一种EPO受体及其在伴红细胞增多症的肝细胞癌中的应用

摘要

本发明涉及肿瘤治疗技术领域，具体是EPO/EPOR信号通路抑制剂或阻断剂在制备治疗伴红细胞增多症的肝癌药物中的应用。本发明发现肝细胞癌中EPO的产生引起的红细胞增多症对于肝细胞癌的进展起到促进作用，本发明提出抑制或阻断EPO/EPOR信号通路可以作为此类肝癌的新的治疗靶点。本发明的重组腺病毒Ad‑EPOR‑Fc和重组蛋白EPOR‑Fc能够明显抑制细胞的增殖，下调p‑stat3表达水平，而对正常肝细胞无明显毒性，较其他商业化同类受体重组蛋白对于伴红细胞增多症的肝癌治疗效果更显著，为肝癌的治疗提供了新的思路和方法。

权利要求

1.EPO/EPOR信号通路抑制剂或阻断剂在制备治疗伴红细胞增多症的肝癌药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的EPO/EPOR信号通路抑制剂或阻断剂在制备治疗伴红细胞增多症的肝癌药物中的应用，其特征在于，所述的EPO/EPOR信号通路抑制剂或阻断剂抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤的生长。

3.根据权利要求1所述的EPO/EPOR信号通路抑制剂或阻断剂在制备治疗伴红细胞增多症的肝癌药物中的应用，其特征在于，所述的EPO/EPOR信号通路抑制剂或阻断剂是EPO或EPOR的抑制剂。

4.根据权利要求1所述的EPO/EPOR信号通路抑制剂或阻断剂在制备治疗伴红细胞增多症的肝癌药物中的应用，其特征在于，所述的EPO/EPOR信号通路抑制剂是JAK2抑制剂。

5.根据权利要求1所述的EPO/EPOR信号通路抑制剂或阻断剂在制备治疗伴红细胞增多症的肝癌药物中的应用，其特征在于，所述的EPO/EPOR信号通路抑制剂或阻断剂是EPOR胞外段Fc融合蛋白。

6.根据权利要求1所述的EPO/EPOR信号通路抑制剂或阻断剂在制备治疗伴红细胞增多症的肝癌药物中的应用，其特征在于，所述的EPO/EPOR信号通路抑制剂或阻断剂是表达EPOR胞外段Fc融合蛋白的重组载体。

7.根据权利要求5所述的EPO/EPOR信号通路抑制剂或阻断剂在制备治疗伴红细胞增多症的肝癌药物中的应用，其特征在于，所述的EPO/EPOR信号通路抑制剂或阻断剂是表达EPOR胞外段Fc融合蛋白的重组腺病毒Ad-EPOR-Fc。

说明书

一种EPO受体及其在伴红细胞增多症的肝细胞癌中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及肿瘤治疗技术领域，具体地说，是一种EPO受体(EPOR)及其在伴红细胞增多症的肝细胞癌中的应用。

背景技术

[0002] 肝癌是一种临床常见的恶性肿瘤，其中肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是最主要的病理类型。世界卫生组织(WHO)2014年公布的数据表明，肝癌为男性第五大常见肿瘤，在女性常见肿瘤中居第九位。根据估计，2012年全球新发肝癌78.2万例，仅中国的新发病例就占到总数的50％以上(Rautou,P.E.,et al.,Autophagy in liver diseases.J Hepatol,2010.53(6):p.1123-34.)。近年来，由于HCV感染和脂肪性肝炎等基础疾病发病率的升高，肝癌发病率呈上升态势。肝癌病因复杂，恶性程度高，异质性强，并且多数患者发现时已是晚期，往往预后不良。在欧美等发达国家，5年生存率也低于15％(Czaja,M.J.,Functions of autophagy in hepatic and pancreatic physiology and disease.Gastroenterology,2011.140(7):p.1895-908.)。现行的肝癌治疗策略是以分期系统指导的根治性手术和姑息性治疗相结合的方式(Kroemer,G.,G.Marino,and B.Levine,Autophagy and the integrated stress response.Mol Cell,2010.40(2):p.280-93.)，临床肝癌诊疗中存在着治疗方法不特异、复发转移率高、个体化治疗缺乏依据、创新的特效药物少等难点问题，这样的现状导致肝癌病死率居高不下。在全球2012年因恶性肿瘤导致死亡的病例数中，肝癌排名第二，仅次于肺癌，死亡病例占死亡总数的9.1％(Rautou,P.E.,et al.,Autophagy in liver diseases.J Hepatol,2010.53(6):p.1123-
34.)。

[0003] 近年来，人们逐渐认识到，包括肝癌在内的恶性肿瘤是一种非常复杂的病变，病理过程涉及到一系列分子通路的异常调节，且患者之间存在明显的异质性，甚至同一患者肿瘤的不同部位存在差别，使得肝癌的发生发展难以用单一的模型来解释。因此，从不同的分子水平和信号通路的异常表达对肝癌进行分子水平的区别有对于肝癌的个体化治疗是至关重要的(Mizushima,N.and M.Komatsu,Autophagy:renovation of cells and tissues.Cell,2011.147(4):p.728-41.)。

[0004] 红细胞增多症是较为常见的伴癌综合症，在肝细胞癌中约3％-12％的患者伴(Jacobson RJ,Lowenthal MN,and Kew MC.Erythrocytosis in hepatocellular cancer.S Afr Med J.1978；53(17):658-60)。在前期报道中，红细胞增多症在很多恶性肿瘤中均有发现，例如肾癌，脑膜瘤(Hammond D,and Winnick S.Paraneoplastic erythrocytosis and ectopic erythropoietins.Ann N Y Acad Sci.1974；230(219-27)。在肝细胞癌中红细胞增多症的主要是癌组织中促红细胞生成素(EPO)生成增多引起的(Matsuyama M,Yamazaki O,Horii K,Higaki I,Kawai S,Mikami S,Higashino M,Oka H,Nakai T,and Inoue T.Erythrocytosis caused by an erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma.J Surg Oncol.2000；75(3):197-202.)。EPO是一种多效性的细胞因子，在红细胞生成，血管新生，细胞增殖等多个过程中均有一定的作用(Mocini D,Leone T,Tubaro M,Santini M,and Penco M.Structure,production and function of erythropoietin:implications for therapeutical use in cardiovascular disease.Curr Med Chem.2007；14(21):2278-87.Foley RN.Erythropoietin:physiology and molecularmechanisms.Heart  Fail  Rev.2008；13(4):405-14.Glaspy JA.Erythropoietin in cancer patients.Annu Rev Med.2009；60(181-92))。EPO主要通过与其特异性受体EPOR结合后发挥作用。EPOR属于细胞因子受体超家族中的成员，主要表达在造血前体细胞上(Bunn HF.Erythropoietin.Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine.2013；3(3).Jelkmann W,Bohlius J,Hallek M,and Sytkowski AJ.The erythropoietin receptor in normal and cancer tissues.Crit Rev Oncol Hematol.2008；67(1):39-61.)。EPOR在没有激素作用时呈二聚体，每个二聚体组成型结合一个JAK-2酪氨酸激酶分子，EPO与EPOR结合之后诱导EPOR的构象改变，通过结合的JAK2交互磷酸化，激活下游的级联信号转导，导致细胞的增殖，存活及分化(Bunn HF.Erythropoietin.Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine.2013；3(3).)。

[0005] 前期有报道表明EPOR可以表达在一些非造血细胞来源的肿瘤细胞系中，由此引发了科研人员对于促进红细胞生成制剂(erythropoiesis-stimulating agents,ESAs)影响肿瘤细胞增殖从而促进肿瘤细胞存活的猜想。同时，一些随机的临床实验结果表明，促红细胞生成制剂的使用缩短了肿瘤进展的时间，患者的总体生存期也更短(Crouch Z,and DeSantis ER.Use of erythropoietin-stimulating agents in breast cancer patients:a risk review.Am J Health Syst Pharm.2009；66(13):1180-5.Kumar SM,Zhang G,Bastian BC,Arcasoy MO,Karande P,Pushparajan A,Acs G,and  Xu X.Erythropoietin receptor contributes to melanoma cell survival  in vivo.Oncogene.2012；31(13):1649-60.Tovari J,Pirker R,Timar J,Ostoros G,Kovacs G,and Dome B.Erythropoietin in cancer:an update.Curr Mol Med.2008；8(6):481-91.Wang L,Li HG,Xia ZS,Wen JM,and Lv J.Prognostic significance of erythropoietin and erythropoietin receptor in gastric adenocarcinoma.World J Gastroenterol.2011；17(34):3933-40.Wright JR,Ung YC,Julian JA,Pritchard KI,Whelan TJ,Smith C,Szechtman B,Roa W,Mulroy L,Rudinskas L,et al.Randomized,double-blind,placebo-controlled trial of erythropoietin in non-small-cell lung cancer with disease-related anemia.J Clin Oncol.2007；25(9):1027-32.Smith RE,Jr.,Aapro MS,Ludwig H,Pinter T,Smakal M,Ciuleanu TE,Chen L,Lillie T,and Glaspy JA.Darbepoetin alpha for the treatment of anemia in patients with active cancer not receiving chemotherapy or radiotherapy:results of a phase III,multicenter,randomized,double-blind,placebo-controlled study.J Clin Oncol.2008；26(7):1040-50.)。在很大比例的乳腺癌的样本以及乳腺癌细胞系中，EPOP与人类上皮生长因子受体-2(HER2)呈共表达。EPO通过促进肿瘤前体细胞的自我更新能力促进乳腺癌的形成(Zhou B,Damrauer JS,Bailey ST,Hadzic T,Jeong Y,Clark K,Fan C,Murphy  L,Lee CY,Troester MA,et al.Erythropoietin  promotes breast tumorigenesis through tumor-initiating cell self-renewal.J Clin Invest.2014；
124(2):553-63.)。用人重组的EPO对这类乳腺癌进行联合治疗可以降低肿瘤细胞对曲妥单抗的反应性，且HER-2阳性的转移性乳腺癌中联合用药肿瘤抑制时间更短，患者总体生存时间也更短(Liang K,Esteva FJ,Albarracin C,Stemke-Hale K,Lu Y,Bianchini G,YangCY,Li Y,Li X,Chen CT,et al.Recombinant human erythropoietin antagonizes trastuzumab treatment of breast cancer cells via Jak2-mediated Src activation and PTEN inactivation.Cancer Cell.2010；18(5):423-35)。

[0006] 目前EPO或是EPOR与肝细胞癌的进展相关的研究报道十分有限，有文献认为肝细胞癌组织中EPO/EPOR的表达量与肝细胞癌的血管新生和进展相关，其作用可能是通过肝癌细胞分泌EPO作用于血管内皮细胞的EPOR这种旁分泌的形式促进血管新生(Ribatti D,Marzullo A,Gentile A,Longo V,Nico  B,Vacca A,et al.Erythropoietin/erythropoietin-receptor system is involved in angiogenesis in human hepatocellular carcinoma.Histopathology 2007；50(5):591-6.)。但是该文章并未对其作用机制进行进一步探索，并且仅仅局限于EPO对于血管内皮细胞的作用进行了讨论，并未探究其对于肝癌细胞以及其他相关间质细胞的作用。该研究选择的所有患者HbsAg均为阴性，其研究人群并不符合中国大多数肝癌患者伴有HbsAg阳性的特点，且该研究针对肝癌患者的分化程度进行，并非研究肝癌中伴有红细胞增多症的这类患者。因此目前尚未有文献报道肝癌中EPO与肝癌伴红细胞增多症患者的关系，也未见有文献报道通过阻断EPOR来治疗伴红细胞增多症的肝细胞癌。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供伴红细胞增多症的肝癌的新的治疗靶点。

[0008] 本发明对伴随红细胞增多症的肝细胞癌的癌组织及癌旁正常组织进行了全基因组及mtDNA测序，发现这些肝癌样本中线粒体突变可以使三羧酸循环中代谢物缺失，从而导致HIF的蓄积。组成型增多的HIF可以诱导肝细胞癌中大量EPO的表达，引起红细胞增多症，从而导致肝癌的进展。EPOR胞外段Fc融合蛋白可以阻断EPO/EPOR信号通路，经体内外实验验证可以显著诱导细胞凋亡，抑制肿瘤的生长。以上这些发现均表明肝细胞癌中EPO的产生引起的红细胞增多症对于肝细胞癌的进展起到促进作用，并且提出阻断EPO/EPOR信号通路可以作为此类肝癌的治疗新靶点。

[0009] 本发明的第一方面，提供EPO/EPOR信号通路抑制剂或阻断剂在制备治疗伴红细胞增多症的肝癌药物中的应用。

[0010] 所述的EPO/EPOR信号通路抑制剂或阻断剂抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤的生长。

[0011] 优选的，所述的EPO/EPOR信号通路抑制剂或阻断剂是EPO或EPOR的抑制剂。

[0012] 优选的，所述的EPO/EPOR信号通路抑制剂是JAK2抑制剂，可以是AZD1480等。

[0013] 更优选的，所述的EPO/EPOR信号通路抑制剂或阻断剂是EPOR胞外段Fc融合蛋白。

[0014] 更优选的，所述的EPO/EPOR信号通路抑制剂或阻断剂是表达EPOR胞外段Fc融合蛋白的重组载体或腺病毒。

[0015] 最优选的，所述的EPO/EPOR信号通路抑制剂或阻断剂是表达EPOR胞外段Fc融合蛋白的重组腺病毒Ad-EPOR-Fc。

[0016] 所述的Ad-EPOR-Fc由腺病毒载体、EPOR胞外段模板序列(SEQ ID NO:1)和人免疫球蛋白Fc段模板序列(SEQ ID NO:2)组成，通过DNA重组技术构建到同一个质粒中，该质粒通过与腺病毒骨架质粒在293A细胞中组装成具有感染能力的腺病毒颗粒。其表达的EPOR受体Fc段融合蛋白(EPOR-Fc)是EPOR上与EPO结合的结构域，在真核细胞中合成表达该蛋白能够起到阻断EPO/EPOR信号通路的效果。

[0017] 本发明的第二方面，提供一种治疗伴红细胞增多症的肝癌药物，所述的治疗伴红细胞增多症的肝癌药物的活性成分为EPO/EPOR信号通路抑制剂或阻断剂。

[0018] 本发明优点在于：

[0019] 本发明发现肝细胞癌中EPO的产生引起的红细胞增多症对于肝细胞癌的进展起到促进作用，本发明提出抑制或阻断EPO/EPOR信号通路可以作为此类肝癌的新的治疗靶点。本发明的重组腺病毒Ad-EPOR-Fc和重组蛋白EPOR-Fc能够明显抑制细胞的增殖，下调p-stat3表达水平，而对正常肝细胞无明显毒性，较其他商业化同类受体重组蛋白对于伴红细胞增多症的肝癌治疗效果更显著，为肝癌的治疗提供了新的思路和方法。

附图说明

[0020] 图1是ELISA检测伴有红细胞增多症的肝癌患者(红色)和普通肝癌患者(蓝色)血清中EPO的含量。

[0021] 图2是用RT-PCR检测伴有红细胞增多症的肝癌患者(红色)和普通肝癌患者(蓝色)肿瘤组织中EPO的表达量。

[0022] 图3是用流式细胞分选技术分选出PDX模型中EPOR阳性的细胞亚群，该亚群中EPCAM表达量更高。

[0023] 图4是用RT-PCR检测流式分选出PDX模型中EPOR阳性和阴性的细胞亚群中干细胞标志物的表达量。用RT-PCR检测两组细胞中肿瘤前体细胞标志物的表达水平，发现EPOR高表达细胞OCT4、SOX9、LGR5、NANOG以及CD133表达量明显高于EPOR阴性细胞组。

[0024] 图5是腺病毒Ad-EPOR-Fc表达的可溶性EPOR胞外段可以与EPO结合，从而阻断EPO与细胞膜上的EPOR结合，封闭了EPO的胞内信号传导途径的模式图。

[0025] 图6是分别用Ad-GFP和Ad-EPOR-Fc作用于Huh7细胞后细胞的增殖曲线。图中所示Ad-EPOR-Fc处理Huh7之后72h内细胞增殖明显慢于对照细胞。

[0026] 图7是体内实验中用Ad-EPOR-Fc和对照腺病毒治疗EPOR高表达PDX一个月后肿瘤的大小比较图。用Ad-EPOR-Fc和对照腺病毒尾静脉注射接种EPOR高表达PDX小鼠一个月后，图中显示Ad-EPOR-Fc治疗后肿瘤大小明显小于对照组。

[0027] 图8是Ad-EPOR-Fc和对照腺病毒处理过的Huh7细胞以及原代分离正常肝细胞荧光图。图中显示与对照腺病毒相比Ad-EPOR-Fc可以明显抑制Huh7细胞的增殖，而对原代分离的正常肝细胞并无明显毒性。

[0028] 图9是用WB检测Ad-EPOR-Fc和对照腺病毒处理Huh7细胞后p-stat3的表达量。图中显示用Ad-EPOR-Fc处理Huh7细胞后p-stat3的表达量明显低于对照组。

[0029] 图10是利用EPO和EPOR高表达的肝癌细胞系Huh7感染Ad-GFP和Ad-EPOR-Fc 24小时后细胞裂解液检测p-stat3表达量的图，如图所示Huh7细胞感染Ad-EPOR-Fc后，p-stat3表达水平与对照相比明显下调。

[0030] 图11为用不同浓度的竞争性JAK2抑制剂AZD1480处理Huh7细胞100小时细胞的增殖系数。图中A1/A2为对照组，B1/B2为AZD1480 2uM处理组，C1/C2为AZD1480 4uM处理组，,D1/D2为AZD1480 8uM处理组。

[0031] 图12为用不同浓度的竞争性JAK2抑制剂AZD1480处理原代分离PDX肿瘤细胞100小时细胞的增殖系数。图中A1/B1为对照组，F1/F2为AZD14802uM处理组，G1/G2为AZD1480 4uM处理组，H1/H2为AZD1480 8uM处理组。

[0032] 图13为构建表达重组可溶性EPO受体Fc段融合蛋白的腺病毒Ad-EPOR-Fc PCR克隆目的基因克隆片段鉴定图。

[0033] 图14为构建表达重组可溶性EPO受体Fc段融合蛋白的腺病毒Ad-EPOR-Fc PCR，用Fermentas的限制性内切酶EcoRI/BamHI进行双酶切基因片段和载体Ad8后酶切效果鉴定图。

[0034] 图15为构建表达重组可溶性EPO受体Fc段融合蛋白的腺病毒Ad-EPOR-Fc PCR验证克隆菌，挑取克隆用引物Ad8-F和R进行PCR验证，目的条带大小如图所示，证明此三个克隆都为阳性。

具体实施方式

[0035] 下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

[0036] 实施例1：伴红细胞增多症的肝癌患者血清和肿瘤组织中检测到EPO高表达[0037] 本研究从东方肝胆外科医院获得肝癌患者肝癌，癌旁组织及血清样本，8名符合伴随红细胞增多症诊断的肝癌患者样本被纳入研究中，用Human EPO Platinum ELISA kit(eBioscience公司)检测验证该样本血清EPO水平显著高于对照组以及参考值上限(35mU/mL)，ELISA检测结果见图1。通过RT-PCR检测对照组和伴红细胞增多症肝癌组织中EPO mRNA水平，验证了血清中EPO检测水平升高的患者与对照组相比EPO表达水平升高。

[0038] 1.ELISA检测EPO具体操作方法如下：

[0039] (1)收集上述肝癌患者术前血清；

[0040] (2)每孔加入100μl梯度稀释的标准品和100μl样品，同时设立对照孔；

[0041] (3)每孔加入50μl Biotin-Conjugate，混匀后，盖上封板膜，室温孵育1h；

[0042] (4)在滤纸上扣去孔内液体，每孔加入300μl Wash Buffer，洗6次；

[0043] (5)每孔加入100μl Streptavidin-HRP，盖上封板膜，室温孵育20min；

[0044] (6)在滤纸上扣去孔内液体，每孔加入300μl Wash Buffer，洗6次；

[0045] (7)每孔加入100μl/孔加入TMB显色底物，室温避光孵育20min；

[0046] (8)每孔加入100μl终止液终止反应；

[0047] (9)用酶标仪测定450nm吸光值。

[0048] 2.RT-PCR检测患者样本EPO mRNA水平具体操作步骤如下

[0049] 样本RNA抽提：收集术后肝癌患者肝癌和癌旁组织，取上述组织加入适量的TRIZON中(100mg组织，1ml)，用匀浆机处理充分裂解，加入Trizol体积1/5的氯仿，剧烈震荡30s，室温静置3min；4℃，12000×g，离心15min，吸取上清至新管；加入等体积的异丙醇，室温沉淀10min；4℃，12000×g，离心10min；弃去上清，75％乙醇洗一遍，4℃，7500×g，离心5min，
75％乙醇的量至少为所用离心管最大体积的3/4，加入后需上下颠倒数次；弃去上清，控干5～10min，溶于适当体积的水，所得即为RNA。

[0050] 将RNA反转录为cDNA：

[0051] 定量上述RNA，取2ugRNA，加入2ul N6随机引物和适量的Q水，将总体积调整为14ul，70℃水浴5分钟后冰上静止5分钟，按照如下比例加入逆转录试剂：RNAsin 1ul，MMLV buffer 5ul，dNTP 1.25ul，MMLV 1ul，Q水2.75ul，总体积为25ul。37度水浴1h，所得即为cDNA。

[0052] RT-PCR：

[0053] 用 96(Roche)进行RT-PCR对样本中EPO转录水平进行定量，反应体系为20ul：SYBR Green PCR Master Mix(Roche)10ul，引物10ul，cDNA 1ul和Q水8ul，退货温度为60℃，按照机器设置的反应条件进行PCR反应，EPO的检测引物为：

[0054] 上游引物5’-ATCACGACGGGCTGTGCTGAACAC-3’，(SEQ ID NO:3)

[0055] 下游引物5’-GGGAGATGGCTTCCTTCTGGGCTC-3’，(SEQ ID NO:4)

[0056] EPO的mRNA水平用β-actin进行标准化处理。

[0057] 实施例2：EPOR高表达的肝癌细胞具有更强的肿瘤干细胞特性

[0058] 取EPOR高表达患者肝癌样本进行处理后皮下接种裸鼠构建PDX模型，原代分离PDX肿瘤细胞，用磁分选技术富集PDX模型小鼠EPOR阳性和阴性的肝癌细胞，通过流式细胞检测EPOR阳性细胞与对照细胞相比Epcam表达更高(图3)。用RT-PCR检测两组细胞中肿瘤前体细胞标志物的表达水平，发现EPOR高表达细胞肿瘤前体细胞标志物OCT4，SOX9，LGR5，NANOG以及CD133表达量明显高于EPOR阴性细胞组(图4)。

[0059] 肝癌细胞原代分离及磁分选步骤如下：

[0060] (1)取一黄豆大小的新鲜肝癌组织，用无菌组织剪剪碎，装入无菌离心管中；

[0061] (2)加入适量0.5mg/ml IV型胶原酶5ml，置于37℃水浴锅中，消化15min，每5min震荡一次；

[0062] (3)用70μm无菌过滤网过滤至新的离心管中，制备单细胞悬液；

[0063] (4)1000rpm离心3min，弃去上层液体；

[0064] (5)加入红细胞裂解液裂解3-5min；

[0065] (6)1000rpm离心3min，弃去上层液体；

[0066] (7)细胞重悬并计数后，重悬后计数，取约2×107个细胞，加磁分选buffer，300g离心10min；

[0067] (8)弃上清，加入EPOR-FITC抗体，混匀，4℃孵育30min，每隔10分钟弹匀一次；

[0068] (9)加2ml缓冲液洗细胞，离心(300g×10min)弃上清；

[0069] (10)加180ul缓冲液重悬并加入20ul Anti-FITC MicroBeads，混匀，4℃孵育15min；

[0070] (11)加2ml缓冲液300g离心10min，弃上清；

[0071] (12)加入500ul缓冲液重悬轻柔吹打；

[0072] (13)将中号磁分选柱吸附在磁铁上，加500buffer冲洗柱子；

[0073] (14)将细胞悬液加入磁分选柱中，以1.5ml EP管收集柱子中滤过细胞即为EPOR阴性细胞；

[0074] (15)待细胞悬液全部流下后，加入500ul缓冲液冲洗磁分选柱，重复2次；

[0075] (16)将磁分选柱移离磁场，加入1ml buffer，用柱芯将液体冲出，所得细胞即为EPOR阳性细胞。

[0076] RT-PCR反应体系及条件同前，所用到的引物序列如下：

[0077] h CD133F 5’-GCCACCGCTCTAGATACTGC(SEQ ID NO:5)

[0078] h CD133R 5’-TGTTGTGATGGGCTTGTCAT(SEQ ID NO:6)

[0079] h SOX9-F 5’-GTGCTCAAAGGCTACGACTG(SEQ ID NO:7)

[0080] h SOX9-R 5’-CAGCTGCTCCGTCTTGATG(SEQ ID NO:8)

[0081] h Nanog F 5’-CATGAGTGTGGATCCAGCTTG(SEQ ID NO:9)

[0082] h Nanog R 5’-CCTGAATAAGCAGATCCATGG(SEQ ID NO:10)

[0083] h Oct 4F 5’-AGTGAGAGGCAACCTGGAGA(SEQ ID NO:11)

[0084] h Oct 4R 5’-ACACTCGGACCACATCCTTC(SEQ ID NO:12)

[0085] h Sox2F 5’-CAAGATGCACAACTCGGAGA(SEQ ID NO:13)

[0086] h Sox2R 5’-GCTTAGCCTCGTCGATGAAC(SEQ ID NO:14)

[0087] hLGR5-F:5'-CCTTCCAACCTCAGCGTCT-3'(SEQ ID NO:15)

[0088] hLGR5-R:5'-GAGCTTCTGTGGGTACGTGTC-3'(SEQ ID NO:16)

[0089] 实施例3：构建Ad-EPOR-Fc并验证其抑制肝癌细胞增殖的作用

[0090] 利用腺病毒作为载体，构建表达重组可溶性EPO受体Fc段融合蛋白的腺病毒Ad-EPOR-Fc，腺病毒重组质粒构建方法如下所示：

[0091] 1.引物设计与合成

[0092] 1.1PCR引物序列

[0093] epr1-GCGAATTCGCCACCATGGACCAC(SEQ ID NO:17)

[0094] epr2-GAGACAAAGGGAGCCGACCTGGGGCCAGAGGGACGCCCCGAGGTGGTCCATGGTGGCG(SEQ ID NO:18)

[0095] epr3-GTCGGCTCCCTTTGTCTCCTGCTCGCTGGGGCCGCCTGGGCGCCCCCGCCTAACCTCC(SEQ ID NO:19)

[0096] epr4-GGGCCGCCAGCAAGGCCGCTTTGCTCTCGAACTTGGGGTCCGGGAGGTTAGGCGGGGG(SEQ ID NO:20)

[0097] epr5-CCTTGCTGGCGGCCCGGGGGCCCGAAGAGCTTCTGTGCTTCACCGAGCGGTTGGAGGA(SEQ ID NO:21)

[0098] epr6-CCCACCCCAGCGCTCGCCGCTTCCTCCCAGAAACACACCAAGTCCTCCAACCGCTCGG(SEQ ID NO:22)

[0099] epr7-GAGCGCTGGGGTGGGCCCGGGCAACTACAGCTTCTCCTACCAGCTCGAGGATGAGCCA(SEQ ID NO:23)

[0100] epr8-CACGAGCCGTGGGAGCCTGGTGCAGGCGACACAGCTTCCATGGCTCATCCTCGAGCTG(SEQ ID NO:24)

[0101] epr9-GCTCCCACGGCTCGTGGTGCGGTGCGCTTCTGGTGTTCGCTGCCTACAGCCGACACGT(SEQ ID NO:25)

[0102] epr10-GGAGGCTGCTGTGACGCGCAACTCTAGGGGCACGAAGCTCGACGTGTCGGCTGTAGGC(SEQ ID NO:26)

[0103] epr11-CGTCACAGCAGCCTCCGGCGCTCCGCGATATCACCGTGTCATCCACATCAATGAAGTA(SEQ ID NO:27)

[0104] epr12-CGCGCCACCAGCCCCACGGGGGCGTCTAGGAGCACTACTTCATTGATGTGGATGACAC(SEQ ID NO:28)

[0105] epr13-GGGCTGGTGGCGCGGTTGGCTGACGAGAGCGGCCACGTAGTGTTGCGCTGGCTCCCGC(SEQ ID NO:29)

[0106] epr14-GTCCACCTCGTAGCGGATGTGAGACGTCATGGGTGTCTCAGGCGGCGGGAGCCAGCGC(SEQ ID NO:30)

[0107] epr15-TCCGCTACGAGGTGGACGTCTCGGCCGGCAACGGCGCAGGGAGCGTACAGAGGGTGGA(SEQ ID NO:31)

[0108] epr16-CAGGTTGCTCAGCACACACTCGGTGCGGCCCTCCAGGATCTCCACCCTCTGTACGCTC(SEQ ID NO:32)

[0109] epr17-TGTGTGCTGAGCAACCTGCGGGGCCGGACGCGCTACACCTTCGCCGTCCGCGCGCGTA(SEQ ID NO:33)

[0110] epr18-CTCCGACCAGGCGCTCCAGAAGCCGCCGAAGCTCGGCTCAGCCATACGCGCGCGGACG(SEQ ID NO:34)

[0111] epr19-GAGCGCCTGGTCGGAGCCTGTGTCGCTGCTGACGCCTAGCGACCTGGACCCCGACAAA(SEQ ID NO:35)

[0112] epr20-CATGTGTGAGTTTTGTCGGGGTCCAGGT(SEQ ID NO:36)

[0113] fcf-CCCCGACAAAACTCACACATGCCCAC(SEQ ID NO:37)

[0114] fcr-CCGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG(SEQ ID NO:38)

[0115] 1.2PCR验证引物

[0116] Ad8-F GCGTTCTACGTGGGTATAAG(SEQ ID NO:39)

[0117] Ad8-R GACAAACCACAACTAGAATGC(SEQ ID NO:40)

[0118] 1.3测序引物

[0119] Ad8-F GCGTTCTACGTGGGTATAAG(SEQ ID NO:41)

[0120] Ad8-R GACAAACCACAACTAGAATGC(SEQ ID NO:42)

[0121] 2.PCR克隆目的基因

[0122] 全基因合成目的基因片段EPOR(最上游带有EcoRI酶切位点)，分成两段进行搭桥epr1-10和epr11-20，同时以质粒PIH(带有FC基因片段)为模板，引物fcf/r进行PCR，克隆出基因FC(681bp，最下游带有BamHI酶切位点)，再以上面三个基因片段拼接搭桥，以引物epr1/fcf扩增得到全长目的基因EPOR-FC。克隆片段鉴定图如图13所示。

[0123] 3.重组载体构建

[0124] 用Fermentas的限制性内切酶EcoRI/BamHI进行双酶切基因片段(产物直接进行纯化)和载体Ad8(进行胶纯化)，鉴定图如图14。再通过T4DNA ligase连接载体与片段，并将重组载体转化于宿主菌TOP10中，转化产物涂布于Amp抗性平板上，37℃培养过夜，平板上长了约300个克隆。

[0125] 4.PCR验证克隆菌

[0126] 挑取克隆用引物Ad8-F和R进行PCR验证，目的条带大小如图15，此三个克隆都为阳性，送阳性克隆测序。

[0127] 5.测序结果

[0128] 用上下游载体引物Ad8-F和R进行测序，全长测通，EPOR段序列符合提供的目标序列，Fc段测序正常。

[0129] 由于腺病毒Ad-EPOR-Fc表达的可溶性EPOR胞外段可以与EPO结合，从而阻断EPO与细胞膜上的EPOR结合，封闭了EPO的胞内信号传导途径。该腺病毒在Huh7细胞系中可以阻断病理性升高的EPO的功能，通过CCK8检测细胞增殖，发现与对照相比Ad-EPOR-Fc可以明显抑制细胞的增殖(图6)。

[0130] 在体内实验中，用Ad-EPOR-Fc和对照腺病毒尾静脉注射接种EPOR高表达PDX小鼠，病毒量：108p.f.u./只，两周一次，肿瘤形成后处死小鼠，取出肿瘤测量体积大小并拍照，可见Ad-EPOR-Fc治疗组肿瘤大小明显小于对照组(图7)。

[0131] 实施例4：Ad-EPOR-Fc对正常肝细胞毒性小

[0132] 分别接种正常的肝原代细胞和Huh7细胞于96孔板，加入Ad-EPOR-Fc感染肝原代细胞和Huh7细胞，并且以Ad-GFP作为对照病毒，感染24h后，用荧光显微镜观察细胞形态，与对照腺病毒相比Ad-EPOR-Fc可以明显抑制Huh7细胞的增殖，而对原代分离的正常肝细胞并无明显毒性(图8)。

[0133] 实施例5：EPOR-Fc较其他商业化同类受体重组蛋白对于伴红细胞增多症的肝癌治疗效果更显著

[0134] 利用EPO和EPOR高表达的肝癌细胞系Huh7进行同类的商业化可溶性受体与Ad-EPOR-Fc对于细胞增殖影响的比较。用Ad-EPOR-Fc感染293T细胞，MOI值为10，48h后收集细胞培养上清，上清中即含有分泌型的EPOR-Fc段。96孔板中每孔种4000个Huh7细胞，贴壁后依次加入细胞通路抑制剂，分别为溶剂对照，GMCSFR-Fc，PRLR-Fc，EGFR-Fc，HGFR-Fc，IL-6ST-Fc，浓度为10ug/ml，以及上述收集到的含EPOR-Fc段的细胞培养上清，分别用CCK8测量
0h，24h，48h和72h时450nm的OD值，结果如图9所示可见含EPOR-Fc段的细胞培养上清与其他通路抑制剂相比细胞增殖速度明显被抑制。

[0135] 实施例6：EPOR-Fc显著下调Huh7细胞中EPO诱导的STAT3的激活

[0136] 利用EPO和EPOR高表达的肝癌细胞系Huh7感染Ad-GFP和Ad-EPOR-Fc，接种1×106个Huh7细胞于6孔板中，MOI值为10：培养24h后，生理盐水洗涤后加入适量IP裂解液；冰上充分裂解15min-30min，冰上超声破碎细胞(30％强度，3-5秒/次，间隔3-5秒，共超3-5次)，4℃，12,000rpm，离心15-30min，转移上清到新EP管中；BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量；使用多功能酶标仪进行蛋白定量，得到每个样本的蛋白浓度，取等量蛋白样品(细胞样品取40ug)，用IP裂解液调整至每组样品体积相同，再加入1/3该体积量的4×SDS loading buffer；100℃蜂窝炉，变性样品5min后冰上放置大于2min；样品按设定顺序上样；1×Tris-glycine进行SDS-PAGE蛋白电泳3-4h；通过湿转式转膜仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜)，恒压90V共50分钟；5％脱脂奶粉封闭液室温封闭NC膜1h(在杂交摇床上缓慢摇荡)；1×TBST洗3次，每次5min；杂交盒内倒入5％BSA稀释一抗，抗体具体信息如下：Stat3(124H6)Mouse mAb，Cat#9139(Cell Signaling Technology)，Phospho-Stat3(Tyr705)(D3A7)Rabbit mAb，Cat#9145(Cell Signaling Technology)，Beta-Actin Antibody，Rabbit pAb，Cat#100162-RP02-50(Sino Biological Inc.)；室温下在杂交摇床上缓慢摇荡孵育NC膜2-3h；1×TBST洗3次，每次5min；5％BSA稀释荧光二抗液室温下孵育1.5-2h；1×TBST洗3次，每次5min(需避光)；Odyssey荧光扫描仪扫膜。如图10所示Huh7细胞感染Ad-EPOR-Fc后，p-stat3表达水平明显下调。

[0137] 实施例7：细胞通路JAK抑制剂对伴红细胞增多症的肝癌细胞增殖有显著抑制的效果

[0138] 用培养基孵育E-Plate VIEW 16孔板30分钟，每孔接种Huh7细胞4000个，待细胞贴壁后，加入竞争性的JAK2抑制剂AZD1480(selleck)，设置浓度梯度为2ug/ml，4ug/ml和8ug/ml，对照为生理盐水，用RTCA(ACEA Bioscience)实时监测细胞增殖情况，共监测100h，细胞增殖系数如图11所示。原代分离PDX肿瘤细胞，每孔接种10000个细胞，待细胞贴壁后重复上述实验，细胞增殖系数如图12所示，细胞通路JAK抑制剂对伴红细胞增多症的肝癌细胞增殖有显著抑制的效果。

[0139] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。