(CH2)0‑2CH(OR )2;‑O(卤代R
● ● ● ●
)、‑CN、‑N3、‑(CH2)0‑2C(O)R 、‑(CH2)0‑2C(O)OH、‑(CH2)0‑2C(O)OR 、‑(CH2)0‑2SR 、‑(CH2)0‑
● ● ● ● ●
2SH、‑(CH2)0‑2NH2、‑(CH2)0‑2NHR 、‑(CH2)0‑2NR 2、‑NO2、‑SiR 3、‑OSiR 3、‑C(O)SR 、‑(C1‑4直链
● ● ●
或支链亚烷基)C(O)OR 或‑SSR ,其中各R 未被取代或当前边有“卤代”时仅被一个或更多
个卤素取代,并且独立地选自C1‑4脂族、‑CH2Ph、‑O(CH2)0‑1Ph,或具有0‑4个独立地选自氮、氧
o
或硫的杂原子的5‑6元饱和、部分不饱和或芳基环。R 的饱和碳原子上的合适的二价取代基
包括=O和=S。
=NNR 2、=NNHC(O)R 、=NNHC(O)OR 、=NNHS(O)2R 、=NR 、=NOR 、‑O(C(R 2))2‑3O‑或‑S
* *
(C(R 2))2‑3S‑,其中各独立出现的R 选自氢,可如下所定义被取代的C1‑6脂族,或具有0‑4个
独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的5‑6元饱和、部分不饱和或芳基环。结合于“任选
*
地经取代的”基团的邻近可取代碳的合适的二价取代基包括:‑O(CR 2)2‑3O‑,其中各独立出
*
现的R 选自氢,可如下所定义被取代的C1‑6脂族,或具有0‑4个独立地选自氮、氧或硫的杂原
子的未取代的5‑6元饱和、部分不饱和或芳基环。
)、‑CN、‑C(O)OH、‑C(O)OR 、‑NH2、‑NHR 、‑NR 2或‑NO2,其中各R 未被取代或当前边有“卤
基”时仅被一个或更多个卤素取代,并且独立地是C1‑4脂族、‑CH2Ph、‑O(CH2)0‑1Ph或具有0‑4
个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5‑6元饱和、部分不饱和或芳基环。
氢、可如下所定义被取代的C1‑6脂族、未被取代的‑OPh,或具有0‑4个独立地选自氮、氧或硫
的杂原子的未被取代的5‑6元饱和、部分不饱和或芳基环,或尽管具有以上定义,但两个独
立出现的 与其间插原子一起形成具有0‑4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未被取代
的3‑12元饱和、部分不饱和或芳基单环或双环。
● ● ●
(卤代R )、‑CN、‑C(O)OH、‑C(O)OR 、‑NH2、‑NHR 、‑NR 2或‑NO2,其中各R 未被取代或当前边
有“卤基”时仅被一个或更多个卤素取代,并且独立地是C1‑4脂族、‑CH2Ph、‑O(CH2)0‑1Ph,或具
有0‑4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5‑6元饱和、部分不饱和或芳基环。
物或组合物。
施用以外的施用模式,通常通过注射来进行,并且包括但不限于:静脉内、肌肉内、动脉内、
鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下(subcuticular)、关节内、囊下、
蛛网膜下、脊椎内和胸骨内注射和输注。
基或杂芳基部分。
治疗作用的统计显著概率的治疗方案中施用的单位给药量存在。在一些实施方案中,药物
组合物可被特别配制来以固体或液体形式施用,所述形式包括适合于以下的那些:经口施
用,例如兽用顿服药(drench)(水性或非水性溶剂或混悬剂)、片剂(例如以口含、舌下和全
身性吸收为目标的那些)、大丸剂(bolus)、散剂、颗粒剂、用于向舌施用的糊剂;胃肠外施
用,例如通过以例如无菌溶液剂或混悬剂、或持续释放制剂形式进行皮下、肌肉内、静脉内
或硬膜外注射;表面施用,例如作为乳膏剂、软膏剂或控制释放贴剂或向皮肤、肺或口腔施
用的喷雾剂;阴道内或直肠内,例如作为子宫托(pessary)、乳膏剂或泡沫;舌下;经眼;经
皮;或经鼻、经肺以及向其他黏膜表面施用。
症,与合理益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料。各载体在可与制剂的其他成分相容和不
损伤患者的意义上必须是“可接受的”。可充当可药用载体的材料的一些实例包括:糖,例如
乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,例如玉米淀粉和马铃薯淀粉;纤维素及其衍生物,例如羧甲基纤
维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素;粉末状西黄蓍胶;麦芽;明胶;滑石;赋形剂,例如可可豆
脂和栓剂蜡;油类,例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油;二醇类,
例如丙二醇;多元醇,例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇;酯类,例如油酸乙酯和月
桂酸乙酯;琼脂;缓冲剂,例如氢氧化镁和氢氧化铝;海藻酸;无热原水;等张盐水;林格液
(Ringer’s solution);乙醇;pH缓冲溶液;聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐;和用于药物制剂中
的其他无毒可相容物质。
敏反应等并且与合理益处/风险比相称的盐。可药用盐是本领域中公知的。例如,S.M.Berge
等在J.Pharmaceutical Sciences,66:1‑19(1977)中详细描述了可药用盐。在一些实施方
案中,可药用盐包括但不限于:无毒酸加成盐,其为氨基与无机酸(例如盐酸、氢溴酸、磷酸、
硫酸和高氯酸)或与有机酸(例如乙酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)或通过使
用本领域中使用的其他方法(例如离子交换)形成的盐。在一些实施方案中,可药用盐包括
但不限于己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸
盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸
盐、乙烷磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸
盐、己酸盐、氢碘酸盐、2‑羟基‑乙烷磺酸盐、乳糖酸盐(lactobionate)、乳酸盐、月桂酸盐、
月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲烷磺酸盐、2‑萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、
油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐(pamoate)、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3‑苯基丙
酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸
盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、
镁等盐。在一些实施方案中,适当时,可药用盐包括使用反离子,如卤离子、氢氧根、羧酸根、
硫酸根、磷酸根、硝酸根、具有1至6个碳原子的烷基、磺酸根和芳基磺酸根形成的无毒铵、季
铵和胺阳离子盐。
谢涉及移除至少一个“前药部分”以形成活性剂。多种形式的“前药”在本领域中是已知的。
对于所述前药部分的实例,参见:
Wiley&Sons,1999中的那些,该参考文献通过引用整体并入本文。也包括描述于Current
Protocols in Nucleic Acid Chemistry,Serge L.Beaucage等编06/2012中的特别适合于
核苷和核苷酸化学的那些保护基,第2章通过引用整体并入本文。合适的氨基保护基包括氨
基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、氨基甲酸9‑芴基甲酯(Fmoc)、氨基甲酸9‑(2‑磺基)芴基甲酯、
氨基甲酸9‑(2,7‑二溴)芴基甲酯、氨基甲酸2,7‑二‑叔丁基‑[9‑(10,10‑二氧代‑10,10,10,
10‑四氢噻吨基)]甲酯(DBD‑Tmoc)、氨基甲酸4‑甲氧基苯甲酰甲酯(Phenoc)、氨基甲酸2,2,
2‑三氯乙酯(Troc)、氨基甲酸2‑三甲基甲硅烷基乙酯(Teoc)、氨基甲酸2‑苯基乙酯(hZ)、氨
基甲酸1‑(1‑金刚烷基)‑1‑甲基乙酯(Adpoc)、氨基甲酸1,1‑二甲基‑2‑卤代乙酯、氨基甲酸
1,1‑二甲基‑2,2‑二溴乙酯(DB‑t‑BOC)、氨基甲酸1,1‑二甲基‑2,2,2‑三氯乙酯(TCBOC)、氨
基甲酸1‑甲基‑1‑(4‑联苯基)乙酯(Bpoc)、氨基甲酸1‑(3,5‑二‑叔丁基苯基)‑1‑甲基乙酯
(t‑Bumeoc)、氨基甲酸2‑(2’‑和4’‑吡啶基)乙酯(Pyoc)、氨基甲酸2‑(N,N‑二环己基甲酰氨
基)乙酯、氨基甲酸叔丁酯(BOC)、氨基甲酸1‑金刚烷酯(Adoc)、氨基甲酸乙烯酯(Voc)、氨基
甲酸烯丙酯(Alloc)、氨基甲酸1‑异丙基烯丙酯(Ipaoc)、氨基甲酸肉桂酯(Coc)、氨基甲酸
4‑硝基肉桂酯(Noc)、氨基甲酸8‑喹啉酯、氨基甲酸N‑羟基哌啶酯、二硫代氨基甲酸烷基酯、
氨基甲酸苄酯(Cbz)、氨基甲酸对甲氧基苄酯(Moz)、氨基甲酸对硝基苄酯、氨基甲酸对溴代
苄酯、氨基甲酸对氯代苄酯、氨基甲酸2,4‑二氯代苄酯、氨基甲酸4‑甲基亚磺酰基苄酯
(Msz)、氨基甲酸9‑蒽基甲酯、氨基甲酸二苯基甲酯、氨基甲酸2‑甲硫基乙酯、氨基甲酸2‑甲
基磺酰基乙酯、氨基甲酸2‑(对甲苯磺酰基)乙酯、氨基甲酸[2‑(1,3‑二硫杂环己基)]甲酯
(Dmoc)、氨基甲酸4‑甲硫基苯酯(Mtpc)、氨基甲酸2,4‑二甲硫基苯酯(Bmpc)、氨基甲酸2‑磷
基乙酯(Peoc)、氨基甲酸2‑三苯基磷 基异丙酯(Ppoc)、氨基甲酸1,1‑二甲基‑2‑氰基
乙酯、氨基甲酸间氯‑对酰氧基苄酯、氨基甲酸对(二羟基硼烷基)苄酯、氨基甲酸5‑苯并异
唑基甲酯、氨基甲酸2‑(三氟甲基)‑6‑色酮基甲酯(Tcroc)、氨基甲酸间硝基苯酯、氨基
甲酸3,5‑二甲氧基苄酯、氨基甲酸邻硝基苄酯、氨基甲酸3,4‑二甲氧基‑6‑硝基苄酯、氨基
甲酸苯基(邻硝基苯基)甲酯、吩噻嗪基‑(10)‑羰基衍生物、N’‑对甲苯磺酰基氨基羰基衍生
物、N’‑苯基氨基硫羰基衍生物、氨基甲酸叔戊酯、硫代氨基甲酸S‑苄酯、氨基甲酸对氰基苄
酯、氨基甲酸环丁酯、氨基甲酸环己酯、氨基甲酸环戊酯、氨基甲酸环丙基甲酯、氨基甲酸对
癸基氧基苄酯、氨基甲酸2,2‑二甲氧基羰基乙烯酯、氨基甲酸邻(N,N‑二甲基甲酰氨基)苄
酯、氨基甲酸1,1‑二甲基‑3‑(N,N‑二甲基甲酰氨基)丙酯、氨基甲酸1,1‑二甲基丙炔酯、氨
基甲酸二(2‑吡啶基)甲酯、氨基甲酸2‑呋喃基甲酯、氨基甲酸2‑碘代乙酯、氨基甲酸异冰片
酯、氨基甲酸异丁酯、氨基甲酸异烟碱酯、氨基甲酸对(对’‑甲氧基苯基偶氮基)苄酯、氨基
甲酸1‑甲基环丁酯、氨基甲酸1‑甲基环己酯、氨基甲酸1‑甲基‑1‑环丙基甲酯、氨基甲酸1‑
甲基‑1‑(3,5‑二甲氧基苯基)乙酯、氨基甲酸1‑甲基‑1‑(对苯基偶氮基苯基)乙酯、氨基甲
酸1‑甲基‑1‑苯基乙酯、氨基甲酸1‑甲基‑1‑(4‑吡啶基)乙酯、氨基甲酸苯酯、氨基甲酸对
(苯基偶氮基)苄酯、氨基甲酸2,4,6‑三‑叔丁基苯酯、氨基甲酸4‑(三甲基铵)苄酯、氨基甲
酸2,4,6‑三甲基苄酯、甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯基乙酰胺、3‑
苯基丙酰胺、吡啶甲酰胺、3‑吡啶基甲酰胺、N‑苯甲酰基苯基丙氨酰基衍生物、苯甲酰胺、对
苯基苯甲酰胺、邻硝基苯基乙酰胺、邻硝基苯氧基乙酰胺、乙酰乙酰胺、(N’‑二硫基苄基氧
基羰基氨基)乙酰胺、3‑(对羟基苯基)丙酰胺、3‑(邻硝基苯基)丙酰胺、2‑甲基‑2‑(邻硝基
苯氧基)丙酰胺、2‑甲基‑2‑(邻苯基偶氮基苯氧基)丙酰胺、4‑氯丁酰胺、3‑甲基‑3‑硝基丁
酰胺、邻硝基肉桂酰胺、N‑乙酰基甲硫氨酸衍生物、邻硝基苯甲酰胺、邻(苯甲酰氧基甲基)
苯甲酰胺、4,5‑二苯基‑3‑ 唑啉‑2‑酮、N‑苯邻二甲酰亚胺、N‑二硫代琥珀酰亚胺(Dts)、
N‑2,3‑二苯基马来酰亚胺、N‑2,5‑二甲基吡咯、N‑1,1,4,4‑四甲基二甲硅烷基氮杂环戊烷
加合物(STABASE)、5‑取代的1,3‑二甲基‑1,3,5‑三氮杂环己‑2‑酮、5‑取代的1,3‑二苄基‑
1,3,5‑三氮杂环己‑2‑酮、1‑取代的3,5‑二硝基‑4‑吡啶酮、N‑甲胺、N‑烯丙胺、N‑[2‑(三甲
基甲硅烷基)乙氧基]甲胺(SEM)、N‑3‑乙酰氧基丙胺、N‑(1‑异丙基‑4‑硝基‑2‑氧代‑3‑吡咯
啉‑3‑基)胺、季铵盐、N‑苯甲胺、N‑二(4‑甲氧基苯基)甲胺、N‑5‑二苯并环庚胺、N‑三苯基甲
胺(Tr)、N‑[(4‑甲氧基苯基)二苯基甲基]胺(MMTr)、N‑9‑苯基芴基胺(PhF)、N‑2,7‑二氯‑9‑
芴基亚甲胺、N‑二茂铁基甲基氨基(Fcm)、N‑2‑吡啶甲基氨基N’‑氧化物、N‑1,1‑二甲硫基亚
甲胺、N‑亚苄胺、N‑对甲氧基亚苄胺、N‑二苯基亚甲胺、N‑[(2‑吡啶基)均三甲苯基]亚甲胺、
N‑(N’,N’‑二甲基氨基亚甲基)胺、NN’‑异亚丙二胺、N‑对硝基亚苄胺、N‑亚水杨基胺、N‑5‑
氯亚水杨基胺、N‑(5‑氯‑2‑羟基苯基)苯基亚甲胺、N‑亚环己胺、N‑(5,5‑二甲基‑3‑氧代‑1‑
环己烯基)胺、N‑硼烷衍生物、N‑二苯基硼酸衍生物、N‑[苯基(五羰基铬‑或钨)羰基]胺、N‑
铜螯合物、N‑锌螯合物、N‑硝基胺、N‑亚硝基胺、胺N‑氧化物、二苯基膦酰胺(Dpp)、二甲硫基
膦酰胺(Mpt)、二苯硫基膦酰胺(Ppt)、氨基磷酸二烷酯、氨基磷酸二苄酯、氨基磷酸二苯酯、
苯亚磺酰胺、邻硝基苯亚磺酰胺(Nps)、2,4‑二硝基苯亚磺酰胺、五氯苯亚磺酰胺、2‑硝基‑
4‑甲氧基苯亚磺酰胺、三苯基甲基亚磺酰胺、3‑硝基吡啶亚磺酰胺(Npys)、对甲苯磺酰胺
(Ts)、苯磺酰胺、2,3,6,‑三甲基‑4‑甲氧基苯磺酰胺(Mtr)、2,4,6‑三甲氧基苯磺酰胺
(Mtb)、2,6‑二甲基‑4‑甲氧基苯磺酰胺(Pme)、2,3,5,6‑四甲基‑4‑甲氧基苯磺酰胺(Mte)、
4‑甲氧基苯磺酰胺(Mbs)、2,4,6‑三甲基苯磺酰胺(Mts)、2,6‑二甲氧基‑4‑甲基苯磺酰胺
(iMds)、2,2,5,7,8‑五甲基色烷‑6‑磺酰胺(Pmc)、甲烷磺酰胺(Ms)、β‑三甲基甲硅烷基乙烷
磺酰胺(SES)、9‑蒽磺酰胺、4‑(4’,8’‑二甲氧基萘基甲基)苯磺酰胺(DNMBS)、苄基磺酰胺、
三氟甲基磺酰胺和苯甲酰甲基磺酰胺。
硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基等。合适的烷基的实例包括甲基、苄基、
对甲氧基苄基、3,4‑二甲氧基苄基、三苯甲基、叔丁基、四氢吡喃‑2‑基。合适的烯基的实例
包括烯丙基。合适的芳基的实例包括任选地经取代的苯基、联苯或萘基。合适的芳基烷基的
实例包括任选地经取代的苄基(例如,对甲氧基苄基(MPM)、3,4‑二甲氧基苄基、O‑硝基苄
基、对硝基苄基、对卤苄基、2,6‑二氯苄基、对氰基苄基)以及2‑吡啶甲基和4‑吡啶甲基。
基(PMBM)、(4‑甲氧基苯氧基)甲基(p‑AOM)、愈创木酚甲基(GUM)、叔丁氧基甲基、4‑戊烯基
氧基甲基(POM)、甲硅烷氧基甲基、2‑甲氧基乙氧基甲基(MEM)、2,2,2‑三氯乙氧基甲基、双
(2‑氯乙氧基)甲基、2‑(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基(SEMOR)、四氢吡喃基(THP)、3‑溴四氢
吡喃基、四氢噻喃基、1‑甲氧基环己基、4‑甲氧基四氢吡喃基(MTHP)、4‑甲氧基四氢噻喃基、
4‑甲氧基四氢噻喃基S,S‑二氧化物、1‑[(2‑氯‑4‑甲基)苯基]‑4‑甲氧基哌啶‑4‑基(CTMP)、
1,4‑二氧杂环己烷‑2‑基、四氢呋喃基、四氢硫代呋喃基、2,3,3a,4,5,6,7,7a‑八氢‑7,8,8‑
三甲基‑4,7‑桥亚甲基苯并呋喃‑2‑基、1‑乙氧基乙基、1‑(2‑氯乙氧基)乙基、1‑甲基‑1‑甲
氧基乙基、1‑甲基‑1‑苄基氧基乙基、1‑甲基‑1‑苄基氧基‑2‑氟乙基、2,2,2‑三氯乙基、2‑三
甲基甲硅烷基乙基、2‑(苯基氢硒基)乙基、叔丁基、烯丙基、对氯苯基、对甲氧基苯基、2,4‑
二硝基苯基、苄基、对甲氧基苄基、3,4‑二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对卤苄基、
2,6‑二氯苄基、对氰基苄基、对苯基苄基、2‑吡啶甲基、4‑吡啶甲基、3‑甲基‑2‑吡啶甲基N‑
氧、二苯基甲基、p,p’‑二硝基二苯甲基、5‑二苯并环庚基、三苯基甲基、α‑萘基二苯基甲基、
对甲氧基苯基二苯基甲基、二(对甲氧基苯基)苯基甲基、三(对甲氧基苯基)甲基、4‑(4’‑溴
苯甲酰甲基氧基苯基)二苯基甲基、4,4’,4”‑三(4,5‑二氯苯二甲酰亚氨基苯基)甲基、4,
4’,4”‑三(乙酰丙酰基氧基苯基)甲基、4,4’,4”‑三(苯甲酰基氧基苯基)甲基、3‑(咪唑‑1‑
基)双(4’,4”‑二甲氧基苯基)甲基、1,1‑双(4‑甲氧基苯基)‑1’‑芘基甲基、9‑蒽基、9‑(9‑苯
基)呫吨基、9‑(9‑苯基‑10‑氧代)蒽基、1,3‑苯并硫杂环戊烷‑2‑基、苯并异噻唑基S,S‑二
氧、三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、二甲基异丙
基甲硅烷基(IPDMS)、二乙基异丙基甲硅烷基(DEIPS)、二甲基叔己基甲硅烷基、叔丁基二甲
基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、三苄基甲硅烷基、三‑对二甲苯基甲
硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基(DPMS)、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基
(TBMPS)、甲酸酯、苯甲酰基甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸
酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、3‑苯基丙酸
酯、4‑氧代戊酸酯(乙酰丙酸酯)、4,4‑(亚乙基二硫基)戊酸酯(乙酰丙酰基二硫基缩醛)、新
戊酸酯、金刚酸酯、巴豆酸酯、4‑甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯基苯甲酸酯、2,4,6‑三甲
基苯甲酸酯(三菜酸酯(mesitoate))、烷基甲基碳酸酯、9‑芴基甲基碳酸酯(Fmoc)、烷基乙
基碳酸酯、烷基2,2,2‑三氯乙基碳酸酯(Troc)、2‑(三甲基甲硅烷基)乙基碳酸酯(TMSEC)、
2‑(苯磺酰基)乙基碳酸酯(Psec)、2‑(三苯基磷 基)乙基碳酸酯(Peoc)、烷基异丁基碳酸
酯、烷基乙烯基碳酸酯、烷基烯丙基碳酸酯、烷基对硝基苯基碳酸酯、烷基苄基碳酸酯、烷基
对甲氧基苄基碳酸酯、烷基3,4‑二甲氧基苄基碳酸酯、烷基邻硝基苄基碳酸酯、烷基对硝基
苄基碳酸酯、烷基S‑苄基硫代碳酸酯、4‑乙氧基‑1‑萘基碳酸酯、甲基二硫代碳酸酯、2‑碘代
苯甲酸酯、4‑叠氮基丁酸酯、4‑硝基‑4‑甲基戊酸酯、邻‑(二溴甲基)苯甲酸酯、2‑甲酰基苯
磺酸酯、2‑(甲硫基甲氧基)乙基、4‑(甲硫基甲氧基)丁酸酯、2‑(甲硫基甲氧基甲基)苯甲酸
酯、2,6‑二氯‑4‑甲基苯氧基乙酸酯、2,6‑二氯‑4‑(1,1,3,3‑四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2,
4‑双(1,1‑二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯二苯基乙酸酯、异丁酸酯、单琥珀酸酯、(E)‑2‑甲
基‑2‑丁烯酸酯、邻‑(甲氧基羰基)苯甲酸酯、α‑萘甲酸酯、硝酸酯、烷基N,N,N’,N’‑四甲基
磷酰二胺、N‑苯基氨基甲酸烷酯、硼酸酯、二甲基硫代膦酰基、2,4‑二硝基苯基次磺酸烷酯、
硫酸酯、甲烷磺酸酯(甲磺酸酯)、苄基磺酸酯和甲苯磺酸酯(Ts)。对于保护1,2‑二醇或1,3‑
二醇,保护基包括亚甲基缩醛、亚乙基缩醛、1‑叔丁基亚乙基缩酮、1‑苯基亚乙基缩酮、(4‑
甲氧基苯基)亚乙基缩醛、2,2,2‑三氯亚乙基缩醛、丙酮化合物、亚环戊基缩酮、亚环己基缩
酮、亚环庚基缩酮、亚苄基缩醛、对甲氧基亚苄胺缩醛、2,4‑二甲氧基亚苄胺缩酮、3,4‑二甲
氧基亚苄胺缩醛、2‑硝基亚苄胺缩醛、甲氧基亚甲基缩醛、乙氧基亚甲基缩醛、二甲氧基亚
甲基原酸酯、1‑甲氧基亚乙基原酸酯、1‑乙氧基次乙基原酸酯、1,2‑二甲氧基亚乙基原酸
酯、α‑甲氧基亚苄胺原酸酯、1‑(N,N‑二甲基氨基)亚乙基衍生物、α‑(N,N’‑二甲基氨基)亚
苄胺衍生物、2‑氧杂亚环戊基原酸酯、二叔丁基亚甲硅烷基(DTBS)、1,3‑(1,1,3,3‑四异丙
基二亚硅氧烷基)衍生物(TIPDS)、四‑叔丁氧基二硅氧烷‑1,3‑二亚基衍生物(TBDS)、环状
碳酸酯、环状硼酸酯、乙基硼酸酯和苯基硼酸酯。
硝基苯基、苄基、苯甲酰基、对苯基苯甲酰基、2,6‑二氯苄基、二苯基甲基、对硝基苄基、三苯
基甲基(三苯甲基)、4,4′‑二甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二
甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、苯甲酰基甲
酸酯、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、9‑芴基甲基碳酸酯、甲磺酸酯、甲苯磺
酸酯、三氟甲磺酸酯、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基(MMTr)、4,4′‑二甲氧基三苯甲基(DMTr)
和4,4′,4″‑三甲氧基三苯甲基(TMTr)、2‑氰基乙基(CE或Cne)、2‑(三甲基甲硅烷基)乙基
(TSE)、2‑(2‑硝基苯基)乙基、2‑(4‑氰基苯基)乙基、2‑(4‑硝基苯基)乙基(NPE)、2‑(4‑硝基
苯基磺酰基)乙基、3,5‑二氯苯基、2,4‑二甲基苯基、2‑硝基苯基、4‑硝基苯基、2,4,6‑三甲
基苯基、2‑(2‑硝基苯基)乙基、丁基硫羰基、4,4′,4″‑三(苯甲酰基氧基)三苯甲基、二苯基
氨基甲酰基、乙酰丙酰基、2‑(二溴甲基)苯甲酰基(Dbmb)、2‑(异丙基硫基甲氧基甲基)苯甲
酰基(Ptmt)、9‑苯基呫吨‑9‑基(pixyl)或9‑(对甲氧基苯基)黄嘌呤‑9‑基(MOX)。在一些实
施方案中,各羟基保护基独立地选自乙酰基、苄基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基
甲硅烷基和4,4′‑二甲氧基三苯甲基。在一些实施方案中,羟基保护基选自三苯甲基、单甲
氧基三苄基和4,4′‑二甲氧基三苯甲基。
施方案中,磷保护基连接于核苷酸间硫代磷酸酯键联的氧原子。在一些实施方案中,磷保护
基连接于核苷酸间磷酸酯键联的氧原子。在一些实施方案中,磷保护基是2‑氰基乙基(CE或
Cne)、2‑三甲基硅烷基乙基、2‑硝基乙基、2‑磺酰基乙基、甲基、苄基、邻硝基苄基、2‑(对硝
基苯基)乙基(NPE或Npe)、2‑苯基乙基、3‑(N‑叔丁基甲酰氨基)‑1‑丙基、4‑氧代戊基、4‑甲
硫基‑l‑丁基、2‑氰基‑1,1‑二甲基乙基、4‑N‑甲基氨基丁基、3‑(2‑吡啶基)‑1‑丙基、2‑[N‑
甲基‑N‑(2‑吡啶基)]氨基乙基、2‑(N‑甲酰基,N‑甲基)氨基乙基、4‑[N‑甲基‑N‑(2,2,2‑三
氟乙酰基)氨基]丁基。
含一个或更多个非天然氨基酸(例如与邻近氨基酸形成一个或更多个肽键的部分)。在一些
实施方案中,蛋白质链中的一个或更多个残基含有非氨基酸部分(例如聚糖等)。在一些实
施方案中,蛋白质包含超过一个例如通过一个或更多个二硫键连接或通过其他手段缔合的
多肽链。在一些实施方案中,蛋白质含有L‑氨基酸、D‑氨基酸或两者;在一些实施方案中,蛋
白质含有一个或更多个本领域中已知的氨基酸修饰或类似物。可用的修饰包括例如末端乙
酰化、酰胺化、甲基化等。术语“肽”通常用于指长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基
酸、小于20个氨基酸或小于10个氨基酸的多肽。在一些实施方案中,蛋白质是抗体、抗体片
段、其生物活性部分和/或其特征部分。
包括生物体,如动物或人。在一些实施方案中,生物样品包括生物组织或流体。在一些实施
方案中,生物样品是或包括骨髓;血液;血细胞;腹水;组织或细针活检样品;含有细胞的体
液;自由浮动的核酸;痰;唾液;尿;脑脊髓液;腹膜液;胸膜液;粪便;淋巴液;妇科流体;皮肤
拭子;阴道拭子;口腔拭子;鼻拭子;洗涤物或灌洗物,如导管灌洗物或支气管肺泡灌洗物;
抽吸物;刮屑;骨髓标本;组织活检标本;手术标本;粪便;其他体液、分泌物和/或排泄物;
和/或从其得到的细胞等。在一些实施方案中,生物样品是或包括从个体获得的细胞。在一
些实施方案中,样品是通过任何适当手段直接获自目标来源的“初级样品”。例如,在一些实
施方案中,初级生物样品是通过选自活检(例如细针抽吸或组织活检)、手术、体液(例如血
液、淋巴液、粪便等)收集等的方法获得。在一些实施方案中,如根据上下文将明确的是,术
语“样品”是指通过处理(例如通过移除一种或更多种组分和/或通过添加一种或更多种试
剂)初级样品获得的制备物。例如,使用半透膜进行过滤。这样的“经处理样品”可包括例如
从样品提取或通过使初级样品经受例如扩增或逆转录mRNA、分离和/或纯化某些组分等的
技术获得的核酸或蛋白质。在一些实施方案中,样品是生物体。在一些实施方案中,样品是
植物。在一些实施方案中,样品是动物。在一些实施方案中,样品是人。在一些实施方案中,
样品是人以外的生物体。
一些实施方案中,提供的化学组合物可以是或包括化合物的个体立体化学异构体形式的纯
制备物;在一些实施方案中,提供的化学组合物可以是或包括所述化合物的两种或更多种
立体化学异构体形式的混合物。在某些实施方案中,这样的混合物含有等量的不同立体化
学异构体形式;在某些实施方案中,这样的混合物含有不同量的至少两种不同立体化学异
构体形式。在一些实施方案中,化学组合物可含有化合物的所有非对映体和/或对映体。在
一些实施方案中,化学组合物可含有化合物的少于所有的非对映体和/或对映体。在一些实
施方案中,如果期望本发明化合物的特定对映体,则其可例如通过不对称合成,或通过用手
性助剂衍生来制备,其中分离所得非对映体混合物,并且切割辅助基团以提供纯的期望对
映体。或者,当分子含有碱性官能团如氨基时,非对映体盐用适当光学活性的酸形成,并且
例如通过分级结晶来拆分。
物(例如哺乳动物,如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人;昆虫;蠕虫;等)和植物。在一些
实施方案中,对象可患有和/或易患有疾病、障碍和/或病症。
象很少达到完全和/或进行至完全或达到或避免绝对结果。因此,术语“基本上”在本文中用
于获取许多生物学和/或化学现象中固有的潜在完全性缺乏。
被诊断有所述疾病、障碍和/或病症。在一些实施方案中,易患有疾病、障碍和/或病症的个
体可表现出所述疾病、障碍和/或病症的症状。在一些实施方案中,易患有疾病、障碍和/或
病症的个体可不表现出所述疾病、障碍和/或病症的症状。在一些实施方案中,易患有疾病、
障碍和/或病症的个体将发生所述疾病、障碍和/或病症。在一些实施方案中,易患有疾病、
障碍和/或病症的个体将不发生所述疾病、障碍和/或病症。
施用(administered peripherally)”具有其在本领域中理解的含义,是指施用化合物或组
合物以使其进入接受者的系统。
单键和邻近双键的转换。在一些实施方案中,互变异构体可由质子移变互变异构(即质子重
新定位)产生。在一些实施方案中,互变异构体可由价位互变异构(即成键电子快速重构)产
生。所有此类互变异构形式都旨在包括在本发明的范围内。在一些实施方案中,化合物的互
变异构形式以彼此动态平衡存在,因此制备单独物质的尝试导致形成混合物。在一些实施
方案中,化合物的互变异构形式是可分开以及可分离化合物。在本发明的一些实施方案中,
可提供是或包括化合物的单一互变异构形式的纯制备物的化学组合物。在本发明的一些实
施方案中,化学组合物可以化合物的两种或更多种互变异构形式的混合物形式提供。在某
些实施方案中,所述混合物含有等量的不同互变异构形式;在某些实施方案中,所述混合物
含有化合物的不同量的至少两种不同互变异构形式。在本发明的一些实施方案中,化学组
合物可含有化合物的所有互变异构形式。在本发明的一些实施方案中,化学组合物可含有
化合物的少于所有的互变异构形式。在本发明的一些实施方案中,化学组合物可含有化合
物的一种或更多种互变异构形式,其数量由于相互转化而随时间变化。在本发明的一些实
施方案中,互变异构是酮‑烯醇互变异构。化学领域技术人员将认识到酮‑烯醇互变异构体
可使用化学领域中已知的任何适合试剂来“捕获(trapped)”(即化学改性以使其保持“烯
醇”形式),以提供可随后使用本领域中已知的一种或更多种适合技术加以分离的烯醇衍生
物。除非另有说明,否则本发明涵盖相关化合物的所有互变异构形式,无论呈纯的形式或呈
彼此混合。
善、缓和、抑制、预防疾病、障碍和/或病症,延迟其发作、减轻其严重性、和/或降低其一种或
更多种症状或特征之发生的任何物质。
的治疗有效量是当向患有或已患有疾病、障碍和/或病症的对象施用时足以治疗、诊断、预
防所述疾病、障碍和/或病症和/或延迟其发作的量。如本领域普通技术人员将了解,物质的
有效量可根据诸如期望生物终点、待递送的物质、靶细胞或组织等的因素而变化。例如,制
剂中的化合物的用以治疗疾病、障碍和/或病症的有效量是减轻、改善、缓和、抑制、预防所
述疾病、障碍和/或病症,延迟其发作、减轻其严重性和/或降低其一种或更多种症状或特征
之发生的量。在一些实施方案中,治疗有效量是以单次剂量施用;在一些实施方案中,递送
治疗有效量需要多个单位剂量。
降低其一种或更多种症状或特征之发生的任何方法。治疗可向未表现出疾病、障碍和/或病
症的征象的对象施用。在一些实施方案中,治疗可向仅表现出疾病、障碍和/或病症的早期
征象的对象施用例如以达到降低发生与所述疾病、障碍和/或病症相关的病理状况之风险
的目的。
施方案中,单位剂量含有药剂的整个单次剂量。在一些实施方案中,施用超过一个单位剂量
以达到总单次剂量。在一些实施方案中,需要或预期需要施用多个单位剂量以达到预定作
用。单位剂量可以是例如一定体积的含有预定量的一种或更多种治疗剂的液体(例如可接
受的载体)、预定量的一种或更多种呈固体形式的治疗剂、含有预定量的一种或更多种治疗
剂的持续释放制剂或药物递送装置等。应了解单位剂量可存在于除治疗剂之外还包含多种
组分中的任一种的制剂中。例如,可如下文所述包含可接受的载体(例如可药用载体)、稀释
剂、稳定剂、缓冲剂、防腐剂等。本领域技术人员应了解,在许多实施方案中,特定治疗剂的
合适总日剂量可包括单位剂量的一部分或多个单位剂量,并且可例如由主治医师在合理医
学判断的范围确定。在一些实施方案中,用于任何特定对象或生物体的具体有效剂量水平
可取决于多种因素,包括所治疗的障碍和障碍的严重性;所用具体活性化合物的活性;所用
具体组合物;对象的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食;所用具体活性化合物的施用时
间和排泄速率;治疗的持续时间;与所用一种或更多种具体化合物组合或同时使用的药物
和/或其他治疗;以及医学领域中公知的类似因素。
体。本领域普通技术人员将了解野生型基因和多肽常以多种不同形式(例如等位基因)存
在。
(DNA))。这些术语是指分子的一级结构,并且因此包括双链和单链DNA以及双链和单链RNA。
这些术语包括RNA或DNA的由核苷酸类似物和经修饰多核苷酸(例如但不限于甲基化、经保
护的和/或加帽的核苷酸或多核苷酸)制得的类似物作为等效物。所述术语涵盖多核糖核苷
酸或寡核糖核苷酸(RNA)和多脱氧核糖核苷酸或寡脱氧核糖核苷酸(DNA);源于核苷碱基
和/或经修饰核苷碱基的N‑糖苷或C‑糖苷的RNA或DNA;源于糖和/或经修饰糖的核酸;以及
源于磷酸酯桥(phosphate bridge)和/或经修饰磷原子桥(在本文中也称为“核苷酸间键联
(internucleotide linkage)”)的核酸。该术语涵盖含有核苷碱基、经修饰核苷碱基、糖、经
修饰糖、磷酸酯桥或经修饰磷原子桥的任何组合的核酸。实例包括并且不限于含有核糖部
分的核酸、含有脱氧核糖部分的核酸、含有核糖与脱氧核糖部分两者的核酸、含有核糖和经
修饰核糖部分的核酸。前缀多是指核酸含有2至约10,000个核苷酸单体单元,并且其中前缀
寡是指核酸含有2至约200个核苷酸单体单元。
胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U))是嘌呤或嘧啶的衍生物,但应了解也包括天然和非
天然碱基类似物。天然糖是戊糖(五碳糖)脱氧核糖(其形成DNA)或核糖(其形成RNA),但应
了解也包括天然和非天然糖类似物。核苷酸是通过核苷酸间键联连接以形成核酸或多核苷
酸。许多核苷酸间键联在本领域中是已知的(例如但不限于磷酸酯、硫代磷酸酯、硼代磷酸
酯等)。人工核酸包括PNA(肽核酸)、磷酸三酯、硫代磷酸酯、H‑膦酸酯、氨基磷酸酯、硼代磷
酸酯、甲基膦酸酯、膦酰基乙酸酯、硫代膦酰基乙酸酯和天然核酸的磷酸酯骨架的其他变
体,如本文中所述的那些。
结构类似物,如二醇,其聚合物形成核酸类似物二醇核酸(“GNA”)的骨架。
(U)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。在一些实施方案中,天然核苷碱基是经修饰腺嘌呤、鸟嘌
呤、尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些实施方案中,天然核苷碱基是甲基化腺嘌呤、鸟嘌
呤、尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些实施方案中,核苷碱基是“经修饰核苷碱基”,例如除
腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)以外的核苷碱基。在一些实施
方案中,经修饰核苷碱基是甲基化腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些实施
方案中,经修饰核苷碱基模拟核苷碱基的空间排列、电子性质或某种其他物理化学性质,并
且保留使一个核酸链以序列特异性方式结合于另一核酸链的氢键合的性质。在一些实施方
案中,经修饰核苷碱基可与全部五种天然碱基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌
呤)配对,而基本上不影响解链行为、被细胞内酶的识别或寡核苷酸双链体的活性。
包含反应性基团的玻璃或聚合物。在一些实施方案中,固体支持物是高交联聚苯乙烯
(Cross‑linked Polystyrene,HCP)或可控孔度玻璃(Controlled Pore Glass,CPG)。在一
些实施方案中,固体支持物是可控孔度玻璃(CPG)。在一些实施方案中,固体支持物是可控
孔度玻璃(CPG)和高交联聚苯乙烯(HCP)的杂合支持物。
将其限于任何特定三级形式。因此,该术语包括尤其存在于线性DNA分子(例如限制片段)、
病毒、质粒和染色体中的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子的结构时,在本文中可根据仅沿
非转录DNA链(即具有与mRNA同源的序列的链)以5’至3’方向给出序列的正常惯例来描述序
列。
5’(氨基)末端的起始密码子和在3’(羧基)末端的翻译终止密码子来确定。编码序列可包括
但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列,
和合成DNA序列。聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3’。术语“非编码序
列”或“非编码区”是指多核苷酸序列的不翻译成氨基酸的区域(例如5′和3′未翻译区域)。
此,反义核酸分子可通过氢键与有义核酸分子缔合。
存在四个编码甘氨酸的密码子,即GGU、GGC、GGA和GGG,因此任何摆动位置核苷酸突变成选
自A、U、C和G的任何其他核苷酸都不导致编码的蛋白质在氨基酸水平上变化,并且因此是沉
默取代。
以及某些密码子的第一位置中的突变,如在密码子“CGG”中,其在突变成AGG时仍然编码
Arg。
显子序列),并且还可包括内含子序列。本文中使用的术语“内含子”是指存在于给定基因中
的不翻译成蛋白质,并且在一些而非所有情况下存在于外显子之间的DNA序列。如本领域中
公知的那样,可期望的是基因可操作地连接于(或其可包含)一个或更多个启动子、增强子、
阻遏子和/或其他调控序列以调节基因的活性或表达。
较的序列中的等效位置由相同碱基占据时,那么分子在那个位置是相同的;当等效位点由
相同或类似核酸残基(例如在空间和/或电子性质方面类似)占据时,那么分子可称为在那
个位置是同源的(类似的)。表述为同源性/类似性或同一性百分比是指在由所比较的序列
共有的位置处相同或类似核酸数目的函数。“无关”或“非同源”序列与本文中所述的序列共
有小于40%同一性、小于35%同一性、小于30%同一性、或小于25%同一性。在比较两个序
列时,不存在残基(氨基酸或核酸)或存在额外残基也会降低同一性和同源性/类似性。
进行搜索,例如以鉴定其他家族成员、相关序列或同源物。在一些实施方案中,此类搜索可
使用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403‑10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。在一
些实施方案中,BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程序(计分=100,字长=12)来进行以获得与
本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。在一些实施方案中,为出于比较目的获得空位比对,
可如Altschul等,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389‑3402中所述利用空位BLAST。当
利用BLAST和空位BLAST程序时,可使用相应程序(例如XBLAST和BLAST)的缺省参数(参见
www.ncbi.nlm.nih.gov)。
易于通过已知方法计算,所述方法包括但不限于Computational Molecular Biology,
Lesk,A.M.编,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics
and Genome Projects,Smith,D.W.编,Academic Press,New York,1993;Computer
Analysis of Sequence Data,第I部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G编,Humana Press,
New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic
Press,1987;以及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编,M Stockton
Press,New York,1991;和Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073
(1988)中所述的那些。用以确定同一性的方法被设计来给出与测试的序列之间的最大匹
配。此外,用以确定同一性的方法被编纂在公开可用的电脑程序中。用以确定两个序列之间
的同一性的电脑程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux,J.等,Nucleic Acids
Research 12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等,
J.Molec.Biol.215:403‑410(1990)以及Altschul等Nuc.Acids Res.25:3389‑3402
(1997))。BLAST X程序可自NCBI和其他来源公开获得(BLAST Manual,Altschul,S.等,NCBI
NLM NIH Bethesda,Md.20894;Altschul,S.等,J.Mol.Biol.215:403‑410(1990))。公知的
Smith Waterman算法也可用于确定同一性。
生物体的基因组中不侧接(flank)哺乳动物基因组DNA的DNA侧接。异源编码序列的另一实
例是其中编码序列自身不存在于自然界中的序列(例如其中基因组编码序列含有内含子的
cDNA或具有不同于未经修饰基因的密码子或基序的合成序列)。等位基因变化形式或天然
突变事件不产生如本文中所定义的异源DNA区域。
组合的核苷酸单体的聚合物或寡聚体。
括但不限于结构基因、包括控制和终止区域的基因、自我复制性系统(如病毒或质粒DNA)、
单链和双链siRNA和其他RNA干扰试剂(RNAi剂或iRNA剂)、shRNA、反义寡核苷酸、核酶、微小
RNA、微小RNA模拟物、超级微小RNA(supermir)、适体(aptamer)、反义微小RNA(antimer)、微
小RNA拮抗剂(antagomir)、Ul衔接头(UI adaptor)、成三链体寡核苷酸(triplex‑forming
oligonucleotide)、G四链体寡核苷酸(G‑quadruplex oligonucleotide)、RNA活化剂、免疫
刺激性寡核苷酸和诱饵寡核苷酸(decoy oligonucleotide)。
induced silencing complex,RISC)的细胞质多蛋白质复合物缔合。在许多实施方案中,单
链和双链RNAi剂具有足够长度,以使其可被内源性分子,例如被Dicer切割,以产生可进入
RISC机构,并且参与RISC介导的靶序列(例如靶mRNA)切割的较小寡核苷酸。
度可在约4至约10个核苷酸、约10至约50个核苷酸、约20至约50个核苷酸、约15至约30个核
苷酸、约20至约30个核苷酸的范围内。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是约9至约39个
核苷酸。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是至少4个核苷酸。在一些实施方案中,寡核苷
酸的长度是至少5个核苷酸。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是至少6个核苷酸。在一些
实施方案中,寡核苷酸的长度是至少7个核苷酸。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是至
少8个核苷酸。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是至少9个核苷酸。在一些实施方案中,
寡核苷酸的长度是至少10个核苷酸。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是至少11个核苷
酸。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是至少12个核苷酸。在一些实施方案中,寡核苷酸
的长度是至少15个核苷酸。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是至少20个核苷酸。在一些
实施方案中,寡核苷酸的长度是至少25个核苷酸。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是至
少30个核苷酸。在一些实施方案中,寡核苷酸是长度是至少18个核苷酸的互补链的双链体。
在一些实施方案中,寡核苷酸是长度是至少21个核苷酸的互补链的双链体。
一些实施方案中,核苷酸间键联是如存在于天然DNA和RNA分子中的磷酸二酯键联。在一些
实施方案中,核苷酸间键联是“经修饰核苷酸间键联”,其中磷酸二酯键联的各氧原子任选
地并独立地被有机或无机部分替换。在一些实施方案中,所述有机或无机部分选自但不限
于=S、=Se、=NR’、‑SR’、‑SeR’、‑N(R’)2、B(R’)3、‑S‑、‑Se‑和‑N(R’)‑,其中各R’独立地如
下所定义和描述。在一些实施方案中,核苷酸间键联是磷酸三酯键联、硫代磷酸二酯键联
或经修饰硫代磷酸三酯键联。本领域普通技术人员应了解由于在键联中存
在酸或碱部分,在给定pH下,核苷酸间键联可作为阴离子或阳离子存在。
联。除非另外规定,否则在寡核苷酸序列之前的Rp/Sp符号依次自寡核苷酸序列的5’至3’描
述核苷酸间键联中的手性键联磷原子的构型。例如,在(Rp,Sp)‑ATsCs1GA中,T与C之间的
“s”键联中的磷具有Rp构型,并且C与G之间的“s1”键联中的磷具有Sp构型。在一些实施方案
中,“全(Rp)”或“全(Sp)”用于指示寡核苷酸中的所有手性键联磷原子都分别具有相同Rp或
Sp构型。例如,全‑(Rp)‑GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC指示寡核苷酸中的所
有手性键联磷原子都具有Rp构型;全‑(Sp)‑GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC
指示寡核苷酸中的所有手性键联磷原子都具有Sp构型。
1
(即键联磷立体化学样式(Rp/Sp))和骨架磷修饰样式(例如式I中的“‑XLR”基团样式)的寡
核苷酸。具有常见指定“类型”的寡核苷酸在结构上是彼此相同的。
学和/或在键联磷处的特定修饰、和/或特定碱基和/或特定糖。在一些实施方案中,提前设
计和/或选择寡核苷酸链以在键联磷处具有立体中心的特定组合。在一些实施方案中,设计
和/或确定寡核苷酸链以在键联磷处具有修饰的特定组合。在一些实施方案中,设计和/或
选择寡核苷酸链以具有碱基的特定组合。在一些实施方案中,设计和/或选择寡核苷酸链以
具有一种或更多种以上结构特征的特定组合。本发明提供了包含多种寡核苷酸分子或由多
种寡核苷酸分子组成的组合物(例如手性控制的寡核苷酸组合物)。在一些实施方案中,所
有所述分子都具有相同类型(即在结构上是彼此相同的)。然而,在许多实施方案中,所提供
的组合物通常以预定相对量包含多种不同类型的寡核苷酸。
在的寡核苷酸。
制的寡核苷酸组合物包含一种寡核苷酸类型。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组
合物包含超过一种寡核苷酸类型。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物包含多
种寡核苷酸类型的混合物。本文进一步描述示例性手性控制的寡核苷酸组合物。
体化学的寡核苷酸是手性均一的。同样,核苷酸单元都在键联磷处具有Sp立体化学的寡核
苷酸是手性均一的。
供的组合物和/或包括在所提供的组合物中,并且进一步允许精确控制任选地以所选特定
相对量进行所选特定类型的制备,以制备所提供的组合物的新的且出人意料的技术。此类
所提供的组合物如本文中所述是“预定的”。因为可含有某些个体寡核苷酸类型的组合物碰
巧已通过不能被控制来有意产生特定寡核苷酸类型的过程产生,所以它们不是“预定”组合
物。在一些实施方案中,预定组合物是可有意再产生(例如通过重复受控过程)的组合物。
二酯的磷原子。在一些实施方案中,键联磷原子在经修饰核苷酸间键联中,其中磷酸二酯键
联的各氧原子任选地且独立地被有机或无机部分替换。在一些实施方案中,键联磷原子是
*
式I的P 。在一些实施方案中,键联磷原子是手性的。在一些实施方案中,手性键联磷原子是
*
式I的P 。
1 1
些实施方案中,“P修饰”是‑X‑L‑R,其中X、L和R各自独立地如本文以及以下所定义和描述。
核苷酸单元的寡核苷酸链。共同结构特征是指在键联磷处的共同立体化学或在键联磷处的
共同修饰。在一些实施方案中,至少两个在核苷酸间磷键联处共有共同结构特征的连续核
苷酸单元称为“嵌段”。
Sp)‑ATsCs1GA是立体嵌段聚体,因为至少两个连续核苷酸单元Ts和Cs1在键联磷处具有相
同立体化学(均是Sp)。在相同寡核苷酸(Sp,Sp)‑ATsCs1GA中,TsCs1形成嵌段,并且它是立
体嵌段。
Sp)‑ATsCsGA是P修饰嵌段聚体,因为至少两个连续核苷酸单元Ts和Cs具有相同P修饰(即两
者均是硫代磷酸二酯)。在相同寡核苷酸(Rp,Sp)‑ATsCsGA中,TsCs形成嵌段,并且它是P修
饰嵌段。
如,(Rp,Rp)‑ATsCsGA是键联嵌段聚体,因为至少两个连续核苷酸单元Ts和Cs具有相同立体
化学(均是Rp)和P修饰(均是硫代磷酸酯)。在相同寡核苷酸(Rp,Rp)‑ATsCsGA中,TsCs形成
嵌段,并且它是键联嵌段。
于另一嵌段是P修饰嵌段聚体,和/或关于另一嵌段是键联嵌段聚体。例如,(Rp,Rp,Rp,Rp,
Rp,Sp,Sp,Sp)‑AAsTsCsGsAs1Ts1Cs1Gs1ATCG关于立体嵌段AsTsCsGsAs1(在键联磷处都是
Rp)或Ts1Cs1Gs1(在键联磷处都是Sp)是立体嵌段聚体,关于P修饰嵌段AsTsCsGs(都是s键
联)或As1Ts1Cs1Gs1(都是s1键联)是P修饰嵌段聚体,或关于键联嵌段AsTsCsGs(在键联磷
处都是Rp,并且都是s键联)或Ts1Cs1Gs1(在键联磷处都是Sp,并且都是s1键联)是键联嵌段
聚体。
有特定结构特征的寡核苷酸链。在一些实施方案中,设计交替聚体以使其包含重复样式。在
一些实施方案中,设计交替聚体以使其不包含重复样式。
Sp,Rp,Sp,Rp)‑GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC。
修饰。
Rp,Sp,Rp,Sp,Rp,Sp,Rp)‑GsCs1CsTs1CsAs1GsTs1CsTs1GsCs1TsTs2CsGs3CsAs4CsC。
酸链。共同结构特征是指在键联磷处的共同立体化学或在键联磷处的共同修饰。
GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC,其中所有核苷酸间键联都是硫代磷酸二酯。
CsC,其中所有核苷酸间键联都是具有Sp键联磷的硫代磷酸二酯。
链。在一些实施方案中,寡核苷酸链的多于一个核苷酸间磷键联是磷酸二酯键联,如存在于
天然DNA或RNA中的那些。例如,全‑(Sp)‑CAs1GsT,其中C与A之间的核苷酸间键联是磷酸二
酯键联。
那些,并且寡核苷酸链的每隔一个核苷酸间磷键联是经修饰核苷酸间键联。例如,全‑(Sp)‑
AsTCs1GAs2TCs3G。
(wing)的ONT‑87类似,同时二者具有比立构无规的2’‑MOE间隔聚体(ONT‑41,米泊美生
(Mipomersen))更好的稳定。通过反相HPLC测量剩余全长寡聚体的量,其中用内标物将目标
峰的峰面积归一化。
泊美生)的手性纯非对映体的体外代谢稳定性随Sp核苷酸间键联的增多而提高。通过反相
HPLC测量剩余全长寡聚体的量,其中用内标物将目标峰的峰面积归一化。
鼠ApoB序列(ONT‑83,2’‑MOE间隔聚体,立构无规硫代磷酸酯)的手性纯非对映体的体外代
谢稳定性随Sp核苷酸间键联的增多而提高。通过反相HPLC测量剩余全长寡聚体的量,其中
用内标物将目标峰的峰面积归一化。
研究中观察到了ONT‑87作用持续时间的延长。在某些体内研究中,ONT‑88表现出与ONT‑41
(米泊美生)类似的效力和回收谱(recovery profile)。给予Hu ApoB转基因小鼠(n=4)
10mpk IP推注,2×/周,持续三周。将小鼠随机化分到研究组中,在第1、4、8、11、15、18和22
天,基于在每个给药天给药之前测量的个体小鼠体重以10mg/kg腹膜内(IP)给药。在第0、
17、24、31、38、45和52天通过颌下(颊)出血以及在第52天处死时通过心脏穿刺收集血液,然
后处理成血清。通过ELISA测量ApoB。显著的:给药后3周时保持72%对比于35%的敲减。
ONT‑80、ONT‑75、ONT‑41、ONT‑88、ONT‑154、ONT‑87,ONT‑77/154彼此非常接近。
的强烈影响。箭头表示切割的位置(切割位点)。通过UPLC/MS分析产物。箭头的长度表示反
应混合物中存在的产物的量,其由UV峰面积与该片段的理论消光系数的比例确定(箭头越
大,检出的切割产物越多)。(A):切割图的图例。(B)和(C):寡核苷酸的切割图。
于37℃用RNase H1C孵育各双链体30分钟后获得的反应混合物。箭头表示切割位点, 表
示在反应混合物中鉴定了5’‑磷酸酯物质和5’‑OH 3’‑OH物质两种片段。「( )表示仅检出5’‑
磷酸酯物质, 表示在质谱分析中仅检出了5’‑OH 3’‑OH组分。箭头长度表示反应混合物
中存在的产物的量,其由UV峰面积与所述片段的理论消光系数的比例确定(箭头越大,检出
的切割产物越多)。仅在反应混合物中不能检出5’‑OH 3’‑OH的情况下,将5’‑磷酸酯物质峰
用于量化。通过由反相HPLC测量的反应混合物中剩余的全长RNA的量确定切割速率。在固定
时间点通过30mM Na2EDTA淬灭反应。
据比较了手性控制的寡核苷酸组合物与靶向FOXO1mRNA中的不同区域的两种立构无规硫代
磷酸酯寡核苷酸组合物(ONT‑366和ONT‑367)的结果。每个图示出了立构无规DNA(上图)和
三种不同的且立体化学纯的寡核苷酸制备物的比较。切割图来自于在1×PBS缓冲液的存在
下于37℃用RNase H1C孵育各双链体30分钟后获得的反应混合物。箭头表示切割位点,
表示在反应混合物中鉴定了5’‑磷酸酯物质和5’‑OH 3’‑OH物质两种片段。(「)表示仅检出
5’‑磷酸酯物质, 表示在质谱分析中仅检出了5’‑OH 3’‑OH组分。箭头长度表示反应混合
物中存在的产物的量,其由UV峰面积与所述片段的理论消光系数的比例确定(箭头越大,检
出的切割产物越多)。仅在反应混合物中不能检出5’‑OH 3’‑OH的情况下,将5’‑磷酸酯物质
峰用于量化。
孵育。使用RP‑HPLC由全长RNA在254nm的峰面积测量全长RNA的消失。A):在60分钟时从上到
下:ONT‑355、ONT‑316、ONT‑367、ONT‑392、ONT‑393和ONT‑394(60分钟时ONT‑393和ONT‑394
大致相同;在5分钟时ONT‑393具有更高的%剩余RNA底物)。(B):在60分钟时从上到下:ONT‑
315、ONT‑354、ONT‑366、ONT‑391、ONT‑389和ONT‑390。通过由反相HPLC测量的反应混合物中
剩余的全长RNA的量确定切割速率。在固定时间点通过30mM Na2EDTA淬灭反应。
峰面积测量全长RNA的消失。通过由反相HPLC测量的反应混合物中剩余的全长RNA的量确定
切割速率。在固定时间点通过30mM Na2EDTA淬灭反应。在40分钟时从上到下:ONT‑316、ONT‑
367和ONT‑392。
ONT‑367(无规DNA)与ONT‑316(5‑10‑52’‑MOE间隔聚体)的比较中也明显的是组成化学物质
对RNase H活性的依赖性。在40分钟时从上到下:ONT‑316、ONT‑421、ONT‑367、ONT‑392、ONT‑
394、ONT‑415和ONT‑422(在40分钟时ONT‑394/415/422具有类似水平;在5分钟时,DNA/RNA
双链体中%剩余RNA为ONT‑422>ONT‑394>ONT‑415)。
对RNase H活性的依赖性。在40分钟时从上到下:ONT‑396、ONT‑409、ONT‑414、ONT‑408(40分
钟时ONT‑396/409/414/408具有类似水平)、ONT‑404、ONT‑410、ONT‑402(40分钟时ONT‑404/
410/408有类似水平)、ONT‑403、ONT‑407、ONT‑405、ONT‑401、ONT‑406和ONT‑400(40分钟时
ONT‑401/405/406/400有类似水平)。
对RNase H活性的依赖性。观察到ONT‑406以稍微超过磷酸二酯寡核苷酸ONT‑415的速率引
起双链体RNA的切割。在40分钟时从上到下:ONT‑396、ONT‑421、ONT‑392、ONT‑394、ONT‑
415ONT‑406和ONT‑422(40分钟时ONT‑394/415/406有类似水平;在5分钟时,DNA/RNA双链体
中的%剩余RNA为ONT‑394>ONT‑415>ONT‑406)。
2.35分钟:7聚体;3.16分钟:8聚体和p‑6聚体;4.48分钟:P‑7聚体;5.83分钟:P‑8聚体;6.88
分钟:12聚体;9.32分钟:13聚体;10.13分钟:P‑11聚体;11.0分钟:P‑12聚体和14聚体;
11.93分钟:P‑13聚体;13.13分钟:P‑14聚体。ONT‑394(最下面)峰分配:4.55分钟:p‑7聚体;
4.97分钟:10聚体;9.53分钟:13聚体。
DNA)获得的RNA片段,下面为由ONT‑387,RNA/ONT‑315,(5‑10‑5,2’‑MOE间隔聚体)获得的
RNA片段。
以靶向用于等位基因选择性地抑制突变亨廷顿的单核苷酸多态性。靶向ONT‑453(muHTT)和
ONT‑454(wtHTT)的ONT‑450(立构无规)在RNA切割及其切割图中表现出微小差异。靶向ONT‑
453(muHTT)和ONT‑454(wtHTT)的3’‑SSR‑5’基序在RNase H识别位点中具有选择性落点
(placement)的手性控制的ONT‑451在RNA切割速率中表现出大的差异。从切割图中,值得注
意的是,设置3’‑SSR‑5’基序以指导在第8位和第9位之间切割,如果从RNA的5′端阅读,其在
错配之后。靶向ONT‑453(muHTT)和ONT‑454(wtHTT)的3’‑SSR‑5’基序在RNase H识别位点中
具有选择性落点的ONT‑452在RNA切割速率中具有适度差异。设置3’‑SSR‑5’基序以指导在
第7位和第8位之间切割,如果从RNA的5′端阅读,其在错配之前。示例性数据说明了3’‑SSR‑
5’基序落点位置对于实现提高的等位基因特异性切割的辨别的意义。所有切割图来自于在
1×PBS缓冲液的存在下于37℃用RNase H1C孵育各双链体30分钟后获得的反应混合物。箭
头表示切割位点, 表示在反应混合物中鉴定了5’‑磷酸酯物质和5’‑OH 3’‑OH物质两种
片段。(「)表示仅检出5’‑磷酸酯物质, 表示在质谱分析中仅检出了5’‑OH 3’‑OH组分。箭
头长度表示反应混合物中存在的代谢物的量,其由UV峰面积与所述片段的理论消光系数的
比例确定。仅在反应混合物中不能检出5’‑OH 3’‑OH的情况下,将5’‑磷酸酯物质峰用于量
化。
序列靶向FOXO1 mRNA中的相同区域。切割图来自于在1×PBS缓冲液的存在下于37℃用
RNase H1C孵育各双链体5分钟后获得的反应混合物。箭头表示切割位点, 表示在反应混
合物中鉴定了5’‑磷酸酯物质和5’‑OH 3’‑OH物质两种片段。 表示仅检出5’‑磷酸酯物
质, 表示在质谱分析中仅检出了5’‑OH3’‑OH组分。箭头长度表示反应混合物中存在的代
谢物的量,其由UV峰面积与所述片段的理论消光系数的比例确定。仅在反应混合物中不能
检出5’‑OH 3’‑OH的情况下,将5’‑磷酸酯物质峰用于量化。通过由反相HPLC测量的反应混
合物中剩余的全长RNA的量确定切割速率。在固定时间点通过30mM Na2EDTA淬灭反应。
H1C孵育各双链体5分钟后获得的反应混合物。箭头表示切割位点, 表示在反应混合物中
鉴定了5’‑磷酸酯物质和5’‑OH 3’‑OH物质两种片段。 表示仅检出5’‑磷酸酯物质, 表
示在质谱分析中仅检出了5’‑OH 3’‑OH组分。箭头长度表示反应混合物中存在的代谢物的
量,其由UV峰面积与所述片段的理论消光系数的比例确定。仅在反应混合物中不能检出5’‑
OH 3’‑OH的情况下,将5’‑磷酸酯物质峰用于量化。
FOXO1 mRNA中的相同区域。所有双链体在1×PBS缓冲液的存在下于37℃用RNase H1C孵育。
在固定时间点通过30mM Na2EDTA淬灭反应。通过由反相HPLC测量的反应混合物中剩余的全
长RNA的量确定切割速率。发现ONT‑406和ONT‑401具有优异的切割速率。(B)RNase H测定
(10μM寡核苷酸)中%切割的RNA和体内测定(20nM寡核苷酸)中%RNA敲减之间的相关性。所
有序列靶向FOXO1 mRNA中的相同区域。当相对于相同反应混合物的DNA归一化时,通过RNA
的UV峰面积确定剩余RNA的量。所有上图来自于在1×PBS缓冲液的存在下于37℃用RNase
H1C孵育各双链体5分钟后获得的反应混合物。ONT‑396至ONT‑414的所有序列具有一个Rp硫
氮磷酸酯并且其Rp的位置不同。ONT‑421(全Sp)硫代磷酸酯在体外测定中无活性。其符合当
ONT‑421与互补RNA形成双链体时RNase H测定中RNA差的切割速率。
意的是在测试终点ONT‑396和ONT‑455分解。
的稳定性,同时保持了RNase H活性。在RNase H测定(10μM寡核苷酸)中,ONT‑367(立构无规
硫代磷酸酯DNA)和ONT‑440(5‑15,2’‑F‑DNA)具有类似的切割图和类似的RNA切割速率。在
一些实施方案中,ONT‑440(5‑11,2’‑F‑DNA)可具有更好的细胞渗透特性。在一些实施方案
中,不对称2’‑修饰提供了Tm优点,同时保持了RNase H活性。引入RSS基序可以进一步提高
半聚体中的RNase H效率。切割图来自于在1×PBS缓冲液的存在下于37℃用RNase H1C孵育
各双链体5分钟后获得的反应混合物。箭头表示切割位点, 表示在反应混合物中鉴定了
5’‑磷酸酯物质和5’‑OH3’‑OH物质两种片段。 表示仅检出5’‑磷酸酯物质, 表示在质
谱分析中仅检出了5’‑OH 3’‑OH组分。箭头长度表示反应混合物中存在的代谢物的量,其由
UV峰面积与所述片段的理论消光系数的比例确定。仅在反应混合物中不能检出5’‑OH3’‑OH
的情况下,将5’‑磷酸酯物质峰用于量化。
13聚体;10.13分钟:P‑11聚体;11.14分钟:P‑12聚体和14聚体;12.11分钟:P‑13聚体;13.29
分钟:P‑14聚体;14.80分钟:全长RNA(ONT‑388),以及18.33分钟:立构无规DNA(ONT‑367)。
下:ONT‑406的数据:4.72分钟:p‑rArUrGrGrCrUrA,5’‑磷酸化7聚体RNA;9.46分钟:5’‑
rGrUrGrArGrCrArGrCrUrGrCrA,5’‑OH 3’‑OH 13聚体RNA;16.45分钟:全长RNA(ONT‑388);
19.48和19.49分钟:立体纯DNA(ONT‑406)。
易受核酸内切酶和核酸外切酶影响而受限制。因此,多种合成对应物已被开发来避免这些
缺点。这些包括含有致使这些分子较不易受降解影响的骨架修饰的合成寡核苷酸。从结构
观点来看,对核苷酸间磷酸酯键联的所述修饰引入手性。已变得明确的是寡核苷酸的某些
性质可受形成寡核苷酸的骨架的磷原子的构型影响。例如,体外研究已显示反义核苷酸的
性质(如结合亲和力、结合互补RNA的序列特异性、对核酸酶的稳定性)尤其受骨架的手性
(例如磷原子的构型)影响。
本发明涵盖以下见解:立构无规寡核苷酸制备物通常不可能包含相关核苷酸的每种可能的
立体异构体。因此,本发明尤其提供了目标寡核苷酸的特定立体异构体的新化学实体。也就
是说,本发明提供了单一核苷酸化合物的基本上纯的制备物,其中特定寡核苷酸化合物可
以通过其碱基序列、其长度、其骨架键联样式及其骨架手性中心样式定义。
稳定性改善可相当于或甚至优于通过使用某些经修饰骨架、碱基和/或糖(例如,通过使用
某些类型的经修饰磷酸酯、2’‑修饰、碱基修饰等)实现的那些。本公开内容在一些实施方案
中还证明,通过寡核苷酸内特定手性中心的引入和/或定位实现的活性改善可相当于或甚
至优于通过使用某些经修饰骨架、碱基和/或糖(例如,通过使用某些类型的经修饰磷酸酯、
2’‑修饰、碱基修饰等)实现的那些。在一些实施方案中,当寡核苷酸用于切割所述核酸聚合
物时,寡核苷酸内特定手性中心的引入和/或定位可以出人意料地改变所述核酸聚合物的
切割样式。例如,在一些实施方案中,骨架手性中心样式提供了靶核酸聚合物的出人意料的
高切割效率。在一些实施方案中,骨架手性中心样式提供了新切割位点。在一些实施方案
中,骨架手性中心样式提供了更少切割位点,例如,通过阻断某些已经存在的切割位点。甚
至更出人意料地,在一些实施方案中,骨架手性中心样式提供了靶核酸聚合物的与用于切
割的寡核苷酸互补的序列内的仅一个位点的切割。在一些实施方案中,通过选择用于最小
化切割位点数目的骨架手性中心样式,实现了更高切割效率。
键联样式和所述共同骨架手性中心样式。寡核苷酸的骨架手性中心样式可以通过从5’到3’
的键联磷立体化学(Rp/Sp)的组合表示。例如,如下文示例的,ONT‑154具有5S‑(SSR)3‑5S样
式,ONT‑80具有S19。
苷酸。在一些实施方案中,本发明提供了寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物,其中相对
于相同寡核苷酸的基本上外消旋的制备物,所述组合物富含单一寡核苷酸类型的寡核苷
酸,所述寡核苷酸共有以下:
性。寡核苷酸的示例性的基本上外消旋制备物是通过用二硫化四乙基秋兰姆
(tteraethylthiuram disulfide)或(TETD)或者3H‑1,2‑苯二硫醇‑3‑酮1,1‑二氧化物
(BDTD)对亚磷酸三酯进行本领域中公知的硫化过程的硫代磷酸酯寡核苷酸的制备物。在一
些实施方案中,寡核苷酸的基本上外消旋的制备物提供了基本上外消旋的寡核苷酸组合物
(或手性未控制的寡核苷酸组合物)。
案中,手性控制的寡核苷酸组合物是一种寡核苷酸类型的基本上纯的制备物,其中组合物
中不是所述寡核苷酸类型的寡核苷酸是来自所述寡核苷酸类型的制备过程的杂质,在一些
情况下,在某些纯化操作之后。
寡核苷酸具有共同碱基序列和长度、共同骨架键联样式和共同骨架手性中心样式。在一些
实施方案中,组合物中至少约30%的寡核苷酸具有共同碱基序列和长度、共同骨架键联样
式和共同骨架手性中心样式。在一些实施方案中,组合物中至少约35%的寡核苷酸具有共
同碱基序列和长度、共同骨架键联样式和共同骨架手性中心样式。在一些实施方案中,组合
物中至少约40%的寡核苷酸具有共同碱基序列和长度、共同骨架键联样式和共同骨架手性
中心样式。在一些实施方案中,组合物中至少约45%的寡核苷酸具有共同碱基序列和长度、
共同骨架键联样式和共同骨架手性中心样式。在一些实施方案中,组合物中至少约50%的
寡核苷酸具有共同碱基序列和长度、共同骨架键联样式和共同骨架手性中心样式。在一些
实施方案中,组合物中至少约55%的寡核苷酸具有共同碱基序列和长度、共同骨架键联样
式和共同骨架手性中心样式。在一些实施方案中,组合物中至少约60%的寡核苷酸具有共
同碱基序列和长度、共同骨架键联样式和共同骨架手性中心样式。在一些实施方案中,组合
物中至少约65%的寡核苷酸具有共同碱基序列和长度、共同骨架键联样式和共同骨架手性
中心样式。在一些实施方案中,组合物中至少约70%的寡核苷酸具有共同碱基序列和长度、
共同骨架键联样式和共同骨架手性中心样式。在一些实施方案中,组合物中至少约75%的
寡核苷酸具有共同碱基序列和长度、共同骨架键联样式和共同骨架手性中心样式。在一些
实施方案中,组合物中至少约80%的寡核苷酸具有共同碱基序列和长度、共同骨架键联样
式和共同骨架手性中心样式。在一些实施方案中,组合物中至少约85%的寡核苷酸具有共
同碱基序列和长度、共同骨架键联样式和共同骨架手性中心样式。在一些实施方案中,组合
物中至少约90%的寡核苷酸具有共同碱基序列和长度、共同骨架键联样式和共同骨架手性
中心样式。在一些实施方案中,组合物中至少约92%的寡核苷酸具有共同碱基序列和长度、
共同骨架键联样式和共同骨架手性中心样式。在一些实施方案中,组合物中至少约94%的
寡核苷酸具有共同碱基序列和长度、共同骨架键联样式和共同骨架手性中心样式。在一些
实施方案中,组合物中至少约95%的寡核苷酸具有共同碱基序列和长度、共同骨架键联样
式和共同骨架手性中心样式。在一些实施方案中,组合物中至少约91%、92%、93%、94%、
95%、96%、97%、98%或99%的寡核苷酸具有共同碱基序列和长度、共同骨架键联样式和
共同骨架手性中心样式。在一些实施方案中,组合物中大于约99%的寡核苷酸具有共同碱
基序列和长度、共同骨架键联样式和共同骨架手性中心样式。在一些实施方案中,寡核苷酸
的手性控制的寡核苷酸组合物的纯度可以表示为组合物中具有共同碱基序列和长度、共同
骨架键联样式和共同骨架手性中心样式的寡核苷酸的百分比。
组合物中至少约10%的寡核苷酸为相同寡核苷酸类型。在一些实施方案中,手性控制的寡
核苷酸组合物中至少约20%的寡核苷酸为相同寡核苷酸类型。在一些实施方案中,在一些
实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物中至少约30%的寡核苷酸为相同寡核苷酸类型。
在一些实施方案中,在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物中至少约40%的寡核
苷酸为相同寡核苷酸类型。在一些实施方案中,在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组
合物中至少约50%的寡核苷酸为相同寡核苷酸类型。在一些实施方案中,在一些实施方案
中,手性控制的寡核苷酸组合物中至少约60%的寡核苷酸为相同寡核苷酸类型。在一些实
施方案中,在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物中至少约70%的寡核苷酸为相
同寡核苷酸类型。在一些实施方案中,在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物中至
少约80%的寡核苷酸为相同寡核苷酸类型。在一些实施方案中,在一些实施方案中,手性控
制的寡核苷酸组合物中至少约90%的寡核苷酸为相同寡核苷酸类型。在一些实施方案中,
在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物中至少约92%的寡核苷酸为相同寡核苷酸
类型。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物中至少约94%的寡核苷酸为相同寡
核苷酸类型。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物中至少约95%的寡核苷酸为
相同寡核苷酸类型。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物中至少约96%的寡核
苷酸为相同寡核苷酸类型。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物中至少约97%
的寡核苷酸为相同寡核苷酸类型。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物中至少
约98%的寡核苷酸为相同寡核苷酸类型。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物
中至少约99%的寡核苷酸为相同寡核苷酸类型。
如,非对映体选择性)(由偶联步骤形成的60%新核苷酸间键联具有预期的立体化学)。在这
样的偶联步骤后,形成的新核苷酸间键联可指具有60%纯度。在一些实施方案中,每个偶联
步骤具有至少60%的立体选择性。在一些实施方案中,每个偶联步骤具有至少70%的立体
选择性。在一些实施方案中,每个偶联步骤具有至少80%的立体选择性。在一些实施方案
中,每个偶联步骤具有至少85%的立体选择性。在一些实施方案中,每个偶联步骤具有至少
90%的立体选择性。在一些实施方案中,每个偶联步骤具有至少91%的立体选择性。在一些
实施方案中,每个偶联步骤具有至少92%的立体选择性。在一些实施方案中,每个偶联步骤
具有至少93%的立体选择性。在一些实施方案中,每个偶联步骤具有至少94%的立体选择
性。在一些实施方案中,每个偶联步骤具有至少95%的立体选择性。在一些实施方案中,每
个偶联步骤具有至少96%的立体选择性。在一些实施方案中,每个偶联步骤具有至少97%
的立体选择性。在一些实施方案中,每个偶联步骤具有至少98%的立体选择性。在一些实施
方案中每个偶联步骤具有至少99%的立体选择性。在一些实施方案中,每个偶联步骤具有
至少99.5%的立体选择性。在一些实施方案中,每个偶联步骤具有几乎100%的立体选择
性。在一些实施方案中,每个偶联步骤具有几乎100%的立体选择性,其中通过分析方法(例
如,NMR、HPLC等),来自偶联步骤的所有可检测产物具有预期立体选择性。
是siRNA寡核苷酸。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物是可以是以下的
寡核苷酸:反义寡核苷酸、微小RNA拮抗剂(antagomir)、微小RNA(microRNA)、前微小RNA
(pre‑microRN)、反义微小RNA(antimir)、超微小RNA(supermir)、核酶(ribozyme)、U1衔接
头(Ul adaptor)、RNA活化剂、RNAi剂、诱饵寡核苷酸(decoy oligonucleotide)、成三链体
寡核苷酸(triplex forming oligonucleotide)、适体(aptamer)或佐剂(adjuvant)。在一
些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物是反义寡核苷酸的组合物。在一些实施方案中,
手性控制的寡核苷酸组合物是微小RNA拮抗剂寡核苷酸的组合物。在一些实施方案中,手性
控制的寡核苷酸组合物是微小RNA寡核苷酸的组合物。在一些实施方案中,手性控制的寡核
苷酸组合物是前微小RNA寡核苷酸的组合物。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合
物是反义微小RNA寡核苷酸的组合物。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物是超
微小RNA寡核苷酸的组合物。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物是核酶寡核苷
酸的组合物。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物是U1衔接头寡核苷酸的组合
物。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物是RNA活化剂寡核苷酸的组合物。在一
些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物是RNAi剂寡核苷酸的组合物。在一些实施方案
中,手性控制的寡核苷酸组合物是诱饵寡核苷酸的组合物。在一些实施方案中,手性控制的
寡核苷酸组合物是成三链体寡核苷酸的组合物。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸
组合物是适体寡核苷酸的组合物。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物是佐剂
寡核苷酸的组合物。
施方案中,提供的核苷酸包含三个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。在一些实施方案中,
提供的核苷酸包含四个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。在一些实施方案中,提供的核
苷酸包含五个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。在一些实施方案中,提供的核苷酸包含
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个手性的经
修饰磷酸酯键联。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸类型包含5个或更多个手性的经修饰
磷酸酯键联。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸类型包含6个或更多个手性的经修饰磷酸
酯键联。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸类型包含7个或更多个手性的经修饰磷酸酯键
联。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸类型包含8个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。
在一些实施方案中,提供的寡核苷酸类型包含9个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。在一
些实施方案中,提供的寡核苷酸类型包含10个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。在一些
实施方案中,提供的寡核苷酸类型包含11个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。在一些实
施方案中,提供的寡核苷酸类型包含12个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。在一些实施
方案中,提供的寡核苷酸类型包含13个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。在一些实施方
案中,提供的寡核苷酸类型包含14个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。在一些实施方案
中,提供的寡核苷酸类型包含15个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。在一些实施方案中,
提供的寡核苷酸类型包含16个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。在一些实施方案中,提
供的寡核苷酸类型包含17个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。在一些实施方案中,提供
的寡核苷酸类型包含18个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。在一些实施方案中,提供的
寡核苷酸类型包含19个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。在一些实施方案中,提供的寡
核苷酸类型包含20个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。在一些实施方案中,提供的寡核
苷酸类型包含21个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。在一些实施方案中,提供的寡核苷
酸类型包含22个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸
类型包含23个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸类
型包含24个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸类型
包含25个或更多个手性的经修饰磷酸酯键联。
经修饰磷酸酯键联。这样的示例性手性的经修饰磷酸酯键联描述在上文和本文中。在一些
实施方案中,提供的寡核苷酸包含至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、
50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的Sp构型的手性的经修
饰磷酸酯键联。
有大于约85%的立体化学纯度。在一些实施方案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)的
制备物具有大于约90%的立体化学纯度。在一些实施方案中,提供的手性控制(和/或立体
化学纯)的制备物是具有大于约91%的立体化学纯度。在一些实施方案中,提供的手性控制
(和/或立体化学纯)的制备物具有大于约92%的立体化学纯度。在一些实施方案中,提供的
手性控制(和/或立体化学纯)的制备物具有大于约93%的立体化学纯度。在一些实施方案
中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)的制备物具有大于约94%的立体化学纯度。在一些
实施方案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)的制备物具有大于约95%的立体化学纯
度。在一些实施方案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)的制备物具有大于约96%的立
体化学纯度。在一些实施方案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)的制备物具有大于约
97%的立体化学纯度。在一些实施方案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)的制备物具
有大于约98%的立体化学纯度。在一些实施方案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)的
制备物具有大于约99%的立体化学纯度。
25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或
100%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施方案中,所有手性的经修饰磷酸键联是手
性硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的至少约10%、20%、
30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Sp构象。在一些
实施方案中,提供的寡核苷酸的至少约10%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Sp构象。在一
些实施方案中,提供的寡核苷酸的至少约20%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Sp构象。在
一些实施方案中,提供的寡核苷酸的至少约30%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Sp构象。
在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的至少约40%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Sp构
象。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的至少约50%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Sp
构象。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的至少约60%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为
Sp构象。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的至少约70%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联
为Sp构象。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的至少约80%手性硫代磷酸酯核苷酸间键
联为Sp构象。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的至少约90%手性硫代磷酸酯核苷酸间
键联为Sp构象。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的至少约95%手性硫代磷酸酯核苷酸
间键联为Sp构象。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的至少约10%、20%、30%、40%、
50%、60%、70%、80%或90%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。在一些实施方案中,
提供的寡核苷酸的至少约10%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。在一些实施方案
中,提供的寡核苷酸的至少约20%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。在一些实施方
案中,提供的寡核苷酸的至少约30%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。在一些实施
方案中,提供的寡核苷酸的至少约40%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。在一些实
施方案中,提供的寡核苷酸的至少约50%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。在一些
实施方案中,提供的寡核苷酸的至少约60%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。在一
些实施方案中,提供的寡核苷酸的至少约70%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。在
一些实施方案中,提供的寡核苷酸的至少约80%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。
在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的至少约90%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构
象。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的至少约95%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp
构象。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的小于约10%、20%、30%、40%、50%、60%、
70%、80%或90%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。在一些实施方案中,提供的寡核
苷酸的小于约10%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。在一些实施方案中,提供的寡
核苷酸的小于约20%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。在一些实施方案中,提供的
寡核苷酸的小于约30%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。在一些实施方案中,提供
的寡核苷酸的小于约40%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。在一些实施方案中,提
供的寡核苷酸的小于约50%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。在一些实施方案中,
提供的寡核苷酸的小于约60%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。在一些实施方案
中,提供的寡核苷酸的小于约70%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。在一些实施方
案中,提供的寡核苷酸的小于约80%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。在一些实施
方案中,提供的寡核苷酸的小于约90%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。在一些实
施方案中,提供的寡核苷酸的小于约95%手性硫代磷酸酯核苷酸间键联为Rp构象。在一些
实施方案中,提供的寡核苷酸具有仅一个Rp手性硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施方
案中,提供的寡核苷酸具有仅一个Rp手性硫代磷酸酯核苷酸间键联,其中所有核苷酸间键
联为手性硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施方案中,手性硫代磷酸酯核苷酸间键联是
手性硫代磷酸二酯键联。在一些实施方案中,每个手性硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是
手性硫代磷酸二酯键联。在一些实施方案中,每个核苷酸间键联独立地是手性硫代磷酸二
酯键联。在一些实施方案中,每个核苷酸间键联独立地是手性硫代磷酸二酯键联,并且仅一
个是Rp。
的制备物是不包含经修饰碱基的寡核苷酸的。示例性的这种经修饰碱基在上文和本文中描
述。
体化学纯)的制备物是具有至少9个碱基之共同碱基序列的寡核苷酸的制备物。在一些实施
方案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)的制备物是是具有至少10个碱基之共同碱基
序列的寡核苷酸的制备物。在一些实施方案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)的制备
物是具有至少11个碱基之共同碱基序列的寡核苷酸的制备物。在一些实施方案中,提供的
手性控制(和/或立体化学纯)的制备物是具有至少12个碱基之共同碱基序列的寡核苷酸的
制备物。在一些实施方案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)的制备物是具有至少13个
碱基之共同碱基序列的寡核苷酸的制备物。在一些实施方案中,提供的手性控制(和/或立
体化学纯)的制备物是具有至少14个碱基之共同碱基序列的寡核苷酸的制备物。在一些实
施方案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)的制备物是具有至少15个碱基之共同碱基
序列的寡核苷酸的制备物。在一些实施方案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)的制备
物是具有至少16个碱基之共同碱基序列的寡核苷酸的制备物。在一些实施方案中,提供的
手性控制(和/或立体化学纯)的制备物是具有至少17个碱基之共同碱基序列的寡核苷酸的
制备物。在一些实施方案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)的制备物是具有至少18个
碱基之共同碱基序列的寡核苷酸的制备物。在一些实施方案中,提供的手性控制(和/或立
体化学纯)的制备物是具有至少19个碱基之共同碱基序列的寡核苷酸的制备物。在一些实
施方案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)的制备物是具有至少20个碱基之共同碱基
序列的寡核苷酸的制备物。在一些实施方案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)的制备
物是具有至少21个碱基之共同碱基序列的寡核苷酸的制备物。在一些实施方案中,提供的
手性控制(和/或立体化学纯)的制备物是具有至少22个碱基之共同碱基序列的寡核苷酸的
制备物。在一些实施方案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)的制备物是具有至少23个
碱基之共同碱基序列的寡核苷酸的制备物。在一些实施方案中,提供的手性控制(和/或立
体化学纯)的制备物是具有至少24个碱基之共同碱基序列的寡核苷酸的制备物。在一些实
施方案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)的制备物是具有至少25个碱基之共同碱基
序列的寡核苷酸的制备物。在一些实施方案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)的制备
物是具有至少30、35、40、45、50、55、60、65、70或75个碱基之共同碱基序列的寡核苷酸的制
备物。
体化学纯)的制备物包含含有在糖部分的2’位置修饰(在本文中也称为“2’‑修饰”)的一个
或更多个残基的寡核苷酸。示例性的这种修饰在上文和本文中描述,并且包括但不限于2’‑
OMe、2’‑MOE、2’‑LNA、2’‑F等。在一些实施方案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)制备
物包含含有一个或更多个2’‑修饰之残基的寡核苷酸。例如,在一些实施方案中,提供的寡
核苷酸包含一个或更多个为2’‑O‑甲氧基乙基(2’‑MOE)修饰残基的残基。在一些实施方案
中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)制备物包含不含有任何2’‑修饰的寡核苷酸。在一
些实施方案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)的制备物是不含任何2’‑MOE残基的寡
核苷酸。即,在一些实施方案中,提供的寡核苷酸不是MOE‑修饰的。
个或更多个具有特定修饰的残基,所述修饰在核心不存在于“Y”部分中。在一些实施方案
中,每个翼区包含一个或更多个具有2′修饰的残基,所述2’修饰不存在于核心部分中。例
如,在一些实施方案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)寡核苷酸具有表示为X‑Y‑X的
翼区‑核心‑翼区基序,其中每个“X”部分的残基是特定类型的2’修饰残基,并且核心“Y”部
分中的残基不是相同特定类型的2’修饰残基。例如,在一些实施方案中,提供的手性控制
(和/或立体化学纯)寡核苷酸具有表示为X‑Y‑X的翼区‑核心‑翼区基序,其中每个“X”部分
的残基是2’‑MOE修饰残基,并且核心“Y”部分中的残基不是2’‑MOE修饰残基。在一些实施方
案中,提供的手性控制(和/或立体化学纯)寡核苷酸具有表示为X‑Y‑X的翼区‑核心‑翼区基
序,其中每个“X”部分的残基是2’‑MOE修饰残基,并且核心“Y”部分中的残基是2’‑脱氧核糖
核苷酸。相关领域技术人员将承认,上文和本文描述的所有这样的2’‑修饰均考虑在这样的
X‑Y‑X基序的范围内。
地具有三个或更多个碱基的长度。在一些实施方案中,每个翼区独立地具有四个或更多个
碱基的长度。在一些实施方案中,每个翼区独立地具有五个或更多个碱基的长度。在一些实
施方案中,每个翼区独立地具有六个或更多个碱基的长度。在一些实施方案中,每个翼区独
立地具有七个或更多个碱基的长度。在一些实施方案中,每个翼区独立地具有八个或更多
个碱基的长度。在一些实施方案中,每个翼区独立地具有九个或更多个碱基的长度。在一些
实施方案中,每个翼区独立地具有十个或更多个碱基的长度。在某些实施方案中,每个翼区
具有一个碱基的长度。在某些实施方案中,每个翼区具有两个碱基的长度。在某些实施方案
中,每个翼区具有三个碱基的长度。在某些实施方案中,每个翼区具有四个碱基的长度。在
某些实施方案中,每个翼区具有五个碱基的长度。
碱基的长度。在一些实施方案中,核心区域具有三个或更多个碱基的长度。在一些实施方案
中,核心区域具有四个或更多个碱基的长度。在一些实施方案中,核心区域具有五个或更多
个碱基的长度。在一些实施方案中,核心区域具有六个或更多个碱基的长度。在一些实施方
案中,核心区域具有七个或更多个碱基的长度。在一些实施方案中,核心区域具有八个或更
多个碱基的长度。在一些实施方案中,核心区域具有九个或更多个碱基的长度。在一些实施
方案中,核心区域具有十个或更多个碱基的长度。在一些实施方案中,核心区域具有11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20、25或更多个碱基的长度。在某些实施方案中,核心区域具有十
个碱基的长度。在某些实施方案中,核心区域具有3个碱基的长度。在某些实施方案中,核心
区域具有4个碱基的长度。在某些实施方案中,核心区域具有5个碱基的长度。在某些实施方
案中,核心区域具有6个碱基的长度。在某些实施方案中,核心区域具有7个碱基的长度。在
某些实施方案中,核心区域具有8个碱基的长度。在某些实施方案中,核心区域具有9个碱基
的长度。在某些实施方案中,核心区域具有10个碱基的长度。在某些实施方案中,核心区域
具有11个碱基的长度。在某些实施方案中,核心区域具有12个碱基的长度。在某些实施方案
中,核心区域具有13个碱基的长度。在某些实施方案中,核心区域具有14个碱基的长度。在
某些实施方案中,核心区域具有15个碱基的长度。在某些实施方案中,核心区域具有16个碱
基的长度。在某些实施方案中,核心区域具有17个碱基的长度。在某些实施方案中,核心区
域具有18个碱基的长度。在某些实施方案中,核心区域具有19个碱基的长度。在某些实施方
案中,核心区域具有11个或更多个碱基的长度。在某些实施方案中,核心区域具有12个或更
多个碱基的长度。在某些实施方案中,核心区域具有13个或更多个碱基的长度。在某些实施
方案中,核心区域具有14个或更多个碱基的长度。在某些实施方案中,核心区域具有15个或
更多个碱基的长度。在某些实施方案中,核心区域具有16个或更多个碱基的长度。在某些实
施方案中,核心区域具有17个或更多个碱基的长度。在某些实施方案中,核心区域具有18个
或更多个碱基的长度。在某些实施方案中,核心区域具有19个或更多个碱基的长度。在某些
实施方案中,核心区域具有20个或更多个碱基的长度。在某些实施方案中,核心区域具有大
于20个或更多个碱基的长度。
是10个碱基长度。在一些实施方案中,是例如翼区‑核心‑翼区基序为例如2‑16‑2、3‑14‑3、
4‑12‑4、5‑10‑5等中的任一个。在某些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序为5‑10‑5。
翼区(即,X‑Y‑X)基序的寡核苷酸的核苷酸间键联全部是手性硫代磷酸酯核苷酸间键联。在
一些实施方案中,提供的这种翼区‑核心‑翼区基序的寡核苷酸的核苷酸间键联是至少约
10%、20%、30%、40%、50%、50%、70%、80%或90%手性的经修饰磷酸酯核苷酸间键联。
在一些实施方案中,提供的这种翼区‑核心‑翼区基序的寡核苷酸的手性寡核苷酸的核苷酸
间键联是至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%手性硫代磷酸酯核苷
酸间键联。在一些实施方案中,提供的这种翼区‑核心‑翼区基序的寡核苷酸的手性寡核苷
酸的核苷酸间键联是至少约10%、20%、30%、40%、50%、50%、70%、80%或90%Sp构象的
手性硫代磷酸酯核苷酸间键联。
硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序的每个翼区包含手性
硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序的两个翼区具有相同
的核苷酸间键联立体化学。在一些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序的两个翼区具有不同
的核苷酸间键联立体化学。在一些实施方案中,翼区的每个核苷酸间键联独立地为手性核
苷酸间键联。
硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序的核心区域包含核苷
酸间键联立体化学的重复样式。在一些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序的核心区域具有
核苷酸间键联立体化学的重复样式。在一些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序的核心区域
包含核苷酸间键联立体化学的重复样式,其中所述重复样式是(Sp)mRp或Rp(Sp)m,其中m是
2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序的核心区域具有核苷酸间键联
立体化学的重复样式,其中所述重复样式是(Sp)mRp或Rp(Sp)m,其中m是2、3、4、5、6、7或8。
在一些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序的核心区域具有核苷酸间键联立体化学的重复样
式,其中所述重复样式是(Sp)mRp,其中m是2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方案中,翼区‑核
心‑翼区基序的核心区域具有核苷酸间键联立体化学的重复样式,其中所述重复样式是Rp
(Sp)m,其中m是2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序的核心区域具有
核苷酸间键联立体化学的重复样式,其中所述重复样式是(Sp)mRp或Rp(Sp)m,其中m是2、3、
4、5、6、7或8。在一些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序的核心区域具有核苷酸间键联立体
化学的重复样式,其中所述重复样式是包含至少33%S构象的核苷酸间键联的基序。在一些
实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序的核心区域具有核苷酸间键联立体化学的重复样式,其
中所述重复样式是包含至少50%S构象的核苷酸间键联的基序。在一些实施方案中,翼区‑
核心‑翼区基序的核心区域具有核苷酸间键联立体化学的重复样式,其中所述重复样式是
包含至少66%S构象的核苷酸间键联的基序。在一些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序的核
心区域具有核苷酸间键联立体化学的重复样式,其中所述重复样式是选自RpRpSp和SpSpRp
的重复三联体基序。在一些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序的核心区域具有核苷酸间键
联立体化学的重复样式,其中所述重复样式是重复RpRpSp。在一些实施方案中,翼区‑核心‑
翼区基序的核心区域具有核苷酸间键联立体化学的重复样式,其中所述重复样式是重复
SpSpRp。
了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合物,其在核心区域的骨架手性中心样式包含Rp
(Sp)m。在一些实施方案中,本发明提供了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合物,其在
核心区域的骨架手性中心样式包含(Sp)mRp。在一些实施方案中,m是2。在一些实施方案中,
本发明提供了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合物,其在核心区域的骨架手性中心样
式包含Rp(Sp)2。在一些实施方案中,本发明提供了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合
物,其在核心区域的骨架手性中心样式包含(Sp)2Rp(Sp)2。在一些实施方案中,本发明提供
了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合物,其在核心区域的骨架手性中心样式包含
(Rp)2Rp(Sp)2。在一些实施方案中,本发明提供了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合
物,其在核心区域的骨架手性中心样式包含RpSpRp(Sp)2。在一些实施方案中,本发明提供
了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合物,其在核心区域的骨架手性中心样式包含
SpRpRp(Sp)2。在一些实施方案中,本发明提供了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合
物,其在核心区域的骨架手性中心样式包含(Sp)2Rp。
的手性控制的寡核苷酸组合物,其骨架手性中心样式包含Rp(Sp)m。在一些实施方案中,本
发明提供了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合物,其骨架手性中心样式包含(Sp)mRp。
在一些实施方案中,m是2。在一些实施方案中,本发明提供了核苷酸类型的手性控制的寡核
苷酸组合物,其骨架手性中心样式包含Rp(Sp)2。在一些实施方案中,本发明提供了核苷酸
类型的手性控制的寡核苷酸组合物,其骨架手性中心样式包含(Sp)2Rp(Sp)2。在一些实施方
案中,本发明提供了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合物,其骨架手性中心样式包含
(Rp)2Rp(Sp)2。在一些实施方案中,本发明提供了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合
物,其在核心区域的骨架手性中心样式包含RpSpRp(Sp)2。在一些实施方案中,本发明提供
了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合物,其在核心区域的骨架手性中心样式包含
SpRpRp(Sp)2。在一些实施方案中,本发明提供了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合
物,其在核心区域的骨架手性中心样式包含(Sp)2Rp。
是6、7或8。在一些实施方案中,m是7或8。在一些实施方案中,m是2。在一些实施方案中,m是
3。在一些实施方案中,m是4。在一些实施方案中,m是5。在一些实施方案中,m是6。在一些实
施方案中,m是7。在一些实施方案中,m是8。
的手性控制的寡核苷酸组合物,其骨架手性中心样式包含(Sp)m(Rp)n。在一些实施方案中,
本发明提供了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合物,其核心区域中的骨架手性中心样
式包含(Sp)m(Rp)n。在一些实施方案中,重复样式是(Rp)n(Sp)m,其中n独立地是1、2、3、4、
5、6、7或8,并且m独立地如上文中所限定和本文中所述。在一些实施方案中,本发明提供了
核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合物,其骨架手性中心样式包含(Rp)n(Sp)m。在一些
实施方案中,本发明提供了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合物,其核心区域中的骨
架手性中心样式包含(Rp)n(Sp)m。在一些实施方案中,(Rp)n(Sp)m是(Rp)(Sp)2。在一些实
施方案中,(Sp)n(Rp)m是(Sp)2(Rp)。
了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合物,其骨架手性中心样式包含(Sp)m(Rp)n(Sp)t。
在一些实施方案中,本发明提供了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合物,其核心区域
中的骨架手性中心样式包含(Sp)m(Rp)n(Sp)t。在一些实施方案中,重复样式是(Sp)t(Rp)n
(Sp)m,其中n和t各自独立地是1、2、3、4、5、6、7或8,并且m独立地如上文中所限定和本文中
所述。在一些实施方案中,本发明提供了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合物,其骨架
手性中心样式包含(Sp)t(Rp)n(Sp)m。在一些实施方案中,本发明提供了核苷酸类型的手性
控制的寡核苷酸组合物,其核心区域中的骨架手性中心样式包含(Sp)t(Rp)n(Sp)m。
方案中,本发明提供了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合物,其骨架手性中心样式包
含(Np)t(Rp)n(Sp)m。在一些实施方案中,本发明提供了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸
组合物,其核心区域中的骨架手性中心样式包含(Np)t(Rp)n(Sp)m。在一些实施方案中,重
复样式是(Np)m(Rp)n(Sp)t,其中n和t各自独立地是1、2、3、4、5、6、7或8,Np独立地是Rp或
Sp,并且m独立地如上文中所限定和本文中所述。在一些实施方案中,本发明提供了核苷酸
类型的手性控制的寡核苷酸组合物,其骨架手性中心样式包含(Np)m(Rp)n(Sp)t。在一些实
施方案中,本发明提供了核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合物,其核心区域中的骨架
手性中心样式包含(Np)m(Rp)n(Sp)t。在一些实施方案中,Np是Rp。在一些实施方案中,Np是
Sp。在一些实施方案中,所有Np相同。在一些实施方案中,所有Np是Sp。在一些实施方案中,
至少一个Np不同于其他Np。在一些实施方案中,t是2。
方案中,n是5、6、7或8。在一些实施方案中,n是6、7或8。在一些实施方案中,n是7或8。在一些
实施方案中,n是1。在一些实施方案中,n是2。在一些实施方案中,n是3。在一些实施方案中,
n是4。在一些实施方案中,n是5。在一些实施方案中,n是6。在一些实施方案中,n是7。在一些
实施方案中,n是8。
方案中,t是5、6、7或8。在一些实施方案中,t是6、7或8。在一些实施方案中,t是7或8。在一些
实施方案中,t是1。在一些实施方案中,t是2。在一些实施方案中,t是3。在一些实施方案中,
t是4。在一些实施方案中,t是5。在一些实施方案中,t是6。在一些实施方案中,t是7。在一些
实施方案中,t是8。
少一个大于5。在一些实施方案中,m和t中的至少一个大于6。在一些实施方案中,m和t中的
至少一个大于7。在一些实施方案中,m和t中的每一个大于2。在一些实施方案中,m和t中的
每一个大于3。在一些实施方案中,m和t中的每一个大于4。在一些实施方案中,m和t中的每
一个大于5。在一些实施方案中,m和t中的每一个大于6。在一些实施方案中,m和t中的每一
个大于7。
m(Rp)n(Sp)t是(Sp)2Rp(Sp)2。在一些实施方案中,(Sp)t(Rp)n(Sp)m是(Sp)2Rp(Sp)2。在一
些实施方案中,(Sp)t(Rp)n(Sp)m是SpRp(Sp)2。在一些实施方案中,(Np)t(Rp)n(Sp)m是
(Np)tRp(Sp)m。在一些实施方案中,(Np)t(Rp)n(Sp)m是(Np)2Rp(Sp)m。在一些实施方案中,
(Np)t(Rp)n(Sp)m是(Rp)2Rp(Sp)m。在一些实施方案中,(Np)t(Rp)n(Sp)m是(Sp)2Rp(Sp)m。
在一些实施方案中,(Np)t(Rp)n(Sp)m是RpSpRp(Sp)m。在一些实施方案中,(Np)t(Rp)n(Sp)
m是SpRpRp(Sp)m。
方案中,(Sp)t(Rp)n(Sp)m是(Sp)4Rp(Sp)4。在一些实施方案中,(Sp)t(Rp)n(Sp)m是(Sp)tRp
(Sp)5。在一些实施方案中,(Sp)t(Rp)n(Sp)m是SpRp(Sp)5。在一些实施方案中,(Sp)t(Rp)n
(Sp)m是(Sp)2Rp(Sp)5。在一些实施方案中,(Sp)t(Rp)n(Sp)m是(Sp)3Rp(Sp)5。在一些实施
方案中,(Sp)t(Rp)n(Sp)m是(Sp)4Rp(Sp)5。在一些实施方案中,(Sp)t(Rp)n(Sp)m是(Sp)5Rp
(Sp)5。
实施方案中,(Sp)m(Rp)n(Sp)t是(Sp)mRp(Sp)5。在一些实施方案中,(Sp)m(Rp)n(Sp)t是
(Sp)2Rp(Sp)5。在一些实施方案中,(Sp)m(Rp)n(Sp)t是(Sp)3Rp(Sp)5。在一些实施方案中,
(Sp)m(Rp)n(Sp)t是(Sp)4Rp(Sp)5。在一些实施方案中,(Sp)m(Rp)n(Sp)t是(Sp)5Rp(Sp)5。
酸间键联。在一些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序的核心区域包含至少两个Rp核苷酸间
键联。在一些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序的核心区域包含至少两个Rp硫代磷酸酯核
苷酸间键联。在一些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序的核心区域包含至少三个Rp核苷酸
间键联。在一些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序的核心区域包含至少三个Rp硫代磷酸酯
核苷酸间键联。在一些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序的核心区域包含至少4、5、6、7、8、9
或10个Rp核苷酸间键联。在一些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序的核心区域包含至少4、
5、6、7、8、9或10个Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。
心“Y”区域中的残基是2’‑脱氧核苷酸残基。在某些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序是5‑
10‑5基序,其中所有核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在某些实施方案中,翼区‑
核心‑翼区基序是5‑10‑5基序,其中所有核苷酸间键联是手性硫代磷酸酯核苷酸间键联。在
某些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序是5‑10‑5基序,其中每个“X”翼区中的残基是2’‑
MOE‑修饰的残基,核心“Y”区域中的残基是2’‑脱氧核苷酸残基,并且所有核苷酸间键联是
手性硫代磷酸酯核苷酸间键联。
核心“Y”区域中的残基是2’‑脱氧核苷酸残基。在某些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序是
5‑10‑5基序,其中所有核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在某些实施方案中,翼
区‑核心‑翼区基序是5‑10‑5基序,其中所有核苷酸间键联是手性硫代磷酸酯核苷酸间键
联。在某些实施方案中,翼区‑核心‑翼区基序是5‑10‑5基序,其中每个“X”翼区中的残基不
是2’‑MOE‑修饰的残基,核心“Y”区域中的残基是2’‑脱氧核苷酸残基,并且所有核苷酸间键
联是手性硫代磷酸酯核苷酸间键联。
性的影响,包括对寡核苷酸与同源配体和/或与加工酶的相互作用的影响。本发明特别提供
了结构引入或反映了设计参数的寡核苷酸。相对于具有相同碱基序列和长度的立构无规制
备物,这样的寡核苷酸是新化学实体。
些实施方案中,本发明提供了siRNA寡核苷酸的立体化学设计参数。在一些实施方案中,本
发明特别提供了可以被例如DICER、Argonaute蛋白(例如Argonaute‑1和Argonaute‑2)结合
和/或切割的寡核苷酸的设计参数。
键联中的至少一个是手性的。在一些实施方案中,第一个、第二个、第三个、第五个、第七个、
第八个、第九个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键联中的至少两个是手性的。在
一些实施方案中,第一个、第二个、第三个、第五个、第七个、第八个、第九个、第十八个、第十
九个和第二十个核苷酸间键联中的至少三个是手性的。在一些实施方案中,第一个、第二
个、第三个、第五个、第七个、第八个、第九个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键联
中的至少四个是手性的。在一些实施方案中,第一个、第二个、第三个、第五个、第七个、第八
个、第九个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键联中的至少五个是手性的。在一些
实施方案中,第一个、第二个、第三个、第五个、第七个、第八个、第九个、第十八个、第十九个
和第二十个核苷酸间键联中的至少六个是手性的。在一些实施方案中,第一个、第二个、第
三个、第五个、第七个、第八个、第九个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键联中的
至少七个是手性的。在一些实施方案中,第一个、第二个、第三个、第五个、第七个、第八个、
第九个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键联中的至少八个是手性的。在一些实施
方案中,第一个、第二个、第三个、第五个、第七个、第八个、第九个、第十八个、第十九个和第
二十个核苷酸间键联中的至少九个是手性的。在一些实施方案中,第一个、第二个、第三个、
第五个、第七个、第八个、第九个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键联中的一个是
手性的。在一些实施方案中,第一个、第二个、第三个、第五个、第七个、第八个、第九个、第十
八个、第十九个和第二十个核苷酸间键联中的两个是手性的。在一些实施方案中,第一个、
第二个、第三个、第五个、第七个、第八个、第九个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间
键联中的三个是手性的。在一些实施方案中,第一个、第二个、第三个、第五个、第七个、第八
个、第九个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键联中的四个是手性的。在一些实施
方案中,第一个、第二个、第三个、第五个、第七个、第八个、第九个、第十八个、第十九个和第
二十个核苷酸间键联中的五个是手性的。在一些实施方案中,第一个、第二个、第三个、第五
个、第七个、第八个、第九个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键联中的六个是手性
的。在一些实施方案中,第一个、第二个、第三个、第五个、第七个、第八个、第九个、第十八
个、第十九个和第二十个核苷酸间键联中的七个是手性的。在一些实施方案中,第一个、第
二个、第三个、第五个、第七个、第八个、第九个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键
联中的八个是手性的。在一些实施方案中,第一个、第二个、第三个、第五个、第七个、第八
个、第九个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键联中的九个是手性的。在一些实施
方案中,第一个、第二个、第三个、第五个、第七个、第八个、第九个、第十八个、第十九个和第
二十个核苷酸间键联中的十个是手性的。
个是手性的。在一些实施方案中,第一个、第二个、第三个、第五个、第七个、第十八个、第十
九个和第二十个核苷酸间键联中的至少两个是手性的。在一些实施方案中,第一个、第二
个、第三个、第五个、第七个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键联中的至少三个是
手性的。在一些实施方案中,第一个、第二个、第三个、第五个、第七个、第十八个、第十九个
和第二十个核苷酸间键联中的至少四个是手性的。在一些实施方案中,第一个、第二个、第
三个、第五个、第七个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键联中的至少五个是手性
的。在一些实施方案中,第一个、第二个、第三个、第五个、第七个、第十八个、第十九个和第
二十个核苷酸间键联中的至少六个是手性的。在一些实施方案中,第一个、第二个、第三个、
第五个、第七个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键联中的至少七个是手性的。在
一些实施方案中,第一个、第二个、第三个、第五个、第七个、第十八个、第十九个和第二十个
核苷酸间键联中的一个是手性的。在一些实施方案中,第一个、第二个、第三个、第五个、第
七个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键联中的两个是手性的。在一些实施方案
中,第一个、第二个、第三个、第五个、第七个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键联
中的三个是手性的。在一些实施方案中,第一个、第二个、第三个、第五个、第七个、第十八
个、第十九个和第二十个核苷酸间键联中的四个是手性的。在一些实施方案中,第一个、第
二个、第三个、第五个、第七个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键联中的五个是手
性的。在一些实施方案中,第一个、第二个、第三个、第五个、第七个、第十八个、第十九个和
第二十个核苷酸间键联中的六个是手性的。在一些实施方案中,第一个、第二个、第三个、第
五个、第七个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键联中的七个是手性的。在一些实
施方案中,第一个、第二个、第三个、第五个、第七个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸
间键联中的八个是手性的。
键联中的至少一个是手性的,并且至少一个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,
提供的组合物的单一寡核苷酸包含这样的区域,其中第一个、第二个、第三个、第五个、第七
个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键联中的至少一个是手性的,并且至少一个核
苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,至少两个核苷酸间键联是非手性的。在一些实
施方案中,至少三个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,至少四个核苷酸间键联
是非手性的。在一些实施方案中,至少五个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,
至少六个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,至少七个核苷酸间键联是非手性
的。在一些实施方案中,至少八个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,至少九个
核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,至少10个核苷酸间键联是非手性的。在一些
实施方案中,至少11个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,至少12个核苷酸间键
联是非手性的。在一些实施方案中,至少13个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案
中,至少14个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,至少15个核苷酸间键联是非手
性的。在一些实施方案中,至少16个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,至少17
个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,至少18个核苷酸间键联是非手性的。在一
些实施方案中,至少19个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,至少20个核苷酸间
键联是非手性的。在一些实施方案中,一个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,
两个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,三个核苷酸间键联是非手性的。在一些
实施方案中,四个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,五个核苷酸间键联是非手
性的。在一些实施方案中,六个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,七个核苷酸
间键联是非手性的。在一些实施方案中,八个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案
中,九个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,10个核苷酸间键联是非手性的。在
一些实施方案中,11个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,12个核苷酸间键联是
非手性的。在一些实施方案中,13个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,14个核
苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,15个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方
案中,16个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,17个核苷酸间键联是非手性的。
在一些实施方案中,18个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,19个核苷酸间键联
是非手性的。在一些实施方案中,20个核苷酸间键联是非手性的。在一些实施方案中,提供
的组合物的单一寡核苷酸包含这样的区域,其中所有核苷酸间键联是非手性的,除了第一
个、第二个、第三个、第五个、第七个、第八个、第九个、第十八个、第十九个和第二十个核苷
酸间键联中的至少一个是手性的。
键联中的至少一个是手性的,并且至少一个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,提
供的组合物的单一寡核苷酸包含这样的区域,其中第一个、第二个、第三个、第五个、第七
个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键联中的至少一个是手性的,并且至少一个核
苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,至少两个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方
案中,至少三个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,至少四个核苷酸间键联是磷酸
酯。在一些实施方案中,至少五个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,至少六个核
苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,至少七个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方
案中,至少八个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,至少九个核苷酸间键联是磷酸
酯。在一些实施方案中,至少10个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,至少11个核
苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,至少12个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方
案中,至少13个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,至少14个核苷酸间键联是磷酸
酯。在一些实施方案中,至少15个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,至少16个核
苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,至少17个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方
案中,至少18个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,至少19个核苷酸间键联是磷酸
酯。在一些实施方案中,至少20个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,一个核苷酸
间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,两个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,三
个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,四个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方
案中,五个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,六个核苷酸间键联是磷酸酯。在一
些实施方案中,七个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,八个核苷酸间键联是磷酸
酯。在一些实施方案中,九个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,10个核苷酸间键
联是磷酸酯。在一些实施方案中,11个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,12个核
苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,13个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案
中,14个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,15个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些
实施方案中,16个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,17个核苷酸间键联是磷酸
酯。在一些实施方案中,18个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,19个核苷酸间键
联是磷酸酯。在一些实施方案中,20个核苷酸间键联是磷酸酯。在一些实施方案中,提供的
组合物的单一寡核苷酸包含这样的区域,其中所有核苷酸间键联是磷酸酯,除了第一个、第
二个、第三个、第五个、第七个、第八个、第九个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键
联中的至少一个是手性的。
键联中的至少一个是手性的,并且所述区域中全部核苷间键联中的至少10%是非手性的。
在一些实施方案中,提供的组合物的单一寡核苷酸包含这样的区域,其中第一个、第二个、
第三个、第五个、第七个、第十八个、第十九个和第二十个核苷酸间键联中的至少一个是手
性的,并且所述区域中全部核苷间键联中的至少10%是非手性的。在一些实施方案中,所述
区域中全部核苷间键联中的至少20%是非手性的。在一些实施方案中,所述区域中全部核
苷间键联中的至少30%是非手性的。在一些实施方案中,所述区域中全部核苷间键联中的
至少40%是非手性的。在一些实施方案中,所述区域中全部核苷间键联中的至少50%是非
手性的。在一些实施方案中,所述区域中全部核苷间键联中的至少60%是非手性的。在一些
实施方案中,所述区域中全部核苷间键联中的至少70%是非手性的。在一些实施方案中,所
述区域中全部核苷间键联中的至少80%是非手性的。在一些实施方案中,所述区域中全部
核苷间键联中的至少90%是非手性的。在一些实施方案中,所述区域中全部核苷间键联中
的至少50%是非手性的。在一些实施方案中,非手性核苷酸间键联是磷酸酯键联。在一些实
施方案中,每个非手性核苷酸间键联是磷酸酯键联。
施方案中,所述区域的第二个核苷酸间键联是Sp修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案中,
所述区域的第二个核苷酸间键联是Rp修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案中,所述区域
的第三个核苷酸间键联是Sp修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案中,所述区域的第三个
核苷酸间键联是Rp修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案中,所述区域的第五个核苷酸间
键联是Sp修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案中,所述区域的第五个核苷酸间键联是Rp
修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案中,所述区域的第七个核苷酸间键联是Sp修饰的核
苷酸间键联。在一些实施方案中,所述区域的第七个核苷酸间键联是Rp修饰的核苷酸间键
联。在一些实施方案中,所述区域的第八个核苷酸间键联是Sp修饰的核苷酸间键联。在一些
实施方案中,所述区域的第八个核苷酸间键联是Rp修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案
中,所述区域的第九个核苷酸间键联是Sp修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案中,所述区
域的第九个核苷酸间键联是Rp修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案中,所述区域的第十
八个核苷酸间键联是Sp修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案中,所述区域的第十八个核
苷酸间键联是Rp修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案中,所述区域的第十九个核苷酸间
键联是Sp修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案中,所述区域的第十九个核苷酸间键联是
Rp修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案中,所述区域的第二十个核苷酸间键联是Sp修饰
的核苷酸间键联。在一些实施方案中,所述区域的第二十个核苷酸间键联是Rp修饰的核苷
酸间键联。
少21个碱基的长度。在一些实施方案中,提供的组合物中的单一寡核苷酸具有21个碱基的
长度。
手性核苷酸间键联独立地具有式I的结构。在一些实施方案中,提供的组合物的单一寡核苷
酸中的每个手性核苷酸间键联是硫代磷酸酯。
引入多种修饰。常用的2’‑修饰包括但不限于2’‑OR ,其中R 不是氢。在一些实施方案中,修
饰时2’‑OR,其中R是任选地经取代的脂族。在一些实施方案中,修饰是2’‑OMe。在一些实施
方案中,修饰是2’‑O‑MOE。在一些实施方案中,本发明证明特定手性纯核苷酸间键联的引入
和/或定位可以提供稳定性改善,所述改善比得上或优于使用经修饰骨架键联、碱基和/或
糖实现的那些。在一些实施方案中,提供的组合物的提供的单一核苷酸在糖上没有修饰。在
一些实施方案中,提供的组合物的提供的单一核苷酸在糖的2’‑位置没有修饰(即,2’‑位置
的两个基团是‑H/‑H或‑H/‑OH)。在一些实施方案中,提供的组合物的提供的单一核苷酸不
具有任何2’‑MOE修饰。
联的选择和/或位置可用于设计用于与诸如siRNA的这样的蛋白质相互作用的寡核苷酸的
参数。
联是Sp构型。在一些实施方案中,提供的组合物的单一核苷酸中至少约35%的其核苷酸间
键联是Sp构型。在一些实施方案中,提供的组合物的单一核苷酸中至少约40%的其核苷酸
间键联是Sp构型。在一些实施方案中,提供的组合物的单一核苷酸中至少约45%的其核苷
酸间键联是Sp构型。在一些实施方案中,提供的组合物的单一核苷酸中至少约50%的其核
苷酸间键联是Sp构型。在一些实施方案中,提供的组合物的单一核苷酸中至少约55%的其
核苷酸间键联是Sp构型。在一些实施方案中,提供的组合物的单一核苷酸中至少约60%的
其核苷酸间键联是Sp构型。在一些实施方案中,提供的组合物的单一核苷酸中至少约65%
的其核苷酸间键联是Sp构型。在一些实施方案中,提供的组合物的单一核苷酸中至少约
70%的其核苷酸间键联是Sp构型。在一些实施方案中,提供的组合物的单一核苷酸中至少
约75%的其核苷酸间键联是Sp构型。在一些实施方案中,提供的组合物的单一核苷酸中至
少约80%的其核苷酸间键联是Sp构型。在一些实施方案中,提供的组合物的单一核苷酸中
至少约85%的其核苷酸间键联是Sp构型。在一些实施方案中,提供的组合物的单一核苷酸
中至少约90%的其核苷酸间键联是Sp构型。
ONT‑108 (Rp)‑AAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT PCSK9反义
ONT‑109 (Sp)‑AAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT PCSK9反义
ONT‑110 (Rp,Rp)‑asAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT PCSK9反义
ONT‑111 (Sp,Rp)‑asGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT PCSK9反义
ONT‑112 (Sp,Sp)‑asGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT PCSK9反义
ONT‑113 (Rp,Sp)‑asGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT PCSK9反义
[CSCSCSCSCSCRCRCSCSC],其中R是Rp硫代磷酸酯键联,S是Sp硫代磷酸酯键联。
GGARTSGRTSTRCSTCGA、GGARTRGSTSTRCRTCGA、GGASTSGRTRTSCSTCGA,其中R是Rp硫代磷酸酯键联,
m
S是Sp硫代磷酸酯键联,所有其他键联是PO,并且每个C是5‑甲基胞嘧啶修饰的核苷酸。
TkTkCkAGTCATGA CTkTCk Ck,其中每个带有下标“k”的核苷表示(S)‑cEt修饰,R是Rp硫代磷
m
酸酯键联,S是Sp硫代磷酸酯键联,每个 C是5‑甲基胞嘧啶修饰的核苷酸,并且所有核苷酸
间键联是具有选自以下的立体化学样式的硫代磷酸酯(PS):RSSSRSRRRS、RSSSSSSSSS、
SRRSRSSSSR、SRSRSSRSSR、RRRSSSRSSS、RRRSRSSRSR、RRSSSRSRSR、SRSSSRSSSS、SSRRSSRSRS、
SSSSSSRRSS、RRRSSRRRSR、RRRRSSSSRS、SRRSRRRRRR、RSSRSSRRRR、RSRRSRRSRR、RRSRSSRSRS、
SSRRRRRSRR、RSRRSRSSSR、RRSSRSRRRR、RRSRSRRSSS、RRSRSSSRRR、RSRRRRSRSR、SSRSSSRRRS、
RSSRSRSRSR、RSRSRSSRSS、RRRSSRRSRS、SRRSSRRSRS、RRRRSRSRRR、SSSSRRRRSR、RRRRRRRRRR
和SSSSSSSSSS。
TkTkCkAGTCATGA CTTkCk Ck,其中每个带有下标“k”的核苷表示(S)‑cEt修饰,R是Rp硫代磷
m
酸酯键联,S是Sp硫代磷酸酯键联,每个 C是5‑甲基胞嘧啶修饰的核苷酸,并且所有核苷酸
间键联还具有选自以下的立体化学样式的硫代磷酸酯(PS):RSSSRSRRRS、RSSSSSSSSS、
SRRSRSSSSR、SRSRSSRSSR、RRRSSSRSSS、RRRSRSSRSR、RRSSSRSRSR、SRSSSRSSSS、SSRRSSRSRS、
SSSSSSRRSS、RRRSSRRRSR、RRRRSSSSRS、SRRSRRRRRR、RSSRSSRRRR、RSRRSRRSRR、RRSRSSRSRS、
SSRRRRRSRR、RSRRSRSSSR、RRSSRSRRRR、RRSRSRRSSS、RRSRSSSRRR、RSRRRRSRSR、SSRSSSRRRS、
RSSRSRSRSR、RSRSRSSRSS、RRRSSRRSRS、SRRSSRRSRS、RRRRSRSRRR、SSSSRRRRSR、RRRRRRRRRR
和SSSSSSSSSS。
性(例如如用于特定应用和适应症中)的修饰形式。以下描述示例性此类修饰。
用于制备聚阴离子电荷降低的中性多核苷酸(NN)的组合物和方法。WO2008/008476(在本文
中是“TraversaIII”)描述SATE(Imbach型)磷酸酯前药的合成。Traversa I、II和III未教导
如由本发明所述的手性控制的寡核苷酸、其组合物以及制备和使用所述寡核苷酸和组合物
的方法。
发明所述的手性控制的寡核苷酸、其组合物以及制备和使用所述寡核苷酸和组合物的方
法。
导了用于通过使H‑膦酸酯单体偶联于固体承载的5’‑羟基寡核苷酸,并且进一步使所得H‑
膦酸二酯硫化成硫代磷酸三酯来固相合成磷酸三酯寡核苷酸的方法。WO2001/064702(在本
文中是“Avecia III”)的公开内容类似于Avecia II,并且进一步描述在不同固体支持物上
进行固相合成。Avecia I、II和III未教导如由本发明所述的手性控制的寡核苷酸、其组合
物以及制备和使用所述寡核苷酸和组合物的方法。
例如柱色谱法进行拆分获得的立体纯寡核苷酸。Chiron未教导如由本发明所述的手性控制
的寡核苷酸、其组合物以及制备和使用所述寡核苷酸和组合物的方法。
“Spring Bank II”)教导了磷酸三酯前药作为抗病毒核酸,并且教导了硫代磷酸酯前药的
合成。Spring Bank I和II未教导如由本发明所述的手性控制的寡核苷酸、其组合物以及制
备和使用所述寡核苷酸和组合物的方法。
性质。Hybridon未教导如由本发明所述的手性控制的寡核苷酸、其组合物以及制备和使用
所述寡核苷酸和组合物的方法。
合成后烷基化或含有前药基团的亚磷酰胺制备某些前药寡核苷酸。US 6,124,445(在本文
中是“Imbach II”)教导了经修饰反义和嵌合前药寡核苷酸。Imbach I和II未教导如由本发
明所述的手性控制的寡核苷酸、其组合物以及其制备和使用方法。
导如由本发明所述的手性控制的寡核苷酸、其组合物以及制备和使用所述寡核苷酸和组合
物的方法。
“Wada I”)。具体来说,WO2010/064146(在本文中称为“Wada II”)公开用于合成磷原子修饰
的核酸的方法,其中控制在磷处的立体化学构型。然而,Wada II的方法受限制,因为其不提
供以控制和设计方式对各手性键联磷进行单独P修饰。即,Wada II的用于P修饰的键联的方
法提供了产生缩合的中间聚H‑膦酸酯寡核苷酸链,其一旦被构建成所需长度,即在键联磷
处被大量修饰以提供例如所需硫代磷酸二酯、氨基磷酸酯或硼代磷酸酯或其他所述磷原子
修饰的核酸(在文献的第36页方案6中称为途径B)。此外,Wada II的H‑膦酸酯寡核苷酸链具
有较短长度(例如二聚体、三聚体或四聚体)。结合在途径B中不存在加帽步骤的事实(此通
常由于“n‑1”型副产物累积而呈现低粗纯度),Wada II途径关于合成较长寡核苷酸含有局
限性。尽管Wada II一般地涵盖特定寡核苷酸可被考虑来在各键联磷处含有不同修饰,但
Wada II未描述或表明如本文中所述的用于将所述修饰进行受控迭代性安置的方法。就
Wada II描述不需要在于键联磷处修饰之前完全装配H‑膦酸酯中间寡核苷酸的合成循环
(在其中称为途径A,第35页,方案5“通过途径A合成包含式1的手性X磷酸酯部分的核酸
(Synthesis of a nucleic acid comprising a chiral X‑phosphonate moiety of
Formula 1 via Route)A”)而言,这个一般性公开内容未教导如由本发明提供了的为安置
某些P修饰所需的某些关键步骤,并且尤其不具有任何程度的效率和通用性以使这个循环
将适用于合成手性控制的P修饰的寡核苷酸,并且尤其是长度较长的寡核苷酸。
剂,所述寡核苷酸一旦构建即可随后被修饰来尤其提供硫代磷酸酯等。Wada等在Wada III
中观察到Wada II中公开的四种类型的手性助剂在键联磷处与磷形成强键,并且因此不允
许高效移除。Wada III指示移除Wada II手性助剂需要严苛条件,所述条件倾向于损害产物
寡核苷酸的完整性。Wada III观察到这在合成长链寡核苷酸时尤其成问题,原因至少是随
着一个或更多个降解反应进行,产生可进一步与产物寡核苷酸反应并且使产物寡核苷酸降
解的其他副产物。因此,Wada III提供可在温和酸性条件下通过释放H‑膦酸酯核苷酸间键
联的SN1机制(途径B),或在相对温和碱性条件下通过β‑消除路径更高效地自寡核苷酸切割
的手性助剂。
条件必须设计成使(1)化学可与增长的寡核苷酸的每个部分相容;(2)在各单体添加期间产
生的副产物不损害增长的寡核苷酸的结构和立体化学完整性;以及(3)粗最终产物组合物
是允许分离所需手性控制的寡核苷酸产物的组合物。
Dev.(1993),3:383‑390)。在不考虑硫代磷酸酯的立体化学下制备的寡核苷酸硫代磷酸酯
n
以2非对映体的混合物形式存在,其中n是核苷酸间硫代磷酸酯键联的数目。这些非对映异
构硫代磷酸酯的化学和生物性质可不同。例如,Wada等(Nucleic Acids Symposium Series
第51期第119‑120页;doi:10.1093/nass/nrm060)发现立体确定的(Rp)‑(Ups)9U/(Ap)9A双
链体显示的Tm值高于天然(Up)9U/(Ap)9A,并且立体确定的(Sp)‑(Ups)9u不形成双链体。在
另一实例中,在由Tang等(Nucleosides Nucleotides(1995),14:985‑990)进行的研究中,
发现立体纯Rp‑寡脱氧核糖核苷硫代磷酸酯具有的对人血清内源性核酸酶的稳定性低于磷
手性未确定的母体寡脱氧核糖核苷硫代磷酸酯。
苷酸和手性控制的寡核苷酸组合物。在一些实施方案中,本发明提供了具有高非对映体纯
度的手性控制的寡核苷酸和手性控制的寡核苷酸组合物。
键联样式和所述共同骨架手性中心样式。
苷酸。在一些实施方案中,本发明提供了寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物,其中相对
于所述寡核苷酸的基本上外消旋的制备物,所述组合物富含单一寡核苷酸类型的寡核苷
酸,所述寡核苷酸共有以下:
行以提供增强的立体选择性。寡核苷酸的示例性的基本上外消旋制备物是通过用二硫化四
乙基秋兰姆或(TETD)或者3H‑1,2‑苯并二硫醇‑3‑酮1,1‑二氧化物(BDTD)对亚磷酸三酯进
行本领域周知的硫化过程的硫代磷酸酯寡核苷酸的制备物。在一些实施方案中,寡核苷酸
的基本上外消旋的制备物提供了基本上外消旋的寡核苷酸组合物(或手性未控制的寡核苷
酸组合物)。
备过程的杂质,在一些情况下,在某些纯化操作之后。
式I结构的非对映体纯核苷酸间键联的寡核苷酸。在一些实施方案中,本发明提供了包含一
个或更多个关于手性键联磷是非对映体纯的核苷酸间键联以及一个或更多个磷酸二酯键
联的寡核苷酸。在一些实施方案中,本发明提供了包含一个或更多个具有式I结构的非对映
体纯核苷酸间键联以及一个或更多个磷酸二酯键联的寡核苷酸。在一些实施方案中,本发
明提供了包含一个或更多个具有式I‑c结构的非对映体纯核苷酸间键联以及一个或更多个
磷酸二酯键联的寡核苷酸。在一些实施方案中,所述寡核苷酸是通过使用如本申请中所述
的立体选择性寡核苷酸合成来制备以形成预设计的关于手性键联磷是非对映体纯的核苷
酸间键联。例如,在一种示例性寡核苷酸(Rp/Sp,Rp/Sp,Rp/Sp,Rp,Rp,Sp,Sp,Sp,Sp,Sp Sp,
Sp,Sp,Sp,Rp,Rp,Rp,Rp,Rp)‑d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGs1Cs1As1CsC]中,前三
个核苷酸间键联是使用传统寡核苷酸合成方法构建,并且非对映体纯核苷酸间键联是在如
本申请中所述的立体化学控制下构建。以下进一步描述示例性核苷酸间键联,包括具有式I
结构的那些。
些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸内的至少两个
个体核苷酸间键联具有相对于彼此不同的P修饰。在某些实施方案中,本发明提供了一种手
性控制的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸内的至少两个个体核苷酸间键联具有相对于彼此不
同的P修饰,并且其中所述手性控制的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联。在某
些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸内的至少两个
个体核苷酸间键联具有相对于彼此不同的P修饰,并且其中所述手性控制的寡核苷酸包含
至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少一个硫代磷酸二酯核苷酸间键联。在某些实施方案
中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸内的至少两个个体核苷酸
间键联具有相对于彼此不同的P修饰,并且其中所述手性控制的寡核苷酸包含至少一个硫
代磷酸三酯核苷酸间键联。在某些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其
中所述寡核苷酸内的至少两个个体核苷酸间键联具有相对于彼此不同的P修饰,并且其中
所述手性控制的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少一个硫代磷酸三酯
核苷酸间键联。
体式I核苷酸间键联具有相对于彼此不同的P修饰。在一些实施方案中,本发明提供了一种
手性控制的寡核苷酸,其包含一个或更多个式I经修饰核苷酸间键联,并且其中所述寡核苷
1
酸内的个体式I核苷酸间键联具有相对于彼此不同的‑X‑L‑R 。在一些实施方案中,本发明
提供了一种手性控制的寡核苷酸,其包含一个或更多个式I经修饰核苷酸间键联,并且其中
所述寡核苷酸内的个体式I核苷酸间键联具有相对于彼此不同的X。在一些实施方案中,本
发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其包含一个或更多个式I经修饰核苷酸间键联,并且
1
其中所述寡核苷酸内的个体式I核苷酸间键联具有相对于彼此不同的‑L‑R。
些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸内的至少两个
个体核苷酸间键联具有相对于彼此不同的立体化学,并且其中所述手性控制的寡核苷酸的
至少一部分结构的特征在于具有交替立体化学的重复样式。
内的至少两个个体核苷酸间键联具有相对于彼此不同的P修饰,其中其在‑XLR部分中具有
1 1
不同X原子,和/或因其中其在‑XLR部分中具有不同L基团,和/或其中其在‑XLR 部分中具有
1
不同R原子。
所述寡核苷酸具有由下式表示的结构:
20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、
170、180、190和200的上限之间,其中所述上限大于所述下限。
中,至少两个偶数n彼此具有不同值;在一些实施方案中,至少两个奇数n彼此具有不同值。
包含具有相等长度的S和R立体化学键联的重复嵌段。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸
包含S和R立体化学键联的重复嵌段,其中至少两个所述嵌段具有彼此不同的长度;在一些
所述实施方案中,各S立体化学嵌段具有相同长度,并且具有不同于各R立体化学长度的长
度,所述各R立体化学长度可任选地是彼此相同的长度。
键联嵌段分隔,所述分隔嵌段与具有第一立体化学的嵌段可具有相同长度或不同长度。
方案中,末端嵌段是由具有另一键联立体化学的中间嵌段彼此分隔。
段聚体。在一些实施方案中,提供的式[Sn1R n2Sn3Rn4…SnxR ny]寡核苷酸是立体跳跃
B B B B B B
聚体。在一些实施方案中,提供的式[Sn1R n2Sn3Rn4…SnxR ny]寡核苷酸是立体交替聚
B B B B B B
体。在一些实施方案中,提供的式[Sn1Rn2Sn3Rn4…SnxRny]寡核苷酸是间隔聚体。
述样式,并且还包含P修饰样式。例如,在一些实施方案中,提供的式[S n1R n2Sn3R n4…
B B
S nxR ny]寡核苷酸是立体跳跃聚体和P修饰跳跃聚体。在一些实施方案中,提供的式
B B B B B B
[Sn1R n2S n3Rn4…SnxR ny]寡核苷酸是立体嵌段聚体和P修饰交替聚体。在一些实施方
B B B B B B
案中,提供的式[Sn1Rn2Sn3Rn4…SnxRny]寡核苷酸是立体交替聚体和P修饰嵌段聚体。
C‑、‑C(R')2‑、‑Cy‑、‑O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N(R')‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR')‑、‑C(O)N(R')‑、‑N
(R')C(O)N(R')‑、‑N(R')C(O)‑、‑N(R')C(O)O‑、‑OC(O)N(R')‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2N
(R')‑、‑N(R')S(O)2‑、‑SC(O)‑、‑C(O)S‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑;
O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N(R')‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR')‑、‑C(O)N(R')‑、‑N(R')C(O)N(R')‑、‑N
(R')C(O)‑、‑N(R')C(O)O‑、‑OC(O)N(R')‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2N(R')‑、‑N(R')S(O)2‑、‑
SC(O)‑、‑C(O)S‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑;
一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸包含硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中,手性控
制的寡核苷酸包含至少两个硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸
包含至少三个硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸包含至少四个
硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸包含至少五个硫代磷酸三酯
键联。本文中进一步描述了示例性所述经修饰核苷酸间磷键联。
酸间键联。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联
和至少一个硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸包含至少一个磷
酸二酯核苷酸间键联和至少两个硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中,手性控制的寡核
苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少三个硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案
中,手性控制的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少四个硫代磷酸三酯键
联。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少
五个硫代磷酸三酯键联。本文进一步描述了示例性所述经修饰核苷酸间磷键联。
维持硫代磷酸三酯键联直至向对象施用,和/或在向对象施用期间有意维持硫代磷酸三酯
键联。
一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少两个连续的硫代磷酸三酯核苷酸间键联。
体。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸是键联嵌段聚体。
体。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸是键联交替聚体。
些实施方案中,手性控制的寡核苷酸是键联单聚体。
C‑、‑C(R')2‑、‑Cy‑、‑O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N(R')‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR')‑、‑C(O)N(R')‑、‑N
(R')C(O)N(R')‑、‑N(R')C(O)‑、‑N(R')C(O)O‑、‑OC(O)N(R')‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2N
(R')‑、‑N(R')S(O)2‑、‑SC(O)‑、‑C(O)S‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑;
O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N(R')‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR')‑、‑C(O)N(R')‑、‑N(R')C(O)N(R')‑、‑N
(R')C(O)‑、‑N(R')C(O)O‑、‑OC(O)N(R')‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2N(R')‑、‑N(R')S(O)2‑、‑
SC(O)‑、‑C(O)S‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑;
案中,P 是Rp。在另一些实施方案中,P 是Sp。在一些实施方案中,寡核苷酸包含一个或更多
*
个式I核苷酸间键联,其中各P 独立地是Rp或Sp。在一些实施方案中,寡核苷酸包含一个或
*
更多个式I核苷酸间键联,其中各P 是Rp。在一些实施方案中,寡核苷酸包含一个或更多个
*
式I核苷酸间键联,其中各P 是Sp。在一些实施方案中,寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间
* *
键联,其中P 是Rp。在一些实施方案中,寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联,其中P 是
*
Sp。在一些实施方案中,寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联,其中P 是Rp,以及至少一
*
个式I核苷酸间键联,其中P 是Sp。
核苷酸间键联,其中W是O。在一些实施方案中,寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联,其
中W是S。在一些实施方案中,寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联,其中W是Se。
方案中,R是任选地经取代的直链或支链戊基。在一些实施方案中,R是任选地经取代的直链
或支链丁基。在一些实施方案中,R是任选地经取代的直链或支链丙基。在一些实施方案中,
R是任选地经取代的乙基。在一些实施方案中,R是任选地经取代的甲基。
中,R是任选地经取代的环庚基。在一些实施方案中,R是任选地经取代的环己基。在一些实
施方案中,R是任选地经取代的环戊基。在一些实施方案中,R是任选地经取代的环丁基。在
一些实施方案中,R是任选地经取代的环丙基。在一些实施方案中,R是任选地经取代的双环
碳环基。
中,R是具有1‑3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的经取代的5‑6元单环杂芳基环。在一些
实施方案中,R是具有1‑3个独立地选自氮、硫或氧的杂原子的未取代的5‑6元单环杂芳基
环。
的任选地经取代的6元单环杂芳基环。
地经取代的5元杂芳基环。示例性R基团包括任选地经取代的吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻
唑基、 唑基或异 唑基。
子的任选地经取代的6元杂芳基环。在某些实施方案中,R是具有1个氮的任选地经取代的6
元杂芳基环。示例性R基团包括任选地经取代的吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基或
四嗪基。
子的任选地经取代的5,6‑稠合杂芳基环。在另一些实施方案中,R是具有1‑2个独立地选自
氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5,6‑稠合杂芳基环。在某些实施方案中,R是具有1个
独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5,6‑稠合杂芳基环。在一些实施方案中,
R是任选地经取代的吲哚基。在一些实施方案中,R是任选地经取代的氮杂双环[3.2.1]辛烷
基。在某些实施方案中,R是具有2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5,6‑
稠合杂芳基环。在一些实施方案中,R是任选地经取代的氮杂吲哚基。在一些实施方案中,R
是任选地经取代的苯并咪唑基。在一些实施方案中,R是任选地经取代的苯并噻唑基。在一
些实施方案中,R是任选地经取代的苯并 唑基。在一些实施方案中,R是任选地经取代的吲
唑基。在某些实施方案中,R是具有3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5,
6‑稠合杂芳基环。
的任选地经取代的6,6‑稠合杂芳基环。在另一些实施方案中,R是具有1个独立地选自氮、氧
或硫的杂原子的任选地经取代的6,6‑稠合杂芳基环。在一些实施方案中,R是任选地经取代
的喹啉基。在一些实施方案中,R是任选地经取代的异喹啉基。根据一个方面,R是具有2个独
立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的6,6‑稠合杂芳基环。在一些实施方案中,R
是喹唑啉或喹喔啉。
实施方案中,R是具有1‑2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的经取代的3‑7元饱和或部分不
饱和杂环。在一些实施方案中,R是具有1‑2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的3‑
7元饱和或部分不饱和杂环。
施方案中,R是具有2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的6元部分不饱和杂
环。在一些实施方案中,R是具有2个氧原子的任选地经取代的6元部分不饱和杂环。
喃基、氧杂环庚烷基、氮丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、氮杂环庚烷基、硫杂环丙
烷基、硫杂环丁烷基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、硫杂环庚烷基、二氧杂戊环烷基、氧硫杂环
戊烷基、 唑烷基、咪唑烷基、噻唑烷基、二硫杂环戊烷基、二 烷基、吗啉基、氧硫杂环己
烷基、哌嗪基、硫代吗啉基、二硫杂环己基、二氧杂环庚烷基、氧杂氮杂环庚烷基、氧硫杂环
庚烷基、二硫杂环庚烷基、二氮杂环庚烷基、二氢呋喃酮基、四氢吡喃酮基、氧杂环庚酮基、
吡咯烷酮基、哌啶酮基、氮杂环庚酮基、二氢噻吩酮基、四氢噻喃酮基、硫杂环庚烷酮基、
唑啶酮基、 嗪烷酮基、氧杂氮杂环庚烷酮基、二氧杂戊环烷酮基、二 烷酮基、二氧杂环
庚烷酮基、氧硫杂啉酮基、氧硫杂环己烷酮基、氧硫杂环庚烷酮基、噻唑烷酮基、噻嗪烷酮
基、硫杂氮杂环庚烷酮基、咪唑烷酮基、四氢嘧啶酮基、二氮杂环庚烷酮基、咪唑烷二酮基、
唑烷二酮基、噻唑烷二酮基、二氧环戊烷二酮基、氧杂硫杂环戊烷二酮基、哌嗪二酮基、
吗啉二酮基、硫代吗啉二酮基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、吗啉基、硫代吗啉基、哌啶基、哌嗪
基、吡咯烷基、四氢噻吩基或四氢噻喃基。在一些实施方案中,R是具有1‑2个独立地选自氮、
氧或硫的杂原子的任选地经取代的5元饱和或部分不饱和杂环。
基、二氢 唑基或 唑啉基。
基。在一些实施方案中,R是任选地经取代的异二氢吲哚基。在一些实施方案中,R是任选地
经取代的1,2,3,4‑四氢喹啉。在一些实施方案中,R是任选地经取代的1,2,3,4‑四氢异喹
啉。
R如上所定义并如本文中所述。
代的芳基、碳环、杂环或杂芳基环。
案中,‑Cy‑是任选地经取代的亚杂芳基。在一些实施方案中,‑Cy‑是任选地经取代的亚杂环
基。
中L和R各自独立地如上所定义和如下所述。
些实施方案中,寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联,其中X是‑S‑。在一些实施方案中,
寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联,其中X是‑O‑,以及至少一个式I核苷酸间键联,其
中X是‑S‑。在一些实施方案中,寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联,其中X是‑O‑,以及
至少一个式I核苷酸间键联,其中X是‑S‑,以及至少一个式I核苷酸间键联,其中L是任选地
经取代的直链或支链C1‑C10亚烷基,其中L的一个或更多个亚甲基单元任选地并独立地被以
下替换:任选地经取代的C1‑C6亚烷基、C1‑C6亚烯基、‑C≡C‑、‑C(R')2‑、‑Cy‑、‑O‑、‑S‑、‑S‑
S‑、‑N(R')‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR')‑、‑C(O)N(R')‑、‑N(R')C(O)N(R')‑、‑N(R')C(O)‑、‑N
(R')C(O)O‑、‑OC(O)N(R')‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2N(R')‑、‑N(R')S(O)2‑、‑SC(O)‑、‑C(O)
S‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑。
立地被以下替换:任选地经取代的C1‑C6亚烷基、C1‑C6亚烯基、‑C≡C‑、‑C(R')2‑、‑Cy‑、‑O‑、‑
S‑、‑S‑S‑、‑N(R')‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR')‑、‑C(O)N(R')‑、‑N(R')C(O)N(R')‑、‑N(R')C
(O)‑、‑N(R')C(O)O‑、‑OC(O)N(R')‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2N(R')‑、‑N(R')S(O)2‑、‑SC
(O)‑、‑C(O)S‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑。在一些实施方案中,X是任选地经取代的C1‑C10亚烷基或
C1‑C10亚烯基。在一些实施方案中,X是亚甲基。
立地被以下替换:任选地经取代的C1‑C6亚烷基、C1‑C6亚烯基、‑C≡C‑、‑C(R')2‑、‑Cy‑、‑O‑、‑
S‑、‑S‑S‑、‑N(R')‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR')‑、‑C(O)N(R')‑、‑N(R')C(O)N(R')‑、‑N(R')C
(O)‑、‑N(R')C(O)O‑、‑OC(O)N(R')‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2N(R')‑、‑N(R')S(O)2‑、‑SC
(O)‑、‑C(O)S‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑。在一些实施方案中,Y是任选地经取代的C1‑C10亚烷基或
C1‑C10亚烯基。在一些实施方案中,Y是亚甲基。
立地被以下替换:任选地经取代的C1‑C6亚烷基、C1‑C6亚烯基、‑C≡C‑、‑C(R')2‑、‑Cy‑、‑O‑、‑
S‑、‑S‑S‑、‑N(R')‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR')‑、‑C(O)N(R')‑、‑N(R')C(O)N(R')‑、‑N(R')C
(O)‑、‑N(R')C(O)O‑、‑OC(O)N(R')‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2N(R')‑、‑N(R')S(O)2‑、‑SC
(O)‑、‑C(O)S‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑。在一些实施方案中,Z是任选地经取代的C1‑C10亚烷基或
C1‑C10亚烯基。在一些实施方案中,Z是亚甲基。
亚烷基、C1‑C6亚烯基、‑C≡C‑、‑C(R')2‑、‑Cy‑、‑O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N(R')‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C
(NR')‑、‑C(O)N(R')‑、‑N(R')C(O)N(R')‑、‑N(R')C(O)‑、‑N(R')C(O)O‑、‑OC(O)N(R')‑、‑S
(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2N(R')‑、‑N(R')S(O)2‑、‑SC(O)‑、‑C(O)S‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑。
取代的C1‑C6亚烷基、C1‑C6亚烯基、‑C≡C‑、‑C(R')2‑、‑Cy‑、‑O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N(R')‑、‑C
(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR')‑、‑C(O)N(R')‑、‑N(R')C(O)N(R')‑、‑N(R')C(O)‑、‑N(R')C(O)O‑、‑
OC(O)N(R')‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2N(R')‑、‑N(R')S(O)2‑、‑SC(O)‑、‑C(O)S‑、‑OC(O)‑
或‑C(O)O‑。
芳基;
基、亚杂芳基或亚杂环基。在一些实施方案中,L 是任选地经取代的 在一些实施方
1
案中,L是
并且硫
1
原子连接于V。在一些实施方案中,L 是选自以下的任选地经取代的基团:
并且碳原子连接于X。
E是‑O‑、‑S‑或‑NH‑。在一些实施方案中,E是‑O‑。在一些实施方案中,E是‑S‑。在一些实施方
案中,E是‑NH‑。
些实施方案中,G是‑S‑。在一些实施方案中,G是‑NH‑。
并且
案中,L是‑L‑O‑,其中L 如上所定义并如本文中所述。在一些实施方案中,L是‑L‑N(R’)‑,
3 3
其中L 和R’各自独立地如上所定义和如本文中所述。在一些实施方案中,L是‑L ‑NH‑,其中
3
L和R’各自独立地如上所定义和如本文中所述。
(O)‑、‑S(O)2‑或 并且R’和环Cy’各自独立地如上所定义和如本文中所述。在一些
3 3
实施方案中,L是任选地经取代的C5亚烷基。在一些实施方案中,‑L‑G‑是
(O)‑、‑S(O)2‑或 并且R’和Cy’各自独立地如上所定义和如本文中所述。
3
(O)‑、‑S(O)2‑或 并且R’和Cy’各自独立地如上所定义和如本文中所述。
3
(O)‑、‑S(O)2‑或 并且R’和Cy’各自独立地如上所定义和如本文中所述。
3
所定义并如本文中所述。在一些实施方案中,L是‑L ‑G‑,其中L是任选地经取代的C1‑C2亚
1 4 4
烷基;G如上所定义和如本文中所述;并且G连接于R。在一些实施方案中,L是‑L‑G‑,其中L
1
是任选地经取代的亚甲基;G如上所定义和如本文中所述;并且G连接于R 。在一些实施方案
4 4 1
中,L是‑L‑G‑,其中L 是亚甲基;G如上所定义和如本文中所述;并且G连接于R。在一些实施
4 4
方案中,L是‑L ‑G‑,其中L是任选地经取代的‑(CH2)2‑;G如上所定义和如本文中所述;并且
1 4 4
G连接于R。在一些实施方案中,L是‑L‑G‑,其中L是‑(CH2)2‑;G如上所定义和如本文中所
1
述;并且G连接于R。
述,并且G连接于R。在一些实施方案中,L是 其中G如上所定义和如本文中所述,并
1
且G连接于R。在一些实施方案中,L是 其中G如上所定义和如本文中所述,并且G
1 1
连接于R。在一些实施方案中,L是 其中硫原子连接于R。在一些实施
1
方案中,L是 其中氧原子连接于R。
代的C1‑C6亚烷基、C1‑C6亚烯基、‑c≡c‑、‑C(R′)2‑、‑Cy‑、‑O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N(R′)‑、‑C(O)‑、‑
C(S)‑、‑C(NR′)‑、‑C(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)‑、‑N(R′)C(O)O‑、‑OC(O)N
(R′)‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2N(R′)‑、‑N(R′)S(O)2‑、‑SC(O)‑、‑C(O)S‑、‑OC(O)‑或‑C(O)
L3
O‑,其中R’和‑Cy‑各自独立地如上所定义和如本文中所述。在一些实施方案中,L是‑S‑R ‑
L3 L3 L3
或‑S‑C(O)‑R ‑,其中R 是任选地经取代的C1‑C6亚烷基。在一些实施方案中,L是‑S‑R ‑或‑
L3 L3 L3
S‑C(O)‑R ‑,其中R 是任选地经取代的C1‑C6亚烯基。在一些实施方案中,L是‑S‑R ‑或‑S‑C
L3 L3
(O)‑R ‑,其中R 是任选地经取代的C1‑C6亚烷基,其中一个或更多个亚甲基单元任选地并
独立地被以下替换:任选地经取代的C1‑C6亚烯基、亚芳基或亚杂芳基。在一些实施方案中,
3
在一些实施方案中,RL是任选地经取代的‑S‑(C1‑C6亚烯基)‑、‑S‑(C1‑C6亚烷基)‑、‑S‑(C1‑
C6亚烷基)‑亚芳基‑(C1‑C6亚烷基)‑、‑S‑CO‑亚芳基‑(C1‑C6亚烷基)‑或‑S‑CO‑(C1‑C6亚烷
基)‑亚芳基‑(C1‑C6亚烷基)‑。
些实施方案中,以上以及本文中所述的L实施方案中的硫原子连接于R。
烯基、‑c≡c‑、‑C(R′)2‑、‑Cy‑、‑O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N(R′)‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR′)‑、‑C(O)N
(R′)‑、‑N(R′)C(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)‑、‑N(R′)C(O)O‑、‑OC(O)N(R′)‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑
S(O)2N(R′)‑、‑N(R′)S(O)2‑、‑SC(O)‑、‑C(O)S‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑,其中各变量独立地如上
1
所定义和如本文中所述。在一些实施方案中,R是卤素、R或任选地经取代的C1‑C10脂族,其
中一个或更多个亚甲基单元任选地并独立地被以下替换:任选地经取代的C1‑C6亚烷基、C1‑
C6亚烯基、‑c≡c‑、‑C(R′)2‑、‑Cy‑、‑O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N(R′)‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR′)‑、‑C
(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)‑、‑N(R′)C(O)O‑、‑OC(O)N(R′)‑、‑S(O)‑、‑S
(O)2‑、‑S(O)2N(R′)‑、‑N(R′)S(O)2‑、‑SC(O)‑、‑C(O)S‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑,其中各变量独
立地如上所定义和如本文中所述。
是‑F。在一些实施方案中,R是‑Cl。在一些实施方案中,R是‑Br。在一些实施方案中,R是‑
I。
地经取代的C1‑C10脂族。在一些实施方案中,R 是任选地经取代的C1‑C6脂族。在一些实施方
1 1
案中,R是任选地经取代的C1‑C6烷基。在一些实施方案中,R是任选地经取代的直链或支链
1 1
己基。在一些实施方案中,R是任选地经取代的直链或支链戊基。在一些实施方案中,R 是任
1
选地经取代的直链或支链丁基。在一些实施方案中,R 是任选地经取代的直链或支链丙基。
1 1
在一些实施方案中,R 是任选地经取代的乙基。在一些实施方案中,R是任选地经取代的甲
基。
基。在一些实施方案中,R是苯基。
经取代的C3‑C10碳环基。在一些实施方案中,R 是任选地经取代的单环碳环基。在一些实施
1 1
方案中,R是任选地经取代的环庚基。在一些实施方案中,R是任选地经取代的环己基。在一
1 1
些实施方案中,R是任选地经取代的环戊基。在一些实施方案中,R是任选地经取代的环丁
1 1
基。在一些实施方案中,R是任选地经取代的环丙基。在一些实施方案中,R是任选地经取代
的双环碳环基。
选地经取代的C1‑C6亚烷基、C1‑C6亚烯基、‑c≡c‑、‑C(R′)2‑、‑Cy‑、‑O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N
(R′)‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR′)‑、‑C(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)‑、‑N(R′)C
(O)O‑、‑OC(O)N(R′)‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2N(R′)‑、‑N(R′)S(O)2‑、‑SC(O)‑、‑C(O)S‑、‑
1
OC(O)‑或‑C(O)O‑,其中各变量独立地如上所定义和如本文中所述。在一些实施方案中,R
1
是任选地经取代的 在一些实施方案中,R是
1
在一 些 实 施方 案中 ,R 是 任选 地 经取 代的
经取代的C1‑C50脂族。在一些实施方案中,R是包含一个或更多个任选地经取代的多环烃部
分的任选地经取代的C1‑C50脂族,其中一个或更多个亚甲基单元任选地并独立地被以下替
换:任选地经取代的C1‑C6亚烷基、C1‑C6亚烯基、‑c≡c‑、‑C(R′)2‑、‑Cy‑、‑O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N
(R′)‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR′)‑、‑C(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)‑、‑N(R′)C
(O)O‑、‑OC(O)N(R′)‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2N(R′)‑、‑N(R′)S(O)2‑、‑SC(O)‑、‑C(O)S‑、‑
1
OC(O)‑或‑C(O)O‑,其中各变量独立地如上所定义和如本文中所述。在一些实施方案中,R
是包含一个或更多个任选地经取代的
的任选地经取代的C1‑C50脂族。在一些实施方
1 1
案中,R是 在一些实施方案中,R是
1
在一些实施方案中,R是
在一些实施方案
1 1
中,R 是 在一些实施方案中,R 是
1
中,R是具有1‑3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的经取代的5‑6元单环杂芳基环。在一些
1
实施方案中,R 是具有1‑3个独立地选自氮、硫或氧的杂原子的未取代的5‑6元单环杂芳基
环。
代的5元单环杂芳基环。在一些实施方案中,R是具有1‑3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子
的任选地经取代的6元单环杂芳基环。
单环杂芳基环。在一些实施方案中,R选自吡咯基、呋喃基或噻吩基。
的5元杂芳基环。在某些实施方案中,R 是具有1个氮原子和选自硫或氧的另一杂原子的任
1
选地经取代的5元杂芳基环。示例性R基团包括任选地经取代的吡唑基、咪唑基、噻唑基、异
噻唑基、 唑基或异 唑基。
R是具有1‑2个氮原子的任选地经取代的6元杂芳基环。在一些实施方案中,R 是具有2个氮
1
原子的任选地经取代的6元杂芳基环。在某些实施方案中,R是具有1个氮的任选地经取代
1
的6元杂芳基环。示例性R基团包括任选地经取代的吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪
基或四嗪基。
代的8‑10元双环杂芳基环。在一些实施方案中,R 是具有1‑4个独立地选自氮、氧或硫的杂
1
原子的任选地经取代的5,6‑稠合杂芳基环。在另一些实施方案中,R是具有1‑2个独立地选
1
自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5,6‑稠合杂芳基环。在某些实施方案中,R是具有
1个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5,6‑稠合杂芳基环。在一些实施方案
1 1
中,R是任选地经取代的吲哚基。在一些实施方案中,R是任选地经取代的氮杂双环[3.2.1]
1
辛烷基。在某些实施方案中,R 是具有2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代
1
的5,6‑稠合杂芳基环。在一些实施方案中,R是任选地经取代的氮杂吲哚基。在一些实施方
1 1
案中,R 是任选地经取代的苯并咪唑基。在一些实施方案中,R 是任选地经取代的苯并噻唑
1 1
基。在一些实施方案中,R 是任选地经取代的苯并 唑基。在一些实施方案中,R 是任选地
1
经取代的吲唑基。在某些实施方案中,R 是具有3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选
地经取代的5,6‑稠合杂芳基环。
代的6,6‑稠合杂芳基环。在一些实施方案中,R 是具有1‑2个独立地选自氮、氧或硫的杂原
1
子的任选地经取代的6,6‑稠合杂芳基环。在另一些实施方案中,R 是具有1个独立地选自
1
氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的6,6‑稠合杂芳基环。在一些实施方案中,R是任选地
1 1
经取代的喹啉基。在一些实施方案中,R是任选地经取代的异喹啉基。根据一个方面,R 是具
有2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的6,6‑稠合杂芳基环。在一些实施方
1
案中,R是喹唑啉或喹喔啉。
1
实施方案中,R 是具有1‑2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的经取代的3‑7元饱和或部分
1
不饱和杂环。在一些实施方案中,R是具有1‑2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代
的3‑7元饱和或部分不饱和杂环。
1
施方案中,R 是具有2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的6元部分不饱和
1
杂环。在一些实施方案中,R是具有2个氧原子的任选地经取代的6元部分不饱和杂环。
或部分不饱和杂环。在某些实施方案中,R是环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢
吡喃基、氧杂环庚烷基、氮丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、氮杂环庚烷基、硫杂环
丙烷基、硫杂环丁烷基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、硫杂环庚烷基、二氧杂戊环烷基、氧硫杂
环戊烷基、 唑烷基、咪唑烷基、噻唑烷基、二硫杂环戊烷基、二 烷基、吗啉基、氧硫杂环
己烷基、哌嗪基、硫代吗啉基、二硫杂环己基、二氧杂环庚烷基、氧杂氮杂环庚烷基、氧硫杂
环庚烷基、二硫杂环庚烷基、二氮杂环庚烷基、二氢呋喃酮基、四氢吡喃酮基、氧杂环庚酮
基、吡咯烷酮基、哌啶酮基、氮杂环庚酮基、二氢噻吩酮基、四氢噻喃酮基、硫杂环庚烷酮基、
唑啶酮基、 嗪烷酮基、氧杂氮杂环庚烷酮基、二氧杂戊环烷酮基、二 烷酮基、二氧杂
环庚烷酮基、氧硫杂啉酮基、氧硫杂环己烷酮基、氧硫杂环庚烷酮基、噻唑烷酮基、噻嗪烷酮
基、硫杂氮杂环庚烷酮基、咪唑烷酮基、四氢嘧啶酮基、二氮杂环庚烷酮基、咪唑烷二酮基、
唑烷二酮基、噻唑烷二酮基、二氧环戊烷二酮基、氧杂硫杂环戊烷二酮基、哌嗪二酮基、
吗啉二酮基、硫代吗啉二酮基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、吗啉基、硫代吗啉基、哌啶基、哌嗪
1
基、吡咯烷基、四氢噻吩基或四氢噻喃基。在一些实施方案中,R 是具有1‑2个独立地选自
氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5元饱和或部分不饱和杂环。
代的5‑6元部分不饱和单环。在某些实施方案中,R是任选地经取代的四氢吡啶基、二氢噻
唑基、二氢 唑基或 唑啉基。
代的8‑10元双环饱和或部分不饱和杂环。在一些实施方案中,R 是任选地经取代的二氢吲
1 1
哚基。在一些实施方案中,R是任选地经取代的异二氢吲哚基。在一些实施方案中,R 是任选
1
地经取代的1,2,3,4‑四氢喹啉。在一些实施方案中,R是任选地经取代的1,2,3,4‑四氢异
喹啉。
(R′)2‑、‑Cy‑、‑O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N(R′)‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR′)‑、‑C(O)N(R′)‑、‑N(R′)C
(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)‑、‑N(R′)C(O)O‑、‑OC(O)N(R′)‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2N(R′)‑、‑N
(R′)S(O)2‑、‑SC(O)‑、‑C(O)S‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑,其中各变量独立地如上所定义和如本
1
文中所述。在一些实施方案中,R 是任选地经取代的C1‑C10脂族,其中一个或更多个亚甲基
单元任选地并独立地被以下替换:任选地‑Cy‑、‑O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N(R′)‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑
C(NR′)‑、‑C(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)‑、‑N(R′)C(O)O‑、‑OC(O)N(R′)‑、‑S
(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2N(R′)‑、‑N(R′)S(O)2‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑,其中各R’独立地如上所定
1
义和如本文中所述。在一些实施方案中,R 是任选地经取代的C1‑C10脂族,其中一个或更多
个亚甲基单元任选地并独立地被以下替换:任选地‑Cy‑、‑O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N(R′)‑、‑C
(O)‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑,其中各R’独立地如上所定义和如本文中所述。
述示例性所述R基团:
示例性所述R基团:
基、‑c≡c‑、‑C(R’)2‑、‑Cy‑、‑O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N(R′)‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR′)‑、‑C(O)N
(R′)‑、‑N(R′)C(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)‑、‑N(R′)C(O)O‑、‑OC(O)N(R′)‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑
S(O)2N(R′)‑、‑N(R′)S(O)2‑、‑SC(O)‑、‑C(O)S‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑,并且R’和‑Cy‑各自独立
1 L2
地如上所定义和如本文中所述。在一些实施方案中,R是‑S‑R ,其中硫原子与L基团中的硫
原子连接。
烯基、‑c≡c‑、‑C(R’)2‑、‑Cy‑、‑O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N(R′)‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR′)‑、‑C(O)N
(R′)‑、‑N(R′)C(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)‑、‑N(R′)C(O)O‑、‑OC(O)N(R′)‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑
S(O)2N(R′)‑、‑N(R′)S(O)2‑、‑SC(O)‑、‑C(O)S‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑,并且R’和‑Cy‑各自独立
1 L2
地如上所定义和如本文中所述。在一些实施方案中,R是‑C(O)‑R ,其中羰基与L基团中的G
1 L2
连接。在一些实施方案中,R是‑C(O)‑R ,其中羰基与L基团中的硫原子连接。
选地经取代的C1‑C9烷基。在一些实施方案中,R 是任选地经取代的C1‑C9烯基。在一些实施
L2 L2
方案中,R 是任选地经取代的C1‑C9炔基。在一些实施方案中,R 是任选地经取代的C1‑C9脂
族,其中一个或更多个亚甲基单元任选地并独立地被以下替换:‑Cy‑或‑C(O)‑。在一些实施
L2
方案中,R 是任选地经取代的C1‑C9脂族,其中一个或更多个亚甲基单元任选地并独立地被
L2
以下替换:‑Cy‑。在一些实施方案中,R 是任选地经取代的C1‑C9脂族,其中一个或更多个亚
L2
甲基单元任选地并独立地被以下替换:任选地经取代的亚杂环基。在一些实施方案中,R 是
任选地经取代的C1‑C9脂族,其中一个或更多个亚甲基单元任选地并独立地被以下替换:任
L2
选地经取代的亚芳基。在一些实施方案中,R 是任选地经取代的C1‑C9脂族,其中一个或更
多个亚甲基单元任选地并独立地被以下替换:任选地经取代的亚杂芳基。在一些实施方案
L2
中,R 是任选地经取代的C1‑C9脂族,其中一个或更多个亚甲基单元任选地并独立地被以下
L2
替换:任选地经取代的C3‑C10亚碳环基。在一些实施方案中,R 是任选地经取代的C1‑C9脂
族,其中两个亚甲基单元任选地并独立地被以下替换:‑Cy‑或‑C(O)‑。在一些实施方案中,
L2
R 是任选地经取代的C1‑C9脂族,其中两个亚甲基单元任选地并独立地被以下替换:‑Cy‑
L2
或‑C(O)‑。以下描述示例性R 基团:
1
环基。在一些实施方案中,R是
或‑S ‑
1
(C1‑C10脂族) 。在一些实施方案中 ,R 是
1
1
文中所述的R实施方案中的‑C(O)‑部分与以上以及本文中所述的L实施方案中的硫原子、
G、E或‑C(O)‑部分连接。
1
其中R 是任选地经取代的C1‑C9脂族,其中一个或更多个亚甲基单元任
选地并独立地被以下替换:任选地经取代的C1‑C6亚烷基、C1‑C6亚烯基、‑c≡c‑、‑C(R’)2‑、‑
Cy‑、‑O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N(R′)‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR′)‑、‑C(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)N
(R′)‑、‑N(R′)C(O)‑、‑N(R′)C(O)O‑、‑OC(O)N(R′)‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2N(R′)‑、‑N(R′)
S(O)2‑、‑SC(O)‑、‑C(O)S‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑,并且各G独立地如上所定义和如本文中所
述。
中所述。在一些实施方案中,‑L‑R是‑R ‑C(O)‑S‑S‑R ,其中各变量独立地如上所定义和如
本文中所述。
在一些实施方案中,‑L‑R是
些实施方案中,‑L‑R包含连接于X的末端‑(CH2)2‑部分。以下描述示例性所述‑L‑R部分:
些实施方案中,‑L‑R包含连接于X的末端‑(CH2)‑部分。以下描述示例性所述‑L‑R部分:
1
1
(C1‑C10脂族)。
族)。
族)。
地被取代。在一些实施方案中,‑X‑L‑R 是 在一些实施方案中,‑X‑L‑R
1
是 在一些实施方案中,‑X‑L‑R是 在一些实施方案
1
中,‑X‑L‑R 具有结构 其中X’是O或S,Y’是‑O‑、‑S‑或‑NR’‑,并且
部分任选地被取代。在一些实施方案中,Y’是‑O‑、‑S‑或‑NH‑。在一些实施方案
中, 是 在一些实施方案中, 是
在一些实施方案中, 是 在一些
1
实施方案中,‑X‑L‑R 具有结构 其中X’是O或S,并且 部分任
选地被取代。在一些实施方案中, 是 在一些实施
1
方案中,‑X‑L‑R 是 其中 任选地被取代。在一些实施方案
1 1
中,‑X‑L‑R是 其中 被取代。在一些实施方案中,‑X‑L‑R 是
其中 未被取代。
x
方案中,L是 在一些实施方
1 x 1 1
案中,‑X‑L‑R是(CH3)3C‑S‑S‑L‑S‑。在一些实施方案中,‑X‑L‑R是R ‑C(=X’)‑Y’‑C(R)2‑
x 1 x
S‑L‑S‑。在一些实施方案中,‑X‑L‑R是R‑C(=X’)‑Y’‑CH2‑S‑L‑S‑。在一些实施方案中,‑
1
X‑L‑R是
对象施用之后可转化成‑X 。在一些实施方案中,‑X‑L‑R是可切割的。在一些实施方案中,‑
1 1 ‑
X‑L‑R 是‑S‑L‑R ,并且在向对象施用之后转化成‑S 。在一些实施方案中,转化是由对象的
1 ‑
酶促进。如本领域技术人员所了解,确定‑S‑L‑R基团在施用之后是否转化成‑S的方法在本
领域中是广泛已知并实施的,包括用于研究药物代谢和药物动力学的那些。
c‑、‑C(R′)2‑、‑Cy‑、‑O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N(R′)‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR′)‑、‑C(O)N(R′)‑、‑N
(R′)C(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)‑、‑N(R′)C(O)O‑、‑OC(O)N(R′)‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2N
(R′)‑、‑N(R′)S(O)2‑、‑SC(O)‑、‑C(O)S‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑;
O‑、‑S‑、‑S‑S‑、‑N(R′)‑、‑C(O)‑、‑C(S)‑、‑C(NR′)‑、‑C(O)N(R′)‑、‑N(R′)C(O)N(R′)‑、‑N
(R′)C(O)‑、‑N(R′)C(O)O‑、‑OC(O)N(R′)‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2N(R′)‑、‑N(R′)S(O)2‑、‑
SC(O)‑、‑C(O)S‑、‑OC(O)‑或‑C(O)O‑;
本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少两
个具有式I‑c结构的硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的
寡核苷酸,其包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少三个具有式I‑c结构的硫代磷酸
三酯键联。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其包含至少一个磷
酸二酯核苷酸间键联和至少四个具有式I‑c结构的硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中,
本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少五
个具有式I‑c结构的硫代磷酸三酯键联。
苷酸,其包含存在于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列,其中所述序列与
GCCTCAGTCTGCTTCGCACC具有超过50%同一性。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性
控制的寡核苷酸,其包含存在于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列,其中所述序列与
GCCTCAGTCTGCTTCGCACC具有超过60%同一性。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性
控制的寡核苷酸,其包含存在于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列,其中所述序列与
GCCTCAGTCTGCTTCGCACC具有超过70%同一性。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性
控制的寡核苷酸,其包含存在于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列,其中所述序列与
GCCTCAGTCTGCTTCGCACC具有超过80%同一性。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性
控制的寡核苷酸,其包含存在于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列,其中所述序列与
GCCTCAGTCTGCTTCGCACC具有超过90%同一性。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性
控制的寡核苷酸,其包含存在于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列,其中所述序列与
GCCTCAGTCTGCTTCGCACC具有超过95%同一性。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性
控制的寡核苷酸,其包含序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC。在一些实施方案中,本发明提供了一
种手性控制的寡核苷酸,其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC。
施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其包含存在于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC
中的序列,其中至少一个核苷酸间键联具有式I结构。在一些实施方案中,本发明提供了一
种手性控制的寡核苷酸,其包含存在于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列,其中各核苷酸间
键联具有式I结构。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其包含存
在于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列,其中至少一个核苷酸间键联具有式I‑c结构。在一些
实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸 ,其包含 存在于
GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列,其中各核苷酸间键联具有式I‑c结构。在一些实施方案
中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其包含存在于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序
列,其中至少一个核苷酸间键联是 在一些实施方案中,本发明提供了一种手性
控制的寡核苷酸,其包含存在于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列,其中各核苷酸间键联是
在一些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其包含存在于
GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列,其中至少一个核苷酸间键联是 在一
些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其包含存在于
GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列,其中各核苷酸间键联是
本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其包含序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中至少一
个核苷酸间键联具有式I结构。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷
酸,其包含序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中各核苷酸间键联具有式I结构。在一些实施方
案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其包含序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中至
少一个核苷酸间键联具有式I‑c结构。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡
核苷酸,其包含序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中各核苷酸间键联具有式I‑c结构。在一些
实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其包含序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,
其中至少一个核苷酸间键联是 在一些实施方案中,本发明提供了一种手性控
制的寡核苷酸,其包含序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中各核苷酸间键联是 在
一些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其包含序列
GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中至少一个核苷酸间键联是 在一些实施
方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其包含序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中
各核苷酸间键联是
本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中至少一
个核苷酸间键联具有式I结构。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷
酸,其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中各核苷酸间键联具有式I结构。在一些实施方
案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中至
少一个核苷酸间键联具有式I‑c结构。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡
核苷酸,其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中各核苷酸间键联具有式I‑c结构。在一些
实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,
其中至少一个核苷酸间键联是 在一些实施方案中,本发明提供了一种手性控
制的寡核苷酸,其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中各核苷酸间键联是 在
一些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其具有序列
GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中至少一个核苷酸间键联是 在一些实施
方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中
各核苷酸间键联是
手性控制的寡核苷酸包含RNA序列的某些实施方案中,各T独立地并任选地被U替换。在一些
实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,
其中各键联磷是Rp。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其具有序
列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中至少一个键联磷是Sp。在一些实施方案中,本发明提供了一
种手性控制的寡核苷酸,其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中各键联磷是Sp。在一些实
施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其
中所述寡核苷酸是嵌段聚体。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,
其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中所述寡核苷酸是立体嵌段聚体。在一些实施方案
中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中所述
寡核苷酸是P修饰嵌段聚体。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,
其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中所述寡核苷酸是键联嵌段聚体。在一些实施方案
中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中所述
寡核苷酸是交替聚体。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其具有
序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中所述寡核苷酸是立体交替聚体。在一些实施方案中,本发
明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中所述寡核苷
酸是P修饰交替聚体。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其具有
序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中所述寡核苷酸是键联交替聚体。在一些实施方案中,本发
明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中所述寡核苷
酸是单聚体。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其具有序列
GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中所述寡核苷酸是立体单聚体。在一些实施方案中,本发明提供
了一种手性控制的寡核苷酸,其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中所述寡核苷酸是P修
饰单聚体。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其具有序列
GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中所述寡核苷酸是键联单聚体。在一些实施方案中,本发明提供
了一种手性控制的寡核苷酸,其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中所述寡核苷酸是间
隔聚体。在一些实施方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其具有序列
GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中所述寡核苷酸是跳跃聚体。
方案中,本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中
至少一个胞嘧啶任选地并独立地被5‑甲基胞嘧啶替换。在一些实施方案中,本发明提供了
一种手性控制的寡核苷酸,其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC,其中各胞嘧啶任选地并独
立地被5‑甲基胞嘧啶替换。
酸自我切割来提供例如磷酸二酯,如存在于天然DNA和RNA中的那些。在一些实施方案中,所
1 1
述磷修饰具有结构‑O‑L‑R ,其中L和R各自独立地如上所定义和如本文中所述。在一些实施
方案中,自动释放基团包括吗啉代基团。在一些实施方案中,自动释放基团的特征在于能够
将试剂递送至核苷酸间磷接头中,所述试剂有助于对磷原子的进一步修饰,例如脱硫。在一
些实施方案中,试剂是水,并且进一步的修饰是水解以形成如存在于天然DNA和RNA中的磷
酸二酯。
解,并且表现穿过细胞质细胞膜的不良细胞摄取(Poijarvi‑Virta等,Curr.Med.Chem.
(2006),13(28);3441‑65;Wagner等,Med.Res.Rev.(2000),20(6):417‑51;Peyrottes等,
Mini Rev.Med.Chem.(2004),4(4):395‑408;Gosselin等,(1996),43(1):196‑208;Bologna
等,(2002),Antisense&Nucleic Acid Drug Development 12:33‑41)。例如,Vives等
(Nucleic Acids Research(1999),27(20):4071‑76)发现叔丁基SATE前寡核苷酸相较于母
体寡核苷酸显示细胞渗透显著提高。
天然DNA和RNA中存在的那些。
分由键联磷处的PEG化产生。相关领域技术人员将了解多种PEG链长度是可用的,并且对链
长度的选择将部分地由PEG化寻求达到的结果所决定。例如,在一些实施方案中,实现PEG化
以降低RES摄取,并且延长寡核苷酸的体内循环寿命。
一些实施方案中,PEG化试剂的分子量为约300g/mol至约5,000g/mol。在一些实施方案中,
PEG化试剂的分子量为约500g/mol。在一些实施方案中,PEG化试剂的分子量为约1000g/
mol。在一些实施方案中,PEG化试剂的分子量为约3000g/mol。在一些实施方案中,PEG化试
剂的分子量为约5000g/mol。
PEG5000。
荷(payload)(例如与寡核苷酸或寡核苷酸组合物)缔合,并且也与目标靶标位点相互作用
以使当与所述靶向试剂缔合时,所述目标有效载荷靶向所述目标靶标位点的程度基本上大
于当所述目标有效载荷不与所述靶向试剂缔合时,在另外可比条件下观察到的程度。靶向
试剂可以是或包含多种化学部分中的任一个,所述部分包括例如小分子部分、核酸、多肽、
碳水化合物等。靶向试剂由Adarsh等“Organelle Specific Targeted Drug Delivery‑A
Review,”International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical
Sciences,2011,第895页进一步描述。
合物(例如单糖和/或寡糖(甘露糖、甘露糖‑6‑磷酸、半乳糖等))、维生素(例如叶酸盐)或其
他小生物分子。在一些实施方案中,靶向部分是类固醇分子(例如胆汁酸,包括胆酸、脱氧胆
酸、脱氢胆酸;可的松(cortisone);地高辛(digoxigenin);睪固酮(testosterone);胆固
醇;阳离子类固醇,如具有在可的松环的3位通过双键连接的三甲基氨基甲基酰肼基团的可
的松等)。在一些实施方案中,靶向部分是亲脂性分子(例如脂环族烃、饱和和不饱和脂肪
酸、蜡、萜烯和聚脂环族烃,如金刚烷胺和巴克敏斯特富勒烯(buckminsterfullerene))。在
一些实施方案中,亲脂性分子是类萜,如维生素A、视黄酸、视黄醛或脱氢视黄醛。在一些实
施方案中,靶向部分是肽。
当前药和内体逃逸试剂。相关领域技术人员将认识到众多其他所述组合是可能的,并且由
本发明考虑。
尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤;2‑氟尿嘧啶、2‑氟胞嘧啶、5‑溴尿嘧啶、5‑碘尿
嘧啶、2,6‑二氨基嘌呤、氮杂胞嘧啶、嘧啶类似物(如假异胞嘧啶和假尿嘧啶)和其他经修饰
核苷碱基,如8‑取代的嘌呤、黄嘌呤或次黄嘌呤(后两个是天然降解产物)。示例性经修饰核
苷碱基公开于Chiu和Rana,RNA,2003,9,1034‑1048;Limbach等Nucleic Acid Research,
1994,22,2183‑2196以及Revankar和Rao,Comprehensive Natural Products Chemistry,
第7卷,313中。
9 10
苄基或苯氧基甲基;并且R 和R 各自独立地是选自直链或支链脂族、碳环基、芳基、杂环基
和杂芳基的任选地经取代的基团。
Acc.Chem.Res.,2007,40,141‑150;Kool,ET,Acc.Chem.Res.,2002,35,936‑943;Benner
S.A.等,Nat.Rev.Genet.,2005,6,553‑543;Romesberg,F.E.等,Curr.Opin.Chem.Biol.,
2003,7,723‑733;Hirao,I.,Curr.Opin.Chem.Biol.,2006,10,622‑627中所述的核酸碱基
替换被考虑作为可用于合成本文中所述的核酸。以下显示这些尺寸扩大的核苷碱基的一些
实例:
Org.Lett.,2002,4,4377‑4380中。以下显示可用作碱基替换物的卟啉源性环的一实例:
(lumazine)、栓系的芪、苯并尿嘧啶和萘并尿嘧啶,如下所示:
物素或抗生蛋白部分或其他蛋白质或肽的杂原子、烷基或连接部分。在一些实施方案中,经
修饰核苷碱基是在最经典意义上不是核苷碱基、但与核苷碱基起类似作用的“通用碱基”。
所述通用碱基的一个代表性实例是3‑硝基吡咯。
些实例包括4‑乙酰基胞苷;5‑(羧基羟甲基)尿苷;2′‑O‑甲基胞苷;5‑羧基甲基氨基甲基‑2‑
硫代尿苷;5‑羧基甲基氨基甲基尿苷;二氢尿苷;2′‑O‑甲基假尿苷;β,D‑半乳糖基Q核苷;
6
2′‑O‑甲基鸟苷;N‑异戊烯基腺苷;1‑甲基腺苷;1‑甲基假尿苷;1‑甲基鸟苷;1‑甲基肌苷;
7
2,2‑二甲基鸟苷;2‑甲基腺苷;2‑甲基鸟苷;N‑甲基鸟苷;3‑甲基‑胞苷;5‑甲基胞苷;5‑羟
6
甲基胞苷;5‑甲酰基胞嘧啶;5‑羧基胞嘧啶;N ‑甲基腺苷;7‑甲基鸟苷;5‑甲基氨基乙基尿
苷;5‑甲氧基氨基甲基‑2‑硫代尿苷;β,D‑甘露糖基Q核苷;5‑甲氧基羰基甲基尿苷;5‑甲氧
6
基尿苷;2‑甲硫基‑N‑异戊烯基腺苷;N‑((9‑β,D‑呋喃核糖基‑2‑甲基硫代嘌呤‑6‑基)氨基
甲酰基)苏氨酸;N‑((9‑β,D‑呋喃核糖基嘌呤‑6‑基)‑N‑甲基氨基甲酰基)苏氨酸;尿苷‑5‑
氧基乙酸甲酯;尿苷‑5‑氧基乙酸(v);假尿苷;Q核苷;2‑硫代胞苷;5‑甲基‑2‑硫代尿苷;2‑
硫代尿苷;4‑硫代尿苷;5‑甲基尿苷;2′‑O‑甲基‑5‑甲基尿苷;和2′‑O‑甲基尿苷。
5′位具有(R)或(S)手性的5′‑修饰的双环核苷类似物,并且包括美国专利申请公布
No.20070287831中所述的类似物。
一些实施方案中,核苷碱基或经修饰核苷碱基是5‑溴尿嘧啶、5‑碘尿嘧啶或2,6‑二氨基嘌
呤。在一些实施方案中,核苷碱基或经修饰核苷碱基是通过用荧光或生物分子结合部分取
代来修饰。在一些实施方案中,核苷碱基或经修饰核苷碱基上的取代基是荧光部分。在一些
实施方案中,核苷碱基或经修饰核苷碱基上的取代基是生物素或抗生蛋白。
No.5,130,30;No.5,134,066;No.5,175,273;No.5,367,066;No.5,432,272;No.5,457,187;
No.5,457,191;No.5,459,255;No.5,484,908;No.5,502,177;No.5,525,711;No.5,552,
540;No.5,587,469;No.5,594,121,No.5,596,091;No.5,614,617;No.5,681,941;No.5,
750,692;No.6,015,886;No.6,147,200;No.6,166,197;No.6,222,025;No.6,235,887;
No.6,380,368;No.6,528,640;No.6,639,062;No.6,617,438;No.7,045,610;No.7,427,
672;和No.7,495,088,其各自通过引用整体并入本文。
可连接于糖或经修饰糖的多个位置。作为非限制性实例,磷酸酯基团或键联磷可连接于糖
或经修饰糖的2′、3′、4′或5′羟基部分。在本文中中,还涵盖并入有如本文中所述的经修饰
核苷碱基的核苷酸。在一些实施方案中,根据本发明方法使用包含未保护的‑OH部分的核苷
酸或经修饰核苷酸。
N(R’)2,其中各R’独立地如上所定义和如本文中所述;‑O‑(C1‑C10烷基)、‑S‑(C1‑C10烷基)、‑
NH‑(C1‑C10烷基)或‑N(C1‑C10烷基)2;‑O‑(C2‑C10烯基)、‑S‑(C2‑C10烯基)、‑NH‑(C2‑C10烯基)
或‑N(C2‑C10烯基)2;‑O‑(C2‑C10炔基)、‑S‑(C2‑C10炔基)、‑NH‑(C2‑C10炔基)或‑N(C2‑C10炔基)2;
或‑O‑(C1‑C10亚烷基)‑O‑(C1‑C10烷基)、‑O‑(C1‑C10亚烷基)‑NH‑(C1‑C10烷基)或‑O‑(C1‑C10亚
烷基)‑NH(C1‑C10烷基)2、‑NH‑(C1‑C10亚烷基)‑O‑(C1‑C10烷基)或‑N(C1‑C10烷基)‑(C1‑C10亚
烷基)‑O‑(C1‑C10烷基),其中所述烷基、亚烷基、烯基和炔基可以是经取代的或未经取代的。
取代基的实例包括并不限于‑O(CH2)nOCH3和‑O(CH2)nNH2(其中n是1至约10)、MOE、DMAOE、
DMAEOE。本文中也考虑WO 2001/088198;以及Martin等,Helv.Chim.Acta,1995,78,486‑504
中所述的经修饰糖。在一些实施方案中,经修饰糖包含一个或更多个选自以下的基团:经取
代甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、荧光标记、嵌入剂、用于改进核酸的药物动力学性质
的基团、用于改进核酸的药效学性质的基团、或具有类似性质的其他取代基。在一些实施方
案中,修饰是在糖或经修饰糖的2′、3′、4′、5′或6′位中的一个或更多个处进行,包括3′末端
核苷酸上的糖的3′位或在5′末端核苷酸的5′位中。
述;‑O‑(C1‑C10烷基)、‑S‑(C1‑C10烷基)、‑NH‑(C1‑C10烷基)或‑N(C1‑C10烷基)2;‑O‑(C2‑C10烯
基)、‑S‑(C2‑C10烯基)、‑NH‑(C2‑C10烯基)或‑N(C2‑C10烯基)2;‑O‑(C2‑C10炔基)、‑S‑(C2‑C10炔
基)、‑NH‑(C2‑C10炔基)或‑N(C2‑C10炔基)2;或‑O‑(C1‑C10亚烷基)‑O‑(C1‑C10烷基)、‑O‑(C1‑
C10亚烷基)‑NH‑(C1‑C10烷基)或‑O‑(C1‑C10亚烷基)‑NH(C1‑C10烷基)2、‑NH‑(C1‑C10亚烷基)‑
O‑(C1‑C10烷基)或‑N(C1‑C10烷基)‑(C1‑C10亚烷基)‑O‑(C1‑C10烷基),其中所述烷基、亚烷基、
烯基和炔基可被取代或未被取代。在一些实施方案中,2’‑OH被‑H替换(脱氧核糖)。在一些
实施方案中,2’‑OH被‑F替换。在一些实施方案中,2’‑OH被‑OR’替换。在一些实施方案中,
2’‑OH被‑OMe替换。在一些实施方案中,2’‑OH被‑OCH2CH2OMe替换。
案中,形成的二价部分具有本文定义的‑L‑结构。在一些时候方案中,‑L‑是‑O‑CH2‑,其中‑
CH2‑任选地被取代。在一些实施方案中,‑L‑是‑O‑CH2‑。在一些实施方案中,‑O‑CH2‑是‑O‑CH
(Et)‑。在一些实施方案中,‑L‑在糖部分的C2和C4之间。在一些实施方案中,锁定核酸具有
以下指示的结构。指示了具有以下结构的锁定核酸,其中Ba表示如本文中所述的核苷碱基
2s
或经修饰核苷碱基,并且其中R 是‑OCH2C4’‑。
酸)中的那些中的任一个,例如阿拉伯糖、失水己糖醇、苏糖、2’氟阿拉伯糖或环己烯。
118,800;5,319,080;和5,359,044。考虑的一些经修饰糖包括其中核糖环内的氧原子被氮、
硫、硒或碳替换的糖。在一些实施方案中,经修饰糖是经修饰核糖,其中核糖环内的氧原子
被氮替换,并且其中氮任选地被烷基(例如甲基、乙基、异丙基等)取代。
等,J.Am.Chem.Soc.,2005,127,4174‑4175以及Tsai CH等,PNAS,2007,14598‑14603中(X=
‑
O):
Chem.Soc.,2008,130,412‑413中,并且如下所示:
4’)糖具有任一下式:
“‑XLR,’,Ba如本文所定义,并且X选自‑S‑、‑Se‑、‑CH2‑、‑NMe‑、‑NEt‑或‑NiPr‑。
22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、
37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%或更多
(例如55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多)(包括端值)的糖被修饰。
在一些实施方案中,仅嘌呤残基被修饰(例如约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、
10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、
25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、
40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%或50%以上[例如55%、
60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多]的嘌呤残基被修饰)。在一些实施方
案中,仅嘧啶残基被修饰(例如约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、
12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、
27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、
42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%或50%以上[例如55%、60%、65%、
70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多]的嘌呤残基被修饰)。在一些实施方案中,嘌呤残
基与嘧啶残基两者均被修饰。
1416‑1477;M.Egli等,J.Am.Chem.Soc.(2006),128(33):10847‑56;A.Eschenmoser in
Chemical Synthesis:Gnosis to Prognosis,C.Chatgilialoglu和V.Sniekus编,(Kluwer
Academic,Netherlands,1996),第293页;K.‑U.Schoning等,Science(2000),290:1347‑
1351;A.Eschenmoser等,Helv.Chim.Acta(1992),75:218;J.Hunziker等,Helv.Chim.Acta
(1993),76:259;G.Otting等,Helv.Chim.Acta(1993),76:2701;K.Groebke等,
Helv.Chim.Acta(1998),81:375;以及A.Eschenmoser,Science(1999),284:2118。关于2′修
饰的修饰可见于Verma,S.等Annu.Rev.Biochem.1998,67,99‑134以及其中所有参考文献
中。对核糖的特定修饰可见于以下参考文献中:2’‑氟(Kawasaki等,J.Med.Chem.,1993,36,
831‑841)、2’‑MOE(Martin,P.Helv.Chim.Acta 1996,79,1930‑1938)、“LNA”(Wengel,
J.Acc.Chem.Res.1999,32,301‑310)。在一些实施方案中,经修饰糖是通过引用并入本文的
PCT公布号WO2012/030683中所述,并且描述于本申请的图26‑30中的那些中的任一个。
寡核苷酸类型由以下定义:1)碱基序列;2)骨架键联样式;3)骨架手性中心样式;和4)骨架P
修饰样式。
提供的寡核苷酸是具有构型Rp的立体单聚体。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸是具有
构型Sp的立体单聚体。
实施方案中,5’‑端或3’‑端具有或包含2至20个核苷酸。在一些实施方案中,结构特征是碱
基修饰。在一些实施方案中,结构特征是糖修饰。在一些实施方案中,结构特征是P修饰。在
一些实施方案中,结构特征是手性核苷酸间键联的立体化学。在一些实施方案中,结构特征
是或包含碱基修饰、糖修饰、P修饰或手性核苷酸间键联的立体化学,或者其组合。在一些实
施方案中,半聚体是这样的寡核苷酸,其中5’‑端序列的各糖部分共有共同修饰。在一些实
施方案中,半聚体是这样的寡核苷酸,其中3’‑端序列的各糖部分共有共同修饰。在一些实
施方案中,5’或3’端序列的共同糖修饰不被寡核苷酸中任意其他糖部分共有。在一些实施
方案中,示例性半聚体是这样的寡核苷酸,其在一端包含经修饰或未经经修饰的2’‑O‑烷基
TM
糖修饰的核苷、双环糖修饰的核苷、β‑D‑脱氧核糖核苷(例如2′‑MOE修饰的核苷、和LNA 或
TM
ENA 二环糖修饰的核苷),并且在另一端包含具有不同糖部分的核苷(例如经修饰或未经修
饰的2′‑O‑烷基糖修饰的核苷、双环糖修饰的核苷或天然核苷)的序列。在一些实施方案中,
提供的寡核苷酸是单聚体、交替聚体、嵌段聚体、间隔聚体、半聚体和跳跃聚体中的一种或
更多种的组合。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸是单聚体是单聚体、交替聚体、嵌段聚
体、间隔聚体和跳跃聚体中的一种或更多种的组合。例如,在一些实施方案中,提供的寡核
苷酸是交替聚体和间隔聚体二者。在一些实施方案中,寡核苷酸是间隔聚体和跳跃聚体二
者。化学和合成领域的技术人员将承认,多种其他样式的组合可供使用并且仅受根据本发
明方法合成提供好的寡核苷段所需的组成部分的商业可得性和合成可及性的限制。在一些
实施方案中,半聚体结构提供了有利益处,如图29中所示。在一些实施方案中,提供的寡核
苷酸是5’‑半聚体,其在5’‑端部分中包含经修饰糖部分。在一些实施方案中,提供的寡核苷
酸是5’‑半聚体,其在5’‑端部分中包含经修饰2’‑糖部分。
提供的寡核苷酸包含一个或更多个任选地经取代的核苷。在一些实施方案中,提供的寡核
苷酸包含一个或更多个经修饰核苷。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸包含一个或更多
个任选地经取代的LNA。
些实施方案中,提供的寡核苷酸包含一个或更多个任选地经取代的经修饰核碱基。在一些
实施方案中,提供的寡核苷酸包含一个或更多个5‑甲基胞苷;5‑羟甲基胞苷、5‑甲酰基胞嘧
啶或5‑羧基胞嘧啶。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸包含一个或更多个5‑甲基胞苷。
的糖。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸包含一个或更多个任选地经取代的核糖或脱氧
核糖。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸包含一个或更多个任选地经取代的核糖或脱氧
核糖,其中核糖或脱氧核糖部分的一个或更多个羟基任选地并独立地被以下替换:卤素、
R’、‑N(R’)2、‑OR’或‑SR’,其中各R’独立地如上所定义和如本文中所述。在一些实施方案
中,提供的寡核苷酸包含一个或更多个任选地经取代的脱氧核糖,其中脱氧核糖的2’位任
选地并独立地被以下取代:卤素、R’、‑N(R’)2、‑OR’或‑SR’,其中各R’独立地如上所定义和
如本文中所述。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸包含一个或更多个任选地经取代的脱
氧核糖,其中脱氧核糖的2’位任选地并独立地被卤素取代。在一些实施方案中,提供的寡核
苷酸包含一个或更多个任选地经取代的脱氧核糖,其中脱氧核糖的2’位任选地并独立地被
一个或更多个‑F卤素取代。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸包含一个或更多个任选地
经取代的脱氧核糖,其中脱氧核糖的2’位任选地并独立地被‑OR’取代,其中各R’独立地如
上所定义和如本文中所述。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸包含一个或更多个任选地
经取代的脱氧核糖,其中脱氧核糖的2’位任选地并独立地被‑OR’取代,其中各R’独立地是
任选地经取代的C1‑C6脂族。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸包含一个或更多个任选地
经取代的脱氧核糖,其中脱氧核糖的2’位任选地并独立地被‑OR’取代,其中各R’独立地是
任选地经取代的C1‑C6烷基。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸包含一个或更多个任选地
经取代的脱氧核糖,其中脱氧核糖的2’位任选地并独立地被‑OMe取代。在一些实施方案中,
提供的寡核苷酸包含一个或更多个任选地经取代的脱氧核糖,其中脱氧核糖的2’位任选地
并独立地被‑O‑甲氧基乙基取代。
的寡核苷酸链。在某些实施方案中,提供的寡核苷酸是双链寡核苷酸。在某些实施方案中,
提供的寡核苷酸是三链寡核苷酸(例如三链体)。
含在任何一个或更多个键联磷处的立体化学修饰和/或在任何一个或更多个键联磷处的P
修饰。例如,在一些实施方案中,预先选择WO2012/030683的寡核苷酸的特定核苷酸单元以
在该核苷酸单元的键联磷处进行立体化学修饰,和/或在该核苷酸单元的键联磷处进行P修
饰。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸具有图26‑30中描述的任一结构。在一些实施
方案中,手性控制的寡核苷酸是图26‑30中描述的任一结构的变体(例如修饰形式)。
WO2012/030683的公开内容通过引用整体并入本文。
化形式,如逆转录PCR(RT‑PCR)和实时PCR中。
然DNA/RNA比Rp立体异构体更易受影响或同样易受影响,所述Rp立体异构体又比相应Sp立
体异构体更易受影响。
用于控制细胞增殖、病毒复制和/或任何其他细胞信号传导过程。
的寡核苷酸的长度是约2至约160个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长
度是约2至约140个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约2至约120
个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约2至约100个核苷酸单元。在
一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约2至约90个核苷酸单元。在一些实施方案中,
提供的寡核苷酸的长度是约2至约80个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的
长度是约2至约70个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约2至约60
个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约2至约50个核苷酸单元。在
一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约2至约40个核苷酸单元。在一些实施方案中,
提供的寡核苷酸的长度是约2至约30个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的
长度是约2至约29个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约2至约28
个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约2至约27个核苷酸单元。在
一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约2至约26个核苷酸单元。在一些实施方案中,
提供的寡核苷酸的长度是约2至约25个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的
长度是约2至约24个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约2至约23
个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约2至约22个核苷酸单元。在
一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约2至约21个核苷酸单元。在一些实施方案中,
提供的寡核苷酸的长度是约2至约20个核苷酸单元。
的寡核苷酸的长度是约4至约160个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长
度是约4至约140个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约4至约120
个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约4至约100个核苷酸单元。在
一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约4至约90个核苷酸单元。在一些实施方案中,
提供的寡核苷酸的长度是约4至约80个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的
长度是约4至约70个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约4至约60
个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约4至约50个核苷酸单元。在
一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约4至约40个核苷酸单元。在一些实施方案中,
提供的寡核苷酸的长度是约4至约30个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的
长度是约4至约29个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约4至约28
个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约4至约27个核苷酸单元。在
一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约4至约26个核苷酸单元。在一些实施方案中,
提供的寡核苷酸的长度是约4至约25个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的
长度是约4至约24个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约4至约23
个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约4至约22个核苷酸单元。在
一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度是约4至约21个核苷酸单元。在一些实施方案中,
提供的寡核苷酸的长度是约4至约20个核苷酸单元。
寡核苷酸的长度是约15至约25个核苷酸单元。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸的长度
是约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸单元。
苷酸单元。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是至少5个核苷酸单元。在一些实施方案中,
寡核苷酸的长度是至少6个核苷酸单元。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是至少7个核
苷酸单元。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是至少8个核苷酸单元。在一些实施方案中,
寡核苷酸的长度是至少9个核苷酸单元。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是至少10个核
苷酸单元。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是至少11个核苷酸单元。在一些实施方案
中,寡核苷酸的长度是至少12个核苷酸单元。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是至少13
个核苷酸单元。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是至少14个核苷酸单元。在一些实施方
案中,寡核苷酸的长度是至少15个核苷酸单元。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是至少
16个核苷酸单元。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是至少17个核苷酸单元。在一些实施
方案中,寡核苷酸的长度是至少18个核苷酸单元。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是至
少19个核苷酸单元。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是至少20个核苷酸单元。在一些实
施方案中,寡核苷酸的长度是至少21个核苷酸单元。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是
至少22个核苷酸单元。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度是至少23个核苷酸单元。在一些
实施方案中,寡核苷酸的长度是至少24个核苷酸单元。在一些实施方案中,寡核苷酸的长度
是至少25个核苷酸单元。在一些其他实施方案中,寡核苷酸的长度是至少30个核苷酸单元。
在一些其他实施方案中,寡核苷酸是长度是至少18个核苷酸单元的互补链的双链体。在一
些其他实施方案中,寡核苷酸是长度是至少21个核苷酸单元的互补链的双链体。
广泛描述了示例性所述修饰,包括末端帽部分,例如但不限于美国专利申请公布US 2009/
0023675A1中所述的那些。
手性中心样式(即,键联磷立体化学样式(RpASp))、和相同的骨架磷修饰样式(例如,式I中
1
“‑XLR”样式)。寡核苷酸的种类
施方案中,一个或更多个任何核苷酸或键联都可根据本发明加以修饰。在一些实施方案中,
本发明提供了一种手性控制的寡核苷酸,其具有序列G*‑C*‑C*‑U*‑C*‑dA‑dG‑dT‑dC‑
dT‑dG‑dmC‑dT‑dT‑dmC‑G*‑C*‑A*‑C*‑C*[d=2’‑脱氧基,*=2’‑O‑(2‑甲氧基乙
基)],所述序列具有3’→5’硫代磷酸酯键联。在整篇申请中描述了示例性经修饰米泊美生
序列,包括但不限于表2中的那些。
构型Sp的米泊美生单聚体。
相同类型,即所有都具有相同碱基序列、骨架键联样式(即核苷酸间键联类型样式,例如磷
酸酯、硫代磷酸酯等)、骨架手性中心样式(即键联磷立体化学样式(Rp/Sp))和骨架磷修饰
1
样式(例如式I中的“‑XLR”基团样式)。然而,在许多实施方案中,提供的组合物通常以预定
相对量包含多种寡核苷酸类型。
构型呈单一非对映体形式的米泊美生。
键联磷都呈Sp构型。
种类型的提供的寡核苷酸中的每一种的选择以及量将取决于所述组合物的预定用途。也就
是说,相关领域技术人员将设计提供的手性控制的寡核苷酸组合物以使其中包含的提供的
寡核苷酸的量和类型导致组合物总体上具有某些期望的特征(例如生物学上期望的、治疗
上期望的等)。
更多种提供的寡核苷酸类型的组合。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合
物包含四种或更多种提供的寡核苷酸类型的组合。在一些实施方案中,提供的手性控制的
寡核苷酸组合物包含五种或更多种提供的寡核苷酸类型的组合。在一些实施方案中,提供
的手性控制的寡核苷酸组合物包含六种或更多种提供的寡核苷酸类型的组合。在一些实施
方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物包含七种或更多种提供的寡核苷酸类型的组
合。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物包含八种或更多种提供的寡核
苷酸类型的组合。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物包含九种或更多
种提供的寡核苷酸类型的组合。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物包
含十种或更多种提供的寡核苷酸类型的组合。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核
苷酸组合物包含十五种或更多种提供的寡核苷酸类型的组合。
有所需非对映异构形式的手性纯米泊美生的组合。
US2013/050407中描述的那些的寡核苷酸类型的寡核苷酸。
1
有特定碱基序列、骨架键联样式、骨架手性中心样式和骨架磷修饰样式(例如“‑XLR”基团)
的寡核苷酸。具有常见指定“类型”的寡核苷酸在结构上关于碱基序列、骨架键联样式、骨架
手性中心样式和骨架磷修饰样式是彼此相同的。
寡核苷酸混合物的亲脂性。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸在HPLC上具有不同保
留时间。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸可具有显著不同于相应立构无规寡核苷
酸混合物的峰保留时间。在如本领域中一般所实施来使用HPLC纯化寡核苷酸期间,某些手
性控制的寡核苷酸即使不完全损失,也将大部分损失。在如本领域中一般所实施来使用
HPLC纯化寡核苷酸期间,某些手性控制的寡核苷酸即使不完全损失,也将大部分损失。一个
后果是立构无规寡核苷酸混合物的某些非对映体(某些手性控制的寡核苷酸)在测定中未
被测试。另一后果是在各批次之间由于不可避免的仪器和人为误差,假定“纯”立构无规寡
核苷酸将具有不一致组成,因为组合物中的非对映体及其相对量和绝对量在各批次之间不
同。本发明中提供的手性控制的寡核苷酸和手性控制的寡核苷酸组合物克服了所述问题,
因为手性控制的寡核苷酸是以手性控制的方式以单一非对映体形式合成,并且手性控制的
寡核苷酸组合物包含预定水平的一种或更多种个体寡核苷酸类型。
联磷处具有特定立体化学和/或在键联磷处具有特定修饰、和/或特定碱基和/或特定糖。在
一些实施方案中,提前设计和/或选择提供的寡核苷酸以在核苷酸间键联的键联磷处具有
立体中心的特定组合。
被设计和/或确定为具有碱基的特定组合。在一些实施方案中,使用本发明方法制备的提供
的寡核苷酸被设计和/或确定为具有糖的特定组合。在一些实施方案中,使用本发明方法制
备的提供的寡核苷酸被设计和/或确定为具有一种或更多种以上结构特征的特定组合。
酸,其包含一个或更多个独立地具有式I结构的经修饰核苷酸间键联。
些实施方案中,本发明方法提供了一种寡核苷酸,其是具有构型Sp的米泊美生单聚体。
酸组合物包含一种寡核苷酸类型。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物包含超
过一种寡核苷酸类型。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物包含多种寡核苷酸
类型。本文描述了根据本发明制备的示例性手性控制的寡核苷酸组合物。
于键联磷的构型以单一非对映体形式存在于组合物中。
酸单元关于键联磷的构型都具有相同立体化学,例如所有核苷酸单元在键联磷处都具有Rp
构型,或所有核苷酸单元在键联磷处都具有Sp构型。
的寡核苷酸的纯度超过约60%。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超
过约65%。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约70%。在一些实施
方案中,提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约75%。在一些实施方案中,提供的手性控
制的寡核苷酸的纯度超过约80%。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸的纯度
超过约85%。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约90%。在一些实
施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约91%。在一些实施方案中,提供的手性
控制的寡核苷酸的纯度超过约92%。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸的纯
度超过约93%。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约94%。在一些
实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约95%。在一些实施方案中,提供的手
性控制的寡核苷酸的纯度超过约96%。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸的
纯度超过约97%。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约98%。在一
些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约99%。在一些实施方案中,提供的
手性控制的寡核苷酸的纯度超过约99.5%。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷
酸的纯度超过约99.6%。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约
99.7%。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约99.8%。在一些实施
方案中,提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约99.9%。在一些实施方案中,提供的手性
控制的寡核苷酸的纯度超过至少约99%。
述组合物是约50%非对映体纯。在一些实施方案中,所述组合物是约50%非对映体纯。在一
些实施方案中,所述组合物是约55%非对映体纯。在一些实施方案中,所述组合物是约60%
非对映体纯。在一些实施方案中,所述组合物是约65%非对映体纯。在一些实施方案中,所
述组合物是约70%非对映体纯。在一些实施方案中,所述组合物是约75%非对映体纯。在一
些实施方案中,所述组合物是约80%非对映体纯。在一些实施方案中,所述组合物是约85%
非对映体纯。在一些实施方案中,所述组合物是约90%非对映体纯。在一些实施方案中,所
述组合物是约91%非对映体纯。在一些实施方案中,所述组合物是约92%非对映体纯。在一
些实施方案中,所述组合物是约93%非对映体纯。在一些实施方案中,所述组合物是约94%
非对映体纯。在一些实施方案中,所述组合物是约95%非对映体纯。在一些实施方案中,所
述组合物是约96%非对映体纯。在一些实施方案中,所述组合物是约97%非对映体纯。在一
些实施方案中,所述组合物是约98%非对映体纯。在一些实施方案中,所述组合物是约99%
非对映体纯。在一些实施方案中,所述组合物是约99.5%非对映体纯。在一些实施方案中,
所述组合物是约99.6%非对映体纯。在一些实施方案中,所述组合物是约99.7%非对映体
纯。在一些实施方案中,所述组合物是约99.8%非对映体纯。在一些实施方案中,所述组合
物是约99.9%非对映体纯。在一些实施方案中,所述组合物是至少约99%非对映体纯。
选择量的任何一种或更多种手性控制的寡核苷酸类型可与任何一种或更多种其他手性控
制的寡核苷酸类型混合来产生手性控制的寡核苷酸组合物。在一些实施方案中,预先选择
量的寡核苷酸类型是具有任一上述非对映体纯度的组合物。
的寡核苷酸类型。
后,随后循环可使用为该随后循环个体选择的核苷酸单元来进行,在一些实施方案中,所述
核苷酸单元包含不同于第一循环核苷碱基和/或糖的核苷碱基和/或糖。同样,随后循环的
偶联步骤中使用的手性助剂可不同于第一循环中使用的手性助剂,以使第二循环产生具有
不同立体化学构型的磷键联。在一些实施方案中,新形成的核苷酸间键联中的键联磷的立
体化学通过使用立体化学纯亚磷酰胺来控制。另外,随后循环的修饰步骤中使用的修饰试
剂可不同于第一循环或先前循环中使用的修饰试剂。这个迭代装配方法的累积作用是使得
提供的寡核苷酸的各组分可在结构上和在构型上被高度定制。这个方法的另一优势是加帽
步骤使“n‑1”杂质的形成最少化,所述杂质否则将使得分离提供的寡核苷酸极具挑战,并且
尤其是分离长度较长的寡核苷酸。
控制的寡核苷酸。例示的手性助剂具有式3‑I的结构:
一个核苷连接于固体支持物,并且可任选地在去封闭之前进行循环退出。如本领域技术人
PRO
员所了解,B 是寡核苷酸合成中使用的受保护的碱基。以下进一步描述方案I的上述循环
的各步骤。
性基团。在寡核苷酸合成期间,在若干合成循环中用多种试剂处理固体支持物以实现用个
体核苷酸单元逐步延长增长的寡核苷酸链。在链末端的直接连接于固体支持物的核苷单元
称为本文中使用的“第一核苷”。第一核苷是通过接头部分结合于固体支持物,所述接头部
分即在CPG、聚合物或其他固体支持物与核苷之间具有共价键的二价基团。接头在被进行来
装配寡核苷酸链的合成循环期间保持完整,并且在链装配之后被切割以自载体释放寡核苷
酸。
和5,132,418;Andrus等美国专利号5,047,524、5,262,530;以及Koster美国专利号4,725,
677(再颁布为Re34,069)中所述的载体。在一些实施方案中,固相是有机聚合物载体。在一
些实施方案中,固相是无机聚合物载体。在一些实施方案中,有机聚合物载体是聚苯乙烯、
氨基甲基聚苯乙烯、聚乙二醇‑聚苯乙烯接枝共聚物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯
醇、高度交联聚合物(HCP)、或其他合成聚合物、碳水化合物(如纤维素和淀粉或其他聚合碳
水化合物)、或其他有机聚合物和任何共聚物、复合材料或以上无机或有机材料的组合。在
一些实施方案中,无机聚合物载体是二氧化硅、氧化铝、作为硅胶载体的可控聚合玻璃
(CPG)、或氨基丙基CPG。其他适用固体支持物包括氟固体支持物(参见例如WO/2005/
070859)、长链烷基胺(LCAA)可控孔度玻璃(CPG)固体支持物(参见例如S.P.Adams,
K.S.Kavka,E.J.Wykes,S.B.Holder和G.R.Galluppi,J.Am.Chem.Soc.,1983,105,661‑663;
G.R.Gough,M.J.Bruden和P.T.Gilham,Tetrahedron Lett.,1981,22,4177‑4180)。膜载体
和聚合膜(参见例如Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis,
Peptides,Proteins and Nucleic Acids,第21章第157‑162页,1994Roger Epton编以及美
国专利号4,923,901)也可用于合成核酸。一旦形成,膜即可被化学官能化以用于核酸合成
中。除官能团连接于膜之外,使用连接于膜的接头或间隔子基团也用于一些实施方案中来
使膜与合成的链之间的空间位阻最小化。
Alul等,Nucleic Acid Research,1991,19,1527)、TentaGel载体‑一种氨基聚乙二醇衍生
化载体(参见例如Wright等,Tetrahedron Lett.,1993,34,3373)和Poros‑聚苯乙烯/二乙
烯苯共聚物。
柔性以经受任何伴随操作而不丧失完整性的任何聚合物。合适的所选材料的实例包括尼
龙、聚丙烯、聚酯、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯和硝酸纤维素。视研究者的设计而定,其
他材料可充当固体支持物。考虑到一些设计,可选择例如包镀金属(特别是金或铂)(参见例
如美国公布号20010055761)。在寡核苷酸合成的一个实施方案中,例如使核苷锚定于用羟
基或氨基残基官能化的固体支持物。或者,固体支持物被衍生以提供酸不稳定性三烷氧基
三苯甲基,如三甲氧基三苯甲基(TMT)。在不受理论束缚下,预期存在三烷氧基三苯甲基保
护基将允许在通常在DNA合成仪上使用的条件下进行初始脱三苯甲基化。为用氨水较快释
放溶液中的寡核苷酸材料,任选地将二乙醇酸酯接头引于载体上。
应,即使用5′‑核苷亚磷酰胺或在酶促反应中(例如使用核苷5′‑三磷酸进行连接和聚合)。
当考虑5’至3’合成时,本发明的迭代步骤保持不变(即加帽和在手性磷上修饰)。
(例如羟基)的短分子。在一些实施方案中,连接部分是琥珀酰胺酸接头或琥珀酸酯接头(‑
CO‑CH2‑CH2‑CO‑)或草酰基接头(‑CO‑CO‑)。在一些实施方案中,连接部分和核苷是通过酯键
键结在一起。在一些实施方案中,连接部分和核苷是通过酰胺键键结在一起。在一些实施方
案中,连接部分使核苷连接于另一核苷酸或核酸。合适的接头公开于例如
Oligonucleotides And Analogues A Practical Approach,Ekstein,F.编,IRL Press,
N.Y.,1991,第1章以及Solid‑Phase Supports for Oligonucleotide Synthesis,Pon,
R.T.,Curr.Prot.Nucleic Acid Chem.,2000,3.1.1‑3.1.28中。
分。在一些实施方案中,连接部分是如本文中所述的经修饰磷键联。在一些实施方案中,通
用接头(UnyLinker)用于使寡核苷酸连接于固体支持物(Ravikumar等,Org.Process
Res.Dev.,2008,12(3),399‑410)。在一些实施方案中,使用其他通用接头(Pon,R.T.,
Curr.Prot.Nucleic Acid Chem.,2000,3.1.1‑3.1.28)。在一些实施方案中,使用多种正交
接头(如二硫化物接头)(Pon,R.T.,Curr.Prot.Nucleic Acid Chem.,2000,3.1.1‑
3.1.28)。
中,溶剂是醚溶剂,例如四氢呋喃。在一些实施方案中,溶剂是卤化烃,例如二氯甲烷。在一
些实施方案中,使用溶剂的混合物。在某些实施方案中,溶剂是任何一种或更多种上述类别
的溶剂的混合物。
他胺碱包括吡咯烷、哌啶、N‑甲基吡咯烷、吡啶、喹啉、N,N‑二甲基氨基吡啶(DMAP)或N,N‑二
甲基苯胺。
胺溶剂,例如吡啶。在一些实施方案中,新鲜蒸馏的无水非质子性有机溶剂是醚溶剂,例如
四氢呋喃。在一些实施方案中,新鲜蒸馏的无水非质子性有机溶剂是腈溶剂,例如乙腈。
应条件,如用于反应的溶剂。第一活化试剂的实例是光气、氯甲酸三氯甲酯、双(三氯甲基)
碳酸酯(BTC)、草酰氯、Ph3PCl2、(PhO)3PCl2、N,N’‑双(2‑氧代‑3‑ 唑烷基)次膦酰氯
(BopCl)、1,3‑二甲基‑2‑(3‑硝基‑1,2,4‑三唑‑1‑基)‑2‑吡咯烷‑1‑基‑1,3,2‑二氮杂磷杂
环戊烷 六氟磷酸盐(MNTP)或3‑硝基‑1,2,4‑三唑‑1‑基‑三(吡咯烷‑1‑基)磷 六氟磷酸
盐(PyNTP)。
环[5.4.0]十一‑7‑烯。H DBU可以是例如铵离子、烷基铵离子、杂芳族亚铵离子或杂环亚铵
离子,其中任一个是伯、仲、叔或季或单价金属离子。
4,5‑二氯咪唑、1‑苯基咪唑 三氟甲磺酸盐(PhIMT)、苯并咪唑 三氟甲磺酸盐(BIT)、苯并
三唑、3‑硝基‑1,2,4‑三唑(NT)、四唑、5‑乙基硫基四唑(ETT)、5‑苄基硫代四唑(BTT)、5‑(4‑
硝基苯基)四唑、N‑氰基甲基吡咯烷 三氟甲磺酸盐(CMPT)、N‑氰基甲基哌啶 三氟甲磺酸
盐、三氟甲磺酸N‑氰基甲基二甲基铵。式Z‑Va((Z‑Vb)、(Z‑Va’)或(Z‑Vb’))手性中间体可以
单体形式分离。通常来说,手性中间体Z‑Va((Z‑Vb)、(Z‑Va’)或(Z‑Vb’))不分离,并且在同
一锅中经受与核苷或经修饰核苷的反应以提供作为缩合的中间体的手性亚磷酸酯化合物。
在另一些实施方案中,当方法是通过固相合成进行时,过滤包含化合物的固体支持物以去
除副产物、杂质和/或试剂。
么加帽步骤不必要。
步骤的实例是氧化和硫化步骤。
基、杂芳基、烷基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫羰基,或Z 和Z 一起
z f f
形成可经取代或未经取代的3至8元脂环族环或杂环;V是SO2、O或NR ;并且R是氢、烷基、烯
基、炔基或芳基。
基、杂芳基、烷基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫羰基,或Z 和Z 一起
z f f
形成可经取代或未经取代的3至8元脂环族环或杂环;V是SO2、S、O或NR ;并且R是氢、烷基、
烯基、炔基或芳基。
二甲基硫化物(BH3Me2S)。
如例如JP 2010‑265304 A和WO2010/064146中所公开。
饰的加帽的缩合的中间体和5’脱保护的修饰的加帽中间体。在至少一轮链延长循环之后,
通过移除手性助剂配体和其他保护基,例如核苷碱基、经修饰核苷碱基、糖和经修饰糖保护
基来进一步将5’脱保护的修饰的加帽中间体去封闭,以提供核酸。在另一些实施方案中,包
含5’‑OH部分的核苷是来自如本文中所述的先前链延长循环的中间体。在另一些实施方案
中,包含5’‑OH部分的核苷是由另一已知核酸合成方法获得的中间体。在其中使用固体支持
物的实施方案中,接着自固体支持物切割磷原子修饰的核酸。在某些实施方案中,出于纯化
目的使核酸连接在固体支持物上,接着在纯化之后自固体支持物切割。
合成方法获得的中间体。在另一些实施方案中,包含5’‑OH部分的核苷是由包括一个或更多
个在方案I中说明的循环的另一已知核酸合成方法获得的中间体。在另一些实施方案中,包
含5’‑OH部分的核苷是由包括一个或更多个在方案I‑b、I‑c或I‑d中说明的循环的另一已知
核酸合成方法获得的中间体。
的磷原子修饰的寡核苷酸衍生物的寡核苷酸合成方法。
2 3 5 6 7 8 8 9 9 7 7 8 9
团,或其中Z 和Z 、Z和Z、Z 和Z 、Z和Z、Z 和Z 、或Z和Z和Z中的任一个一起形成3至20元
‑
脂环族环或杂环;Q是反阴离子;并且LG是离去基团。
ClO4或SbF6,其中Tf是CF3SO2。在一些实施方案中,缩合试剂CR的离去基团是F、Cl、Br、I、3‑
硝基‑1,2,4‑三唑、咪唑、烷基三唑、四唑、五氟苯或1‑羟基苯并三唑。
盐酸盐(EDCI‑HCl)、苯并三唑‑1‑基氧基三(二甲基氨基)磷 六氟磷酸盐(PyBOP)、N,N’‑双
(2‑氧代‑3‑ 唑烷基)次膦酰氯(BopCl)、2‑(1H‑7‑氮杂苯并三唑‑1‑基)‑1,1,3,3‑四甲基
脲六氟磷酸盐(HATU)和O‑苯并三唑‑N,N,N’,N’‑四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、DIPCDI;N,
N’‑双(2‑氧代‑3‑ 唑烷基)次膦酰溴(BopBr)、1,3‑二甲基‑2‑(3‑硝基‑1,2,4‑三唑‑1‑
基)‑2‑吡咯烷‑1‑基‑1,3,2‑二氮杂磷杂环戊烷 六氟磷酸盐(MNTP)、3‑硝基‑1,2,4‑三唑‑
1‑基‑三(吡咯烷‑1‑基)磷 六氟磷酸盐(PyNTP)、溴三吡咯烷子基磷 六氟磷酸盐
(PyBrOP);O‑(苯并三唑‑1‑基)‑N,N,N′,N′‑四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU);以及四甲基氟甲
‑ ‑ ‑ ‑ ‑
脒六氟磷酸盐(TFFH)。在某些实施方案中,缩合试剂CR的反离子是Cl、Br、BF4 、PF6、TfO 、
‑ ‑ ‑ ‑
Tf2N、AsF6、ClO4或SbF6,其中Tf是CF3SO2。
酰氯(BopCl)或2‑氯‑5,5‑二甲基‑2‑氧代‑1,3,2‑二氧杂磷杂环戊烷。在某一实施方案中,
缩合试剂是N,N’‑双(2‑氧代‑3‑ 唑烷基)次膦酰氯(BopCl)。在一些实施方案中,缩合试
剂选自WO/2006/066260中所述的那些。
(吡咯烷‑1‑基)磷 六氟磷酸盐(PyNTP):
构和/或立体化学构型。在一些实施方案中,用于合成提供的寡核苷酸的各核苷偶联配偶体
与寡核苷酸的某些其他核苷偶联配偶体不具有相同的结构和/或立体化学构型。本文描述
供根据本发明方法使用的示例性核苷碱基和糖。相关化学和合成领域技术人员将认识到本
文中所述的核苷碱基和糖的任何组合都被预期供根据本发明方法使用。
(WO2012/039448)中。供根据本发明使用的手性核苷偶联配偶体在本文中也称为“Wada亚酰
PRO
胺化物”。在一些实施方案中,偶联配偶体具有结构 其中B 是受保护的
PRO
核苷碱基。在一些实施方案中,偶联配偶体具有结构 其中B 是受保护的
核苷碱基。以下描述作为偶联配偶体的示例性手性亚磷酰胺:
例如,在一些实施方案中,增长的寡核苷酸的5’羟基被封闭(即受保护),并且必须去封闭以
随后与核苷偶联配偶体反应。
在一些实施方案中,共递送包括递送一定量的溶液形式的手性试剂(例如亚磷酰胺溶液)和
一定量的在诸如腈溶剂(例如乙腈)的极性非质子性溶剂中的溶液形式的活化剂(例如CMPT
溶液)。
在一些实施方案中,手性亚磷酸酯产物以非对映体过量>97%存在。在一些实施方案中,手
性亚磷酸酯产物以非对映体过量>98%存在。在一些实施方案中,手性亚磷酸酯产物以非
对映体过量>99%存在。
步骤超过两个步骤。
加帽基团来加帽。在一些实施方案中,手性助剂的游离胺和未反应的5’羟基用不同加帽基
团来加帽。在某些实施方案中,用不同加帽基团加帽允许在合成寡核苷酸期间移除一个加
帽基团的选择性超过移除另一加帽基团。在一些实施方案中,两个基团的加帽同时发生。在
一些实施方案中,两个基团的加帽迭代发生。
些实施方案中,手性助剂的游离胺是使用酸酐(例如苯氧基乙酸酐,即Pac2O)加帽,随后用
相同酸酐对5’羟基加帽。在某些实施方案中,用相同酸酐对5’羟基加帽发生在不同条件下
(例如在一种或更多种其他试剂存在下)。在一些实施方案中,对5’羟基加帽在胺碱存在下
在醚溶剂中(例如NMI(N‑甲基咪唑),在THF中)发生。短语“加帽基团”在本文中可与短语“保
护基”和“封闭基团”互换使用。
酸间键联磷的分子内切割的加帽基团。
的反应而产生的“短聚体”,例如“n‑m”(m和n是整数,并且m<n;n是靶向的寡核苷酸中的碱
基的数目)杂质。存在所述短聚体(尤其“n‑1”)对粗寡核苷酸的纯度具有有害影响,并且使
得寡核苷酸的最终纯化变得繁重,并且通常是低产率的。
的寡核苷酸上切割帽和/或助剂。在一些实施方案中,选择能够促进E2消除反应的加帽基
团,所述反应从增长的寡核苷酸上切割帽和/或助剂。在一些实施方案中,选择能够促进β‑
消除反应的加帽基团,所述反应从增长的寡核苷酸上切割帽和/或助剂。
联具有式I结构。本发明的P修饰步骤发生在装配提供的寡核苷酸期间而非在提供的寡核苷
酸装配完成之后。因此,提供的寡核苷酸的各核苷酸单元可在安置核苷酸单元所处的循环
期间在键联磷处被个体地修饰。
试剂是硼烷‑胺(例如N,N‑二异丙基乙胺(BH3·DIPEA)、硼烷‑吡啶(BH3·Py)、硼烷‑2‑氯吡
啶(BH3·CPy)、硼烷‑苯胺(BH3·An))、硼烷‑醚试剂(例如硼烷‑四氢呋喃(BH3·THF))、硼
烷‑二烷基硫化物试剂(例如BH3·Me2S)、苯胺‑氰基硼烷或三苯基膦‑烷氧羰基硼烷。在一些
实施方案中,叠氮化物试剂包含能够经受随后还原以提供胺基团的叠氮化物基团。
修饰步骤提供具有式I核苷酸间键联的寡核苷酸。
案中,R 是任选地经取代的脂族、芳基、杂环基或杂芳基。在一些实施方案中,R 是任选地
s1 s1
经取代的烷基。在一些实施方案中,R 是任选地经取代的烷基。在一些实施方案中,R 是甲
s1 s1
基。在一些实施方案中,R 是氰基甲基。在一些实施方案中,R 是硝基甲基。在一些实施方
s1 s1
案中,R 是任选地经取代的芳基。在一些实施方案中,R 是任选地经取代的苯基。在一些实
s1 s1 s1
施方案中,R 是苯基。在一些实施方案中,R 是对硝基苯基。在一些实施方案中,R 是对甲
s1 s1
基苯基。在一些实施方案中,R 是对氯苯基。在一些实施方案中,R 是邻氯苯基。在一些实
s1 s1
施方案中,R 是2,4,6‑三氯苯基。在一些实施方案中,R 是五氟苯基。在一些实施方案中,
s1 s1
R 是任选地经取代的杂环基。在一些实施方案中,R 是任选地经取代的杂芳基。
R ‑S(O)2S‑是 在一些实施方案中,R ‑S(O)2S‑是
s1
在一些实施方案中,R ‑S(O)2S‑是
s 1
在 一些 实施 方案 中 ,R ‑ S (O) 2 S‑ 是
s1
在一些实施方案中,R ‑S(O)2S‑是
s1
在一些实施方案中,R ‑S(O)2S‑是
s1 s1
在一些实施方案中,R ‑S(O)2S‑是 在一些实施方案中,R ‑S
s1
(O)2S‑是 在一些实施方案中,R ‑S(O)2S‑是
s1
在一些实施方案中,R ‑S(O)2S‑是
s1
在一些实施方案中,R ‑S(O)2S‑是
s1
在一些实施方案中 ,R ‑S(O)2S‑是
s1
在一些实施方案中,R ‑S(O)2S‑是
R ‑。在一些实施方案中,L是‑S‑R ‑或‑S‑C(O)‑R ‑,其中R 是任选地经取代的C1‑C6亚烷
L3 L3 L3
基。在一些实施方案中,L是‑S‑R ‑或‑S‑C(O)‑R ‑,其中R 是任选地经取代的C1‑C6亚烯基。
L3 L3 L3
在一些实施方案中,L是‑S‑R ‑或‑S‑C(O)‑R ‑,其中R 是任选地经取代的C1‑C6亚烷基,其
中一个或更多个亚甲基单元任选地并独立地被以下替换:任选地经取代的C1‑C6亚烯基、亚
L3
芳基或亚杂芳基。在一些实施方案中,在一些实施方案中,R 是任选地经取代的‑S‑(C1‑C6
亚烯基)‑、‑S‑(C1‑C6亚烷基)‑、‑S‑(C1‑C6亚烷基)‑亚芳基‑(C1‑C6亚烷基)‑、‑S‑CO‑亚芳基‑
(C1‑C6亚烷基)‑或‑S‑CO‑(C1‑C6亚烷基)‑亚芳基‑(C1‑C6亚烷基)‑。在一些实施方案中,硫化
L3 L3 1
试剂具有结构S‑I或S‑II,其中L是‑S‑R ‑或‑S‑C(O)‑R ‑,并且硫原子连接于R。
1
其中硫原子连接于R。
其中硫原子连接于R ;并且R
是
其中硫原子连接于L。
以及本文中所定义和描述。在一些实施方案中,R 是选自以下的任选地经取代的基团:‑S‑
(C1‑C6亚烷基)‑杂环基、‑S‑(C1‑C6亚烯基)‑杂环基、‑S‑(C1‑C6亚烷基)‑N(R’)2、‑S‑(C1‑C6亚
烷基)‑N(R’)3,其中各R,如上所定义并如本文中所述。
中所述。在一些实施方案中,‑L‑R是‑R ‑C(O)‑S‑S‑R ,其中各变量独立地如上所定义和如
本文中所述。
R ‑S‑X‑R ,
羰基;或
在一些实施方案中,硫化试剂是
硫化试剂修饰:
羰基;或
如‑S或=S)相反,在硫化期间转移至磷的部分是经取代的硫(例如‑SR)。
方案中,供根据本发明使用的硫化试剂的特征在于试剂易于通过例如重结晶纯化。在某些
实施方案中,供根据本发明使用的硫化试剂的特征在于其基本上不含含硫杂质。在一些实
施方案中,基本上不含含硫杂质的硫化试剂表现出提高的效率。
以安置相应磷酸二酯键联。在一些实施方案中,氧化步骤以类似于普通寡核苷酸合成的方
式进行。在一些实施方案中,氧化步骤包括使用I2。在一些实施方案中,氧化步骤包括使用I2
和吡啶。在一些实施方案中,氧化步骤包括使用含0.02M I2的THF/吡啶/水(70:20:10‑v/v/
v)共溶剂系统。方案I‑c中描述示例性循环。
中, 在循环退出之后在标准脱保护/释放操作期间被转化成硫代磷酸二酯
键联。以下进一步描述实例。
一个或更多个磷酸二酯键联和一个或更多个硫代磷酸二酯键联,其中至少一个磷酸二酯键
联当自3’至5’合成时安置在所有硫代磷酸二酯键联之后。为了合成所述手性控制的寡核苷
酸,在一些实施方案中,将一个或更多个修饰步骤任选地替换成氧化步骤以安置相应磷酸
二酯键联,并且安置各硫代磷酸二酯键联的硫代磷酸酯前体。在一些实施方案中,硫代磷酸
酯前体在达成所需寡核苷酸长度之后被转化成硫代磷酸二酯键联。在一些实施方案中,在
循环期间或在循环退出之后的脱保护/释放步骤使硫代磷酸酯前体转化成硫代磷酸二酯键
联。在一些实施方案中,硫代磷酸酯前体的特征在于其能够通过β‑消除路径来移除。在一些
实施方案中,硫代磷酸酯前体是 如本领域普通技术人员所了解,在合成期
间使用例如 的硫代磷酸酯前体的一个益处是在某些条件下,
比硫代磷酸酯更稳定。
2‑(对硝基苯基)乙基(NPE或Npe)、2‑苯基乙基、3‑(N‑叔丁基甲酰胺基)‑1‑丙基、4‑氧代戊
基、4‑甲基硫基‑1‑丁基、2‑氰基‑1,1‑二甲基乙基、4‑N‑甲基氨基丁基、3‑(2‑吡啶基)‑1‑丙
基、2‑[N‑甲基‑N‑(2‑吡啶基)]氨基乙基、2‑(N‑甲酰基,N‑甲基)氨基乙基、4‑[N‑甲基‑N‑
(2,2,2‑三氟乙酰基)氨基]丁基。以下进一步描述实例。
方案中,硫化试剂的溶液通过在腈溶剂(例如乙腈)中混合硫化试剂(例如如本文中所述的
硫代磺酸酯衍生物)与BSTFA(N,O‑双‑三甲基硅烷基‑三氟乙酰胺)来制备。在一些实施方案
s2 s3
中,不包括BSTFA。例如,本发明人已发现反应性相对更大的通式R ‑S‑S(O)2‑R 硫化试剂经
s2
常可以在不存在BSTFA的情况下成功参与硫化反应。仅给出一个实例,发明人已证明当R 是
s3
对硝基苯基,并且R 是甲基时,那么不需要BSTFA。鉴于本公开,本领域技术人员将易于能够
确定不需要BSTFA的其他情况和/或硫化试剂。
的高温下进行。
些实施方案中,操作硫化反应约1分钟至约30分钟。在一些实施方案中,操作硫化反应约1分
钟至约25分钟。在一些实施方案中,操作硫化反应约1分钟至约20分钟。在一些实施方案中,
操作硫化反应约1分钟至约15分钟。在一些实施方案中,操作硫化反应约1分钟至约10分钟。
在一些实施方案中,操作硫化反应约5分钟至约60分钟。
20分钟。在一些实施方案中,硫化反应运行约25分钟。在一些实施方案中,硫化反应运行约
30分钟。在一些实施方案中,硫化反应运行约35分钟。在一些实施方案中,硫化反应运行约
40分钟。在一些实施方案中,硫化反应运行约45分钟。在一些实施方案中,硫化反应运行约
50分钟。在一些实施方案中,硫化反应运行约55分钟。在一些实施方案中,硫化反应运行约
60分钟。
定的产物是包含一个或更多个具有式I‑c结构的核苷酸间键联的手性控制的寡核苷酸。
合物。在一些实施方案中,硫化反应提供纯度是至少90%的粗四核苷酸产物组合物。在一些
实施方案中,硫化反应提供纯度是至少70%的粗十二核苷酸产物组合物。在一些实施方案
中,硫化反应提供纯度是至少50%的粗二十核苷酸产物组合物。
闭,所述去封闭步骤必须发生在再进入循环之前。重复去封闭、偶联、加帽和修饰的过程直
至增长的寡核苷酸达到所需长度,此时寡核苷酸可立刻自固体支持物切割,或出于纯化目
的保持连接于载体并稍后切割。在一些实施方案中,一个或更多个保护基存在于一个或更
多个核苷酸碱基上,并且自载体切割寡核苷酸以及将碱基脱保护发生在单一步骤中。在一
些实施方案中,一个或更多个保护基存在于一个或更多个核苷酸碱基上,并且自载体切割
寡核苷酸以及将碱基脱保护发生在一个以上步骤中。在一些实施方案中,脱保护以及自载
体切割发生在使用例如一种或更多种胺碱的碱性条件下。在某些实施方案中,所述一种或
更多种胺碱包括丙胺。在某些实施方案中,一种或更多种胺碱包括吡啶。
案中,自载体切割和/或脱保护发生在约50℃至约70℃的高温下。在一些实施方案中,自载
体切割和/或脱保护发生在约60℃的高温下。在一些实施方案中,自载体切割和/或脱保护
发生在环境温度下。
步骤中移除;以及(2)倾向于经受副反应和/或受随后化学过程干扰的不稳定磷‑助剂中间
体得以避免。因此,在各循环期间移除手性助剂使得总合成更高效。
应。
的情况下)中,pKa(25℃,在水中)值为‑0.6(三氟乙酸)至4.76(乙酸)的羧酸、烷基磺酸、芳
基磺酸、磷酸及其衍生物、膦酸及其衍生物、烷基膦酸及其衍生物、芳基膦酸及其衍生物、次
膦酸、二烷基次膦酸和二芳基次膦酸。酸化步骤中使用的酸的浓度(1%至80%)取决于酸的
酸性。必须考虑酸强度,因为强酸条件将导致脱嘌呤/脱嘧啶,其中嘌呤基或嘧啶基碱基从
a1 a1 a3
核糖环和/或其他糖环上切割。在一些实施方案中,酸选自R COOH、R SO3H、R SO3H、
a1 a2
其中R 和R 各自独立地是氢或任选地经取代的烷
a3
基或芳基,并且R 是任选地经取代的烷基或芳基。
易斯酸是Zn(X)2,其中X是Cl、Br、I或CF3SO3。
80%乙酸。选择这个步骤中使用的任何布仑斯特酸或路易斯酸的浓度以使酸浓度不超过导
致从糖部分上切割核苷碱基的浓度。
加有机溶剂中的3%二氯乙酸或三氯乙酸。在一些实施方案中,酸化包括添加有机溶剂中的
约0.1%至约10%二氯乙酸或三氯乙酸。在一些实施方案中,酸化包括添加有机溶剂中的
3%三氯乙酸。在一些实施方案中,酸化包括添加机溶剂中的约0.1%至约10%三氯乙酸。在
一些实施方案中,酸化包括添加水中的80%乙酸。在一些实施方案中,酸化包括添加水中的
约50%至约90%、或约50%至约80%、约50%至约70%、约50%至约60%、约70%至约90%
乙酸。在一些实施方案中,酸化包括进一步向酸性溶剂中添加阳离子清除剂。在某些实施方
案中,阳离子清除剂可以是三乙基硅烷或三异丙基硅烷。在一些实施方案中,封闭基团通过
包括添加有机溶剂中的1%三氟乙酸的酸化来去封闭。在一些实施方案中,封闭基团是通过
包括添加有机溶剂中的3%二氯乙酸的酸化来去封闭。在一些实施方案中,封闭基团是通过
包括添加有机溶剂中的3%三氯乙酸的酸化来去封闭。在一些实施方案中,封闭基团是通过
包括添加二氯甲烷中的3%三氯乙酸的酸化来去封闭。
持物。在一些实施方案中,溶剂是卤化溶剂(例如二氯甲烷)。在某些实施方案中,溶剂包含
一定量的酸。在一些实施方案中,溶剂包含一定量的有机酸,例如三氯乙酸。在某些实施方
案中,酸以约1%至约20w/v%的量存在。在某些实施方案中,酸以约1%至约10%w/v的量存
在。在某些实施方案中,酸以约1%至约5w/v%的量存在。在某些实施方案中,酸以约1至约
3w/v%的量存在。在某些实施方案中,酸以约3w/v%的量存在。本文进一步描述用于将羟基
去封闭的方法。在一些实施方案中,酸以3w/v%存在于二氯甲烷中。
定反应条件呈惰性,并且可稍后自分子中的所述官能基移除而基本上不损害分子的其余部
分(参见例如Green和Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,第2版,John
Wiley&Sons,New York,1991)。例如,氨基可用氮封闭基团封闭,所述封闭基团如苯二甲酰
亚氨基、9‑芴基甲氧基羰基(FMOC)、三苯基甲基亚磺酰基、t‑BOC、4,4’‑二甲氧基三苯甲基
(DMTr)、4‑甲氧基三苯甲基(MMTr)、9‑苯基黄嘌呤‑9‑基(Pixyl)、三苯甲基(Tr)或9‑(对甲
氧基苯基)黄嘌呤‑9‑基(MOX)。羧基可被保护为乙酰基。羟基可被保护,如四氢吡喃基
(THP)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、1‑[(2‑氯‑4‑甲基)苯基]‑4‑甲氧基哌啶‑4‑基
(Ctmp)、1‑(2‑氟苯基)‑4‑甲氧基哌啶‑4‑基(Fpmp)、1‑(2‑氯乙氧基)乙基、3‑甲氧基‑1,5‑
二甲氧甲酰基戊‑3‑基(MDP)、双(2‑乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、三异丙基硅烷基氧基甲基
(TOM)、1‑(2‑氰基乙氧基)乙基(CEE)、2‑氰基乙氧基甲基(CEM)、[4‑(N‑二氯乙酰基‑N‑甲基
氨基)苄基氧基]甲基、2‑氰基乙基(CN)、新戊酰氧基甲基(PivOM)、乙酰丙酰氧基甲基
(ALE)。已描述了其他代表性羟基封闭基团(参见例如Beaucage等,Tetrahedron,1992,46,
2223)。在一些实施方案中,羟基封闭基团是酸不稳定性基团,如三苯甲基、单甲氧基三苯甲
基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、9‑苯基黄嘌呤‑9‑基(Pixyl)和9‑(对甲氧基苯
基)黄嘌呤‑9‑基(MOX)。化学官能团也可通过以前体形式包括它们来封闭。因此,叠氮基可
被视为胺的封闭形式,因为叠氮基易于转化成胺。核酸合成中利用的其他代表性保护基是
已知的(参见例如Agrawal等编,Protocols for Oligonucleotide Conjugates,Humana
Press,New Jersey,1994,第26卷,第1‑72页)。
件以选择性移除某些封闭基团。
性,也不是碱性的条件下切割,例如可用氟化物盐或氢氟酸络合物切割。在一些实施方案
中,如果存在,那么核苷碱基封闭基团可在提供的寡核苷酸装配之后在碱或碱性溶剂存在
下切割。在某些实施方案中,一个或更多个核苷碱基封闭基团的特征在于其可在提供的寡
核苷酸装配之后在碱或碱性溶剂存在下切割,但对在提供的寡核苷酸装配期间发生的一个
或更多个早先脱保护步骤的特定条件稳定。
碱基不需要一个或更多个封闭基团。
中的丙胺。在一些实施方案中,自固体支持物切割包括使用于吡啶中的20%丙胺。在一些实
施方案中,自固体支持物切割包括使用于无水吡啶中的丙胺。在一些实施方案中,自固体支
持物切割包括使用于无水吡啶中的20%丙胺。在一些实施方案中,自固体支持物切割包括
使用极性非质子性溶剂,如乙腈、NMP、DMSO、砜和/或卢剔啶。在一些实施方案中,自固体支
持物切割包括使用溶剂(例如极性非质子性溶剂)和一种或更多种伯胺(例如C1‑10胺)、和/
或甲氧基胺、肼和纯无水氨中的一个或更多个。
吡啶中的20%丙胺。在一些实施方案中,将寡核苷酸脱保护包括使用于无水吡啶中的丙胺。
在一些实施方案中,将寡核苷酸脱保护包括使用于无水吡啶中的20%丙胺。
进行。在一些实施方案中,自固体支持物切割寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在高于约30
℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或100℃下进行。在一些实施方案中,自固体支持物切
割寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在约30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或100℃下
进行。在一些实施方案中,自固体支持物切割寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在约40‑80℃
下进行。在一些实施方案中,自固体支持物切割寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在约50‑70
℃下进行。在一些实施方案中,自固体支持物切割寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在约60
℃下进行。
施方案中,进行自固体支持物切割寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约0.1‑5小时。在一些实施
方案中,进行自固体支持物切割寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约3‑10小时。在一些实施方
案中,进行自固体支持物切割寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约5‑15小时。在一些实施方案
中,进行自固体支持物切割寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约10‑20小时。在一些实施方案
中,进行自固体支持物切割寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约15‑25小时。在一些实施方案
中,进行自固体支持物切割寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约20‑40小时。在一些实施方案
中,进行自固体支持物切割寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约2小时。在一些实施方案中,进
行自固体支持物切割寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约5小时。在一些实施方案中,进行自固
体支持物切割寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约10小时。在一些实施方案中,进行自固体支
持物切割寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约15小时。在一些实施方案中,进行自固体支持物
切割寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约18小时。在一些实施方案中,进行自固体支持物切割
寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约24小时。
在一些实施方案中,自固体支持物切割寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在室温下进行约5‑
48小时。在一些实施方案中,自固体支持物切割寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在室温下
进行约10‑24小时。在一些实施方案中,自固体支持物切割寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是
在室温下进行约18小时。在一些实施方案中,自固体支持物切割寡核苷酸或将寡核苷酸脱
保护是在高温下进行超过0.1小时、1小时、2小时、5小时、10小时、15小时、20小时、24小时、
30小时或40小时。在一些实施方案中,自固体支持物切割寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是
在高温下进行约0.5‑5小时。在一些实施方案中,自固体支持物切割寡核苷酸或将寡核苷酸
脱保护是在约60℃下进行约0.5‑5小时。在一些实施方案中,自固体支持物切割寡核苷酸或
将寡核苷酸脱保护是在约60℃下进行约2小时。
24小时、30小时或40小时。示例性条件是于吡啶中的20%丙胺在室温下约18小时,以及于吡
啶中的20%丙胺在60℃下约18小时。
形成磷酸二酯键联。循环产物C‑3可再进入循环C以安置更多磷酸二酯键联,或进入其他循
环以安置其他类型的核苷酸间键联,或去到循环出口。
下结构:
一些实施方案中,使用硫代磷酸二酯前体会改进手性控制的寡核苷酸合成的产率。在一些
实施方案中,使用硫代磷酸二酯前体会改进手性控制的寡核苷酸合成的产物纯度。
I‑d中描述示例性循环。以下描述更多实例。方案I‑d.手性控制的寡核苷酸合成中的硫代磷
酸二酯前体。
硫代磷酸二酯和磷酸二酯是连续的——在其之间可形成其他核苷酸间键联。在方案I‑d中,
替代硫代磷酸二酯键联而安置硫代磷酸二酯前体 在一些实施方案中,所
述替代提供在某些步骤,例如氧化步骤期间的提高的合成效率。在一些实施方案中,使用硫
代磷酸二酯前体通常会改进手性控制的寡核苷酸在合成和/或储存期间的稳定性。在循环
退出之后,在脱保护/释放期间,硫代磷酸二酯前体转化成硫代磷酸二酯键联。在一些实施
方案中,使用硫代磷酸二酯前体是有益的,甚至当磷酸二酯键联不存在于手性控制的寡核
苷酸中,或在合成期间不需要氧化步骤时。
亚磷酰胺具有结构
至少约30%的提供的粗组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中,至少约40%的
提供的粗组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中,至少约50%的提供的粗组合
物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中,至少约60%的提供的粗组合物具有特定寡
核苷酸类型。在一些实施方案中,至少约70%的提供的粗组合物具有特定寡核苷酸类型。在
一些实施方案中,至少约80%的提供的粗组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案
中,至少约90%的提供的粗组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中,至少约95%
的提供的粗组合物具有特定寡核苷酸类型。
3%的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中,至少约4%的提供的组合
物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中,至少约5%的提供的组合物具有特定寡核苷
酸类型。在一些实施方案中,至少约10%的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实
施方案中,至少约20%的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中,至少约
30%的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中,至少约40%的提供的组
合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中,至少约50%的提供的组合物具有特定寡
核苷酸类型。在一些实施方案中,至少约60%的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一
些实施方案中,至少约70%的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中,至
少约80%的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中,至少约90%的提供
的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中,至少约95%的提供的组合物具有特
定寡核苷酸类型。
的寡核苷酸组合物,其中所述寡核苷酸具有共同骨架手性中心样式,所述共同骨架手性中
心样式增强其稳定性和/或生物活性。在一些实施方案中,骨架手性中心样式提供了出人意
料的高的稳定性。在一些实施方案中,骨架手性中心样式出人意料地提供了极大提高的活
性。在一些实施方案中,骨架手性中心样式提供了提高的稳定性和活性两者。在一些实施方
案中,当寡核苷酸用于切割核酸聚合物时,寡核苷酸的骨架手性中心样式本身出人意料地
改变了靶核酸聚合物的切割样式。在一些实施方案中,骨架手性中心样式有效阻止第二位
点的切割。在一些实施方案中,骨架手性中心样式产生新切割位点。在一些实施方案中,骨
架手性中心样式最小化了切割位点的数目。在一些实施方案中,骨架手性中心样式最小化
了切割位点的数目,以使得靶核酸聚合物在靶核酸聚合物与寡核苷酸互补的序列内的仅一
个位点切割。在一些实施方案中,骨架手性中心样式提高了切割位点的切割效率。在一些实
施方案中,寡核苷酸的骨架手性中心样式改善了靶核酸聚合物的切割。在一些实施方案中,
骨架手性中心样式提高了选择性。在一些实施方案中,骨架手性中心样式最小化了脱靶效
应。在一些实施方案中,骨架手性中心样式提高了选择性,例如通过点突变或单核苷酸多态
性(SNP)区别的靶序列之间的切割选择性。在一些实施方案中,骨架手性中心样式提高了选
择性,例如通过仅一个点突变或单核苷酸多态性(SNP)区别的靶序列之间的切割选择性。
酸:
键联样式和所述共同骨架手性中心样式;以及
位点处切割的百分比不同。在一些实施方案中,切割样式具有多个切割位点,并且每个位点
处切割的百分比相同。在一些实施方案中,切割样式具有仅一个切割位点。在一些实施方案
中,切割样式彼此的差异在于其具有不同数目的切割位点。在一些实施方案中,切割样式彼
此的差异在于至少一个切割位置不同。在一些实施方案中,切割样式彼此的差异在于至少
一个共同切割位点处切割的百分比不同。在一些实施方案中,切割样式彼此的差异在于其
具有不同数目的切割位点,和/或至少一个切割位置不同,和/或至少一个共同切割位点处
切割的百分比不同。
发生所述核酸聚合物的切割的条件下进行。
二手性控制的寡核苷酸组合物包含通过具有以下来定义的寡核苷酸:
键联样式和所述共同骨架手性中心样式;以及
组合物包含具有特定碱基序列和长度的寡核苷酸,所述特定碱基序列是或包含与所述靶序
列互补的序列,所述方法包括:
度的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物,所述组合物富含单一寡核苷酸类型的寡核苷酸,
所述寡核苷酸的特征在于:
切割。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物在靶序列中的切割位点提供了提高
的切割速率。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物在靶序列中的切割位点提供
了提高的效率。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物在切割靶核酸聚合物中提
供了提高的周转。
观察到的切割样式。在一些实施方案中,参照寡核苷酸组合物是共有手性控制的寡核苷酸
组合物的共同碱基序列和长度的寡核苷酸的手性未控制(例如,立构无规)的寡核苷酸组合
物。在一些实施方案中,参照寡核苷组合物是共有共同序列和长度的寡核苷酸的基本上外
消旋的制备物。
物。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物的寡核苷酸与待切割核酸聚合
物形成双链体。
些实施方案中,酶是Argonaute蛋白。在一些实施方案中,酶是Ago2。在一些实施方案中,酶
在蛋白质复合物中。示例性蛋白质复合物是RNA诱导的沉默复合物(RISC)。
序列变异的核酸聚合物。在一些实施方案中,核酸聚合物是来自等位基因的转录物。在一些
实施方案中,可以通过提供的手性控制的寡核苷酸组合物选择性靶向来自不同等位基因的
转录物。
一些实施方案中,切割位点在RpSpSp骨架手性中心序列上游附近。在一些实施方案中,切割
位点在RpSpSP骨架手性中心序列上游5个碱基对以内。在一些实施方案中,切割位点在
RpSpSp骨架手性中心序列上游4个碱基对以内。在一些实施方案中,切割位点在RpSpSp骨架
手性中心序列上游3个碱基对以内。在一些实施方案中,切割位点在RpSpSp骨架手性中心序
列上游2个碱基对以内。在一些实施方案中,切割位点在RpSpSp骨架手性中心序列上游1个
碱基对以内。在一些实施方案中,切割位点在RpSpSp骨架手性中心序列下游附近。在一些实
施方案中,切割位点在RpSpSp骨架手性中心序列下游5个碱基对以内。在一些实施方案中,
切割位点在RpSpSp骨架手性中心序列下游4个碱基对以内。在一些实施方案中,切割位点在
RpSpSp骨架手性中心序列下游3个碱基对以内。在一些实施方案中,切割位点在RpSpSp骨架
手性中心序列下游2个碱基对以内。在一些实施方案中,切割位点在RpSpSp骨架手性中心序
列下游1个碱基对以内。因此,本发明尤其提供了对靶序列内切割位点的控制。在一些实施
方案中,示例性切割描述在图21中。在一些实施方案中,图21中描述的切割表示RpSpSp骨架
手性中心序列下游2个碱基对位点处的切割。如本公开内容中广泛描述的,RpSpSp骨架手性
中心序列可以存在以下单个或重复单元:(Np)m(Rp)n(Sp)t、(Np)t(Rp)n(Sp)m、(Sp)m(Rp)n
(SP)t、(Sp)t(Rp)n(Sp)m、(Rp)n(Sp)m、(Rp)m(Sp)n、(Sp)mRp和/或Rp(Sp)m,其各自独立地
在上文和本文中描述。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物在靶分子中
RpSPSP骨架手性中心下游2个碱基对位点处产生新切割位点(例如,参见图21),其中如果使
用参照(例如,手性未控制的)寡核苷酸组合物,所述新切割位点不存在(无法检出)。在一些
实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物提高了靶分子中RpSpSp骨架手性中心下游
2个碱基对切割位点处的切割(例如,参见图21),其中该位点的切割以比当使用参照(例如,
手性未控制的)寡核苷酸组合物时更高的百分比发生。在一些实施方案中,提供的手性控制
的寡核苷酸组合物在该位点处的切割是参照寡核苷酸组合物的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、
20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500或1000倍(例如,当通过位点处的切割百分比测量
时)。在一些实施方案中,与使用参照(例如,手性未控制的)寡核苷酸组合物相比,提供的手
性控制的寡核苷酸组合物在靶分子中RpSpSp骨架手性中心下游2个碱基对切割位点处提供
了加速的切割(例如,参见图21)。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物的
切割比参照寡核苷酸组合物快至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、
200、500或1000倍。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物在靶分子中
RpSpSp骨架手性中心下游2个碱基对处的切割位点(例如,参见图21)是当使用参照(例如,
手性未控制的)寡核苷酸组合物时的切割位点。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核
苷酸组合物在靶分子中RpSpSP骨架手性中心下游2个碱基对处的切割位点(例如,参见图
21)在当使用参照(例如,手性未控制的)寡核苷酸组合物时的切割位点的1个碱基对以内。
在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物在靶分子中RpSpSP骨架手性中心下
游2个碱基对处的切割位点(例如,参见图21)在当使用参照(例如,手性未控制的)寡核苷酸
组合物时的切割位点的2个碱基对以内。在一些实施方案中,其在3个碱基对以内。在一些实
施方案中,其在4个碱基对以内。在一些实施方案中,其在5个碱基对以内。在一些实施方案
中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物在靶分子中RpSpSP骨架手性中心下游2个碱基对处
的切割位点是当使用参照(例如,手性未控制的)寡核苷酸组合物时的主要切割位点中的一
个。在一些实施方案中,该位点是当使用参照(例如,手性未控制的)寡核苷酸组合物时具有
最高切割百分比的切割位点。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物在靶
分子中RpSpSP骨架手性中心下游2个碱基对处的切割位点是当使用参照(例如,手性未控制
的)寡核苷酸组合物时具有较高切割速率的切割位点中的一个。在一些实施方案中,该位点
是当使用参照(例如,手性未控制的)寡核苷酸组合物时具有最高切割速率的切割位点。
案中,相对于参照(例如,手性未控制/立构无规的)组合物,提供的手性控制的寡核苷酸组
合物选择性提高单一位点处的切割。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物通过
提供更高切割速率提高位点处的切割。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物通
过在位点处提供更高切割百分比提高在所述位点处的切割。位点处的切割百分比可以通过
本领域中周知和熟悉的多种方法确定。在一些实施方案中,通过分析切割产物确定位点处
的切割百分比,例如,通过图18、图19和图30中示出的HPLC‑MS;还参见示例性切割图,例如
图9、图10、图11、图14、图22、图25和图26。在一些实施方案中,提高是相对于参照寡核苷酸
组合物。在一些实施方案中,提高是相对于另一切割位点。在一些实施方案中,提供的手性
控制的寡核苷酸组合物提高了为参照寡核苷酸组合物的优选切割位点的位点处的切割。在
一些实施方案中,优选切割位点或优选切割位点组是与一个或更多个其他切割位点相比具
有相对更高切割百分比的一个或更多个位点。在一些实施方案中,优选切割位点可以指示
酶的偏好性。例如,对于RNase H,当使用DNA寡核苷酸时,得到的切割位点可能指示RNase H
的偏好性。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物提高了为酶的优选切割
位点的位点处的切割。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物提高了不是
参照寡核苷酸组合物的优选切割位点的位点处的切割。在一些实施方案中,提供的手性控
制的寡核苷酸组合物提高了不是参照寡核苷酸组合物的优选切割位点的位点处的切割,有
效产生了当使用参照寡核苷酸组合物时不存在的新切割位点。在一些实施方案中,提供的
手性控制的寡核苷酸组合物提高了距离靶向突变或SNP5个碱基对以内的位点处的切割,从
而提高了不期望的靶寡核苷酸的选择性切割。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核
苷酸组合物提高了距离靶向突变或SNP 4个碱基对以内的位点处的切割,从而提高了不期
望的靶寡核苷酸的选择性切割。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物提
高了距离靶向突变或SNP 3个碱基对以内的位点处的切割,从而提高了不期望的靶寡核苷
酸的选择性切割。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物提高了距离靶向
突变或SNP 2个碱基对以内的位点处的切割,从而提高了不期望的靶寡核苷酸的选择性切
割。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物提高了靶向突变或SNP的紧邻上
游或下游的位点处的切割,从而提高了不期望的靶寡核苷酸的选择性切割(例如图22,面板
D,muRNA)。
案中,相对于参照(例如,手性未控制/立构无规的)组合物,提供的手性控制的寡核苷酸组
合物选择性抑制单一位点处的切割。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物通过
提供更低切割速率抑制位点处的切割。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物通
过在位点处提供更低切割百分比抑制在所述位点处的切割。在一些实施方案中,抑制是相
对于参照寡核苷酸组合物。在一些实施方案中,抑制是相对于另一切割位点。在一些实施方
案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物抑制为参照寡核苷酸组合物的优选切割位点的位
点处的切割。在一些实施方案中,优选切割位点或优选切割位点组是与一个或更多个其他
切割位点相比具有相对更高切割百分比的一个或更多个位点。在一些实施方案中,优选切
割位点可以指示酶的偏好性。例如,对于RNase H,当使用DNA寡核苷酸时,得到的切割位点
可能指示RNase H的偏好性。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物抑制了
为酶的优选切割位点的位点处的切割。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组
合物抑制不是参照寡核苷酸组合物的优选切割位点的位点处的切割。在一些实施方案中,
提供的手性控制的寡核苷酸组合物抑制参照寡核苷酸组合物的所有切割位点。在一些实施
方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物一般提高靶寡核苷酸的切割。在一些实施方案
中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物一般抑制非寡核苷酸的切割。在一些实施方案中,提
供的手性控制的寡核苷酸组合物提高靶寡核苷酸的切割并抑制非寡核苷酸的切割。使用图
22面板D为例,切割的靶寡核苷酸是muRNA,而非靶寡核苷酸是wtRNA。在包含具有突变或SNP
的患病组织的对象中,用于切割的靶寡核苷酸可以是具有突变或SNP的转录物,而非靶寡核
苷酸可以是不具有突变或SNP的正常转录物,例如健康组织中表达的那些。
供的寡核苷酸是单聚体、交替聚体、嵌段聚体、间隔聚体、半聚体和跳跃聚体。在一些实施方
案中,提供的寡核苷酸包含一个或更多个单聚体、交替聚体、嵌段聚体、间隔聚体、半聚体或
跳跃聚体或者其任意组合。在一些实施方案中,除了本文的骨架手性中心样式以外,提供的
寡核苷酸是半聚体。在一些实施方案中,除了本文中所述骨架手性中心样式以外,提供的寡
核苷酸是具有经修饰糖部分的5’‑半聚体。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸是具有2’‑
修饰糖部分的5’‑半聚体。合适的修饰是本领域中周知的,例如,本申请中描述的那些。在一
些实施方案中,修饰是2’‑F。在一些实施方案中,修饰是2’‑MOE。在一些实施方案中,修饰是
s‑cEt。
对于同一靶核酸序列的其他等位基因限定该等位基因的特异性核苷酸特征序列元件,所述
方法包括以下步骤:
于:
位基因和同一核酸序列的另一等位基因二者之转录物的体系相接触时,所述特定等位基因
之转录物的抑制水平大于对于同一核酸序列的另一等位基因所观察到的抑制水平。
对于同一靶核酸序列的其他等位基因限定该等位基因的特异性核苷酸特征序列元件,所述
方法包括以下步骤:
于:
位基因和同一核酸序列的另一等位基因二者之转录物的体系相接触时,所述特定等位基因
之转录物的抑制水平大于对于同一核酸序列的另一等位基因所观察到的抑制水平,
对于同一靶核酸序列的其他等位基因限定该等位基因的特异性核苷酸特征序列元件,所述
方法包括以下步骤:
于:
靶核酸序列之转录物的体系相接触时,所述组合物显示出对所述特定等位基因之转录物的
以下抑制水平:
对于同一靶核酸序列的其他等位基因限定该等位基因的特异性核苷酸特征序列元件,所述
方法包括以下步骤:
于:
靶核酸序列之转录物的体系相接触时,所述组合物显示出对所述特定等位基因之转录物的
以下抑制水平:
显子中。在一些实施方案中,特异性核苷酸特征序列元件部分在外显子中,部分在内含子
中。在一些实施方案中,特异性核苷酸特征序列元件包含将一个等位基因与其他等位基因
区别开的突变。在一些实施方案中,突变是缺失。在一些实施方案中,突变是插入。在一些实
施方案中,突变是点突变。在一些实施方案中,特异性核苷酸特征序列元件包含将一个等位
基因与其他等位基因区别开的至少一个单核苷酸多态性(SNP)。
控制的寡核苷酸组合物包含通过具有以下来定义的寡核苷酸:
列互补的序列,其中存在于所述转录物中的所述序列包含SNP位点;
键联样式和所述共同骨架手性中心样式;以及
靶基因的其他等位基因限定该等位基因的特异性核苷酸特征序列元件,所述方法包括以下
步骤:
位基因和同一基因的另一等位基因二者之转录物的体系相接触时,所述特定等位基因之转
录物的抑制水平比对于同一基因的另一等位基因所观察到的抑制水平高至少2倍。
靶基因的其他等位基因限定该等位基因的特异性核苷酸特征序列元件,所述方法包括以下
步骤:
位基因和同一基因的另一等位基因二者之转录物的体系相接触时,所述特定等位基因之转
录物的抑制水平比对于同一基因的另一等位基因所观察到的抑制水平高至少2倍,
靶基因的其他等位基因限定该等位基因的特异性核苷酸特征序列元件,所述方法包括以下
步骤:
位基因和同一基因的另一等位基因二者之转录物的体系相接触时,所述特定等位基因之转
录物的抑制水平比对于同一基因的另一等位基因所观察到的抑制水平高至少2倍,
靶基因的其他等位基因限定该等位基因的特异性核苷酸特征序列元件,所述方法包括以下
步骤:
靶基因之转录物的体系相接触时,所述组合物显示出对所述特定等位基因之转录物表达的
以下抑制水平:
少2倍。
靶基因的其他等位基因限定该等位基因的特异性核苷酸特征序列元件,所述方法包括以下
步骤:
靶基因之转录物的体系相接触时,所述组合物显示出对所述特定等位基因之转录物表达的
以下抑制水平:
少2倍,
靶基因的其他等位基因限定该等位基因的特异性核苷酸特征序列元件,所述方法包括以下
步骤:
靶基因之转录物的体系相接触时,所述组合物显示出对所述特定等位基因之转录物表达的
以下抑制水平:
少2倍,
为至少1.1倍,其中检测到来自所述特定等位基因之转录物的量在所述组合物存在时比其
不存在时低1.1倍。在一些实施方案中,水平为至少1.2倍。在一些实施方案中,水平为至少
1.3倍。在一些实施方案中,水平为至少1.4倍。在一些实施方案中,水平为至少1.5倍。在一
些实施方案中,水平为至少1.6倍。在一些实施方案中,水平为至少1.7倍。在一些实施方案
中,水平为至少1.8倍。在一些实施方案中,水平为至少1.9倍。在一些实施方案中,水平为至
少2倍。在一些实施方案中,水平为至少3倍。在一些实施方案中,水平为至少4倍。在一些实
施方案中,水平为至少5倍。在一些实施方案中,水平为至少6倍。在一些实施方案中,水平为
至少7倍。在一些实施方案中,水平为至少8倍。在一些实施方案中,水平为至少9倍。在一些
实施方案中,水平为至少10倍。在一些实施方案中,水平为至少11倍。在一些实施方案中,水
平为至少12倍。在一些实施方案中,水平为至少13倍。在一些实施方案中,水平为至少14倍。
在一些实施方案中,水平为至少1 5倍。在一些实施方案中,水平为至少20倍。在一些实施方
案中,水平为至少30倍。在一些实施方案中,水平为至少40倍。在一些实施方案中,水平为至
少50倍。在一些实施方案中,水平为至少75倍。在一些实施方案中,水平为至少100倍。在一
些实施方案中,水平为至少150倍。在一些实施方案中,水平为至少200倍。在一些实施方案
中,水平为至少300倍。在一些实施方案中,水平为至少400倍。在一些实施方案中,水平为至
少500倍。在一些实施方案中,水平为至少750倍。在一些实施方案中,水平为至少1000倍。在
一些实施方案中,水平为至少5000倍。
平为对于同一核酸序列的另一等位基因所观察到的抑制水平的至少1.1倍。在一些实施方
案中,水平为至少1.2倍。在一些实施方案中,水平为至少1.3倍。在一些实施方案中,水平为
至少1.4倍。在一些实施方案中,水平为至少1.5倍。在一些实施方案中,水平为至少1.6倍。
在一些实施方案中,水平为至少1.7倍。在一些实施方案中,水平为至少1.8倍。在一些实施
方案中,水平为至少1.9倍。在一些实施方案中,水平为至少2倍。在一些实施方案中,水平为
至少3倍。在一些实施方案中,水平为至少4倍。在一些实施方案中,水平为至少5倍。在一些
实施方案中,水平为至少6倍。在一些实施方案中,水平为至少7倍。在一些实施方案中,水平
为至少8倍。在一些实施方案中,水平为至少9倍。在一些实施方案中,水平为至少10倍。在一
些实施方案中,水平为至少11倍。在一些实施方案中,水平为至少12倍。在一些实施方案中,
水平为至少13倍。在一些实施方案中,水平为至少14倍。在一些实施方案中,水平为至少15
倍。在一些实施方案中,水平为至少20倍。在一些实施方案中,水平为至少30倍。在一些实施
方案中,水平为至少40倍。在一些实施方案中,水平为至少50倍。在一些实施方案中,水平为
至少75倍。在一些实施方案中,水平为至少100倍。在一些实施方案中,水平为至少150倍。在
一些实施方案中,水平为至少200倍。在一些实施方案中,水平为至少300倍。在一些实施方
案中,水平为至少400倍。在一些实施方案中,水平为至少500倍。在一些实施方案中,水平为
至少750倍。在一些实施方案中,水平为至少1000倍。在一些实施方案中,水平为至少5000
倍。
施方案中,特定等位基因之转录物的抑制水平相对于当所述组合物不存在时为至少1.1倍,
并且为对于同一核酸序列的另一等位基因所观察到的抑制水平的至少1.1倍。在一些实施
方案中,各倍数独立地如上文所述。
无论怎样可以包含一个或更多个细胞、组织、器官或生物体。在一些实施方案中,体系包含
一个或更多个细胞。在一些实施方案中,体系包含一个或更多个组织胞。在一些实施方案
中,体系包含一个或更多个器官。在一些实施方案中,体系包含一个或更多个生物体。在一
些实施方案中,体系是对象。
酸特征序列元件的序列,而不是使用全长转录物。在一些实施方案中,测定是生化测定。在
一些实施方案中,测定是生化测定,其中在手性控制的寡核苷酸组合物的存在下测试酶对
核酸聚合物如转录物或来自转录物并且包含特异性核苷酸特征序列元件的序列的切割。
异使来自特定等位基因的转录物区别于来自其他等位基因的转录物。在一些实施方案中,
在该序列差异附近的位点处选择性切割转录物。在一些实施方案中,当使用手性未控制的
寡核苷酸组合物时,在该序列差异附近的位点以更高百分比切割转录物。在一些实施方案
中,在序列差异的位点处切割转录物。在一些实施方案中,仅在特异性核苷酸特征序列元件
内的序列差异位点处切割转录物。在一些实施方案中,在序列差异下游或上游5个碱基对以
内的位点处切割转录物。在一些实施方案中,在序列差异下游或上游4碱基对以内的位点处
切割转录物。在一些实施方案中,在序列差异下游或上游3个碱基对以内的位点处切割转录
物。在一些实施方案中在序列差异下游或上游2个碱基对以内的位点处切割转录物。在一些
实施方案中,在序列差异下游或上游1个碱基对以内的位点处切割转录物。在一些实施方案
中,在序列差异下游5个碱基对以内的位点处切割转录物。在一些实施方案中,在序列差异
下游4个碱基对以内的位点处切割转录物。在一些实施方案中,在序列差异下游3个碱基对
以内的位点处切割转录物。在一些实施方案中,在序列差异下游2个碱基对以内的位点处切
割转录物。在一些实施方案中,在序列差异下游1个碱基对以内的位点处切割转录物。在一
些实施方案中,在序列差异上游5个碱基对以内的位点处切割转录物。在一些实施方案中,
在序列差异上游4个碱基对以内的位点处切割转录物。在一些实施方案中,在序列差异上游
3个碱基对以内的位点处切割转录物。在一些实施方案中,在序列差异上游2个碱基对以内
的位点处切割转录物。在一些实施方案中,在序列差异上游1个碱基对以内的位点处切割转
录物。在没有本申请在本公开内容中提供的手性控制的寡核苷酸组合物及其方法的情况
下,对切割样式的这种精确控制和导致的对来自特定等位基因之转录物的高选择性抑制将
是不可能的。
些实施方案中,本发明提供了用于治疗患有疾病的对象的方法,包括向对象施用包含手性
控制的寡核苷酸组合物的药物组合物,其中来自造成疾病或有利于疾病的等位基因的转录
物被选择性抑制。在一些实施方案中,本发明提供了用于治疗患有疾病的对象的方法,包括
向对象施用包含手性控制的寡核苷酸组合物的药物组合物,其中来自造成疾病的等位基因
的转录物被选择性抑制。在一些实施方案中,本发明提供了用于治疗患有疾病的对象的方
法,包括向对象施用包含手性控制的寡核苷酸组合物的药物组合物,其中来自有利于疾病
的等位基因的转录物被选择性抑制。在一些实施方案中,本发明提供了用于治疗患有疾病
的对象的方法,包括向对象施用包含手性控制的寡核苷酸组合物的药物组合物,其中来自
与疾病有关的等位基因的转录物被选择性抑制。在一些实施方案中,本发明提供了用于预
防对象中的疾病的方法,其通过特异性抑制来自可能造成疾病的特定等位基因的转录物来
实现。在一些实施方案中,本发明提供了用于预防对象中的疾病的方法,其通过特异性抑制
来自提高对象中疾病风险的特定等位基因的转录物来实现。在一些实施方案中,提供的方
法包括向对象施用包含手性控制的寡核苷酸组合物的药物组合物。在一些实施方案中,药
物组合物还包含药用载体。
等,Nucleic Acids Research 2013,41(21),9634‑9650;和Jiang等,
Science 2013,342,111‑114。在一些实施方案中,疾病是亨廷顿病(Huntington′s
disease)。在一些实施方案中,疾病是人肥厚性心肌病(human hypertrophic
cardiomyopathy,HCM)。在一些实施方案中,疾病是扩张性心肌病。在一些实施方案中,导致
疾病之等位基因是肌球蛋重链(MHC)的等位基因。在一些实施方案中,示例性疾病选自:
rs363064_C、rs363099_C、rs363088_A、rs34315806_C、rs2298967_T、rs362272_G、
rs362275_C、rs362306_G、rs3775061_A、rs1006798_A、rs16843804_C、rs3121419_C、
rs362271_G、rs362273_A、rs7659144_C、rs3129322_T、rs3121417_G、rs3095074_G、
rs362296_C、rs108850_C、rs2024115_A、rs916171_C、rs7685686_A、rs6844859_T、
rs4690073_G、rs2285086_A、rs362331_T、rs363092_C、rs3856973_G、rs4690072_T、
rs7691627_G、rs2298969_A、rs2857936_C、rs6446723_T、rs762855_A、rs1263309_T、
rs2798296_G、rs363096_T、rs10015979_G、rs11731237_T、rs363080_C、rs2798235_G和
rs362307_T。在一些实施方案中,靶亨廷顿位点选自:rs34315806_C、rs362273_A、
rs362331_T、rs363099_C、rs7685686_A、rs362306_G、rs363064_C、rs363075_G、rs2276881_
G、rs362271_G、rs362303_C、rs362322_A、rs363088_A、rs6844859_T、rs3025838_C、
rs363081_G、rs3025849_A、rs3121419_C、rs2298967_T、rs2298969_A、rs16843804_C、
rs4690072_T、rs362310_C、rs3856973_G和rs2285086_A。在一些实施方案中,靶亨廷顿位点
选自:rs362331_T、rs7685686_A、rs6844859_T、rs2298969_A、rs4690072_T、rs2024115_A、
rs3856973_G、rs2285086_A、rs363092_C、rs7691627_G、rs10015979_G、rs916171_C、
rs6446723_T、rs11731237_T、rs362272_G、rs4690073_G和rs363096_T。在一些实施方案中,
靶亨廷顿位点选自:rs362267、rs6844859、rs1065746、rs7685686、rs362331、rs362336、
rs2024115、rs362275、rs362273、rs362272、rs3025805、rs3025806、rs35892913、rs363125、
rs17781557、rs4690072、rs4690074、rs1557210、rs363088、rs362268、rs362308、rs362307、
rs362306、rs362305、rs362304、rs362303、rs362302、rs363075和rs2298969。在一些实施方
案中,靶亨廷顿位点选自:
制和/或敲减的另外的示例性靶标可以是与任何疾病有关的任何遗传异常,例如突变。在一
些实施方案中,靶标或靶标组选自疾病的遗传定子,例如在Xiong等,The human splicing
code reveals new insights into the genetic determinants of disease.Science第
347卷,第6218期DOI:10.1126/science.1254806中公开的。在一些实施方案中,错配在突变
体和野生型之间。
控制的寡核苷酸组合物和方法用于选择性抑制癌症中具有突变的转录物。在一些实施方案
中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物和方法用于抑制KRAS的转录物。示例性靶KRAS位点
包括G12V=GGU‑>GUU位置227G‑>U,G12D=GGU‑>GAU位置227G‑>A和G13D=GGC‑>GAC
位置230G‑>A。
因的靶基因。例如,对象在其正常组织中具有野生型基因,而在疾病组织如在肿瘤中同一基
因是突变的。在一些实施方案中,本发明提供了选择性抑制一个等位基因(例如,具有突变
或SNP的一个等位基因)的手性控制的寡核苷酸组合物和方法。在一些实施方案中,本发明
提供了具有更高效力和/或低毒性和/或本申请所述的其他益处的治疗。
型的寡核苷酸。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物具有仅一种寡核苷
酸类型的寡核苷酸。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物包含两种或更
多种寡核苷酸类型的寡核苷酸。在一些实施方案中,使用这样的组合物,提供的方法可以靶
向超过一个靶标。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物包含靶向两个或更多个
靶标的两种或更多种寡核苷酸类型。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物包含
靶向两个或更多个错配的两种或更多种寡核苷酸类型。在一些实施方案中,单一寡核苷酸
类型靶向两个或更多个靶标,例如突变。在一些实施方案中,一种寡核苷酸类型的寡核苷酸
的靶区域包含两个或更多个“靶位点”,例如两个突变或SNP。
饰碱基或糖。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物不具有任何经修饰碱
基。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物中的寡核苷酸包含经修饰碱基
和糖。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物中的寡核苷酸包含经修饰碱
基。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物中的寡核苷酸包含经修饰糖。寡
核苷酸的经修饰碱基和糖是本领域中公知的,包括但不限于本公开内容中所述的那些。在
一些实施方案中,经修饰碱基是5‑mC。在一些实施方案中,经修饰糖是2′‑修饰的糖。寡核苷
酸糖的合适的2’‑修饰是本领域一般技术人员公知的。在一些实施方案中,2’‑修饰包括但
1 1 1 1
不限于2’‑OR ,其中R 不是氢。在一些实施方案中,2’‑修饰是2’‑OR ,其中R是任选地经取
代的C1‑6脂族。在一些实施方案中,2’‑修饰是2’‑MOE。在一些实施方案中,修饰是2’‑卤素。
在一些实施方案中,修饰是2’‑F。在一些实施方案中,经修饰碱基或糖可以进一步提高手性
控制的寡核苷酸组合物地活性、稳定和/或选择性,所述组合物的共同骨架手性中心样式提
供了出人意料的活性、稳定性和/或选择性。
方案中,本发明出人意料地发现通过使用手性控制的寡核苷酸组合物,经修饰糖不是稳定
性、活性和/或控制切割样式必要的。另外,在一些实施方案中,本发明出人意料地发现,不
具有经修饰糖的寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物在稳定性、活性、周转和/或控制切
割样式方面具有更好的特性。例如,在一些实施方案中,出人意料地发现,与具有经修饰糖
的寡核苷酸的组合物相比,不具有经修饰糖的寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物从切
割产物中解离得更快,并且提供了显著提高的周转。
核心‑翼区结构。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物的共同骨架手性中
心样式包含所述(Sp)mRp。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物的共同骨
架手性中心样式包含(Sp)2Rp。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物的共
同骨架手性中心样式包含所述(Sp)m(Rp)n。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷
酸组合物的共同骨架手性中心样式包含所述(Rp)n(Sp)m。在一些实施方案中,提供的手性
控制的寡核苷酸组合物的共同骨架手性中心样式包含所述Rp(Sp)m。在一些实施方案中,提
供的手性控制的寡核苷酸组合物的共同骨架手性中心样式包含Rp(Sp)2。在一些实施方案
中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物的共同骨架手性中心样式包含所述(Sp)m(Rp)n(Sp)
t。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物的共同骨架手性中心样式包含所
述(Sp)mRp(Sp)t。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物的共同骨架手性
中心样式包含所述(Sp)t(Rp)n(Sp)m。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合
物的共同骨架手性中心样式包含所述(Sp)tRp(Sp)m。在一些实施方案中,提供的手性控制
的寡核苷酸组合物的共同骨架手性中心样式包含SpRpSpSp。在一些实施方案中,提供的手
性控制的寡核苷酸组合物的共同骨架手性中心样式包含(Sp)2Rp(Sp)2。在一些实施方案中,
提供的手性控制的寡核苷酸组合物的共同骨架手性中心样式包含(Sp)3Rp(Sp)3。在一些实
施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物的共同骨架手性中心样式包含(Sp)4Rp(Sp)4。
在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物的共同骨架手性中心样式包含(Sp)
tRp(Sp)5。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物的共同骨架手性中心样
式包含SpRp(Sp)5。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物的共同骨架手性
中心样式包含(Sp)2Rp(Sp)5。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物的共同
骨架手性中心样式包含(Sp)3Rp(Sp)5。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合
物的共同骨架手性中心样式包含(Sp)4Rp(Sp)5。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核
苷酸组合物的共同骨架手性中心样式包含(Sp)5Rp(Sp)5。在一些实施方案中,共同骨架手性
中心样式具有仅一个Rp,并且每个其他核苷酸间键联是Sp。在一些实施方案中,如本公开内
容所述,共同碱基长度大于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、30、32、35、40、45或50。在一些实施方案中,共同碱基长度大于10。在一些实施方案
中,共同碱基长度大于11。在一些实施方案中,共同碱基长度大于12。在一些实施方案中,共
同碱基长度大于13。在一些实施方案中,共同碱基长度大于14。在一些实施方案中,共同碱
基长度大于15。在一些实施方案中,共同碱基长度大于16。在一些实施方案中,共同碱基长
度大于17。在一些实施方案中,共同碱基长度大于18。在一些实施方案中,共同碱基长度大
于19。在一些实施方案中,共同碱基长度大于20。在一些实施方案中,共同碱基长度大于21。
在一些实施方案中,共同碱基长度大于22。在一些实施方案中,共同碱基长度大于23。在一
些实施方案中,共同碱基长度大于24。在一些实施方案中,共同碱基长度大于25。在一些实
施方案中,共同碱基长度大于26。在一些实施方案中,共同碱基长度大于27。在一些实施方
案中,共同碱基长度大于28。在一些实施方案中,共同碱基长度大于29。在一些实施方案中,
共同碱基长度大于30。在一些实施方案中,共同碱基长度大于31。在一些实施方案中,共同
碱基长度大于32。在一些实施方案中,共同碱基长度大于33。在一些实施方案中,共同碱基
长度大于34。在一些实施方案中,共同碱基长度大于35。
离相比,来自核酸聚合物的切割产物以更快的速率从提供的手性控制的寡核苷酸组合物的
寡核苷酸解离。在一些实施方案中,与手性未控制的寡核苷酸组合物相比,提供的手性控制
的寡核苷酸组合物可以以更低单位剂量和/或总剂量和/或更少剂量施用。
供了更少切割位点。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物在与其共同碱基序列
互补的核酸聚合物的序列中提供了更少切割位点。在一些实施方案中,核酸聚合物在与手
性控制的寡核苷酸组合物的共同碱基序列互补的序列中或者在手性控制的寡核苷酸组合
物的共同碱基序列中的单一位点选择性切割。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组
合物在与手性控制的寡核苷酸组合物的共同碱基序列互补的序列中或者在手性控制的寡
核苷酸组合物的共同碱基序列中的切割位点提供了更高切割百分比。在一些实施方案中,
手性控制的寡核苷酸组合物在与手性控制的寡核苷酸组合物的共同碱基序列互补的序列
中的切割位点提供开了更高切割百分比。在一些实施方案中,具有更高切割百分比的位点
是当使用参照寡核苷酸组合物时的切割位点。在一些实施方案中,具有更高切割百分比的
位点是当使用参照寡核苷酸时不存在的切割位点。
的互补序列中产生较少切割位点的手性控制的寡核苷酸组合物(尤其是提供单一位点切割
那些)提供了更高的切割速率和更低水平的剩余的未切割核酸聚合物。该结果与追求更多
切割位点以提高切割速率的本领域中的一般教导形成鲜明对比。
速率提高至少3倍。在一些实施方案中,切割速率提高至少4倍。在一些实施方案中,切割速
率提高至少5倍。在一些实施方案中,切割速率提高至少6倍。在一些实施方案中,切割速率
提高至少7倍。在一些实施方案中,切割速率提高至少8倍。在一些实施方案中,切割速率提
高至少9倍。在一些实施方案中,切割速率提高至少10倍。在一些实施方案中,切割速率提高
至少11倍。在一些实施方案中,切割速率提高至少12倍。在一些实施方案中,切割速率提高
至少13倍。在一些实施方案中,切割速率提高至少14倍。在一些实施方案中,切割速率提高
至少15倍。在一些实施方案中,切割速率提高至少20倍。在一些实施方案中,切割速率提高
至少30倍。在一些实施方案中,切割速率提高至少40倍。在一些实施方案中,切割速率提高
至少50倍。在一些实施方案中,切割速率提高至少60倍。在一些实施方案中,切割速率提高
至少70倍。在一些实施方案中,切割速率提高至少80倍。在一些实施方案中,切割速率提高
至少90倍。在一些实施方案中,切割速率提高至少100倍。在一些实施方案中,切割速率提高
至少200倍。在一些实施方案中,切割速率提高至少300倍。在一些实施方案中,切割速率提
高至少400倍。在一些实施方案中,切割速率提高至少500倍。在一些实施方案中,切割速率
提高至少大于500倍。
中,低至少2倍。在一些实施方案中,低至少3倍。在一些实施方案中,低至少4倍。在一些实施
方案中,低至少5倍。在一些实施方案中,低至少6倍。在一些实施方案中,低至少7倍。在一些
实施方案中,低至少8倍。在一些实施方案中,低至少9倍。在一些实施方案中,低至少10倍。
在一些实施方案中,低至少11倍。在一些实施方案中,低至少12倍。在一些实施方案中,低至
少13倍。在一些实施方案中,低至少14倍。在一些实施方案中,低至少15倍。在一些实施方案
中,低至少20倍。在一些实施方案中,低至少30倍。在一些实施方案中,低至少40倍。在一些
实施方案中,低至少50倍。在一些实施方案中,低至少60倍。在一些实施方案中,低至少70
倍。在一些实施方案中,低至少80倍。在一些实施方案中,低至少90倍。在一些实施方案中,
低至少100倍。在一些实施方案中,低至少200倍。在一些实施方案中,低至少300倍。在一些
实施方案中,低至少400倍。在一些实施方案中,低至少500倍。在一些实施方案中,低至少
1000倍。
(例如预定的)关于以下的结构元件:(1)碱基序列;(2)骨架键联样式;(3)骨架手性中心样
式;和(4)骨架P修饰部分样式。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸组合物含有在单一合成
过程中制备的寡核苷酸。在一些实施方案中,提供的组合物含有在单一寡核苷酸分子内具
有超过一种手性构型的寡核苷酸(例如其中沿寡核苷酸的不同残基具有不同立体化学);在
一些所述实施方案中,所述寡核苷酸可在单一合成过程中获得,而无需次级缀合步骤来产
生具有超过一种手性构型的个体寡核苷酸分子。
究和/或诊断目的用作试剂。本领域普通技术人员将易于认识到本文中的本发明公开内容
不限于特定用途,而是可适用于其中期望使用合成寡核苷酸的任何情况。提供的组合物尤
其可用于多种治疗、诊断、农业和/或研究应用中。
更多种核酸类似物的寡核苷酸。在一些实施方案中,提供的寡核苷酸组合物包含含有一种
或更多种包括但不限于以下的人工核酸或残基的寡核苷酸:肽核酸(peptide nucleic
acid,PNA)、吗啉代寡核苷酸和锁定核酸(locked nucleic acid,LNA)、糖基核酸(glycon
nucleic acid,GNA)、苏糖核酸(threose nucleic acid,TNA)、异核酸(Xeno nucleic
acid,ZNA)及其任何组合。
体确定的寡核苷酸组合物可替代常规立构无规或手性不纯对应物加以使用。在一些实施方
案中,提供的组合物显示增强的预定作用和/或降低的不期望的副作用。以下明确讨论本发
明的生物和临床/治疗应用的某些实施方案。
案,其可涉及一个或更多个剂量。在一些实施方案中,给药方案包括多个剂量,其各自彼此
相隔时长相同的时期;在一些实施方案中,给药方案包括多个剂量,并且各剂量相隔至少两
种不同时期。在一些实施方案中,给药方案内的所有剂量都具有相同单位给药量。在一些实
施方案中,给药方案内的不同剂量具有不同量。在一些实施方案中,给药方案包括以第一给
药量施用的第一剂量,继之以一个或更多个以不同于所述第一给药量的第二给药量施用的
其他剂量。在一些实施方案中,给药方案包括以第一给药量施用的第一剂量,继之以一个或
更多个以与所述第一给药(或另一先前给药)量相同或不同的第二(或随后)给药量施用的
其他剂量。在一些实施方案中,给药方案包括施用至少一个单位剂量至少一天。在一些实施
方案中,给药方案包括经过至少一天,并且有时超过一天的时期施用超过一个剂量。在一些
实施方案中,给药方案包括经过至少一周的时期施用多个剂量。在一些实施方案中,时期是
至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2324、25、26、27、28、
29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40周或更久(例如约45、50、55、60、65、70、75、80、85、
90、95、100周或更久)。在一些实施方案中,给药方案包括每周施用一个剂量,持续超过一
周。在一些实施方案中,给药方案包括每周施用一个剂量,持续2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2324、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、
38、39、40周或更久(例如约45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100周或更久)。在一些实
施方案中,给药方案包括每两周施用一个剂量,持续超过两周时期。在一些实施方案中,给
药方案包括每两周施用一个剂量,经过2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、2324、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40周或更久(例如
约45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100周或更久)的时期。在一些实施方案中,给药方
案包括每个月施用一个剂量,持续一个月。在一些实施方案中,给药方案包括每个月施用一
个剂量,持续超过一个月。在一些实施方案中,给药方案包括每个月施用一个剂量,持续2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更久。在一些实施方案中,给药方案包括每周施用一个剂
量,持续约10周。在一些实施方案中,给药方案包括每周施用一个剂量,持续约20周。在一些
实施方案中,给药方案包括每周施用一个剂量,持续约30周。在一些实施方案中,给药方案
包括每周施用一个剂量,持续26周。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物是根据
不同于用于具有相同序列的手性未控制的(例如立构无规的)寡核苷酸组合物和/或具有相
同序列的不同手性控制的寡核苷酸组合物的给药方案的给药方案施用。在一些实施方案
中,手性控制的寡核苷酸组合物是根据相较于具有相同序列的手性未控制的(例如立构无
规的)寡核苷酸组合物的给药方案减量的给药方案施用,其中其经过给定时间单位达到较
低总暴露水平,涉及一个或更多个较低单位剂量,和/或经过给定时间单位包括较小数目的
剂量。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物是根据延续的时期长于具有相同序
列的手性未控制的(例如立构无规的)寡核苷酸组合物的给药方案所延续的时期的给药方
案施用。不希望受到理论的限制,申请人注意到在一些实施方案中,较短给药方案和/或各
剂量之间的较长时期可归因于手性控制的寡核苷酸组合物的稳定性、生物利用度和/或功
效改进。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸组合物相较于相应手性未控制的寡核苷
酸组合物具有较长给药方案。在一些实施方案中,相较于相应手性未控制的寡核苷酸组合
物,手性控制的寡核苷酸组合物在至少两个剂量之间的时期较短。不希望受到理论的限制,
申请人注意到在一些实施方案中,较长给药方案和/或各剂量之间的较短时期可归因于手
性控制的寡核苷酸组合物的安全性改进。
130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300mg或
300mg以上(例如约350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000mg或
1000mg以上)某一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中,单次剂量含有约1mg某
一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中,单次剂量含有约5mg某一类型的手性控
制的寡核苷酸。在一些实施方案中,单次剂量含有约10mg某一类型的手性控制的寡核苷酸。
在一些实施方案中,单次剂量含有约15mg某一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方
案中,单次剂量含有约20mg某一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中,单次剂量
含有约50mg某一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中,单次剂量含有约100mg某
一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中,单次剂量含有约150mg某一类型的手性
控制的寡核苷酸。在一些实施方案中,单次剂量含有约200mg某一类型的手性控制的寡核苷
酸。在一些实施方案中,单次剂量含有约250mg某一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实
施方案中,单次剂量含有约300mg某一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中,手
性控制的寡核苷酸是以单次剂量和/或以总剂量在低于手性未控制的寡核苷酸的量下施
用。在一些实施方案中,由于功效改进,手性控制的寡核苷酸是以单次剂量和/或以总剂量
在低于手性未控制的寡核苷酸的量下施用。在一些实施方案中,手性控制的寡核苷酸是以
单次剂量和/或以总剂量在高于手性未控制的寡核苷酸的量下施用。在一些实施方案中,归
因于安全性改进,手性控制的寡核苷酸是以单次剂量和/或以总剂量在高于手性未控制的
寡核苷酸的量下施用。
有至少部分双链特征的自身互补部分。在一些实施方案中,提供的组合物中包括的寡核苷
酸是单链、双链或三链。在一些实施方案中,提供的组合物中包括的寡核苷酸在寡核苷酸内
包含单链部分和多链部分。在一些实施方案中,如上所指示,各单链寡核苷酸可具有双链区
域和单链区域。
DNA。在一些实施方案中,提供的组合物包括一种或更多种是或充当以下的寡核苷酸:siRNA
或其他RNA干扰试剂(RNAi剂或iRNA剂)、shRNA、反义寡核苷酸、自我切割RNA、核酶、其片段
和/或其变体(如肽基转移酶23S rRNA、RNA酶P、I组和II组内含子、GIR1分支核酶、先导酶、
发夹核酶、锤头核酶、HDV核酶、哺乳动物CPEB3核酶、VS核酶、glmS核酶、CoTC核酶等)、微小
RNA、微小RNA模拟物、超级微小RNA、适体、反义微小RNA、微小RNA拮抗剂、Ul衔接头、成三链
体寡核苷酸、RNA活化剂、长非编码RNA、短非编码RNA(例如piRNA)、免疫调节性寡核苷酸(如
免疫刺激性寡核苷酸、免疫抑制性寡核苷酸)、GNA、LNA、ENA、PNA、TNA、吗啉代寡核苷酸、G四
链体(RNA和DNA)、抗病毒寡核苷酸和诱饵寡核苷酸。
例如(1)在单一分子内具有混合类别的核苷酸例如部分DNA和部分RNA的寡核苷酸分子(例
如DNA‑RNA);(2)不同类别的核酸的互补对,以使DNA:RNA碱基配对发生在分子内或分子间;
或两者;(3)具有两个或更多个种类的骨架或核苷酸间键联的寡核苷酸。
部分和RNA部分。在一些实施方案中,寡核苷酸可包含未经修饰部分和经修饰部分。
望的是修饰双链寡核苷酸(或单链寡核苷酸的双链部分)的一个或两个链。在一些实施方案
中,两个链(或部分)包括不同修饰。在一些实施方案中,两个链包括相同修饰。本领域技术
人员将了解由本发明方法所能够达到的修饰程度和类型允许进行众多修饰排列。本文描述
示例性所述修饰,并且不旨在具有限制性。
或哑铃型结构的单分子寡核苷酸。术语“反义链”与“引导链”在本文中可互换使用。
码的其他RNA。在一些实施方案中,靶标序列与疾病或障碍相关。
分子与它的互补序列的结合自由能足以使核酸的相关功能发生,例如RNAi活性。测定核酸
分子的结合自由能是本领域中公知的(参见例如Turner等,1987,CSH
Symp.Quant.Biol.LIT第123‑133页;Frier等,1986,Proc.Nat.Acad.Sci.USA83:9373‑
9377;Turner等,1987,/.Ain.Chem.Soc.109:3783‑3785)。
90%和100%互补的)。“完全互补”或100%互补性是指核酸序列的所有连续残基都将与第
二核酸序列中的相同数目的连续残基进行氢键结。小于完全互补性是指其中两个链的一些
而非所有核苷单元可彼此进行氢键结的情形。“基本上互补性”是指将多核苷酸链的被选择
以是非互补性的区域,如突出部分除外,多核苷酸链表现90%或90%以上互补性。特异性结
合需要足够互补性程度以避免寡聚化合物与非靶标序列在需要特异性结合所处的条件下,
例如在体内测定或治疗性治疗的情况下的生理条件下,或在体外测定的情况下在进行测定
所处的条件下,进行非特异性结合。在一些实施方案中,非靶标序列与相应靶标序列有至少
5个核苷酸不同。
剂、可药用赋形剂和可药用载体的可药用非活性成分。在另一实施方案中,药物组合物被配
制来用于静脉内注射、经口施用、经颊施用、吸入、经鼻施用、表面施用、经眼施用或经耳施
用。在另一些实施方案中,药物组合物是片剂、丸剂、胶囊、液体、吸入剂、鼻喷雾溶液、栓剂、
混悬剂、凝胶剂、胶体、分散剂、混悬剂、溶液剂、乳剂、软膏剂、洗剂、滴眼剂或滴耳剂。
以及至少一种选自可药用稀释剂、可药用赋形剂和可药用载体的可药用非活性成分。在一
些实施方案中,药物组合物被配制来用于静脉内注射、经口施用、经颊施用、吸入、经鼻施
用、表面施用、经眼施用或经耳施用。在一些实施方案中,药物组合物是片剂、丸剂、胶囊、液
体、吸入剂、鼻喷雾溶液、栓剂、混悬剂、凝胶剂、胶体、分散剂、混悬剂、溶液剂、乳剂、软膏
剂、洗剂、滴眼剂或滴耳剂。
寡核苷酸的可药用盐或其组合物。
法;这包括使用PEG化聚阳离子、聚乙烯胺(polyethyleneamine,PEI)复合物、阳离子嵌段共
聚物和树枝状聚合物。包括PEI和聚酰氨基胺树枝状聚合物的若干阳离子纳米载体有助于
自内体释放内含物。其他方法包括使用聚合纳米粒子、聚合物胶束、量子点和脂质复合物
(lipoplex)。
Pharmacy,(第20版2000)中。
实例。精确剂量将取决于施用途径、所施用化合物所采用的形式、待治疗的对象、待治疗的
对象的体重以及主治医师的偏好和经验。
化物、依地酸钙、右旋樟脑磺酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙
磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、对羟乙酰胺基苯胂酸盐
(glycollylarsanilate)、己基间苯二酚盐(hexylresorcinate)、哈胺(hydrabamine)、氢溴
酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸
盐、杏仁酸盐(mandelate)、甲磺酸盐、黏酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、扑酸盐(双羟萘酸盐)、泛
酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、次乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸
盐、丹宁酸盐、酒石酸盐或茶氯酸盐。其他可药用盐可见于例如Remington,The Science
and Practice of Pharmacy(第20版2000)中。优选可药用盐包括例如乙酸盐、苯甲酸盐、溴
化物、碳酸盐、柠檬酸盐、葡萄糖酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、扑
酸盐(双羟萘酸盐)、磷酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐或酒石酸盐。
的技术可在Remington,The Science and Practice of Pharmacy(第20版2000)中找到。合
适的途径可包括经口、经颊、通过吸入喷雾剂、舌下、经直肠、经皮、经阴道、经黏膜、经鼻或
经肠施用;胃肠外递送,包括肌肉内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接室内、静脉内、关节内、
胸骨内、滑膜内、肝内、病变内、颅内、腹膜内、鼻内或眼内注射或其他递送模式。
黏膜施用,适合于待渗透的屏障的渗透剂用于制剂中。所述渗透剂通常是本领域中已知的。
如通过静脉内注射)来施用本发明的组合物,特别是配制成溶液的那些。
丸剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆液、混悬剂等。
进剂和氟碳化合物)的实例。
细公开内容。
剂、糖衣丸剂、胶囊剂或溶液剂的形式。
或糖衣丸核心。合适的赋形剂特别是填充剂,如糖,包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇;
纤维素制剂,例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维
素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠(CMC)和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP:聚维酮)。必要
时,可添加崩解剂,如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐,如藻酸钠。
化钛、漆溶液和适合有机溶剂或溶剂混合物。染料或颜料可添加至片剂或糖衣片包衣中以
鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
合剂(如淀粉)和/或润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)以及任选地稳定剂混合的活性成分。在软
胶囊中,活性化合物可溶解或混悬于适合液体,如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇(PEG)
中。此外,可添加稳定剂。
proliferative agent)可与本发明的寡核苷酸组合来治疗增殖性疾病和癌症。已知化学治
疗剂的实例包括但不限于:阿霉素、地塞米松、长春新碱、环磷酰胺、氟尿嘧啶、拓扑替康、泰
素、干扰素和铂衍生物。
键联样式和所述共同骨架手性中心样式。
式。
式。
式。
式。
式。
式。
式。
式。
式。
键联中的至少一个是手性的。
2’OR。
Rp,Rp,Rp,Rp,Sp,Sp,Rp,Sp,Sp,Rp,Sp,Sp,Rp,Rp,Rp,Rp,Rp,Rp)‑Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsT
s5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC(5R‑(SSR)3‑5R),其中具有下划线的核苷酸是
2’‑O‑MOE修饰的。
参照寡核苷酸组合物的参照切割样式相比改变的切割样式。
割位点。
位基因的特征序列元件互补的序列,所述组合物的特征在于,当使其与表达靶等位基因和
同一基因的另一等位基因二者之转录物的体系相接触时,所述特定等位基因之转录物的抑
制水平比对于同一基因的另一等位基因所观察到的抑制水平高至少2倍。
位基因的特征序列元件互补的序列,所述组合物的特征在于,当使其与表达所述靶基因之
转录物的体系相接触时,所述组合物显示出对所述特定等位基因之转录物表达的以下抑制
水平:
少2倍。
4、5、6、7或8,并且Np各自独立地是Rp或Sp。
2、3、4、5、6、7或8。
酶、U1衔接头、RNA活化剂、RNAi剂、诱饵寡核苷酸、成三链体寡核苷酸、适体或佐剂。
样式发生。
列和长度的寡核苷酸,所述特定碱基序列是或包含与所述靶序列互补的序列,所述方法包
括:
度的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物,所述组合物富含单一寡核苷酸类型的寡核苷酸,
所述寡核苷酸的特征在于:
手性控制的寡核苷酸组合物提供的切割样式在存在于所述核酸聚合物中的所述靶序列中
具有更少的切割位点。
位点。
提供的切割样式使切割位点处的切割百分比提高。
中的所述特定寡核苷酸类型的寡核苷酸中更快解离。
等位基因限定该等位基因的特异性核苷酸特征序列元件,所述方法包括以下步骤:
于:
位基因和同一核酸序列的另一等位基因二者之转录物的体系相接触时,所述特定等位基因
之转录物的抑制水平大于对于同一核酸序列的另一等位基因所观察到的抑制水平。
该等位基因的特异性核苷酸特征序列元件,所述方法包括以下步骤:
位基因和同一基因的另一等位基因二者之转录物的体系相接触时,所述特定等位基因之转
录物的抑制水平比对于同一基因的另一等位基因所观察到的抑制水平高至少2倍。
该等位基因的特异性核苷酸特征序列元件,所述方法包括以下步骤:
位基因和同一基因的另一等位基因二者之转录物的体系相接触时,所述特定等位基因之转
录物的抑制水平比对于同一基因的另一等位基因所观察到的抑制水平高至少2倍。
200或500倍。
等位基因限定该等位基因的特异性核苷酸特征序列元件,所述方法包括以下步骤:
于:
靶核酸序列之转录物的体系相接触时,所述组合物显示出对所述特定等位基因之转录物的
以下抑制水平:
该等位基因的特异性核苷酸特征序列元件,所述方法包括以下步骤:
靶基因之转录物的体系相接触时,所述组合物显示出对所述特定等位基因之转录物表达的
以下抑制水平:
少2倍。
该等位基因的特异性核苷酸特征序列元件,所述方法包括以下步骤:
靶基因之转录物的体系相接触时,所述组合物显示出对所述特定等位基因之转录物表达的
以下抑制水平:
少2倍。
物的量在所述组合物存在时比其不存在时低2倍。
200或500倍。
或(Rp,Rp,Rp,Rp,Rp,Sp,Sp,Rp,Sp,Sp,Rp,Sp,Sp,Rp,Rp,Rp,Rp,Rp,Rp)‑Gs5mCs5mCsTs5mC
sAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC(5R‑(SSR 3‑5R),其中具有下划线的核苷
酸是2’‑O‑MOE修饰的。
自独立地是1、2、3、4、5、6、7或8,m是2、3、4、5、6、7或8,并且Np各自独立地是Rp或Sp。
立地是1、2、3、4、5、6、7或8,并且m是2、3、4、5、6、7或8。
Cs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15mCs1G]或(Rp,Rp,Rp,Rp,Rp,Sp,Sp,Rp,Sp,Sp,Rp,Sp,Sp,Rp,Rp,
Rp,Rp,Rp,Rp)‑Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC(5R‑
(SSR)3‑5R),其中具有下划线的核苷酸是2’‑O‑MOE修饰的。
ONT‑107 (Sp)‑uucuAGAccuGuuuuGcuudTsdT PCSK9有义
ONT‑108 (Rp)‑AAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT PCSK9反义
ONT‑109 (Sp)‑AAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT PCSK9反义
ONT‑110 (Rp,Rp)‑asAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT PCSK9反义
ONT‑111 (Sp,Rp)‑asGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT PCSK9反义
ONT‑112 (Sp,Sp)‑asGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT PCSK9反义
ONT‑113 (Rp,Sp)‑asGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT PCSK9反义
[CSCSCSCSCSCSCRCRCSC]和d[CSCSCSCSCSCRCRCSCSC],其中R是Rp硫代磷酸酯键联,S是Sp硫代磷酸
酯键联。
是选自以下的寡核苷酸:GGARTSGRTSTR CSTCGA、GGARTRGSTSTRCRTCGA、GGASTSGRTRTSCSTCGA,其
m
中R是Rp硫代磷酸酯键联,S是Sp硫代磷酸酯键联,所有其他键联是PO,并且每个C是5‑甲基
胞嘧啶修饰的核苷酸。
是选自以下的寡核苷酸:TkTkCkAGTCATGA CTkTCkCk,其中每个带有下标“k”的核苷表示
m
(S)‑cEt修饰,R是Rp硫代磷酸酯键联,S是Sp硫代磷酸酯键联,每个C是5‑甲基胞嘧啶修饰
核苷,并且所有核苷酸间键联还具有选自以下的立体化学样式的硫代磷酸酯(PS):
RSSSRSRRRS、RSSSSSSSSS、SRRSRSSSSR、SRSRSSRSSR、RRRSSSRSSS、RRRSRSSRSR、RRSSSRSRSR、
SRSSSRSSSS、SSRRSSRSRS、SSSSSSRRSS、RRRSSRRRSR、RRRRSSSSRS、SRRSRRRRRR、RSSRSSRRRR、
RSRRSRRSRR、RRSRSSRSRS、SSRRRRRSRR、RSRRSRSSSR、RRSSRSRRRR、RRSRSRRSSS、RRSRSSSRRR、
RSRRRRSRSR、SSRSSSRRRS、RSSRSRSRSR、RSRSRSSRSS、RRRSSRRSRS、SRRSSRRSRS、RRRRSRSRRR、
SSSSRRRRSR、RRRRRRRRRR和SSSSSSSSSS。
是选自以下的寡核苷酸:TkTkCkAGTCATGA CTTkCkCk,其中每个带有下标“k”的核苷表示
m
(S)‑cEt修饰,RR是Rp硫代磷酸酯键联,S是Sp硫代磷酸酯键联,每个C是5‑甲基胞嘧啶修
饰,并且所有核苷酸间键联还具有选自以下的立体化学样式的硫代磷酸酯(PS):
RSSSRSRRRS、RSSSSSSSSS、SRRSRSSSSR、SRSRSSRSSR、RRRSSSRSSS、RRRSRSSRSR、RRSSSRSRSR、
SRSSSRSSSS、SSRRSSRSRS、SSSSSSRRSS、RRRSSRRRSR、RRRRSSSSRS、SRRSRRRRRR、RSSRSSRRRR、
RSRRSRRSRR、RRSRSSRSRS、SSRRRRRSRR、RSRRSRSSSR、RRSSRSRRRR、RRSRSRRSSS、RRSRSSSRRR、
RSRRRRSRSR、SSRSSSRRRS、RSSRSRSRSR、RSRSRSSRSS、RRRSSRRSRS、SRRSSRRSRS、RRRRSRSRRR、
SSSSRRRRSR、RRRRRRRRRR和SSSSSSSSSS。
饰样式为特征的寡核苷酸类型的寡核苷酸。
节不旨在限制权利要求的范围。
化学物以预测体内半衰期。
mRNA来抑制载脂蛋白B基因表达。米泊美生具有以下结构:
些实施方案中,测试的类似物包含仅2’‑脱氧残基。特别测试的类似物具有下表3和4中给出
的结构。
灌注。在灌注之后,将肝解剖,并且维持在冰上。将肝切碎成小碎片,接着称重。
管含有每克组织5mL缓冲液。使用QIAGEN TissueRuptor组织均质器,在将管维持在冰上的
情况下使肝/缓冲液混合物均质化。使用Pierce BCA蛋白质测定来测定肝匀浆物库的蛋白
质浓度。将肝匀浆物分成5mL等分试样,转移至合适尺寸的具有标签的冷冻小瓶(cryovial)
中,并且储存在‑60℃下。
加450μL匀浆物。向各管添加50μL ASO(200μM)。在混合之后立刻向一个管中添加125μL(5
×)终止缓冲液(2.5%IGEPAL、0.5M NaCl、5mM EDTA、50mM Tris,pH=8.0)和12.5μL 20mg/
mL蛋白酶K(Ambion,#AM2546),作为0小时时间点。在37℃下,在VWR孵育微板振荡器上于
400rpm下振荡下孵育剩余的反应混合物。在孵育指定的时期(1、2、3、4和5天)之后,各混合
物用125μL(5×)终止缓冲液(2.5%IGEPAL、0.5M NaCl、5mM EDTA、50mM Tris,pH=8.0)和
12.5μL 20mg/mL蛋白酶K(Ambion,#AM2546)处理。
的)作为用于定量非对映体纯寡核苷酸的内标物。向每个管添加50μl内标物(200μM),随后
添加250μL30%氢氧化铵、800μl苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)。在混合并且在600rpm下离心
之后,在speed vac上将水层蒸发至100μl,并且装载于Sep Pak柱(C18,1g,WAT 036905)上。
Sep pak柱的所有水性洗涤物都用快速离子交换方法测试以确保其中不存在产物。使用
50%ACN(3.5ml)评估寡核苷酸和代谢物,并且用70%CAN(3.5)进一步洗涤柱以确保柱上未
留下东西。每个序列收集5个级分。使用Visiprep系统(Sigma,产品型号:57031‑U)进行水洗
涤1、2、3、ACN1和2。
1 5.5 1.0 0 0 100 1
2 5.6 1.0 100 0 0 6
3 7.5 1.0 100 0 0 6
4 7.6 1.0 95 5 0 6
5 12.5 1.0 95 5 0 1
2 5.0 1.0 65 35 1
3 30.0 1.0 40 60 6
4 35.0 1.0 5 90 6
5 36.0 1.0 65 35 6
6 40.0 1.0 65 35 1
反义寡核苷酸,其通常具有本文中称为“5‑10‑52’‑MOE翼区‑核心‑翼区设计”的结构,其中
每一端的5个残基是2’‑O‑甲氧基乙基(2’‑MOE)修饰的残基,并且中间的10个残基是2’‑脱
氧核糖核苷酸;这样的寡核苷酸的核苷酸间键联是硫代磷酸酯。相对于第一代(PCT/
US2005/033837),这种“5‑10‑52’‑MOE翼区‑核心‑翼区”寡核苷酸在效力上表现出显著的改
善。设计了类似的翼区‑核心‑翼区基序如2‑16‑2、3‑14‑3、4‑12‑4或5‑10‑5以改善寡核苷酸
对核酸酶的稳定性,同时保持用于RNA酶活性的足够DNA结构。
上,本发明证明,与相应2’‑修饰的立构无规硫代磷酸酯化合物相比,手性纯硫代磷酸酯寡
核苷酸可以提供相同的或更好的稳定性。
残基,其中所有残基具有相同的立体化学)。在许多实施方案中,在测试的所述寡核苷酸中
约20‑50%的核苷酸类似物不是RNase H的底物。控制DNA中硫代磷酸酯的立体化学的能力
使我们能够保护寡聚体不被核酸酶降解,同时保持RNase活性位点。这些设计中的一种是
ONT‑154,其中寡核苷酸的翼区通过Sp硫代磷酸酯化学而稳定,并且保留了少量Rp硫代磷酸
酯,其为RNase H的更好的底物(Molecular Cell,2007)。与DNA/RNA双链体复合的人RNase
H的结晶结构表明,酶的磷酸酯结合口袋与DNA的四个连续磷酸酯接触。前三个接触似乎比
第四个更强,并且其偏好这三个磷酸酯中每一个的Pro‑R/Pro‑R/Pro‑S氧原子。来自Sp立体
化学的稳定性优点与RNase H活性位点结合,可以设计多种序列以竞争和/或改善2’‑修饰。
从来自比较米泊美生(ONT‑41)与具有和不具有2’‑修饰的我们的合理(手性控制)设计
(ONT‑87和ONT‑154)的大鼠肝匀浆物稳定性实验(表1和图1),明显的是通过移除2’‑修饰以
及利用Rp和Sp磷酸酯的仔细手性控制,我们可以改善这些寡核苷酸的稳定性,其随后影响
体内效力。
明的,这样的手性控制的寡核苷酸组合可提供比手性未控制的寡核苷酸更好的结果。
Human Argonaute‑2 in Complex with miR‑20a Cell,2012PDB‑4f3t)。另外,与人
Argonaute‑1蛋白(hAgo‑1)复合的Let‑7 RNA具有一种报道的结晶结构:The Making of a
Slicer:Activation of Human Argonaute‑1,Cell Rep.2013(PDB‑4krf)。
稳定性和其他药理性质。考虑到这些,使用计算机程序Pymol来定位蛋白质与所有三种结构
的结晶RNA的核苷酸间磷酸二酯键联之间的所有极性相互作用。忽略在超过 距离处
的极性相互作用。
团和友好(respectful)的磷酸酯氧原子之间的产生非常类似的键。因此,硫取代(而不是非
桥氧)可以在基序内的磷原子上赋予独特的立体化学((Sp)或(Rp)绝对构型)。
度保守的。基于该分析结果形成的任何结论和规则可能对于这两种蛋白质分子都有效。
团上通常具有超过一个极性相互作用。
互作用。该组中是在磷酸酯位置2(Sp)、3(Rp)、4(Rp)、6(Rp)、8(Sp)、19(Rp)、20(Sp)和21
(Sp)处的磷酸二酯之间的相互作用。
(PS)二酯核苷酸间键联上的磷原子的立体化学。PO表示所指出位置的磷酸二酯核苷酸间键
联。
siRNA双链体的反义链3’端和5’端的手性硫代磷酸酯的相同Sp构型赋予了空前提高的生物
学效力,其由导致RISC RNAi沉默复合物中的活性提高的对于Ago2蛋白提高的亲和力引起。
制的硫代磷酸酯基团。当分别形成双链体时,制备了1600种独特的siRNA组合。
siRNA的转染,只是Lipofectamine RNAiMax的降低量为0.2μl/孔。从1μM开始,产生十二种1
∶3siRNA双链体稀释。然后将10μl 10×siRNA双链体与制备的每孔9.8μl无血清培养基和
0.2μl Lipofectamine RNAiMax的混合物脂质复合(lipoplexed)。孵育10‑15分钟后,添加
4
80μl EMEM细胞生长培养基(ATCC,30‑2003)中的2.0×10 个细胞以达到每孔100μl的最终
体积。每个剂量进行两次独立的转染事件。
cDNA逆转录试剂盒(Life Technologies,4374967)合成15μl cDNA。使用Probes Master
Mix(Roche,04 707 494 001)根据制造商方案,通过实时PCR在Lightcycler 480(Roche)上
评价基因表达。
复的平均值。将四参数线性回归曲线拟合于数据,并且底部和顶部分别限制为0和100常数
以计算相对IC50。
苷酸链的杂交,从而提供了双链手性控制的siRNA寡核苷酸组合物。本实施例还证明,这样
的试剂成功转染细胞,而且成功抑制靶基因表达。
在90%1×PBS(50μL)中孵育24小时。在孵育结束后,向每个时间点添加10μL终止溶液(0.5M
NaCl,50mM TRIS,5mM EDTA,2.5%IGEPAL),接着3.2μL蛋白酶K(20mg/mL,Ambion)。将样品
在60℃下孵育20分钟,然后以2000rpm离心15分钟。最终的反应混合物在变性IEX HPLC(进
样体积50μL)中直接分析。使用24小时和0分钟的整合面积确定每种siRNA降解的%。
降解样式的整合比例确定的,(Rp,Rp)siRNA双链体在24小时后表现出显著的55.0%的降
解。立构无规siRNA中硫代磷酸酯的立构无规混合物在24小时后表现出25.2%的降解。(Sp/
Sp)siRNA在24小时后仅表现出小的7.3%的降解。这说明了硫代磷酸酯立体化学赋予治疗
性siRNA的显著影响。图2、图3、图4和图5中示出了额外的示例性数据。
不同IC50值。使用上述人血清或人肝细胞液提取物或蛇毒磷酸二酯酶或者分离的内切酶或
分离的外切酶,立体化学对稳定性的影响同样清楚和不同。
识到,siRNA的反义链和/或有义链中在正确位置引入并且具有正确立体化学构型的提高量
的手性硫代磷酸酯导致在效力和体外代谢稳定性方面极大改善的siRNA构建体——转化成
药理学上极大增强的治疗性siRNA。
尽管破坏受体时与受体缔合的LDL也被消除,PCSK9结合的净效应实际上提高了LDL水平,因
为受体可以其他方式循环回到细胞表面并且移除更多胆固醇。
酸剂。已经示出Isis Pharmaceuticals产品(一种反义寡核苷酸)在小鼠中提高LDLR的表达
并且降低循环总胆固醇水平(Graham等″Antisense inhibition of proprotein
convertase subtilisin/kexin type 9reduces serum LDL in hyperlipidemic mice″
.J.Lipid Res.48(4):763‑7,April 2007)。利用Alnylam Pharmaceuticals产品ALN‑PCS进
行的最初临床试验表明,RNA干扰提供了用于抑制PCSK9的有效机制(Frank‑Kamenetsky等″
Therapeutic RNAi targeting PCSK9acutely lowers plasma cholesterol in rodents
and LDL cholesterol in nonhuman primates″.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105(33):
11915‑20,2008年8月)。
和其他药理学品质。为了强化该理念,基于靶向PCSK9信使RNA的siRNA序列,表3包含示例性
的立体化学纯的构建体。
控制的硫代磷酸酯基团。当独立形成双链体时,制备了1600种独特的siRNA组合。
这提供了另外80种独特的序列,其具有(Sp)或(Rp)手性控制的硫代磷酸酯基团。当独立形
成双链体时,制备了1600种独特的siRNA组合。
且内部间隔核心被2’化学修饰(2’OMe、2’MOE、2’LNA、2’F等)所修饰。最终这种设计延伸至
完全未修饰的DNA治疗性寡聚体,其中硫代硫酸酯骨架的仔细的手性控制赋予RNaseH治疗
性寡聚体以期望的药理学特性。
Hybrid:Insight into HIV Reverse Transcription,Nowotny等,Molecular Cell,第28
卷,第2期,264‑276,2007,pdb文件:2qkb)。尤其地,本发明认识了寡核苷酸的核苷酸间键联
立体化学的重要性,例如在本文中的环境中。在使用程序Pymol对该结构进行计算机模拟分
析(in silico analysis)之后,申请人发现,人RNase H1的磷酸酯结合口袋与复合的DNA的
三个连续磷酸酯极性接触,并且优先与这三个磷酸酯中每一个的Pro‑R/Pro‑R/Pro‑S(或与
Pro‑S/Pro‑S/Pro‑R)各氧原子相互作用。基于该观察,我们设计了具有重复(RRS)和(SSR)
三联体硫代磷酸酯基序的两种手性结构作为设计的RNase H底物。申请人还设计了其他核
苷酸间键联立体化学样式。如通过本文中提供的示例性结果证明的,提供的包含某些骨架
核苷酸间键联样式(样式骨架手性中心)寡核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合物提供
了显著提高的活性和/或动力学。尤其,5’‑RSS‑3’骨架手性中心的序列特别可用并且导致
了本公开内容中所述的出人意料的结果。
示Sp‑硫代磷酸酯键联,″R″表示Rp‑硫代磷酸酯键联。
R是1‑50。在一些实施方案中,R是1。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物
的共同骨架手性中心样式包含本文中所述的基序。在一些实施方案中,基序在核心区域中。
在一些实施方案中,n是0。在一些实施方案中,R是1‑50。在一些实施方案中,R是1。在一些实
施方案中,n是2。在一些实施方案中,n是3。在一些实施方案中,n是4。在一些实施方案中,n
是5。
以及寡核苷酸的中间部分,并且在两侧具有反转成像方式定位的重复立体化学基序,例如:
手性中心样式包含本文中所述的基序。在一些实施方案中,基序在核心区域中。在一些实施
方案中,n是0。在一些实施方案中,n是1。在一些实施方案中,n是1‑50。在一些实施方案中,n
是2。在一些实施方案中,n是3。在一些实施方案中,n是4。在一些实施方案中,n是5。
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Sp)(CsCs)OMed[AsTsCsCsAsAsGsTsCsAsCsTsTsGsGsGs](AsG)OMe
不限于本文给出的那些。
补RNA结合时,我们研究了切割速率并且分析了特定寡核苷酸类型(P‑非对映体)的手性控
制的寡核苷酸组合的代谢物。下面的结果也说明了本发明认识的切割样式的重要性。
RNase H切割速率显著降低(Lima,W.F.,Venkatraman,M.,Crooke,S.T.The Influence of
Antisense Oligonucleotide‑induced RNA Structure on Escherichia coli RNase HI
Activity The Journal Of Biological Chemistry 272,第29期,18191‑18199,(1997))。
另外,2’‑MOE间隔聚体设计(5‑10‑5)对RNA靶标提供了更高亲和力,导致反义链最小的周
转。翼区中2’‑MOE修饰的存在也降低了RNase H切割位点的数目。
聚体的立构无规2’‑修饰的间隔聚体、立构无规DNA寡核苷酸组合物和手性纯P‑非对映体
(相应寡核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合物)。改变2’‑修饰区域和DNA核心的立体化
学提供了关于这些区域中的立体化学如何影响RNase H与其底物的相互作用的信息。通过
LCMS分析不同时间点的RNase H反应混合物以确定切割样式。本发明尤其提供了对于设计
具有最佳活性(例如,反义活性)的立体化学核酸结构很关键的核酸聚合物(例如,RNA)、切
割速率和切割样式(图)。
中于90℃加热2分钟,然后经过数小时缓慢冷却。
of Human RNase H1Complexed with an RNA/DNA Hybrid:Insight into HIV Reverse
Transcription.Molecular Cell 28,264‑276,(2007)。根据报道的方案进行蛋白质表达,
只是所得蛋白质具有N末端His6标签。LB培养基中的BL21(DE3)大肠杆菌细胞用于蛋白质表
达。细胞培养在37℃下,直到OD600达到约0.7。然后冷却培养物并且添加0.4mM IPTG以在16
℃下诱导蛋白质表达过夜。通过在添加有蛋白酶抑制剂(Sigma‑Aldrich)的缓冲液A(40mM
NaH2PO4(pH 7.0),1M NaCl,5%甘油,2.8mMβ‑巯基乙醇和10mM咪唑)中超声处理来制备大肠
杆菌提取物。使用缓冲液A加上60mM咪唑通过Ni亲和柱来纯化提取物。用60至300mM咪唑的
线性梯度洗脱蛋白质。收集蛋白质峰并且在Mono S柱(GE Healthcare)上用缓冲液B中的
100mM‑500mM NaCl梯度进一步纯化。将含有RNaseHC的级分在储存缓冲液(20mM HEPES(pH
7.0)、100mM NaCl,5%甘油、0.5mM EDTA、2mM DTT)中浓缩至0.3mg/ml并且储存在‑20℃。基
‑1 ‑1
于报道的消光系数(32095cm M )和MW(18963.3Da单位),0.3mg/ml酶浓度对应于17.4μM。
液,以得到50μL总体积和最终底物/酶浓度5μM/0.01μM(500∶1),并且在37℃下进一步孵育。
使用这些条件研究了多种DNA/RNA双链体:RNase H蛋白比例,以寻找最佳比例来研究动力
学。在不同时间点使用10μL 500mM EDTA二钠水溶液来淬灭反应。对于0分钟时间点,在添加
酶之前向反应混合物中添加EDTA。进行对照以确认EDTA能够成功地完全抑制酶活性。在所
有反应淬灭后,将10μL的每种反应混合物进样到分析型HPLC柱(XBridge C18,3.5μm,4.6×
150mm,Waters Part#186003034)上。可以通过若干方法测量Kcat/Km,例如使用双标记RNA
并且通过SpectraMax监测的FRET(荧光共振能量转移)依赖性RNase H测定。
MSV MHTSOO)用500μL乙腈然后水来平衡板。采取预防措施以使板不干燥。在轻度真空下向
每个孔装载约50‑100μL RNase H反应混合物然后通过水洗涤(2mL)。使用2×50070%ACN/
水回收样品。回收的样品转移到2mL离心管中并且在speed vac中浓缩至干。每份干燥样品
在100μL水中重构,并且10μL进样到AcquityUPLC@OST C181.7μm,2.1×50mm(part#
186003949)上用于LCMS分析。
1 0.0 1.00 95.0 5.0
2 2.00 1.00 95.0 5.0 1
3 22.00 1.00 80.0 20.0 6
4 25.00 1.00 5.0 95.0 6
5 25.5 1.00 95.0 5.0 1
6 30 1.00 95.0 5.0 1
式中表现出对于互补RNA的优秀的切割。由于该图中的所有非对映体具有不活化RNase H酶
的2’‑MOE修饰的翼区,不旨在受到理论的约束,申请人注意到活性可能由DNA核心中的立体
化学指示。在反义链中与ONT‑77和ONT‑81(包括米泊美生)的异源双链体表现出非常类似的
RNA切割速率。在测试条件下,具有交替Sp/Rp立体化学的ONT‑89在测试时间框表现出最低
活性。与其余异源双链体相比,在测试的具有MOE修饰的寡核苷酸中,反义链中的ONT‑87和
ONT‑88单元表现出提高的活性。特别地,ONT‑87提供了惊人地高切割速率和出人意料的低
水平的剩余靶RNA。图6和图24中示出了额外的示例性数据。
文中描述了示例性方案。使用制造商的方案,在96孔板中18×10 个细胞/孔的密度下用
Lipofectamine 2000(Life Technologies,Cat.No.11668‑019)对Hep3B细胞逆转染。对于
剂量响应曲线,使用从60‑100nM开始8个1/3连续稀释。每孔将25μL 6×寡核苷酸浓度与0.4
μLLipofectamine 2000和25μL无血清培养基Opti‑MEM培养基(Gibco,Cat.No.31985‑062)
的制备的混合物混合。孵育20分钟后,添加100μL DMEM细胞培养基(Gibco,Cat.No.11965‑
3
092)中的悬浮在10%FBS中的180×10个细胞/ml以得到150μL每孔的最终体积。转染24‑48
小时后,使用QuantiGene Sample Processing Kit for Cultured Cells(Affymetrix,
Cat.No.QS0103)通过添加具有0.5mg/ml蛋白酶K的75μL裂解混合物来裂解Hep3B细胞。使用
Affymetrix QuantiGene 2.0Assay Kit(Cat.No.QS0011)根据制造商的方案测量细胞裂解
物中靶mRNA和GAPDHmRNA表达水平。将靶mRNA表达相对于来自同一样品的GAPDHmRNA表达归
一化;相对靶标/GAPDH水平与仅使用Lipofectamine 2000(无寡核苷酸)的对照的转染相比
较。使用非线性回归log(抑制剂)相对于以可变斜率拟合的响应曲线(4参数)产生的剂量响
应曲线。对于示例性结果,参见图24、图27和图29。
地或组合地出人意料地改变切割位点的数目、切割位点的切割百分比和/或切割位点的位
置。如本文中实施例中所述,提供的组合物和方法可以提供对核酸聚合物的切割样式的控
制。
154中的那些,在靶序列中出人意料地产生仅一个切割位点。此外,出人意料地发现,提供单
一切割位点的寡核苷酸(例如ONT‑87和ONT‑154)提供了出人意料的高切割速率和低水平的
剩余靶核酸聚合物。还参见图8、图10和图11。
样式,手性控制的寡核苷酸组合物表现为能够提供改变的切割样式。对于示例性结果,参见
图10和图11。如图12中所示,当与参照手性未控制的寡核苷酸组合物相比时,示例性手性控
制的寡核苷酸组合物提供了显著提高的切割速率和出人意料的低水平的剩余底物二者。在
一些实施方案中,如图11中所示,切割位点与RpSpSp骨架手性中心序列有关。在一些实施方
案中,切割位点是RpSpSp上游两个碱基对。
割。互补RNA的ONT‑316(5‑10‑52’‑MOE间隔聚体)的Tm是76℃。在与寡核苷酸互补的RNA序列
中进行一次切割或数次切割之后,2’‑MOE片段可能保持与RNA结合,因此使得其他靶分子不
能被切割。当与RNA形成双链体时,DNA链的热解链温度通常低得多,例如ONT‑367(63℃)和
ONT‑392(60℃)。另外,与2’‑MOE修饰的寡核苷酸相比,DNA序列的热稳定性通常相对均匀地
分布。在一些实施方案中,提供的手性控制的寡核苷酸组合物中的寡核苷酸不包含2’‑修
饰,例如2’‑MOE。在一些实施方案中,与具有2’‑修饰(例如2’‑MOE)的寡核苷酸相比,提供的
手性控制的寡核苷酸组合物中不包含2’‑修饰(例如2’‑MOE)的寡核苷酸更容易从核酸聚合
物切割片段解离并且具有更高周转。在一些实施方案中,本发明提供了其中寡核苷酸不具
有2’‑修饰的全部DNA设计。在一些实施方案中,其中寡核苷酸不具有2’‑修饰的手性控制的
寡核苷酸组合物提供了更高的的核酸酶(例如,RNase H)的周转。在一些实施方案中,切割
之后,RNase H更容易从RNA和提供的手性控制的寡核苷酸组合物的寡核苷酸形成的双链体
上解离。使用与上述类似的方案,与参照手性未控制的寡核苷组合物相比,寡核苷酸类型
ONT‑367和ONT‑392的两种示例性性控制的寡核苷酸组合物的周转确实表现出更高的周转
速率(参见图13)。
了在切割位点的数目、切割位点的位置和/或切割位点的相对切割百分比方面改变的切割
样式。在一些实施方案中,如通过ONT‑401和ONT‑406示例的,手性控制的寡核苷酸组合物提
供了单一位点切割。
(processive nature),导致更短的5’‑OH3’‑OH片段。
方面。参见图15‑17。图18‑20示出了示例性分析数据。不旨在受理论的限制,申请人注意到,
在一些实施方案中,切割可以如图21中所述发生。在图17中,应注意观察到ONT‑406引起双
链体RNA的切割,其切割速率稍微超过具有相同碱基序列和长度的天然DNA寡核苷酸ONT‑
415的切割速率。申请人注意到,本公开内容中提供的手性控制的寡核苷酸组合物ONT‑406
和其他手性控制的寡核苷酸组合物具有例如更好的体外和/或体内稳定性曲线。图25中示
出了另外的示例性数据。另外,本领域技术人员将理解,图26和图27中示出的示例性数据证
实,提供的示例性手性控制的寡核苷酸组合物,尤其是当这样设计旨在通过骨架手性中心
样式控制切割样式时,产生了比参照寡核苷酸组合物(例如,立构无规寡核苷酸组合物)远
远更好的结果。如图26中所示,控制的骨架手性中心样式尤其可以选择性提高和/或降低当
使用DNA寡核苷酸时的现有切割位点的切割,或者产生当使用DNA寡核苷酸时不存在的全新
切割位点(参见图25,ONT‑415)。在一些实施方案中,来自DNA寡核苷酸的切割位点指示
RNase H的内源切割偏好。如图27证实的,提供的手性控制的寡核苷酸组合物能够调节靶切
割速率。在一些实施方案中,细胞活性约75%的变化的原因是切割速率的差异,其可以通过
骨架手性中心样式控制。如本申请中提供的,进一步的结构特征(例如碱基修饰及其样式、
糖修饰及其样式、核苷酸间键联修饰及其样式和/或其任意组合)可与骨架手性中心样式组
合以提供期望的寡核苷酸特性。
些实施方案中,本发明提供了等位基因特异性mHTT抑制。
位基因的转录物测试寡核苷酸451和452。还使用了以下中所述的类似操作在细胞和动物模
型中测试了等位基因特异性抑制:Hohjoh,Pharmaceuticals 2013,6,522‑535;美国专利申
请公开US2013/0197061;和 等,Nucleic Acids Research 2013,41(21),
9634‑9650。在所有情况下,相对于来自其他等位基因的那些,选择性抑制来自靶等位基因
的转录物。如本领域技术人员将理解的,图22中示出的示例性数据证实,提供的示例性手性
控制的寡核苷酸组合物,尤其是在设计为通过立体化学控制切割样式时,产生了比参照寡
核苷酸(在这种情况下,立构无规寡核苷酸组合物)远远更好的结果。如图22确认的,骨架手
性中心样式可以显著改变切割样式(图22C‑E),立体化学样式可用于将切割位点定位在错
配位点(如22C‑E),和/或可显著改善突变体和野生型之间的选择性(图22G‑H)。在一些实施
方案中,用靶标的wtRNA和muRNA孵育手性控制的寡核苷酸组合物并且用RNase H孵育这两
种双链体。
位基因的转录物测试寡核苷酸ONT‑400、ONT‑402和ONT‑406。还使用了以下中所述的类似操
作在细胞和动物模型中测试了等位基因特异性抑制:Hohjoh,Pharmaceuticals 2013,6,
522‑535;美国专利申请公开US 2013/0197061; 等,Nucleic Acids
Research,2013,41(21),9634‑9650;和Jiang等,Science 2013,342,111‑114。相对于来自
其他等位基因的那些,选择性抑制来自靶等位基因的转录物。在一些情况下,由ONT‑388合
成具有错配的两种RNA ONT‑442(A/G,第7位)和ONT‑443(A/G,第13位)并且与ONT‑396至
ONT‑414形成双链体。进行RNase H测定以获得切割速率和切割图。
ONT‑386 rUrGrCrArGrArArUrGrArArGrGrArArCrUrGrGrA
ONT‑387 rUrArUrGrCrCrArGrCrCrArGrGrCrArUrCrUrCrA
ONT‑388 rCrUrCrArGrCrArGrCrUrGrCrArArUrCrGrCrUrA
ONT‑415 d[TAGCCATTGCAGCTCCTCAC]
ONT‑442 rGrUrCrArGrCrGrGrCrUrGrCrArArUrGrGrCrUrA
ONT‑443 rGrUrGrArGrCrArGrCrUrGrCrGrArUrGrGrCrUrA
ONT‑453 rGrCrUrGrArUrGrArCrArArUrUrUrArUrUrArArU
ONT‑454 rGrGrUrGrArUrGrGrCrArArUrUrUrArUrUrArArU
果。手性控制的寡核苷酸组合物尤其可以产生受控的切割样式,包括但不限于切割位点的
位置、切割位点的数目和切割位点的相对切割百分比的控制。还参见图27中示出的示例性
数据。
28。以下描述了用于进行血清稳定性实验的示例性方案。
PS DNA(ONT‑455)(0h和48h)并且通过IEX‑HPLC分析。
(erpicentre,MTC096H)和3μL蛋白酶K溶液(20mg/mL)终止反义。将混合物在60℃下孵育20
分钟,然后将20μL混合物进样到IEX‑HPLC中并进行分析。
1 0.00 1.00 95.0 5.0 0.0 0.0 6
2 1.00 1.00 95.0 5.0 0.0 0.0 1
3 2.00 1.00 75.0 25.0 0.0 0.0 6
4 10.00 1.00 5.0 95.0 0.0 0.0 6
5 10.10 1.00 95.0 5.0 0.0 0.0 6
6 12.50 1.00 95.0 5.0 0.0 0.0 1
2 5.50 1.00 0.0 0.0 100.0 0.0 1
3 5.60 1.00 0.0 100.0 0.0 0.0 6
4 7.50 1.00 0.0 100.0 0.0 0.0 1
5 7.60 1.00 95.0 5.0 0.0 0.0 6
6 12.50 1.00 95.0 5.0 0.0 0.0 1
性实施方案在本领域普通技术人员的能力范围内,并且预期落入本发明的范围内。特别地,
尽管本文中呈现的许多实例涉及方法动作或系统要素的特定组合,但应理解那些动作和那
些要素可以其他方式组合以实现相同目标。仅结合一个实施方案讨论的动作、要素和特征
不旨在排除在其他实施方案中的类似作用。此外,对于所附权利要求中叙述的一个或更多
个手段加功能限制,手段不旨在限于本文公开的用于执行所记载功能的手段,而是旨在在
范围方面涵盖目前已知或稍后开发的用于执行所记载功能的任何手段。
所依的时序,而是仅用作标记来区分具有某名称的一个权利要求要素与具有相同名称的另
一要素(如果不使用顺序术语)以区分所述权利要求要素。类似地,使用a)、b)等或i)、ii)等
本身并不意味权利要求中的步骤的任何优先、居先或次序。类似地,在说明书中使用这些术
语本身并不意味任何需要的优先、居先或次序。
其他功能等价实施方案也在本发明的范围内。除本文中所示和所述的那些修改之外,根据
先前描述,本发明的多种修改对于本领域技术人员是明显的,并且落入所附权利要求的范
围内。本发明的优势和目标未必被本发明的各实施方案所涵盖。