利用二醇基硅胶提取乌鳢磷脂的方法

摘要

本发明公开了一种利用二醇基硅胶提取乌鳢磷脂的方法，包括以下步骤：1)、原料预处理：取新鲜的乌鳢肉，洗净后研磨成糜，真空干燥后粉碎成粉末，得乌鳢粉末；2)、液液萃取：在乌鳢粉末中加入有机溶剂Ⅰ后充分混合均匀，冰浴超声提取，然后加入水震荡离心，待溶液分层后移取下清液；先将下清液干燥，然后用有机溶剂Ⅱ复溶后，得到脂质粗提物；所述有机溶剂Ⅰ为甲醇：氯仿＝1：0.5～2体积比的混合液，所述有机溶剂Ⅱ为甲醇；3)、固相萃取：活化二醇基硅胶固相萃取柱，脂质粗提物经上样、淋洗、洗脱后，得到纯化后的磷脂提取物。

权利要求

1.利用二醇基硅胶提取乌鳢磷脂的方法，其特征是包括以下步骤：

1)、原料预处理：

取新鲜的乌鳢肉，洗净后研磨成糜，真空干燥后粉碎成粉末，得乌鳢粉末；

2)、液液萃取：

在乌鳢粉末中加入有机溶剂Ⅰ后充分混合均匀，冰浴超声提取，然后加入水震荡离心，待溶液分层后移取下清液；先将下清液干燥，然后用有机溶剂Ⅱ复溶后，得到脂质粗提物；

所述有机溶剂Ⅰ为甲醇：氯仿＝1：0.5～2体积比的混合液，乌鳢粉末与有机溶剂Ⅰ的料液比为1g/25～35ml；所述水的用量为有机溶剂Ⅰ的0.5～1体积倍；所述有机溶剂Ⅱ为甲醇，乌鳢粉末与有机溶剂Ⅱ的料液比为1g/8～12ml；

3)、固相萃取：

活化二醇基硅胶固相萃取柱，脂质粗提物经上样、淋洗、洗脱后，得到纯化后的磷脂提取物；

淋洗液为有机溶剂Ⅲ水溶液或有机溶剂Ⅲ，有机溶剂Ⅲ水溶液中有机溶剂Ⅲ的体积浓度≥70％，有机溶剂Ⅲ为甲醇、乙腈；

洗脱液为有机溶剂Ⅳ水溶液，有机溶剂Ⅳ水溶液中有机溶剂Ⅳ的体积浓度为50％，有机溶剂Ⅲ为乙腈；

上样、淋洗和洗脱的流速均为0.2～2mL/min。

2.根据权利要求1所述的利用二醇基硅胶提取乌鳢磷脂的方法，其特征是：该方法还包括步骤4)；

4)、浓缩干燥：

将步骤3)所得的磷脂提取物低温减压浓缩，得到乌鳢磷脂浓缩液。

3.根据权利要求1或2所述的利用二醇基硅胶提取乌鳢磷脂的方法，其特征是：所述步骤1)中：

真空干燥至含水率≤5％；

粉碎至粉末能过80～100目筛。

4.根据权利要求3所述的利用二醇基硅胶提取乌鳢磷脂的方法，其特征是：所述步骤2)中，以移取下清液后的残渣替代乌鳢粉末，以机溶剂Ⅰ中的氯仿替代机溶剂Ⅰ；再重复提取1～3次；

合并所有提取步骤所得的下清液再减压干燥，然后用有机溶剂Ⅱ复溶后，得到脂质粗提物。

5.根据权利要求3所述的利用二醇基硅胶提取乌鳢磷脂的方法，其特征是：所述步骤2)中，

每0.1～1g的乌鳢粉末，对应的超声功率为200W，冰浴超声提取时间为20～40min。

6.根据权利要求2所述的利用二醇基硅胶提取乌鳢磷脂的方法，其特征是：所述步骤4)中于10～25℃、0.7～0.1Mpa下进行低温减压浓缩。

说明书

利用二醇基硅胶提取乌鳢磷脂的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及物质分离技术领域，特别是涉及提取乌鳢中磷脂的方法。

背景技术

[0002] 乌鳢俗称黑鱼，是我国重要的淡水经济鱼类之一。其生命力旺盛，繁殖力强，并且味道鲜美，营养价值高，含有丰富的蛋白质、脂肪、氨基酸、和人体必需的钙、磷、铁及多种维生素。黑鱼作为药用具有祛风治疳、补脾益气、滋补调养、生肌补血，促进伤口愈合等功效。目前国内乌鳢主要以鲜售为主，加工利用程度较低，造成了资源浪费。为提高乌鳢的产业附加值，乌鳢作为一种有待全面开发利用的资源，有着广阔的发展前景。

[0003] 磷脂是一类含有磷酸的脂类；磷脂结构主要由甘油骨架、极性基团和不同长度和饱和度的脂肪酸链组成。根据磷脂极性基团不同，可将磷脂分为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇等类别。生物体中存在的磷脂种数以千计，结构多样、种类复杂，具有独特的化学结构。磷脂是维持细胞结构的重要组成部分，也是新陈代谢不可或缺的营养元素。磷脂还具备广泛的生物学功能，诸如活化细胞，维持代谢与荷尔蒙分泌均衡，增强人体免疫力等。实验证明，磷脂可以分解血脂、胆固醇，阻止多余脂肪在血管壁沉积，使血管循环顺畅，被誉为“血管清道夫”。高效的磷脂提取方法将有利于深化乌鳢中磷脂的营养学研究，促进乌鳢为原料的产品开发。

[0004] 复杂样品基质中脂质的全面提取是脂质组学研究的关键步骤之一，也是当前限制产业发展的技术难题之一。传统提取方法在提取磷脂的同时容易引入小分子杂质，提取效率低，特异性不强。

[0005] 目前乌鳢、鲣鱼、鳀鱼等鱼类中磷脂提取方法主要为液液萃取法和硅胶G层析法，液液萃取法提取的磷脂纯度低(<60％)，提取物中含有甘油脂、胆固醇、脂肪酸等其他脂类，而硅胶G层析法则提取率低，硅胶的死吸附导致磷脂损失较大。

发明内容

[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种利用二醇基硅胶提取乌鳢磷脂的方法；该方法将液液萃取与固相萃取有效结合，高纯度提取乌鳢中的磷脂，从而解决了现有技术中存在的提取效率低、产品质量不高、乌鳢加工利用程度低等问题。

[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用二醇基硅胶提取乌鳢磷脂的方法，包括以 下步骤：

[0008] 1)、原料预处理：

[0009] 取新鲜的乌鳢肉，洗净后研磨成糜，真空干燥后粉碎成粉末，得乌鳢粉末；

[0010] 2)、液液萃取：

[0011] 在乌鳢粉末中加入有机溶剂Ⅰ后充分混合均匀，冰浴超声提取，然后加入水震荡离心，待溶液分层后移取下清液；先将下清液干燥(减压干燥)，然后用有机溶剂Ⅱ复溶后(并过0.22μm有机膜)，得到脂质粗提物；

[0012] 所述有机溶剂Ⅰ为甲醇：氯仿＝1：0.5～2体积比的混合液，乌鳢粉末与有机溶剂Ⅰ的料液比为1g/25～35ml(较佳为1g/30ml)；所述水的用量为有机溶剂Ⅰ的0.5～1体积倍；所述有机溶剂Ⅱ为甲醇，乌鳢粉末与有机溶剂Ⅱ的料液比为1g/8～12ml(较佳为1g/10ml)；

[0013] 3)、固相萃取：

[0014] 活化(使用有机溶剂水溶液活化)二醇基硅胶固相萃取柱，脂质粗提物经上样、淋洗、洗脱后，得到纯化后的磷脂提取物；

[0015] 淋洗液为有机溶剂Ⅲ水溶液或有机溶剂Ⅲ，有机溶剂Ⅲ水溶液中有机溶剂Ⅲ的体积浓度≥70％，有机溶剂Ⅲ为甲醇、乙腈；较佳淋洗液为乙腈；

[0016] 洗脱液为有机溶剂Ⅳ水溶液，有机溶剂Ⅳ水溶液中有机溶剂Ⅳ的体积浓度为40～70％，有机溶剂Ⅲ为甲醇、乙腈；较佳洗脱液为50％(体积％)乙腈。

[0017] 在本发明中，每0.1ml的脂质粗提物，配用≥3ml的淋洗液、≥1mL的洗脱液。

[0018] 作为本发明的利用二醇基硅胶提取乌鳢磷脂的方法的改进：

[0019] 该方法还包括步骤4)；

[0020] 4)、浓缩干燥：

[0021] 将步骤3)所得的磷脂提取物低温减压浓缩，得到乌鳢磷脂浓缩液。

[0022] 作为本发明的利用二醇基硅胶提取乌鳢磷脂的方法的进一步改进：

[0023] 所述步骤3)中：上样、淋洗和洗脱的流速均为0.2～2mL/min(优选流速为0.6mL/min)。

[0024] 作为本发明的利用二醇基硅胶提取乌鳢磷脂的方法的进一步改进：

[0025] 所述步骤1)中：

[0026] 真空干燥至含水率≤5％(重量％)；

[0027] 粉碎至粉末能过80～100目筛。

[0028] 作为本发明的利用二醇基硅胶提取乌鳢磷脂的方法的进一步改进：

[0029] 所述步骤2)中，以移取下清液后的残渣(该残渣包括离心所得的固体物和上清液)替 代乌鳢粉末，以机溶剂Ⅰ中的氯仿替代机溶剂Ⅰ；再重复提取1～3次；

[0030] 合并所有提取步骤所得的下清液再减压干燥，然后用有机溶剂Ⅱ复溶后，得到脂质粗提物。

[0031] 备注说明：甲醇、氯仿、水三者在一起的时候不会混溶，会分成上下两相，甲醇极性较强会与水混溶，因此在离心管中，氯仿混溶少量甲醇在下相，水混溶多量甲醇在上相；由于移取走下相后，实际大部分甲醇依然在上相中并未被移取，因此重复提取的时候只需要加入氯仿即可。即，重复提取时氯仿的体积用量＝机溶剂Ⅰ中的氯仿的体积用量。

[0032] 作为本发明的利用二醇基硅胶提取乌鳢磷脂的方法的进一步改进：

[0033] 所述步骤2)中，

[0034] 每0.1～1g的乌鳢粉末，对应的超声功率为200W，冰浴超声提取时间为20～40min(较佳为30min)。

[0035] 作为本发明的利用二醇基硅胶提取乌鳢磷脂的方法的进一步改进：

[0036] 所述步骤4)中于10～25℃、0.7～0.1Mpa(优选0.9Mpa)下进行低温减压浓缩(至约为原体积的1/10)。

[0037] 在本发明中，

[0038] 步骤1)：取新鲜乌鳢，去皮、去骨、去内脏后得到的肌肉组织作为乌鳢肉。

[0039] 步骤3)：二醇基硅胶固相萃取柱包含空管，上下筛板，筛板中间填料为二醇基硅胶。脂质粗提物与作为填料的二醇基硅胶的用量比一般为1μL/1～3mg。

[0040] 该步骤3)具体包括以下步骤：

[0041] A)填料活化：使用有机溶剂水溶液(甲醇、50％甲醇水溶液、乙腈)对填料层进行活化处理，使用3mL注射器将有机溶剂水溶液流经填料层，将流出液收集并丢弃，达到固相萃取柱活化与清洗的目的。

[0042] B)上样：取3mL注射器抽取适量样品溶液(即，步骤2)所得的脂质粗提物)，注入固相萃取柱，目标组分被吸附在填料上，杂质直接随样品溶液流出固相萃取柱并丢弃。

[0043] C)淋洗：向固相萃取柱注入3mL淋洗液，所述的淋洗液为含70～100％甲醇或乙腈的超纯水，目的是为了洗去与目标组分共吸附的杂质。

[0044] D)洗脱：向固相萃取柱加入1～3mL洗脱剂，所述洗脱剂为含40～70％甲醇或乙腈的超纯水)，收集洗脱液。

[0045] 本发明的方法以乌鳢组织为原料，前期采用液液萃取法提取脂质粗体物，后期采用以二醇基硅胶为填料的固相萃取磷脂，从而实现了高纯度提取乌鳢中的磷脂。本发明最终所得的 乌鳢磷脂浓缩液于低温(≤4℃)避光保存。

[0046] 本发明具有如下技术优势：

[0047] A)工艺简洁，样品制备、填料活化、上样、淋洗和洗脱步骤，均简单易培训，且无需特殊仪器设备，实用性强，适合广泛使用。

[0048] B)本发明的方法稳定、高效，提取效果好。

[0049] C)本发明首次使用二醇基硅胶提取净化乌鳢中的磷脂。相比传统磷脂提取方法---液液萃取法和硅胶G层析法，不仅产物的磷脂纯度高(>90％)，且二醇基硅胶几乎不存在死吸附，提取率在90％以上。

附图说明

[0050] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

[0051] 图1为本发明所得的乌鳢磷脂浓缩液的质谱检测结果图。

具体实施方式

[0052] 以下结合附图详细说明本发明的具体实施方式，使本领域的技术人员更清楚地理解如何实践本发明。应当理解，尽管结合其优选的具体实施方案描述了本发明，但这些实施方案只是阐述，而不是限制本发明的范围。

[0053] 实施例1、一种利用二醇基硅胶提取乌鳢磷脂的方法，依次进行以下步骤：

[0054] 1)、原料预处理：

[0055] 取新鲜乌鳢，去皮、去骨、去内脏后得到肌肉组织，洗净后研磨成糜，真空干燥至含水率≤5％后粉碎成粉末(能过80～100目筛)，得乌鳢粉末。

[0056] 2)、液液萃取：

[0057] 精密称定研磨好的乌鳢粉末0.1g，用氯仿-甲醇(2：1，体积比)混合液3mL冰浴超声(0℃、功率为200W)提取30min，加入超纯水1.5mL并以12,000rpm/min高速冷冻离心5分钟。使用200mL移液枪转移下清液，向余下的上清液和固形物中加入2mL氯仿，根据上述操作重复提取两次。合并3次的下清液并用减压蒸干(0.9MPa的压力下干燥至恒重)，加入1mL甲醇复溶，过0.22μm有机膜后即得到脂质粗提物。

[0058] 3)、固相萃取：

[0059] 选取1mL体积规格的SPE柱空管，在底部垫上筛板，然后往柱管中填装100mg二醇基键合硅胶(粒径为40μm)，在上层用筛板压平。SPE柱使用前预先分别用3mL的甲醇、50％甲醇水溶液、乙腈进行活化和平衡。用移液枪取脂质粗提物100μL后上样，并以0.6mL/min 流速通过柱床。用3ml乙腈清洗SPE柱，弃去淋洗液后用50％乙腈1mL进行洗脱，收集获得洗脱液约1mL。

[0060] 淋洗和洗脱时的流速均为0.6mL/min，所得的洗脱液为磷脂提取物。

[0061] 4)浓缩干燥：

[0062] 将磷脂提取物低温减压(10℃、0.9MPa)浓缩至为0.1ml(即为原体积的1/10)，得到乌鳢磷脂浓缩液。

[0063] 储存：得到的乌鳢磷脂浓缩液于4摄氏度避光保存。

[0064] 质谱检测：针泵注射进样器流速为5μL/min。质谱扫描范围从m/z 450到950。不同类磷脂在母离子和中性丢失两种扫描模式下检测，并通过多通道监测(MCA)将谱图累加。正负离子模式下离子喷雾电压分别为5.5和4.5kV。离子源温度为450℃。雾化气和气帘气分别为35和20psi。去簇电压和碰撞电压分别为100和40V。

[0065] 将处理后的样品直接注入ESI离子源，选定特征离子碎片即可通过质谱扫描得到所有含有该碎片的母离子。PC含有特征碎片[C5H15O4NP]+，故选定m/z 184为子离子，经PIS扫描后即可得到所有PC类磷脂(图1A)。PE含有特征碎片C2H8O4NP，选定141Da为子离子，经NLS扫描后即可得到所有的PE类磷脂(图1B)。同理，扫描m/z 241([C6H10O5P]–)和87Da(C3H5O2N)分别可得到PI和PS类磷脂分子(图1C、D)。

[0066] 使用本发明的方法乌鳢组织磷脂的提取量为：PC，708.13μg/g；PE，361.69μg/g；PI，129.93μg/g；PS，116.46μg/g。含有不饱和脂肪酸链的磷脂含量较多，例如PC 16:0/22:
6&18:1/20:5的含量达到了124.89μg/g。

[0067] 备注说明：上述提取量是以步骤1)所得的乌鳢粉末计算的。

[0068] 对比例1-1、将实施例1步骤3)中的洗脱液由“50％乙腈”改成“30％乙腈”，体积量不变；其余等同于实施例1。

[0069] 对比例1-2、将实施例1步骤3)中的洗脱液由“50％乙腈”改成“90％乙腈”，体积量不变；其余等同于实施例1。

[0070] 对比例2-1、将实施例1步骤3)中的填料由“二醇基键合硅胶”改成“硅胶G”；重量不变，其余等同于实施例1。

[0071] 对比例2-2、将实施例1步骤3)中的填料由“二醇基键合硅胶”改成“氨基键合硅胶”；重量不变，其余等同于实施例1。

[0072] 对比例3-1、将实施例1步骤3)中淋洗和洗脱时的流速均由0.6mL/min改成2.5mL/min，其余等同于实施例1。

[0073] 对比例3-2、将实施例1步骤3)中淋洗和洗脱时的流速均由0.6mL/min改成0.1mL/min，其余等同于实施例1。

[0074] 采用上述案例所述方法所得的乌鳢组织磷脂的提取量如下表1所述。

[0075] 表1

[0076]

[0077] 综上可见，本发明的利用二醇基硅胶提取乌鳢磷脂的方法可以有效的对乌鳢中的磷脂酰胆碱PC、磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰肌醇PI和磷脂酰丝氨酸PS富集净化，将液液萃取与固相萃取有效结合，高纯度提取乌鳢中的磷脂，解决了现有技术中存在的提取效率低、产品质量不高、乌鳢加工利用程度低等问题。

[0078] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。