用于治疗代谢障碍、高脂血症、糖尿病、脂肪肝疾病和动脉粥样硬化的新的胆固醇代谢物5-胆甾烯-3β,25-二醇二硫酸酯(25HCDS)

摘要

已经发现5‑胆甾烯‑3β,25‑二醇二硫酸酯(25HCDS)是可靠的PPARγ激动剂和LXR拮抗剂，并且被用于治疗脂质障碍和炎性疾病，包括但不限于脂肪肝、炎性肠病和动脉粥样硬化性疾病。

权利要求

1.化合物，所述化合物为：(i)下式的5-胆甾烯-3β,25-二醇二硫酸酯或(ii)其药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是

3.根据权利要求1或2所述的化合物，所述化合物是分离的化合物。

4.根据权利要求3所述的化合物，所述化合物是至少75％不含其它化学物质。

5.根据权利要求1-2和4中的任一项所述的化合物，所述化合物是呈固体形式。

6.根据权利要求5所述的化合物，所述化合物是：

-呈散剂形式；和/或

-呈冷冻干燥形式。

7.根据权利要求1-6中任一项的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗选自下述的脂质代谢障碍：主要由各种病毒造成、但是也由一些细菌感染、药物或化学物质造成的肝炎，以及有关的并发症诸如肝纤维化；选自自身免疫性肝炎的自身免疫性病症或遗传性病症；非酒精性脂肪肝病，即与肥胖有关且以肝脏中的脂肪丰度为特征的一系列疾病，以及与非酒精性脂肪肝病有关的各种综合征，其选自肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、末期肝病；肝硬化，即由于替换死亡肝细胞而在肝脏中形成纤维瘢痕组织，其中肝细胞的死亡可以由病毒性肝炎、酒精中毒或与其它肝毒性化学物质的接触造成；血色素沉着症，即一种造成铁在体内积累、最终导致肝损伤的遗传性疾病；肝癌，其选自原发性肝细胞癌或胆管上皮癌和转移性癌症，经常来自胃肠道的其它部分；威尔森氏病，即一种造成身体保留铜的遗传性疾病；原发性硬化性胆管炎，即一种胆管炎性疾病，可能在性质上是自身免疫性的；原发性胆汁性肝硬化，即一种小胆管自身免疫病；选自肝静脉的阻塞的Budd-Chiari综合征；吉尔伯特氏综合征，即一种遗传性胆红素代谢障碍，存在于约5％的人口中；

II型糖原贮积病；以及各种儿科肝疾病，其选自胆道闭锁、α-1抗胰蛋白酶缺乏、alagille综合征和进行性家族性肝内胆汁淤积。

8.根据权利要求1-6中任一项的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗高脂血症或由高脂血症造成的疾病或病症。

9.根据权利要求1-6中任一项的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗选自下述的与异常炎症有关的障碍的：寻常痤疮、哮喘、各种自身免疫疾病、乳糜泻、慢性前列腺炎、肾小球肾炎、各种超敏反应、炎性肠病、骨盆炎性疾病、再灌注损伤、类风湿性关节炎、结节病、移植排斥、血管炎和间质性膀胱炎。

10.根据权利要求1-6中任一项的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗选自下述的炎症性障碍：1型超敏反应、2型超敏反应和3型超敏反应以及由皮肤肥大细胞对变应原的过敏反应造成的枯草热。

11.根据权利要求1-6中任一项的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗炎症性肌病和与肥胖有关的全身性炎症。

12.药物组合物，其包含:(i)如在权利要求1或2中定义的化合物；和(ii)生理学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体，其中所述化合物占所述组合物重量的1％至99％。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述组合物配制成单位剂型。

14.根据权利要求12或13所述的药物组合物，其中所述组合物是呈固体形式。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中：

-所述组合物是呈散剂、片剂、胶囊剂或锭剂的形式；或者

-所述组合物包含与填充剂在一起的冷冻干燥形式的化合物，所述组合物任选地是在密封的小瓶、安瓿、注射器或袋中。

16.根据权利要求12或13所述的药物组合物，所述药物组合物包含液体载体。

17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中：

-所述化合物溶解在所述液体中或分散在所述液体中；和/或

-所述液体是水性的；和/或

-所述液体是无菌注射用水或磷酸盐缓冲盐水；和/或

-所述组合物是在密封的小瓶、安瓿、注射器或袋中。

18.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述单位剂型包含0.1mg至100mg的所述化合物。

19.生产如在权利要求1-6中的任一项中定义的化合物的方法，所述方法包括：使25-羟基胆甾醇与三氧化硫来源反应，和任选地，从得到的5-胆甾烯-3β,25-二醇二硫酸酯形成药学上可接受的盐，其中所述三氧化硫来源是选自下述的三氧化硫-胺复合物：三氧化硫三甲胺复合物、三氧化硫三乙胺复合物、三氧化硫二甲基苯胺复合物、三氧化硫二甲基甲酰胺复合物、三氧化硫吡啶复合物和三氧化硫聚乙烯基吡啶复合物。

20.生产如在权利要求12-18中的任一项中定义的药物组合物的方法，所述方法包括：将所述化合物与所述生理学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合。

说明书

用于治疗代谢障碍、高脂血症、糖尿病、脂肪肝疾病和动脉粥

样硬化的新的胆固醇代谢物5-胆甾烯-3β,25-二醇二硫酸酯

(25HCDS)

[0001] 本申请是申请日为2013年3月15日、申请号为201380019476.3、发明名称为“用于治疗代谢障碍、高脂血症、糖尿病、脂肪肝疾病和动脉粥样硬化的新的胆固醇代谢物5-胆甾烯-3β,25-二醇二硫酸酯(25HCDS)”的中国发明专利申请的分案申请。

[0002] 相关申请的交叉引用

[0003] 本申请要求2012年4月12日提交的美国临时专利申请61/623,203和61/623,414的权益。两篇临时申请的完整内容特此通过引用并入。

技术领域

[0004] 本发明一般地涉及一种新的胆固醇代谢物5-胆甾烯-3β,25-二醇二硫酸酯(5-cholesten-3β,25-diol,disulfate)(25HCDS)及其用途。具体地，本发明提供了用于预防和治疗疾病诸如脂质代谢障碍(lipid metabolic disorder)和炎症性障碍例如高脂血症、糖尿病、脂肪肝疾病和动脉粥样硬化的25HCDS。

背景技术

[0005] 肝在脂质体内稳态的维持中起关键作用。脂质在肝组织中的积累会导致非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。NAFLD影响一般美国群体的几乎1/4，且可以进展成显著的肝硬化和肝细胞癌。NAFLD的范围包括从简单的非进行性皮脂腺病至导致肝硬化和肝细胞癌的进行性非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。NAFLD的发病机制被视作两步过程。第一步是甘油三酯和有关的脂质在肝细胞中的积累。第二步是肝炎的发生。NAFLD的标志特征以增加的肝内甘油三酯积累为特征。降低脂质水平是成功的NAFLD治疗的一个重要要素。在哺乳动物中，甾醇调节元件-结合蛋白-1c(SREBP-1c)优先控制脂肪生成的基因表达；并调节脂肪酸和甘油三酯体内稳态。适当地记载了它在脂肪酸生物合成和脂肪肝病的发展中的作用。但是，目前没有经批准的NAFLD治疗。

[0006] 氧化固醇(oxysterol)可以作用于胆固醇体内稳态和脂质代谢中的多个点。氧化固醇受体LXR是甾醇调节的脂质代谢的转录因子。LXR的活化会通过ABCA1和ABCG5/8刺激胆固醇流出和清除的表达，但是它也会增量调节SREBP-1c的表达，所述SREBP-1c又调节在脂质生物合成和运输中涉及的至少32个基因。因此，尽管合成的配体对LXR的活化可以降低血清胆固醇水平以保护免于动脉粥样硬化，但是由于通过SREBP-1c的活化而诱导脂肪酸和甘油三酯合成，活化也会导致脂肪肝和高甘油三酯血症。肝细胞具有有限的储存甘油三酯形式的脂肪酸的能力。一旦该能力被压倒，就会发生细胞损伤。过量的细胞内游离脂肪酸会触发活性氧类别(ROS)的产生，从而造成脂毒性和炎症性信号传递途径的活化，这最终导致细胞凋亡。

[0007] 5-胆甾烯-3β,25-二醇3-硫酸酯(25HC3S)是最近在原代大鼠肝细胞核中鉴别出的氧化固醇。25HC3S公开在WO 2006/047022中。该氧化固醇可以由甾醇磺基转移酶SULT2B1b从25-羟基胆甾醇(25HC)通过氧化固醇硫酸化而合成。类似的胆固醇代谢物5-胆甾烯-3β,25-二醇3β-硫酸酯(25HCβS)的外源施用会减少SREBP-1和SREBP-2表达；阻断SREBP-1c加工；和抑制在脂质代谢中涉及的关键酶(包括乙酰辅酶A羧化酶-1(ACC-1)、脂肪酸合酶(FAS)和3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶A还原酶(HMGR))的表达，随后降低中性脂质和胆固醇水平。

[0008] 结果指示，25HC3S会充当LXR拮抗剂和胆固醇饱满信号，从而经由LXR/SREBP信号传递的抑制而抑制脂肪酸和甘油三酯合成途径。此外，25HC3S会增加IκBβ表达；阻断TNFα诱导的IκBβ降解；和降低细胞核NFκB水平。相比而言，25HC以相反方式起作用，从而诱导IκBβ降解和细胞核NFκB积累。这些结果指示，25HC3S也涉入炎症应答，并且可能代表炎症性途径和脂质体内稳态的调节之间的联系。

发明内容

[0009] 现在已经鉴别出另一种调节性的胆固醇代谢物5-胆甾烯-3β,25-二 醇二硫酸酯(25HCDS)。25HCDS的研究指示，该天然存在的代谢物的降低表达在肝细胞和巨噬细胞的脂质积累和细胞损伤中起重要作用，由此促进代谢障碍的发病机制。25HCDS向肝细胞和巨噬细胞的培养基中的添加会降低甾醇调节元件结合蛋白(SREBP)的mRNA水平，抑制SREBP加工，并随后下调在脂质生物合成中涉及的关键酶，从而导致肝细胞和巨噬细胞中降低的细胞内脂质水平。25HCDS也会增加过氧化物酶体增殖活化剂受体(PPAR)IκB的表达和过氧化物酶体增殖活化剂受体共活化剂1α(PGC-1α)mRNA水平，降低细胞核NFκB水平，并降低促炎细胞因子表达和分泌。重要的是，体内研究表明，25HCDS施用会使肝中性脂质减少约20-35％，而不表现出毒性。

[0010] 因而，新发现的胆固醇代谢物25HCDS作为可靠的PPARγ激动剂和LXR拮抗剂起作用，其除了经由PPARγ/IκB/NFκB信号传递途径抑制炎症应答以外，还在体外和在体内抑制肝细胞和巨噬细胞中的胆固醇和脂质生物合成。25HCDS(其已经如在本文实施例部分中所述化学合成)因而可以用作用于治疗和预防脂质代谢的和炎症性障碍(包括高脂血症、动脉粥样硬化、糖尿病、脂肪肝疾病等)的药物。

[0011] 本发明的其它特征和优点将在下面的发明描述中阐述，且将从所述描述部分地显而易见，或者可以通过本发明的实践来获知。本发明将由在书面描述及其权利要求中具体指出的组合物和方法实现和达到。

[0012] 在一个方面，本发明提供了化合物作为药物的用途，所述化合物是：(i)下式的5-胆甾烯-3β,25-二醇二硫酸酯(25HCDS)和/或其药学上可接受的盐

[0013]

[0014] 在某些方面，所述化合物是

[0015]

[0016] 在某些方面，本发明提供了所述化合物在以下方法中的用途：在有此需要的受试者中减少脂质的方法；在有此需要的受试者中减少胆固醇和脂质生物合成的方法；在有此需要的受试者中减少炎症的方法；在有此需要的受试者中治疗糖尿病的方法；在有此需要的受试者中治疗高脂血症的方法；在有此需要的受试者中治疗动脉粥样硬化的方法；在有此需要的受试者中治疗脂肪肝病的方法；和/或在有此需要的受试者中治疗炎性疾病的方法。在其它方面，本发明提供了以下化合物用于制备药物的用途，所述药物用于在有此需要的受试者中减少脂质；在有此需要的受试者中减少胆固醇和脂质生物合成；在有此需要的受试者中减少炎症；在有此需要的受试者中治疗糖尿病；在有此需要的受试者中治疗高脂血症；在有此需要的受试者中治疗动脉粥样硬化； 在有此需要的受试者中治疗脂肪肝病；或在有此需要的受试者中治疗炎性疾病

[0017]

[0018] 或者

[0019]

[0020] 在其它方面，本发明提供了治疗受试者的方法，所述方法包括：给所述受试者施用有效量的化合物

[0021]

[0022] 或者

[0023]

[0024] 其中所述方法选自：在有此需要的受试者中减少脂质的方法；在有此需要的受试者中减少胆固醇和脂质生物合成的方法；在有此需要的受试者中减少炎症的方法；在有此需要的受试者中治疗糖尿病的方法；在有此需要的受试者中治疗高脂血症的方法；在有此需要的受试者中治疗动脉粥样硬化的方法；在有此需要的受试者中治疗脂肪肝病的方法；和在有此需要的受试者中治疗炎性疾病的方法。在某些方面，基于所述受试者的体重，以在
0.1mg/kg至100mg/kg范围内的量施用所述化合物，或者基于所述受试者的体重，以在1mg/kg至10mg/kg范围内的量施用所述化合物；和/或所述施用包括以下的至少一种：口服施用、肠施用、舌下施用、透皮施用、静脉内施用、腹膜施用、胃肠外施用、注射施用、皮下注射和肌肉内注射。

[0025] 在一个方面，本发明提供了一种化合物，其为(i)下式的5-胆甾烯-3β,25-二醇二硫酸酯(25HCDS)和/或其药学上可接受的盐。

[0026]

[0027] 在一个方面，提供了化合物本身和其药学上可接受的盐。在另一个方面，提供了化合物及其药学上可接受的盐作为药物的用途。

[0028] 在某些方面，所述化合物是

[0029]

[0030] 在某些方面，所述化合物是分离的化合物。在其它方面，所述化合物是基本上纯的。在其它方面，所述化合物是呈固体形式。所述固体形式可以是呈散剂形式和/或冷冻干燥形式。

[0031] 本发明还提供了药物组合物，其包含(i)为下式的5-胆甾烯-3β,25-二醇二硫酸酯(25HCDS)的化合物和(ii)生理学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

[0032]

[0033] 在某些方面，所述化合物是

[0034]

[0035] 在某些方面，将所述药物组合物配制成单位剂型。在其它方面，所述药物组合物是呈固体形式。所述组合物的固体形式包括这样的形式，其中：所述药物组合物是呈散剂、片剂、胶囊剂或锭剂的形式；或所述组合物包含冷冻干燥形式的化合物以及填充剂(bulking agent)，所述组合物任选地是在密封的小瓶、安瓿、注射器或袋中。在某些方面，所述药物组合物包含为液体的载体。在该方面，所述化合物可以溶解在所述液体中或分散在所述液体中；和/或所述液体是水性的；和/或所述液体是无菌注射用水或磷酸盐缓冲盐水；和/或所述组合物是在密封的小瓶、安瓿、注射器或袋中。

[0036] 本发明还提供了生产以下化合物的方法

[0037]

[0038] 或者

[0039]

[0040] 所述方法包括：使25-羟基胆甾醇与三氧化硫来源(source of sulfur trioxide)反应，和，任选地，从得到的5-胆甾烯-3β,25-二醇二硫酸酯(25HCDS)形成药学上可接受的盐。在某些方面，所述三氧化硫来源是三氧化硫-胺复合物。在其它方面，所述方法包括：将所述化合物与生理学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合。

[0041] 如上面指出的，本发明尤其提供了用在以下方法中的指定化合物：在有此需要的受试者中减少脂质的方法；在有此需要的受试者中减少胆固醇和脂质生物合成的方法；在有此需要的受试者中减少炎症的方法；在有此需要的受试者中治疗糖尿病的方法；在有此需要的受试者中治疗高脂血症的方法；在有此需要的受试者中治疗动脉粥样硬化的方法；在有此需要的受试者中治疗脂肪肝病的方法；或在有此需要的受试者中治疗炎性疾病的方法。为了避免疑惑，在该方面，本发明可 以提供在指定方法中用作药物的指定化合物。此外，本发明可以提供在指定方法中用作活性治疗成分的指定化合物。此外，本发明可以提供用在通过疗法来治疗人或动物体的方法中的指定化合物，所述方法包括指定方法。

附图说明

[0042] 图1.通过负离子-三重四极质谱法表征作为5-胆甾烯-3β,25-二醇二硫酸酯的细胞核氧化固醇。显示了HPLC/MS负离子全扫描谱，即用质量离子80从m/z 583和m/z 561的产物扫描谱分选的HPLC-MS洗脱特性。

[0043] 图2.化学合成的25HCDS的分析。产物的MS谱。

[0044] 图3. 25HCDS的1H NMR谱。箭头指示在该化合物的3位的质子以及它在起始原料中和在产物中的共振化学位移。

[0045] 图4. 25HCDS的13C NMR谱。箭头指示该化合物的3和25碳位置以及它在起始原料中和在产物中的共振化学位移。

[0046] 图5A-D.25HCDS调节脂质生物合成基因表达。A,显示了用指定浓度的25HCDS处理的THP-1细胞中SREBP-1c、ACC和FAS mRNA水平的实时RT-PCR分析；B,SREBP-2、HMG-CoA还原酶和LDLR；在指定的时间(C)和在指定浓度(D)用25HCDS处理的THP-1细胞中的PPARg和IkB mRNA水平。将表达水平标准化 GAPDH。每个值代表3个单独测量结果的平均值±标准偏差。

[0047] 图6. 25HCD3S的施用会减少小鼠NAFLD模型中肝组织的脂质积累。每3天1次地给动物腹膜内注射25HCDS，持续6周。如在实施例中所述确定肝甘油三酯、游离脂肪酸、总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯、游离脂肪酸和甘油三酯。通过蛋白浓度将每个单独水平标准化。将所有值表达为平均值±SD；符号*代表p<0.05，相对于HFD饲喂的媒介物处理的小鼠肝脏。

[0048] 发明详述

[0049] 现在已经鉴别出一种新的胆固醇代谢物5-胆甾烯-3β,25-二醇二硫酸酯(25HCDS)。在小鼠NAFLD模型中，25HCDS的施用会大幅增加PPARγ、PPARγ共活化剂1α(PGC-1α)和IκB的表达，并经由体内LXR-SREBP-1c信号传递途径而降低肝甘油三酯和胆固醇水平。这些发现证实，25HCDS是在脂质代谢和炎症应答中涉及的一种有效调节剂。

[0050] 本发明因而提供了使用25HCDS治疗和预防脂质代谢的和炎症性障碍的方法。在某些方面，所述方法包括：给需要这种治疗的受试者施用治疗有效剂量的25HCDS，以便升高所述受试者中的25HCDS水平和/或实现脂质代谢的有益变化。所述方法的实现通常包括：鉴别罹患脂质代谢障碍和与其有关的病症或处于发展脂质代谢障碍和与其有关的病症的风险中的患者，和/或鉴别罹患异常炎症或处于发展异常炎症的风险中的患者，和通过适当的途径以可接受的形式施用25HCDS。合适的受试者的鉴别可以如下完成，例如，如本领域已知的，通过使用各种血液试验、肝活组织检查结果、明显疾病征状的存在等。合适的待治疗的受试者包括被鉴别为罹患或可能罹患脂质代谢障碍和/或炎症的那些受试者。根据本发明还提供了25HCDS和有关的药物组合物。这些可以用在治疗方法中。

[0051] 25HCDS可以是呈药学上可接受的盐的形式。所述药学上可接受的盐可以是二加成盐或单加成盐。二加成盐由25HCDS分子的2个硫酸酯基团中的每一个丢失氢原子而形成。单加成盐由25HCDS分子的2个硫酸酯基团中的仅一个(在所述分子的3β位或25位)丢失氢原子而形成。

[0052] 所述药学上可接受的盐可以是，例如，碱金属盐(例如，锂盐、钠盐或钾盐)、碱土金属盐(例如，钙盐)或铵盐。所述药学上可接受的盐可以是例如钠盐、钾盐、钙盐、锂盐或铵盐。

[0053] 这样的盐的一个例子是25HCDS的钠盐，例如25HCDS的单加成钠盐，诸如通过25HCDS的25-位处的硫酸酯基团丢失氢原子而形成 的单加成盐，即具有下式的化合物[0054]

[0055] 为了避免疑惑，应当强调的是，贯穿本说明书提及的“25HCDS”包括25HCDS的药学上可接受的盐，除非另外明确指出。

[0056] 胆固醇含有8个手性中心，从而产生大量可辨别的立体异构的异构体。这8个手性中心也存在于25HCDS中。一般而言，在本发明中使用的25HCDS可以是呈任何单一立体异构形式，或可以是这些立体异构形式中的任意两种或更多种的混合物。但是，至少50重量％、优选地至少90重量％和最优选地至少95重量％的25HCDS可以具有下式

[0057]

[0058] 应当理解，在该式中的8个手性中心中的每一处的手性与在天然胆固醇中发现的手性类似。因而，该立体异构体对应于体内天然25HCDS代谢物的立体异构形式。

[0059] 所述25HCDS或其药学上可接受的盐可以是分离的25HCDS或其药学上可接受的盐。“分离的”是指，没有被包含在组织材料中，所述组织材料被包含在人或动物受试者内或者提取自人或动物受试者。例如，分离的25HCDS或其药学上可接受的盐没有被包含在细胞内。
因而，分离的25HCDS或其药学上可接受的盐可与被包含在组织材料(例如，细胞)内的天然
25HCDS明显区分，所述组织材料本身被包含在人或动物受试者内或者已经提取自人或动物受试者。

[0060] 所述25HCDS或其药学上可接受的盐可以是基本上纯的。例如，25HCDS或其药学上可接受的盐可以以基本上纯化的形式提供用在治疗方法中。

[0061] 当它是“基本上纯的”或“基本上纯化的”时，二硫酸化的氧化固醇(25HCDS或其药学上可接受的盐)可以是呈至少约75％、优选地至少约80％、更优选地至少约90％和最优选地至少约95％或更大程度地不含其它化学物质的形式。基本上纯的25HCDS或其药学上可接受的盐可以具体地包含至少约90重量％或至少约95％、和更优选地至少约98重量％、至少约99重量％、或甚至更优选地至少约99.5重量％或至少约99.8重量％的25HCDS或其药学上可接受的盐。

[0062] 所述25HCDS或其药学上可接受的盐可以是固体。例如，所述25HCDS或其药学上可接受的盐可以是呈散剂形式。

[0063] 所述25HCDS或其药学上可接受的盐可以是呈冷冻干燥形式。如众所周知的，冷冻干燥是通常用于保存易腐坏材料或使所述材料更便于运输的脱水过程。该技术存在3个主要阶段，即冷冻、初步干燥和二次干燥。冷冻通常使用冷冻干燥机进行。在初步干燥过程中，通过施加适当的真空水平来控制压力，同时供给足够的热以使存在的任何水升华。在二次干燥过程中，通过进一步施加热来除去水合的水。通常，还降低压力来促进进一步干燥。冷冻干燥过程结束后，可以在密封之前用惰性气体(诸如氮)破坏真空，或可以在真空下密封所述材料。

[0064] 尽管可能从活细胞分离和纯化25HCDS，本领域技术人员会认识 到，为了产生足够量的二硫酸化的氧化固醇，通常通过合成化学方法，或通过包括使用重组DNA技术的方法(例如通过使用克隆的酶进行胆固醇的合适修饰)，合成所述化合物。在下面的实施例部分中提供了一个示例性的合成方案。

[0065] 更一般而言，通过使25-羟基胆甾醇与三氧化硫来源反应，和，任选地，从得到的产物形成药学上可接受的盐，可以合成生产25HCDS或其药学上可接受的盐。

[0066] 可以使用任意合适的三氧化硫来源将存在于25-羟基胆甾醇中的2个羟基(-OH)转化成硫酸酯基团(-OSO3H)。三氧化硫-胺复合物是三氧化硫来源的一个示例性集合。这样的复合物的例子包括三氧化硫三甲胺复合物(TMAS)、三氧化硫三乙胺复合物(TEAS)、三氧化硫二甲基苯胺复合物(DMAS)、三氧化硫二甲基甲酰胺复合物(DMFS)、三氧化硫吡啶复合物(PSS)和三氧化硫聚乙烯基吡啶复合物(PVPS)。通常，每摩尔的25-羟基胆甾醇使用1-20摩尔(例如2-10摩尔)的选定三氧化硫来源(诸如三氧化硫-胺复合物)。

[0067] 所述反应通常在惰性溶剂中进行。所述溶剂可以是例如无水溶剂。一种示例性的这样的溶剂是无水吡啶。

[0068] 还可以加入碱，例如以便从二硫酸酯产品制备期望的药学上可接受的盐。一种这样的碱是NaOH，其可以用于制备25HCDS的钠盐。将容易明白，可以使用替代性试剂(具有不同的碱度和/或不同的阳离子)来制备其它药学上可接受的盐。

[0069] 反应温度通常可以是10-100℃，例如20-80℃。反应时间通常可以是0.1-24小时，例如0.25-5小时。

[0070] 如果需要的话，在反应已经发生以后，可以从反应混合物纯化产物。如果需要的话，在反应已经发生以后，可以从反应混合物分离产物。

[0071] 25-羟基胆甾醇起始原料是一种商购可得的产品。可替换地，它可以通过羟基化胆固醇来制备(参见例如Ogawa等人.Steroids74:81-87)。所述方法因此可以进一步包括羟基化胆固醇以产生25-羟 基胆甾醇的初始步骤。

[0072] 可以以纯形式或在药学上可接受的制剂中施用25HCDS。这样的制剂(组合物)通常包括25HCDS或其药学上可接受的盐和生理学上可接受的(相容的)赋形剂、稀释剂或载体/媒介物。所述25HCDS可以例如呈药学上可接受的盐(例如碱金属盐诸如钠、钾、钙、锂、铵等)或其它复合物的形式。

[0073] 所述药物组合物是无菌的。无菌的是指，基本上不含有活微生物，例如如使用美国药典(USP)无菌度试验(参见“The United States Pharmacopeia”,第30次修订,The United States Pharmacopeial Convention:2008)所确定的。为了维持无菌度，所述药物组合物可以存在于密封包装中，所述包装能够阻止活微生物的进入。例如，在液体药物组合物的情况下，所述组合物可以密封在小瓶或安瓿中。

[0074] 应当理解，药学上可接受的制剂(组合物)包括常规地用于制备可注射剂型和固体剂型(诸如片剂、锭剂、散剂和胶囊剂)以及气雾化剂型的液体和固体材料。可以用水性的或基于油的媒介物配制所述化合物。可以使用水作为用于制备组合物(例如可注射的组合物)的载体，所述组合物还可以包含常规缓冲剂和试剂，以使所述组合物等渗并维持生理学上可接受的pH。其它可能的添加剂(优选被公认为安全的[GRAS]那些)包括：着色剂；调味剂；表面活性剂(TWEEN、油酸等)；溶剂、稳定剂、酏剂和粘合剂或密封剂(乳糖、脂质体等)。固体稀释剂和赋形剂包括乳糖、淀粉、常规崩解剂、包衣剂等。还可以使用防腐剂诸如对羟基苯甲酸甲酯或苯扎氯铵。

[0075] 更详细地，当所述组合物是呈固体形式时，它可以是呈散剂、片剂、胶囊剂或锭剂的形式。当所述组合物是呈固体形式时，所述组合物可以包含与填充剂在一起的冷冻干燥形式的25HCDS。填充剂是药学上无活性的，且通常是可以加入组合物中以增加它的体积的化学惰性物质。用于制备冷冻干燥的药物组合物且在这里合适的常见填充剂包括甘露醇和甘氨酸。当所述组合物是呈固体形式时，它可以任选地在密封的小瓶、安瓿、注射器或袋中。

[0076] 当所述药物组合物包含液体载体时，25HCDS可以溶解在所述液体中或分散在所述液体中；和/或所述液体可以是水性的；和/或所述液体可以是无菌注射用水或磷酸盐缓冲盐水。当所述药物组合物包含液体载体时，所述组合物可以是在密封的小瓶、安瓿、注射器或袋中。

[0077] 取决于制剂，预见到，活性剂25HCDS占所述组合物重量的约1％至约99％，且媒介物“载体”将占所述组合物重量的约1％至约99％。本发明的药物组合物可以包括任意合适的药学上可接受的添加剂或佐剂，只要它们不会阻碍或干扰硫酸化的氧化固醇的治疗效果即可。

[0078] 施用可以是以下的至少一种：口服施用、肠施用、舌下施用、透皮施用、静脉内施用、腹膜施用、胃肠外施用、注射施用、皮下注射和肌肉内注射。例如，施用可以是口服或胃肠外，包括静脉内、肌肉内、皮下、真皮内注射、腹膜内注射等，或通过其它途径(例如透皮、舌下、口服、直肠和含服递送、气雾剂的吸入等)。在一个优选的实施方案中，施用是口服。此外，化合物的施用可以作为单一治疗模式来进行，或与其它疗法(例如降低脂质或胆固醇的药物、锻炼和饮食方案等，如上面关于在检测脂质代谢障碍以后受试者可能采用的治疗方案所述)结合进行。25HCDS给患者的施用可以是间断的，或以逐步的或连续的、恒定的或受控的速率。另外，施用药物制剂的天数和每天的次数可以变化，且由熟练的从业人员(诸如医师)最佳地确定。

[0079] 要施用的25HCDS的确切剂量可以随以下因素而变化：单个患者的年龄、性别、重量、总体健康状况等，以及疾病的精确病原学。但是，通常，对于在哺乳动物(例如人类)中施用而言，治疗上有效的剂量是在约0.1至约100mg或更多化合物/千克体重/24小时的范围内，和经常约0.5至约50mg化合物/千克体重/24小时的范围内，并且经常约1至约10mg化合物/千克体重/24小时是有效的。

[0080] 可以将本发明的药物组合物配制成单位剂型，即，所述药物组合物可以是呈不连续部分的形式，每个部分含有单位剂量的25HCDS。在该背景下，单位剂量可以包含，例如，约0.1mg至约100mg、或约0.5mg至约50mg、或约1mg至约10mg的25HCDS。

[0081] 通过将25HCDS与选择的生理学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体组合，可以制备所述药物组合物。

[0082] 尽管受试者经常是人类，也预见到该技术的兽医应用。

[0083] 在其它方面，通过增加25HCDS的内源性表达/生产，在有此需要的受试者中升高25HCDS的水平。用于这样做的示例性方法包括：给所述受试者提供一种或多种负责合成
25HCDS的酶。在某些实施方案中，提供所述酶本身；在其它实施方案中，提供编码所述酶的核酸。在25HCDS的合成中涉及的酶是SULT2Bab和SULT2B1a，并且可以施用这些中的一种或两种，以便升高内源性25HCDS水平。例如，可以提供含有和表达这些酶中的一种或两种的载体。示例性的载体包括、但不限于：腺病毒载体、逆转录病毒载体、复制型载体、疱疹病毒载体等。

[0084] 如本文中所述通过升高受试者中的25HCDS水平可以预防或治疗的脂质代谢障碍包括、但不限于：主要由各种病毒造成、但是也由一些细菌感染、药物或化学物质(例如毒物、醇)造成的肝炎(肝炎)，以及有关的并发症诸如肝纤维化；自身免疫性病症(自身免疫性肝炎)或遗传性病症；非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，即与肥胖有关且以肝脏中的脂肪丰度为特征的一系列疾病，以及与NAFLD有关的各种综合征(例如肝炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、末期肝病等)；肝硬化，即由于替换死亡肝细胞而在肝脏中形成纤维瘢痕组织(肝细胞的死亡可以由例如病毒性肝炎、酒精中毒或与其它肝毒性化学物质的接触造成)；血色素沉着症，即一种造成铁在体内积累、最终导致肝损伤的遗传性疾病；肝癌(例如原发性肝细胞癌或胆管上皮癌和转移性癌症，经常来自胃肠道的其它部分)；威尔森氏病，即一种造成身体保留铜的遗传性疾病；原发性硬化性胆管炎，即一种胆管炎性疾病，可能在性质上是自身免疫性的；原发性胆汁性肝硬化，即一种小胆管自身免疫病；Budd-Chiari综合征(肝静脉的阻塞)；吉尔伯特氏综合征，即一种遗传性胆红素代谢障碍，存在于约5％的人口中；II型糖原贮积病；以及各种儿科肝疾病，例如包括胆道闭锁、α-1抗胰蛋白酶缺乏、 alagille综合征和进行性家族性肝内胆汁淤积等。另外，还可以治疗由创伤引起的肝损伤，例如由事故、枪弹伤等造成的损伤。此外，可以预防或治疗由某些药物治疗造成的肝损伤，例如，已知药物诸如抗心律不齐药胺碘酮、各种抗病毒药(例如核苷类似物)、阿司匹林(罕见地作为儿童的瑞氏综合征的一部分)、皮质类固醇、甲氨蝶呤、他莫昔芬、四环素等会造成肝损伤。在某些实施方案中，所述诊断和治疗方法与受试者的肝外科手术结合进行(例如在所述肝外科手术之前、过程中或之后)。例如，所述肝外科手术可以是肝移植外科手术，且治疗的受试者可以是供体或受体；或所述肝外科手术可以是除去患病的或损伤的肝组织的外科手术，或除去癌性肿瘤等的外科手术。

[0085] 在某些实施方案中，要预防或治疗的疾病或病症是高脂血症或由其造成。“高脂血症”是指在血液中异常升高的任意或所有脂质和/或脂蛋白水平的病症。高脂血症包括原发性和继发性亚型，其中原发性高脂血症经常是由于遗传原因(诸如受体蛋白中的突变)，且继发性高脂血症源自其它潜在原因诸如糖尿病。可能在受试者中升高且通过本文描述的治疗来降低的脂质和脂质复合物包括、但不限于：乳糜微粒、极低密度脂蛋白、中密度脂蛋白、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。具体地，已知升高的胆固醇(高胆甾醇血症(hypercholesteremia))和甘油三酯(高甘油三酯血症)是血管和心血管疾病的危险因素，因为它们会影响动脉粥样硬化。脂质升高也可能使受试者易患其它病症诸如急性胰腺炎。因此，本发明的方法也可以用在升高的脂质与升高的脂质有关的病症的治疗或预防(例如预防性处理)中。这样的病症包括，例如，但不限于：高脂血症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、脂肪肝(肝脏皮质腺病(hepatic steatosis))、代谢综合征心血管疾病、冠心病、动脉粥样硬化(即动脉硬化性血管疾病或ASVD)和有关病、急性胰腺炎、各种代谢障碍，诸如胰岛素抗性综合征、糖尿病、多囊卵巢综合征、脂肪肝病、恶病质、肥胖、动脉硬化、中风、胆结石、炎性肠病、遗传性代谢障碍诸如脂质贮存障碍等。另外，与高脂血症有关的各种病症包括在授权的美国专利8,003,795(Liu, 等人)和8,044,243(Sharma,等人)中描述的那些，它们二者的整个内容通过引用整体并入本文。

[0086] 在某些实施方案中，要预防或治疗的疾病和病症包括炎症、和/或与炎症有关、以炎症为特征或由炎症造成的疾病和病症。这些包括作为许多人疾病的基础的一大组障碍。在某些实施方案中，所述炎症是急性的，其源自例如感染、损伤等。在其它实施方案中，所述炎症是慢性的。在某些实施方案中，所述炎症性障碍涉及免疫系统，如在变态反应和一些肌病中所见。但是，也可以治疗在炎症性过程中具有病因学起源的各种非免疫疾病，包括癌症、动脉粥样硬化和缺血性心脏病、以及下面列出的其它疾病。

[0087] 使用25HCDS可以预防或治疗的与异常炎症有关的障碍的例子包括、但不限于：寻常痤疮、哮喘、各种自身免疫疾病、乳糜泻、慢性前列腺炎、肾小球肾炎、各种超敏反应、炎性肠病、骨盆炎性疾病、再灌注损伤、类风湿性关节炎、结节病、移植排斥、血管炎和间质性膀胱炎。还包括由于使用合法地开处方的药物和非法药物而发生的炎症障碍，以及由负面认知或其后果触发(例如由应激、暴力或剥夺造成)的炎症。

[0088] 在一个方面，要预防或治疗的炎症性障碍是变态反应(1型超敏反应)，即触发炎症的不适当免疫应答的结果。一个常见的例子是枯草热，其由皮肤肥大细胞对变应原的过敏反应造成。严重的炎症应答可以成熟为被称作过敏反应的全身性应答。其它超敏反应(2型和3型)由抗体反应介导，且通过攻击白细胞(其损伤周围组织)而诱导炎症，且也可以如本文中所述进行治疗。

[0089] 在其它方面，预防或治疗炎症性肌病。这样的肌病由不适当地攻击肌肉组分从而导致肌肉炎症征象的免疫系统造成。它们可以与其它免疫障碍(诸如系统性硬化症)结合发生，且包括皮肌炎、多肌炎和包涵体肌炎(inclusion body myositis)。

[0090] 在一个方面，本发明的方法和组合物用于预防或治疗全身性炎症，诸如与肥胖有关的炎症。在这样的炎症中，涉及的过程与组织炎症相 同，但是全身性炎症不局限于特定组织，而是涉及内皮和其它器官系统。全身性炎症可以是慢性的，且广泛存在于肥胖中，在该情况下观察到许多升高的炎症标志物，包括：IL-6(白介素-6)、IL-8(白介素-8)、IL-18(白介素-18)、TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、CRP(C-反应蛋白)、胰岛素、血糖和瘦素。可以如本文中所述预防或治疗与升高的这些标志物水平有关的病症或疾病。在某些实施方案中，所述炎症可以分类为“低级慢性炎症”，其中观察到细胞因子(诸如TNF-α、IL-6和CRP)的全身浓度的2-3倍增加。腰围也与全身性炎症应答显著相关；在该关联中的一个突出因素是由于肥胖触发的自身免疫应答，由此免疫细胞将脂肪沉积物“误认”为传染性病原体诸如细菌和真菌。全身性炎症也可以由过量进食触发。高饱和脂肪膳食以及高卡路里膳食已经与炎症性标志物的增加关联，且如果过量进食是长期的，所述应答可以变成慢性的。

[0091] 在下面的实施例中描述了本发明的不同方面。但是，在实施例中提供的信息不应当视作以任何方式限制本发明的范围。

具体实施方式

[0092] 新的胆固醇代谢物5-胆甾烯-3β,25-二醇二硫酸酯(25HCDS)在体外和在体内减少脂质生物合成和抑制炎症应答

[0093] 前言

[0094] 已经证实，在非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)中存在广泛的脂质代谢调节异常，并且具体地，存在胆固醇代谢的较大紊乱。这样的紊乱可以经由核受体信号传递而导致NAFLD的潜在机制仍然不明。在本研究中，在原代大鼠肝细胞中鉴别出新的胆固醇代谢物5-胆甾烯-3β,25-二醇二硫酸酯(25HCDS)。如本文中所述，现在已经化学合成了25HCDS并已经研究了它的生物学功能。25HCDS(25μM)给人THP-1巨噬细胞和HepG2细胞的施用和在体内给小鼠NAFLD动物模型的施用，会增加PPARγ和PPARγ共活化剂1α(PGC-1α)表达并减少在脂质生物合成和促炎症应答中涉及的关键蛋白的表达。所述施用显著地 降低肝脂质水平并抑制炎症应答。定量RT-PCR和蛋白质印迹分析表明，25HCDS强烈地降低SREBP-1/2mRNA水平并抑制它们的应答基因(包括ACC、FAS和HMG-CoA还原酶)的表达，以及增加IκB和降低TNFα和ILβ的mRNA水平。结果提示，通过阻断SREBP信号传递而发生脂质生物合成的抑制，并且通过增加PPARγ、PGC-1α和IκB表达而发生炎症应答的抑制。肝组织中的脂质谱的分析表明，每3天
1次施用25HCDS持续6周会使总胆固醇、游离脂肪酸和甘油三酯分别显著降低30％、25％和
20％。因此，25HCDS是脂质代谢和炎症应答的有效调节剂。

[0095] 材料和方法

[0096] 材料：

[0097] 细胞培养试剂和辅助材料购自GIBCO BRL(Grand Island,NY)；25-羟基胆甾醇购自New England Nuclear(Boston,MA)。THP-1和HepG2细胞得自美国典型培养物保藏中心(Rockville,MD)。用于实时RT-PCR的试剂得自AB Applied Biosystems(Warrington WA1 4SR,UK)。在该研究中使用的化学物质得自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)或Bio-Rad Laboratories(Hercules,CA)。针对SREBP1、SREBP-2和HMG-CoA还原酶的多克隆兔抗体购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)。除非另外指出，否则所有溶剂得自Fisher(Fair Lawn,NJ)。增强的化学发光(ECL)试剂购自Amersham Biosciences(Piscataway,NJ)。睾酮和27-羟基胆甾醇得自Research Plus Inc.(Bayonne,NJ)。LK6 20×20cm薄层色谱法(TLC)平板购自Whatman Inc.(Clifton,NJ)。

[0098] 方法：

[0099] 5-胆甾烯-3β,25-二醇二硫酸酯的化学合成

[0100] 一般规程：通过前面描述的方法(Ogawa等人.Steroids 74:81-87)，从胆固醇制备25-羟基胆甾醇。在JASCO FT-IR 460plus波谱仪(Tokyo,日本)上在KBr盘中得到红外波谱。
在Varian 500Inova (AS500)仪器上分别在499.62MHz和125.64MHz得到1H和13C NMR谱。通过配备电喷射电离(ESI)探头的Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra MS，在负离子模式下记录流动注射低分辨率质量(LR-MS)波谱。使用具有ESI探头的Thermo Scientific LTQ Qrbitrap Discovery MS，在负离子模式下测量高分辨率质量(HR-MS)波谱。使用甲醇-水-乙酸混合物(90:10:1,v/v/v)作为展开溶剂，在预涂布的RP-18F254S平板上进行反相TLC。在110℃加热下，用50％H2SO4使斑点显影。将Bond Elute C18柱(10g；Varian)用于样品纯化。  (过氧单硫酸钾)和丙酮购自Sigma-Aldrich Co.(St.Louis,MO,USA)，除了HPLC级有机溶剂以外，使用的所有其它试剂是最高等级。

[0101] 5-胆甾烯-3β,25-二醇二硫酸酯(25HCDS)的合成：向25-羟基胆甾醇(30mg,0.07mmol)在无水吡啶(300μL)中的溶液中，加入三氧化硫-三甲胺复合物(45mg)，并将混悬液在50℃搅拌1h。向反应混合物中加入0.1N NaOH甲醇溶液(100μL)，并将混合物应用于已经用甲醇(10mL)和水(10mL)预处理的Sep Pak C18柱。将柱先后用PBS(25mL)和水(25mL)洗涤，然后将保留的25HCDS用60％甲醇(10ml)洗脱。用乙腈10倍稀释后，在N2气流下在40℃以下蒸发溶剂至干燥，并得到粉末的形式的25HCDS。收率：25mg(60％)。

[0102] 细胞培养

[0103] 人THP-1单核细胞和HepG2细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC,马纳萨斯,VA)，并根据供应商的方案维持。通过加入100nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)，使THP-1单核细胞分化成巨噬细胞。当细胞达到约90％汇合时，加入在乙醇中的25HCDS(乙醇在培养基中的终浓度为0.1％)。在指定的时间收获细胞用于蛋白、mRNA和脂质分析。

[0104] 为了研究HMG CoA表达调节，在有或没有美维诺林(50μM)和甲羟戊酸盐(0.5μM)存在下，在如上所述的培养基中培养HepG2或PHH。培养48小时以后，加入氧化固醇，并培养另外6小时，然后收获细胞 用于确定mRNA和蛋白水平。

[0105] 通过TLC和HPLC确定胆固醇生物合成

[0106] 在含有指定的不同25HCDS浓度的培养基中温育THP-1巨噬细胞或HepG2细胞6小时以后，给60mm培养皿中的细胞施加3ml含有5μCi的[1-14C]乙酸盐的相同新鲜培养基。在37℃温育2小时以后，除去培养基，并将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤2次，按照描述用橡胶刮棒收获，并收集进微量离心管中。通过离心使细胞沉淀，并通过重悬浮和沉降将沉淀物洗涤3次。如以前所述(2)，分离亚细胞级分(微粒体、胞质溶胶和细胞核)。将细胞的或亚细胞的沉淀物再悬浮于0.3ml PBS中。向每个样品中加入1.5μg睾酮作为内部标准品。通过加入3体积的氯仿:甲醇(1:1)，提取和分离总脂质。将[14C]胆固醇和羟基胆甾醇分离进氯仿相中，并在TLC(甲苯:乙酸乙酰酯，2/3，v/v/)上分离。如以前所述(1)，用Image Reader,Fujifilm BAS-1800II使[1-14C]乙酸盐衍生物显影。

[0107] 为了分析未标记的甾醇产物，将提取的脂质与2单位的胆固醇氧化酶一起在37℃温育20min。通过加入1.5ml甲醇，随后加入0.5ml饱和KCl，终止氧化反应。使用3ml己烷提取甾醇2次。收集己烷相，并在氮气流下蒸发。如以前所述(3)，将残余物溶解在流动相溶剂中进行HPLC分析。

[0108] 使用HP Series 1100溶剂递送系统(Hewlett Packard)，以1.3ml/min流速，在硅胶(silica)柱(5μx 4.6mm x 25cm；Beckman,USA)上通过HPLC分析氯仿相中的[1-14C]乙酸酯衍生物。将柱平衡，并在作为流动相的己烷:异丙醇:冰醋酸(965:25:10,v/v/v)的溶剂系统中运行。除了指定的情况以外，每0.5min(0.65ml/级分)收集流出物。通过闪烁计数确定[14C]乙酸盐衍生物中的计数。用[14C]胆固醇、[3H]25-羟基胆甾醇和[14C]27-羟基胆甾醇校准柱。

[0109] 通过实时RT-PCR确定mRNA水平

[0110] 用SV Total RNA Isolation Kit(Promega,Madison,WI)分离总RNA，其包括DNA酶处理。如生产商(Invitrogen,Carlsbad,CA)所推 荐的，将2μg总RNA用于第一链cDNA合成。使用合适的染料作为指示剂，在ABI 7500Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems,Foster City,CA)上进行实时RT-PCR。用于实时PCR的所有引物/探针集合是TaqMan基因表达测定(Applied Biosystems,Foster City,CA)。使用β-肌动蛋白和甘油醛
3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的扩增作为内部对照。用比较周期阈值(Ct)方法定量相对信使RNA(mRNA)表达，并表达为2-ΔΔCt。用于扩增的合适引物的序列描述在例如Ren等人,2007(1)中。

[0111] 蛋白质印迹分析

[0112] 如以前所述(4)，分离微粒体级分。在7.5％SDS-聚丙烯酰胺变性凝胶上分离得自经处理的细胞的微粒体蛋白或总提取蛋白。在SDS-PAGE以后，通过电泳将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)。然后将膜在封闭缓冲液[PBS,pH 7.4,0.1％ 20(使膜蛋白增溶的非离子型表面活性剂,C58H114O26),5％脱脂奶粉]中在25℃封闭60分钟。然后将蛋白与针对人SREBP1、SREBP-2或HMG-CoA还原酶的兔多克隆IgG一起在4℃温育过夜。用含有0.05％的 20的PBS(pH 7.4)洗涤以后，加入在洗涤溶液中的山羊抗-兔IgG-辣根过氧化物酶缀合物(1:2500)，并温育60分钟。使用Amersham ECL plus Kit，检测蛋白带。通过Advanced Image Data Analyzer(Aida Inc.,Straubenhardt,德国)定量阳性带。

[0113] 动物研究

[0114] 动物研究经过Institutional Animal Care and Use Committee of McGuire Veterans Affairs Medical Center批准，并根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)、实验动物护理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)和所有适用规章进行。为了检查25HCDS对血清和肝中饮食诱导的脂质积累的影响，给8-周龄雌性C57BL/6J小鼠(Charles River,Wilmington,MA)饲喂含有42％千卡脂肪、43％千卡碳水化合物、15％千卡蛋白和0.2％胆固醇的高脂肪饮食(HFD)(Harlan Teklad,Madison,WI)持续10周。将所有小鼠在相同 条件下圈养在无菌设备中，并自由获取水和食品。在每个阶段结束时，每3天1次地给小鼠腹膜内地注射媒介物溶液(乙醇/PBS；媒介物)或
25HCDS(25mg/kg)持续6周，并禁食过夜；并收集血液样品。使用标准酶技术在位于McGuire Veterans Affairs Medical Center的临床实验室中测量血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白-胆固醇、葡萄糖、碱性磷酸酶(ALK)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。如下所述，通过HPLC分析血清中的脂蛋白谱。

[0115] 肝脂质的定量

[0116] 将肝组织匀浆化，并用氯仿和甲醇的混合物(2:1)提取脂质，并过滤。将0.2ml提取物蒸发至干燥，并溶解于100μl含有10％的TRITONTMX-100(C14H22O(C2H4O)n)，一种非离子型表面活性剂)(Wako Chemicals USA,Richmond,VA)的异丙醇中进行胆固醇测定，溶解于NEFA溶液(0.5g EDTA-Na2,2g TRITONTMX-100,0.76ml 1N NaOH,和0.5g叠氮化钠/l,pH 6.5)中用于游离脂肪酸测定(Wako Chemicals USA,Richmond,VA)，或溶解于单独异丙醇中用于甘油三酯测定(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)。根据生产商的说明书分别进行所有测定。将每种脂质浓度标准化至肝重量。

[0117] 统计学

[0118] 将数据报告为平均值±标准差。在指出的情况下，对数据进行t-检验分析，并且如果p<0.05，那么确定为显著不同的。

[0119] 结果

[0120] 在原代大鼠肝细胞的细胞核中的新的胆固醇代谢物的检测

[0121] 为了确定新胆固醇代谢物在肝细胞核中的存在，从原代大鼠肝细胞分离细胞核级分。通过LC-MS分析每个级分的甲醇/水相中的氧化固醇。结果表明，2种主要分子离子m/z 561和m/z 583(561+Na)与分子5-胆甾烯-3β,25-二醇二硫酸酯较好地配合(图1)。所述分子最可能由SULT2B1b和SULT2B1a合成。

[0122] 细胞核氧化固醇5-胆甾烯-3β,25-二醇二硫酸酯的化学合成

[0123] 为了证实它的结构并研究它在细胞脂质体内稳态和炎症应答中的 作用，如上所述化学合成25HCDS并纯化。

[0124] 合成的化合物的MS分析显示出与可靠的细胞核氧化固醇相同的分子质量离子m/z 561和m/z 583(+Na)，并且纯化的产物没有被起始原料25-羟基胆甾醇(m/z 401)污染。LR-MS(ESI-阴性的),m/z:583.4(M+Na-2H,88％),561.3(M-H,46％),481.4(M-SO3-H,11％),
463.4(M-H2SO4-H,34％),431.82(14％),381.27(100％)(图2)。1H NMR(CD3OD)δ:0.72(3H,s,18-CH3),0.97(3H,d,J 5.0Hz,21-CH3),1.03(3H,s,19-CH3),1.14(6H,s,26-和27-CH3),
4.14(1H,br.m,3α-H),5.39(1H,br.s,6-H)(图3)。13C NMR(CD3OD)δ:12.45,19.37,19.90,
21.82,22.29,25.45,25.51,27.05,27.12,29.39,29.44,30.13,33.16,33.37,37.26,
37.32,37.50,38.60,40.52,41.27,43.65,51.78,57.71,58.37,79.98,85.93,123.44,
141.71(图4)。结果指示，合成的分子是5-胆甾烯-3β,25-二醇二硫酸酯(25HCDS)，并且它“配合”肝细胞细胞核级分中的指定分子。

[0125] 25HCDS通过经由SREBP信号传递降低ACC、FAS和HMG-CoA还原酶mRNA水平而抑制脂质生物合成

[0126] 为了研究25HCDS如何抑制脂质生物合成，从处理过的THP-1巨噬细胞分离总RNA。通过实时RT-PCR，确定巨噬细胞和hepG2细胞中的ACC和FAS(用于甘油三酯合成)以及HMG-CoA还原酶(用于胆固醇合成)的mRNA水平。如在图5中所示，在向培养的细胞添加25HCDS以后，ACC和FAS(图5A)以及HMG-CoA还原酶mRNA水平(图5B)的下降是浓度依赖性的(如显示的)和时间依赖性的(数据未显示)。这些下降与图5A和5B中所示的SREBP1/2的表达的减少一致。这些结果指示，25HCDS会减少SREBP信号传递，并随后减少脂质生物合成。令人感兴趣的是，25HCDS线性地增加PPARγ的mRNA水平，并在早期阶段和在低浓度一致地增加IκBα表达。结果提示，25HCDS会如同25HC3S一样经由PPARγ/IκBα信号传递途径抑制炎症应答。

[0127] 25HCDS的施用对饲喂HFD的小鼠中的脂质体内稳态的影响

[0128] 为了研究25HCDS的长期治疗对脂质体内稳态的影响，给8-周龄C57BL/6J雌性小鼠饲喂HFD 10周，然后分成2组。一组用25HCDS治疗，另一组用媒介物处理，每3天腹膜内注射1次，持续6周。在治疗过程中，给小鼠饲喂HFD，并监测体重和卡路里摄入。没有观察到这2种参数的显著差异(数据未显示)。注射6周以后，将小鼠禁食过夜并处死。无论饮食如何，小鼠的肝重量没有显示显著差异(数据未显示)。

[0129] 为了研究25HCDS对肝脂质代谢的影响，确定了肝脂质水平和有关的基因表达水平。如以前所报道的，与饲喂食物的小鼠相比，饲喂HFD的小鼠显示出肝中增加的甘油三酯、总胆固醇、游离脂肪酸和甘油三酯水平(数据未显示)。25HCDS施用显著减少了这些增加，例如分别减少了30％、20％和18％(p<0.05)，如图6所示。另外，基因表达分析表明，25HCDS施用显著减少了在游离脂肪酸、甘油三酯和胆固醇合成中涉及的关键酶和受体的表达，如在表1中所示。

[0130] 脂质代谢的调节异常经常与炎性病症有关。25HCDS治疗分别将TNFα和IL1β的表达显著地抑制了50％、36％(表2)。这些结果与肝功能测定相一致，所述肝功能测定表明，25HC3S抑制肝炎应答，从而减轻肝损伤和血清中的碱性磷酸酶活性(数据未显示)。令人感兴趣的是，25HCDS使肝中的PGC-1α的表达增加了2倍。因而，25HCDS似乎经由LXR、PPARγ和PGC-1 信号传递来调节脂质代谢和炎症应答。

[0131] 表1.在有或没有25HCDS的情况下，在饲喂HFD的小鼠中在脂质代谢中涉及的相对肝mRNA表达

[0132]

[0133]

[0134] 如上所述处理动物。将所有值表达为平均值±SD；n＝6-7。*p<0.05，相对于HFD小鼠。缩写：HFD，高脂肪饮食。

[0135] 表2.在有或没有25HCDS的情况下，在饲喂HFD的小鼠中在炎症应答中涉及的相对肝mRNA表达

[0136]

[0137] 如上所述处理动物。将所有值表达为平均值±SD；*p<0.05，**p<0.01，相对于HFD小鼠。缩写：HFD，高脂肪饮食。

[0138] 讨论

[0139] 胆固醇和甘油三酯代谢密切相关。孤儿核受体是调节关键靶基因的表达的配体活化的转录因子，所述关键靶基因是许多生物学事件的重要调节剂。脂肪酸(PPAR)、氧化固醇(LXR)、视黄酸(RXR)和SREBP的受体充当细胞脂质水平的传感器，从而引起基因表达变化，以便维持脂质体内稳态和保护细胞免于脂质积累引起的损伤。但是，在受体活动之间的相互沟通联系仍然不明。如本文证实的，胆固醇代谢物25HCDS会在体外和在体内抑制SREBP-1c表达、加工和活性，并增加PPARγ和PGC-1α表达。确定记载了SREBP控制脂质生物合成，PPARγ调节炎症应答，并且PGC-1α控制能量体内稳态。因而，结果表明，25HCDS是这些过程的有效调节剂，并且在肝脂质体内稳态的维持和炎症应答中起重要作用。25HC3S的施用会增加细胞核PPARγ蛋白水平和抑制炎症应答，但是仅仅轻微增加PPARγ的mRNA。相比而言，
25HCDS以时间和浓度依赖性的方式显著地增加PPARγ和PGC-1α的mRNA表达，从而指示
25HCDS在脂质代谢和炎症应答的调节中比25HC3S更有效。

[0140] 25HCDS生物合成和氧化固醇硫酸化的反应代表一种新的调节途径，其介导肝细胞中的核受体活性。该途径的关键组分总结如下：1)当细胞内胆固醇水平增加时，线粒体胆固醇递送蛋白StAR将胆固醇递送进线粒体中，在此处由CYP27A1合成调节性的氧化固醇，诸如25HC。这些氧化固醇又活化LXR，并随后上调在脂肪酸和甘油三酯生物合成中涉及的它的靶基因的表达。另外，25HC会活化LXR，通过抑制HMGR表达而下调新合成的胆固醇合成，并增加ABCA1介导的来自细胞的胆固醇分泌(HDL形成)。2)25HC3S和25HCDS会灭活LXR并抑制SREBP-1c加工，从而指示这些硫酸化的氧化固醇会通过抑制合成而降低细胞内脂质水平；
3)25HC对脂质代谢的作用与25HC3S和25HCDS的作用相反。因而，细胞内的氧化固醇硫酸化代表在脂质代谢中和在NAFLD发展中涉及的一种新的调节机制。

[0141] 用25HCDS治疗小鼠NAFLD模型会降低肝脂质水平。已经研究 了对NAFLD的大量治疗。尽管许多治疗似乎会改善生化标志物诸如丙氨酸转氨酶水平，大多数没有得到证实会逆转组织学异常或减少临床端点。25HCDS通过阻断核受体LXR和SREBP的活化而在转录水平抑制在脂质生物合成中涉及的关键基因表达，从而抑制由HFD诱导的促炎性细胞因子和经由PGC1a控制能量体内稳态。因而，25HCDS充当有效地降低肝脂质水平的有效调节剂，并因此代表用于治疗NALFD和其它脂质代谢的有关疾病的新药剂。

[0142] 参考文献

[0143] 1.Ren,S.,Li,X.,Rodriguez-Agudo,D.,Gil,G.,Hylemon,P.,和Pandak,W.M.2007.Sulfated oxysterol,25HC3S,is a potent regulator of lipid metabolism in human hepatocytes.Biochem.Biophys.Res.Commun.360:802-808.

[0144] 2.Ren,S.,Hylemon,P.,Zhang,Z.P.,Rodriguez-Agudo,D.,Marques,D.,Li,X.,Zhou,H.,Gil,G.,和Pandak,W.M.2006.Identification of a novel sulfonated oxysterol,5-cholesten-3beta,25-diol 3-sulfonate,in hepatocyte nuclei and mitochondria.J.Lipid Res.47:1081-1090.

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[0146] 4.Ren,S.,Hylemon,P.,Marques,D.,Hall,E.,Redford,K.,Gil,G.,和Pandak,W.M.2004.Effect of increasing the expression of cholesterol transporters(StAR,MLN64,and SCP-2)on bile acid synthesis.J.Lipid Res.45:2123-2131.[0147] 尽管已经以它的优选实施方案的方式描述了本发明，但是本领域 技术人员会认识到，在所附权利要求的精神和范围内做出修改的情况下，可以实践本发明。因此，本发明不应当限于如上所述的实施方案，而是应当进一步包括在本文提供的描述的精神和范围内的所有修改方案及其等同方案。