人CGRP受体结合蛋白

摘要

本发明提供了结合人CGRP受体(CGRP R)的抗原结合蛋白。还提供了编码抗原结合蛋白的核酸、载体和编码其的细胞。所述抗原结合蛋白可抑制CGRP R与CGRP结合，并可用于许多CGRP R相关病症，包括治疗和/或预防偏头痛。

权利要求

1.一种特异性结合人CGRP受体的包含重链和轻链的重组抗体，其中所述抗体分离自宿主细胞，所述宿主细胞表达重链核酸和轻链核酸，其中：

(a) 所述重链核酸包含SEQ ID NO: 244的序列和所述轻链核酸包含SEQ ID NO: 226的序列；

(b) 所述重链核酸包含SEQ ID NO: 257的序列和所述轻链核酸包含SEQ ID NO: 239的序列；

(c) 所述重链核酸包含SEQ ID NO: 248的序列和所述轻链核酸包含SEQ ID NO: 230的序列；

(d) 所述重链核酸包含SEQ ID NO: 246的序列和所述轻链核酸包含SEQ ID NO: 228的序列；

(e) 所述重链核酸包含SEQ ID NO: 249的序列和所述轻链核酸包含SEQ ID NO: 231的序列；

(f) 所述重链核酸包含SEQ ID NO: 255的序列和所述轻链核酸包含SEQ ID NO: 237的序列；

(g) 所述重链核酸包含SEQ ID NO: 242的序列和所述轻链核酸包含SEQ ID NO: 224的序列；

(h) 所述重链核酸包含SEQ ID NO: 247的序列和所述轻链核酸包含SEQ ID NO: 229的序列；

(i) 所述重链核酸包含SEQ ID NO: 250的序列和所述轻链核酸包含SEQ ID NO: 232的序列；

(j) 所述重链核酸包含SEQ ID NO: 256的序列和所述轻链核酸包含SEQ ID NO: 238的序列；

(k) 所述重链核酸包含SEQ ID NO: 252的序列和所述轻链核酸包含SEQ ID NO: 234的序列；

(l) 所述重链核酸包含SEQ ID NO: 253的序列和所述轻链核酸包含SEQ ID NO: 235的序列；

(m) 所述重链核酸包含SEQ ID NO: 254的序列和所述轻链核酸包含SEQ ID NO: 236的序列；

(n) 所述重链核酸包含SEQ ID NO: 243的序列和所述轻链核酸包含SEQ ID NO: 225的序列；

(o) 所述重链核酸包含SEQ ID NO: 251的序列和所述轻链核酸包含SEQ ID NO: 233的序列；

(p) 所述重链核酸包含SEQ ID NO: 245的序列和所述轻链核酸包含SEQ ID NO: 227的序列；

(q) 所述重链核酸包含SEQ ID NO: 258的序列和所述轻链核酸包含SEQ ID NO: 240的序列；或(r) 所述重链核酸包含SEQ ID NO: 258的序列和所述轻链核酸包含SEQ ID NO: 241的序列。

2.权利要求1的重组抗体，其中所述宿主细胞分泌所述抗体，并且所述抗体分离自所述宿主细胞的培养基。

3.权利要求1的重组抗体，其中所述重链核酸包含SEQ ID NO: 247的序列和所述轻链核酸包含SEQ ID NO: 229的序列。

4.权利要求1的重组抗体，其中所述重链核酸包含SEQ ID NO: 251的序列和所述轻链核酸包含SEQ ID NO: 233的序列。

5.一种药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项的抗体和药学上可接受的赋形剂。

6.权利要求1-4中任一项的抗体在制备用于治疗有需要的患者中与CGRP受体介导的血管舒张或神经源性炎症相关的病症的药物中的用途。

7.权利要求6的用途，其中所述病症为头痛。

8.权利要求6的用途，其中所述病症为偏头痛。

9.权利要求6-8中任一项的用途，其中所述治疗包括预防性治疗。

10.一种制备与人AM1、AM2和AMY1受体相比选择性抑制人CGRP受体的抗体的方法，其包括给予动物免疫原，所述免疫原包含：(i)可溶性CGRP受体，其中所述可溶性CGRP受体包含人CRLR的N末端胞外域(ECD)和人RAMP1的ECD，(ii)表达全长人CRLR和人RAMP1多肽的整个细胞，或(iii) (ii)中细胞的膜提取物；和

从免疫动物回收特异性结合人CGRP受体的抗体。

11.权利要求10的方法，其中所述人CRLR的ECD包含SEQ ID NO: 6，所述人RAMP1的ECD包含EQ ID NO: 8。

12.权利要求10的方法，其中所述动物为包含人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠。

说明书

人CGRP受体结合蛋白

[0001] 本申请为分案申请，原申请的申请日为2009年12月18日，申请号为200980157606.3(PCT/US2009/068858)，发明名称为“人CGRP受体结合蛋白”。

[0002] 背景

[0003] 本申请含有序列表，其已经由EFS网提交且其全文在此以引用的方式并入。将2009年12月14日建立的所述ASCII副本命名为A1472PCT.txt，大小为312,447个字节。

[0004] 肽的降钙素超家族包括至少五种已知的成员：降钙素、胰岛淀粉样肽(amylin)、肾上腺髓质素和两种降钙素基因相关肽(“CGRP”)：CGRP1(也称为ctCGRP或CGRP)和CGRP2(也称为βCGRP)。CGRP为表达于中枢神经系统和周围神经系统的37个氨基酸血管活性神经肽，且已被证实为周围神经中的强效血管舒张剂，其中含CGRP的神经元与血管紧密缔合。CGRP介导的血管舒张还与神经源性炎症相关，其为导致血浆外渗和微脉管系统血管舒张的一系
列事件中的一部分并出现于偏头痛中。胰岛淀粉样肽在CNS中也具有特异性结合位点，且被认为可调节胃排空并在碳水化合物代谢中发挥作用。肾上腺髓质素为强效血管舒张剂。肾
上腺髓质素在星形胶质细胞上具有特异性受体，并且其信使RNA在经受局部缺血的CNS组织
中得以上调(Zimmermann等，Identification of adrenomedullin receptors in 
cultured rat astrocytes and in neuroblastoma glioma hybrid cells(NG108-15)，
Brain Res.，724:238-245(1996)；Wang等，Discovery of adrenomedullin in rat 
ischemic cortex and evidence for its role in exacerbating focal brain 
ischemic damage，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，92:11480-11484(1995))。

[0005] 降钙素参与骨代谢的控制，并且还在中枢神经系统(CNS)中具有活性。CGRP的生物活性包括调节神经肌肉接头、免疫系统中的抗原呈递、血管紧张度和感觉神经传递
(Poyner，D. R.，Calcitonin gene-related peptide: multiple actions，multiple 
receptors，Pharmacol. Ther.，56:23-51(1992)；Muff等，Calcitonin，calcitonin gene related peptide，adrenomedullin and amylin: homologous peptides，separate 
receptors and overlapping biological actions，Eur. J. Endocrinol.，133: 17-20
(1995))。已在许多哺乳动物种群中鉴别出三种降钙素受体刺激肽(CRSP)；CRSP可在CGRP家族中形成新的亚族(Katafuchi，T和Minamino，N，Structure and biological properties of three calcitonin receptor-stimulating peptides，novel members of the 
calcitonin gene-related peptide family，Peptides，25(11):2039-2045(2004))。

[0006] 降钙素超家族肽通过七个跨膜域G蛋白偶联受体(GPCR)起作用。降钙素受体(“CT”、“CTR”或“CT受体”)和CGRP受体为II型(“B家族”)GPCR，该家族包括识别调节肽(诸如胰泌素、胰高血糖素和血管活性肠多肽(VIP))的其它GPCR。表征最充分的人降钙素受体的
剪接变体根据第一细胞内环中16个氨基酸的存在(先前为CTRII+或CTR1，现称为CT(b))或不存在(主要剪接变体，先前为CTRII-或CTR2，现称为CT(a))而变化。(Gorn等，Expression of two human skeletal calcitonin isoforms cloned from a giant cell tumor of 
bone: the first intracellular domain modulates ligand binding and signal 
transduction，J. Clin. Invest.，95:2680-2691(1995)；Hay等，Amylin receptors: 
molecular composition and pharmacology，Biochem. Soc. Trans.，32:865-867(2004)；
Poyner等，2002)。已根据多项体内和体外生物测定中差异性拮抗剂亲和力和激动剂功效提出存在至少两种CGRP受体亚型(Dennis等，CGRP8-37，A calcitonin gene-related 
peptide antagonist revealing calcitonin gene-related peptide receptor 
heterogeneity in brain and periphery，J. Pharmacol. Exp. Ther.，254:123-128
(1990)；Dennis等，Structure-activity profile of calcitonin gene-related peptide in peripheral and brain tissues. Evidence for multiplicity，J. Pharmacol. Exp. Ther.，251:718-725(1989)；Dumont等，A potent and selective CGRP2 agonist，[Cys
(Et)2,7]hCGRP: comparison in prototypical CGRP1 and CGRP2 in vitro assays，
Can. J. Physiol. Pharmacol.，75:671-676(1997))。

[0007] 发现CGRP1受体亚型对拮抗剂片段CGRP(8-37)敏感。(Chiba等，Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist human CGRP-(8-37)，Am. J. Physiol.，256:
E331-E335(1989)；Dennis等，(1990)；Mimeault等，Comparative affinities and 
antagonistic potencies of various human calcitonin gene-related peptide 
fragments on calcitonin gene-related peptide receptors in brain and 
periphery，J. Pharmacol. Exp. Ther.，258:1084-1090(1991))。相比之下，CGRP2受体对线性人CGRP(hCGRP)类似物敏感，其中位置2和7处的半胱氨酸残基经衍生化(例如，用乙酰
氨基甲基[Cys(ACM)2,7]或乙基酰胺[Cys(Et)2,7])，但CGRP2受体对片段CGRP(8-37)不敏感。
(Dennis等，(1989)；Dennis等，(1990)；Dumont等，(1997))。

[0008] 降钙素受体和降钙素样受体(“CL”、“CLR”或“CRLR”)的配体特异性取决于称为受体活性修饰蛋白(RAMP)的辅助蛋白家族成员的共表达。RAMP家族包括三种多肽(RAMP1、RAMP2和RAMP3)，其充当决定降钙素家族成员的受体的配体特异性的受体调节剂。RAMP为I
型跨膜蛋白，其与细胞质短C末端(一个跨膜域)和细胞外大N末端(负责特异性)共享约30%
氨基酸序列同一性和共同的预测拓扑结构(topology)。(McLatchie等，(1998) RAMPs 
regulate the transport and ligand specificity of the calcitonin-receptor-like 
receptor，Nature，393:333-339；Fraser等，(1999) The amino terminus of receptor activity modifying proteins is a critical determinant of glycosylation state 
and ligand  binding of calcitonin receptor-like receptor，Molecular 
Pharmacology，55:1054-1059)。

[0009] 1998年，CGRP1受体被鉴别为是由新型单跨膜域辅助蛋白、受体活性修饰蛋白1(RAMP1)和CRLR构成的异二聚体。((McLatchie等，见上文)。交联实验表明，CGRP受体由CRLR和RAMP1按一比一的化学计量排列组成(Hilairet等，JBC 276，42182-42190(2001))，使用若干方法(诸如BRET和BiFC)的最新研究显示，功能性CGRP受体复合物可由CRLR的非对称同
源寡聚体和RAMP1单体构成(Heroux等，JBC 282，31610-31620(2007))。

[0010] 纯化的CRLR N末端域已显示可特异性结合125I-CGRP(Chauhan等，Biochemistry 44，782(2005))，这证实CRLR与CGRP配体之间存在重要且直接的相互作用。具体而言，认为CRLR的Leu 24和Leu 34构成CGRP的C末端Phe37的停泊位点(Banerjee等，BMC Pharmacol. 
6，9(2006))。此外，Koller等，(FEBS Lett. 531，464-468(2002))证明CRLR的N末端18个氨基酸残基有助于与CGRP或肾上腺髓质素的选择性相互作用，并且Ittner等(Biochemistry 
44，5749-5754(2005))提出CRLR的N末端氨基酸残基23-60介导与RAMP1的缔合。

[0011] 对RAMP1的结构-功能分析鉴别出与“螺旋3”相关(Simms等，Biophys. J. 91，662 – 669(2006))并在与CRLR相互作用中具有潜在显著作用的残基91–103以及与CGRP配体潜在相互作用的残基Trp74和Phe92，CGRP配体与其结合CGRP受体复合物有关。使用人/大鼠
RAMP1嵌合体的配体结合研究表明，CGRP R的某些小分子抑制剂(例如BIBN4096BS)的结合
位点位于包括RAMP1的氨基酸66-102的区域内(Mallee等，JBC 277，14294 – 14298
(2002))。

[0012] 尽管跨膜域具有几乎80%的同一性，但CRLR与CTR具有55%的总氨基酸序列同一性(McLatchie等，(1998)；Poyner等，International union of pharmacology. XXXII. The mammalian calcitonin gene-related peptides，adrenomedullin，amylin and 
calcitonin receptors，Pharmacol. Rev.，54:233-246(2002))。

[0013] 经证实，CRLR可形成CGRP的高亲和力受体(当与RAMP1缔合时)或优选地结合肾上腺髓质素(当与RAMP2或RAMP3缔合时)。(McLatchie等，(1998)；Sexton等，Receptor 
activity modifying proteins，Cellular Signaling，13:73-83(2001)；Conner等，
Interaction of calcitonin-gene-related peptide with its receptors，Biochemical Society Transactions 30(第4部分)：451-454(2002))。CRLR的糖基化状态与其药理学相
关。RAMP 1、2和3以相似的效率将CRLR转运至质膜，然而RAMP1将CRLR呈递为末端糖基化、成熟糖蛋白和CGRP受体，而RAMP 2和3将CRLR呈递为未成熟、核心糖基化肾上腺髓质素受体
(“AM”或“AMR”或“AM受体”)。(Fraser等，(1999))。尽管RAMP 2和3共享仅30%的氨基酸序列同一性，但通过放射性配体结合(125I-肾上腺髓质素作为放射性配体)、功能测定(cAMP测
量)或生物化学分析(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)对HEK293T细胞中CRLR/RAMP2和CRLR/
RAMP3受体的表征显示其不可辨别(Fraser等，1999))。然而，在药理学中已观察到用RAMP 2表达的CRLR与用RAMP 3表达的CRLR的差异。CGRP和CGRP8-37以及肾上腺髓质素以及源于肾
上腺髓质素的肽AM 22-52对RAMP 3异二聚体均具有活性，这表明此复合物可充当CGRP和AM
受体(Howitt等，British Journal of Pharmacology，140:477-486(2003)；Muff等，
Hypertens. Res.，26:S3-S8(2003))。人CRLR随大鼠RAMP1的共表达(反之亦然)表明RAMP1
物种决定了CRLR/RAMP1复合物相对于若干所测小分子CGRP受体拮抗剂的药理学特征
(Mallee等，Receptor Activity-Modifying Protein 1 determines the species 
selectivity of non-peptide CGRP receptor antagonists，J. Biol. Chem.，277(16):
14294-14298(2002))。除非与RAMP缔合，未知CRLR可结合任何内源性配体；目前认为仅GPCR以此方式作用。(Conner等，A key role for transmembrane prolines in calcitonin 
receptor-like agonist binding and signaling: implications for family B G-
protein-coupled receptors，Molec. Pharmacol.，67(1):20-31(2005))。

[0014] 已证实，降钙素受体(CT)与RAMP(称为胰岛淀粉样肽受体(“AMY”、“AMY R”或“AMY受体”))可形成异二聚体复合物。一般而言，CT/RAMP1受体(称为“AMY1”或“AMY1”)对鲑鱼降钙素、胰岛淀粉样肽和CGRP具有高亲和力，并对哺乳动物降钙素具有低亲和力。对于CT/RAMP2受体(“AMY2”或“AMY2”)和CT/RAMP3受体(“AMY3”或“AMY3”)，主要观察到了相似的模式，尽管对CGRP的亲和力较低并且在生理相关配体浓度下可能不显著。精确的受体表型取
决于细胞类型和CTR剪接变体(CT(a)或CT(b))，尤其是对于RAMP2产生的胰岛淀粉样肽受体而言。例如，据报导，破骨细胞样细胞的纯群体表达RAMP2、CTR和CRLR，而非RAMP1或RAMP3。
(Hay等，(2004)；Christopoulos等，Multiple amylin receptors arise from receptor activity-modifying protein interaction with the calcitonin receptor gene 
product，Molecular Pharmacology，56:235-242(1999)；Muff等，An amylin receptor is revealed following co-transfection of a calcitonin receptor with receptor 
activity modifying proteins-1 or -3，Endocrinology，140:2924-2927(1999)；Sexton等，(2001)；Leuthauser等，Receptor-activity-modifying protein 1 forms 
heterodimers with two G-protein-coupled receptors to define ligand 
recognition，Biochem. J.，351:347-351(2000)；Tilakaratne等，Amylin receptor 
phenotypes derived from human calcitonin receptor/RAMP co-expression exhibit 
pharmacological differences dependent on receptor isoform and host cell 
environment，J. Pharmacol. Exp. Ther.，294:61-72(2000)；Nakamura等，Osteoclast-like cells express receptor activity modifying protein 2: application of 
laser capture microdissection，J. Molec. Endocrinol.，34:257-261(2005))。

[0015] 下表1汇总了上述受体组分的关系。

[0016] 表1

[0017]

[0018] 已提出CGRP拮抗剂的治疗用途。Noda等描述了CGRP或CGRP衍生物用于抑制血小板凝集和用于治疗或预防动脉硬化或血栓形成。(EP 0385712 B1)。Liu等公开了调节CTR活性的治疗剂，包括载体缀合肽，诸如降钙素和人αCGRP。(WO 01/83526 A2；US 2002/0090646 A1)。Smith等公开了血管活性CGRP肽拮抗剂及其在抑制CGRP与CGRP受体结合的方法中的用
途；经证实此类CGRP肽拮抗剂可抑制CGRP与冠状动脉膜结合并使辣椒碱处理的猪冠状动脉
松弛(美国专利No. 6,268,474 B1；和美国专利No. 6,756,205 B2)。Rist等公开了具有
CGRP受体拮抗剂活性的肽类似物及其在用于治疗及预防多种病症的药物中的用途。(DE 
19732944 A1)。

[0019] CGRP为强效血管舒张剂，其涉及许多血管舒缩症状，诸如所有形式的血管性头痛，包括偏头痛(有或无先兆)和丛集性头痛的病理。Durham，N. Engl. J. Med. 350:1073-1 075，2004。偏头痛病理生理学涉及三叉神经节的活化，CGRP定位于三叉神经节中，并且CGRP水平在偏头痛发作期间显著增加。这转而促进颅内血管舒张和神经源性炎症以及敏感化。
(Doods，H.，Curr. Opin. Investig. Drugs，2:1261-1268(2001))。此外，在偏头痛期间，患者外颈静脉中的血清CGRP水平升高。Goadsby等，Ann. Neurol. 28:183-7，1990。在患有无先兆偏头痛的患者中，人ci-CGRP的静脉内施用诱发头痛和偏头痛，从而支持了CGRP在偏头痛中有致病作用的观点(Lassen等，Cephalalgia 22:54-61，2002)。

[0020] 偏头痛是复杂、常见的神经病症，其特征为头痛的重度、间歇性发作及相关特征，其可包括恶心、呕吐、对光、声或移动的敏感性。在一些患者中，头痛之前或同时有先兆。在某些患者中，头痛可能严重并且还可能为单侧头痛。偏头痛发作会扰乱日常生活。在美国和西欧，偏头痛患者的总患病率为总群体的11%(6%男性；15-18%女性)。此外，个体中发作的中值频率为1.5次/月。尽管存在许多可缓解或减轻症状的疗法，但就每月偏头痛发作超过3-4次的那些患者而言，推荐预防疗法。Goadsby等，New Engl. J. Med. 346(4): 257-275，2002。已用托吡酯对一些偏头痛患者进行了治疗，托吡酯为阻断电压依赖性钠通道和某些
谷氨酸盐受体(AMPA-红藻氨酸盐)，增强GABA-A受体活性以及阻断碳酸酐酶的抗惊厥药。近来血清素5HT-I B/ID和/或5HT-1受体激动剂(如舒马曲坦(sumatriptan))在一些患者中的
成功使得研究者提出该病症的血清素激活性病原学。遗憾的是，尽管一些患者对此治疗反
应良好，但其它患者对其效应具有相对抗性。

[0021] CGRP可能参与偏头痛已成为用于开发和测试许多抑制CGRP(如舒马曲坦)释放，拮抗CGRP受体(例如二肽衍生物BIBN4096BS(Boehringer Ingelheim)；CGRP(8-37))或与一种
或多种受体相关蛋白(如RAMP1)相互作用的化合物的基础。Brain，S.等，Trends in 
Pharmacological Sciences 23:51-53，2002。α-2肾上腺素受体亚型和腺苷Al受体还控制(抑制)CGRP释放和三叉神经活化(Goadsby等，Brain 125:1392- 401，2002)。另一方面，用专门抑制神经源性炎症的化合物(例如，速激肽NKI受体拮抗剂)或抑制三叉神经活化的化
合物(例如，5HT10受体激动剂)进行的治疗作为偏头痛的急性治疗似乎相对无效，导致一些关于抑制CGRP的释放是否为有效的抗偏头痛治疗的基础的问题。Arulmani等，Eur. J. 
Pharmacol. 500:315-330，2004。

[0022] 尽管还未充分了解偏头痛的准确病理生理学，但已提出CGRP拮抗剂和CGRP-靶向适体用于治疗偏头痛和其它病症的用途。(例如Olesen等，Calcitonin gene-related 
peptide receptor antagonist BIBN 4096 BS for the acute treatment of migraine，
New Engl. J. Med.，350:1104-1110(2004)；Perspective: CGRP-receptor 
antagonists--a fresh approach to migraine，New Engl. J. Med.，350:1075(2004)；
Vater等，Short bioactive Spiegelmers to migraine-associated calcitonin gene-
related peptide rapidly identified by a novel approach: tailored-SELEX，Nuc. 
Acids Res.，31(21 e130):1-7(2003)；WO 96/03993)。此外，最近III期临床试验中经证实，强效小分子CGRP拮抗剂可减轻中度至重度偏头痛发作，包括偏头痛和偏头痛相关症状
(Connor等，Efficacy and Safety of telcagepant(MK-0974)，a Novel Oral CGRP 
Receptor Antagonist，for Acute Migraine Attacks. Poster，European Headache and Migraine Trust International Congress，London，England，2008年9月)。

[0023] CGRP可能还参与除偏头痛之外的慢性疼痛综合征。在啮齿类动物中，鞘内递送的CGRP诱发剧烈的疼痛，并且CGRP水平在许多疼痛模型中得以提高。此外，CGRP拮抗剂部分阻断啮齿类动物的急性胰腺炎的伤害感受(Wick等，(2006) Surgery，第139卷第2期第197-
201页)。总之，这些观察结果意味着强效且选择性CGRP受体拮抗剂可为治疗慢性疼痛(包括偏头痛)的有效治疗剂。

发明内容

[0024] 本文描述了结合CGRP R(特别是灵长类动物CGRP R，例如，人CGRP R)的分离抗体、其抗原结合片段和其它分离的抗原结合蛋白。此类分离的抗原结合蛋白可选择性地抑制灵长类动物CGRP R(相比灵长类动物AM1、AM2、CT或胰岛淀粉样肽受体)，并且可结合CGRP R的CRLR和RAMP1组分。发现CGRP R结合蛋白可抑制、干扰或调节与CGRP R有关的生物应答中的至少一种，并因此可用于改善CGRP R相关疾病或病症的影响。因此，某些抗原结合蛋白与
CGRP R的结合可具有一种或多种下列活性：抑制、干扰或调节CGRP R、抑制血管舒张、减少神经源性炎症和缓解、改善、治疗、预防或减轻慢性疼痛或偏头痛的症状。

[0025] 在一个示例性方面，分离的抗原结合蛋白选择性地抑制人CGRP受体(相比人AM1，AM2或胰岛淀粉样肽受体)。在一些实施方案中，分离的抗原结合蛋白以50或以上、75或以
上、100或以上、150或以上、200或以上、250或以上、300或以上、400或以上、500或以上、750或以上或1,000或以上的选择性比率选择性地抑制人CGRP受体。可使用任何合适的方法，例如使用本文实施例中所述的cAMP测定，来测定选择性抑制的程度。在一些实施方案中，分离的抗原结合蛋白特异性结合人CRLR和人RAMP1，并且未特异性结合人AM1、人AM2或人胰岛淀粉样肽受体(例如AMY1或AMY2)。例如，分离的抗原结合蛋白可以KD≤1μM、≤100nM、≤10nM或≤5nM特异性结合人CGRP R。在一些实施方案中，分离的抗原结合蛋白以KD≤100nM、≤
10nM或≤5nM特异性结合人CGRP R，正如使用FACS结合测定所测定，和(例如)使用
Rathanaswami等，Biochemical and Biophysical Research Communications 334(2005) 
1004–1013中描述的方法所分析。在一些实施方案中，在CGRP结合竞争性测定中，分离的抗原结合蛋白的Ki为≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.5nM或≤0.1nM。在一些实施方案中，在放射性标记的125I-CGRP结合竞争性测定(例如本文实施例5中所述的测定)中，分离的抗原结合
蛋白对来自表达人CGRP R的细胞的膜的Ki为≤100nM、≤50nM、≤20nM、≤10nM、≤1nM、≤
0.5nM或≤0.1nM。

[0026] 在另一个示例性方面，分离的抗原结合蛋白与参考抗体竞争结合人CGRP R，例如CGRP R的细胞外部分，其中参考抗体包含含有选自SEQ ID NO:158-170的序列的重链可变
区和含有选自SEQ ID NO:137-153的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，使用结合测定(例如使用Biacore分析，例如本文实施例7中所述)评估结合竞争性。在一些实施方案中，分离的抗原结合蛋白与参考抗体竞争结合人CGRP R，所述参考抗体包含(i)重链可变区，其包含选自SEQ ID NO:161、163、164、166和168的序列；和(ii)轻链可变区，其包含选自SEQ ID NO:140、143、146、148和150的序列。在某些实施方案中，参考抗体包含(i)重链，其由选自SEQ ID NO:32、34、35、37和39的序列定义；和(ii)轻链，其由选自SEQ ID NO:15、18、21、23和25的序列定义。在更具体的实施方案中，参考抗体包含由下列序列对之一定义的重链和
轻链：(i) SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:15；(ii) SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:18；(iii) SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:21；(iv) SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:23；和(v) SEQ ID NO:39和
SEQ ID NO:25。在一个此类实施方案中，参考抗体包含含有SEQ ID NO:32的重链和含有SEQ ID NO:15的轻链。在另一个此类实施方案中，参考抗体包含含有SEQ ID NO:34的重链和含
有SEQ ID NO:18的轻链。在另一个此类实施方案中，参考抗体包含含有SEQ ID NO:35的重
链和含有SEQ ID NO:21的轻链。在另一个此类实施方案中，参考抗体包含含有SEQ ID NO:
37的重链和含有SEQ ID NO:23的轻链。在另一个此类实施方案中，参考抗体包含含有SEQ 
ID NO：39的重链和含有SEQ ID NO：25的轻链。

[0027] 在某些实施方案中，竞争结合人CGRP R的分离的抗原结合蛋白还例如以100或以上、250或以上、500或以上、750或以上、1,000或以上、2,500或以上、5,000或以上或10,000或以上的选择性比率选择性地抑制人CGRP受体，并且此类选择性可通过例如使用本文实施
例中所述的cAMP测定来测定。在相关实施方案中，竞争结合人CGRP R的分离的抗原结合蛋
白以KD≤1μM、≤100nM、≤10nM或≤5nM特异性结合人CGRP R，例如正如使用FACS结合测定所测定，和例如使用Rathanaswami等，Biochemical and Biophysical Research 
Communications 334(2005) 1004-1013中描述的方法所分析。在相关实施方案中，在CGRP
结合竞争性测定，例如放射性标记的125I-CGRP结合竞争性测定(例如本文实施例5中所述的测定)中，竞争结合人CGRP R的分离的抗原结合蛋白对来自表达人CGRP R的细胞的膜具有
≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.5nM或≤0.1nM的Ki。

[0028] 在任一上述实施方案中，竞争结合人CGRP R的分离的抗原结合蛋白可为例如单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人(例如完全人)抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗原结合片段。此外，竞争结合人CGRP R的分离的抗原结合蛋白的抗体片段可为Fab片段和Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子；并且可为例如人单克隆抗体，如IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型抗体。在某些实施方案中，竞争结合人CGRP R的分离的抗原结合蛋白可为中和抗原结合蛋白。

[0029] 在某些示例性方面，所述分离的抗原结合蛋白(例如，分离抗体或其片段)包含(A)一个或多个选自下列的重链互补决定区(CDRH)：(i)具有SEQ ID NO:134的CDRH1；(ii)具有SEQ ID NO:135的CDRH2；(iii)具有SEQ ID NO:136的CDRH3；和任选的(iv)包含一个或多个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRH，所述氨基酸取代、缺失或插入总数不超过四个氨基酸；(B)一个或多个选自下列的轻链互补决定区
(CDRL)：(i)选自SEQ ID NO:107、111和118的CDRL1；(ii)选自SEQ ID NO:108、112和119的CDRL2；(iii)选自SEQ ID NO:109、113和120的CDRL3；和任选的(iv)包含一个或多个(例如一、二、三、四或四个以上)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRL，所述氨基酸取代、缺失或插入总数不超过四个氨基酸；或(C)(A)的一个或多个重链CDRH和(B)的一个或多个轻链CDRL。

[0030] 在一些实施方案中，CDRH还选自：(i)具有SEQ ID NO:131的CDRH1；(ii)具有SEQ ID NO:132的CDRH2；(iii)具有SEQ ID NO:133的CDRH3；和任选的(iv)包含一个或多个(例
如一、二、三、四或四个以上)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRH，所述氨基酸取代、缺失或插入总数不超过三个氨基酸。在相关实施方案中，CDRH还选自：(i)选自SEQ ID NO:76、88、100、121、125和128的CDRH1；(ii)选自SEQ ID NO:
89、101、122、124、126和129的CDRH2；(iii)选自SEQ ID NO:78、90、102、123、127和130的CDRH3；和任选的(iv)包含一个或多个(例如一、二、三、四或四个以上)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRH，所述氨基酸取代、缺失或插入总数不超过两个氨基酸。在其它相关实施方案中，CDRH还选自：(i)选自SEQ ID NO:73、76、79、
82、85、88、92、97和100的CDRH1；(ii)选自SEQ ID NO:74、77、80、83、86、89、91、93、95、98、
101和129的CDRH2；(iii)选自SEQ ID NO:75、78、81、84、87、90、96、99、102和123的CDRH3；和任选的(iv)包含一个或多个(例如一、二、三、四或四个以上)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRH，所述氨基酸取代、缺失或插入总数不超过两个氨基酸。

[0031] 在一些实施方案中，CDRL还选自：(i)选自SEQ ID NO:107、111和115的CDRL1；(ii)选自SEQ ID NO:108、112和116的CDRL2；(iii)选自SEQ ID NO:109、113和117的CDRL3；和任选的(iv)包含一个或多个(例如一、二、三、四或四个以上)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRL。在一些实施方案中，每个CDRL的氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入总数不超过三个氨基酸。在一些实施方案中，每个CDRL的氨基酸取代、缺失或插入总数不超过两个氨基酸。在相关实施方案中，CDRL还选自：
(i)选自SEQ ID NO:42、45、51、57、62、69、103和110的CDRL1；(ii)选自SEQ ID NO:43、52、
55、58、63、70、104、108和114的CDRL2；(iii)选自SEQ ID NO:44、47、53、56、59、64、105和106的CDRL3；和任选的(iv)包含一个或多个(例如一、二、三、四或四个以上)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRL，所述氨基酸取代、缺失或插入总数不超过两个氨基酸。在另外相关实施方案中，CDRL还选自：(i)选自SEQ ID NO:42、45、48、
51、54、57、62、65、66和69的CDRL1；(ii)选自SEQ ID NO:43、46、49、52、55、58、61、63、67和70的CDRL2；(iii)选自SEQ ID NO:44、47、50、53、56、59、64、68、71和72的CDRL3；和任选的(iv)包含一个或多个(例如一、二、三、四或四个以上)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRL。在一个实施方案中，每个CDR的氨基酸取代、缺失或插入总数不超过两个氨基酸。在另一个实施方案中，氨基酸取代为保守性取代。

[0032] 在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含上述(A)中至少一个或两个CDRH和上述(B)中至少一个或两个CDRL。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(i)任
一上述(A)的至少三个CDRH，其中所述三个CDRH包括CDRH1、CDRH2和CDRH3和(ii)至少三个
任一上述(B)的CDRL，其中所述三个CDRL包括CDRL1、CDRL2和CDRL3。在另外实施方案中，上述分离的抗原结合蛋白包含含有至少一个CDRH的第一氨基酸序列和含有至少一个CDRL的
第二氨基酸序列。在一个实施方案中，第一和第二氨基酸序列彼此共价键合。

[0033] 在另一个方面，分离的抗原结合蛋白包括CDRH1、CDRH2和CDRH3。在一个实施方案中，CDRH1包含SEQ ID NO:73，CDRH2包含SEQ ID NO:74，并且CDRH3包含SEQ ID NO:75。在另一个实施方案中，CDRH1包含SEQ ID NO:76，CDRH2包含SEQ ID NO:77，并且CDRH3包含SEQ ID NO:78。在另一个实施方案中，CDRH1包含SEQ ID NO:79，CDRH2包含SEQ ID NO:80，并且CDRH3包含SEQ ID NO:81。在另一个实施方案中，CDRH1包含SEQ ID NO:82，CDRH2包含SEQ ID NO:83，并且CDRH3包含SEQ ID NO:84。在另一个实施方案中，CDRH1包含SEQ ID NO:85，CDRH2包含SEQ ID NO:86，并且CDRH3包含SEQ ID NO:87。在另一个实施方案中，CDRH1包含SEQ ID NO:88，CDRH2包含SEQ ID NO:89，并且CDRH3包含SEQ ID NO:90。在另一个实施方案中，CDRH1包含SEQ ID NO:76，CDRH2包含SEQ ID NO:91，并且CDRH3包含SEQ ID NO:78。在另一个实施方案中，CDRH1包含SEQ ID NO:92，CDRH2包含SEQ ID NO:93，并且CDRH3包含SEQ ID NO:94。在另一个实施方案中，CDRH1包含SEQ ID NO:76，CDRH2包含SEQ ID NO:95，并且CDRH3包含SEQ ID NO:78。在另一个实施方案中，CDRH1包含SEQ ID NO:73，CDRH2包含SEQ ID NO:74，并且CDRH3包含SEQ ID NO:96。在另一个实施方案中，CDRH1包含SEQ ID NO:97，CDRH2包含SEQ ID NO:98，并且CDRH3包含SEQ ID NO:99。在另一个实施方案中，CDRH1包含SEQ ID NO:100，CDRH2包含SEQ ID NO:101，并且CDRH3包含SEQ ID NO:102。

[0034] 在另一个方面，分离的抗原结合蛋白包括CDRL1序列、CDRL2序列和CDRL3序列。在一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:42，CDRL2包含SEQ ID NO:43，并且CDRL3包含SEQ ID NO:44。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:45，CDRL2包含SEQ ID NO:46，并且CDRL3包含SEQ ID NO:47。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:48，CDRL2包含SEQ ID NO:49，并且CDRL3包含SEQ ID NO:50。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:51，CDRL2包含SEQ ID NO:52，并且CDRL3包含SEQ ID NO:53。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:54，CDRL2包含SEQ ID NO:55，并且CDRL3包含SEQ ID NO:56。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:57，CDRL2包含SEQ ID NO:58，并且CDRL3包含SEQ ID NO:59。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:60，CDRL2包含SEQ ID NO:55，并且CDRL3包含SEQ ID NO:56。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:45，CDRL2包含SEQ ID NO:61，并且CDRL3包含SEQ ID NO:47。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:62，CDRL2包含SEQ ID NO:63，并且CDRL3包含SEQ ID NO:64。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:65，CDRL2包含SEQ ID NO:55，并且CDRL3包含SEQ ID NO:56。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:66，CDRL2包含SEQ ID NO:67，并且CDRL3包含SEQ ID NO:68。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:69，CDRL2包含SEQ ID NO:70，并且CDRL3包含SEQ ID NO:71。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:69，CDRL2包含SEQ ID NO:70，并且CDRL3包含SEQ ID NO:72。

[0035] 在另一个方面，分离的抗原结合蛋白包括CDRL1序列、CDRL2序列、CDRL3序列、CDRH1序列、CDRH2序列和CDRH3序列。在一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:42，CDRL2包含SEQ ID NO:43，CDRL3包含SEQ ID NO:44，CDRH1包含SEQ ID NO:73，CDRH2包含SEQ ID 
NO:74，并且CDRH3包含SEQ ID NO:75。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:45，
CDRL2包含SEQ ID NO:46，CDRL3包含SEQ ID NO:47，CDRH1包含SEQ ID NO:76，CDRH2包含
SEQ ID NO:77，并且CDRH3包含SEQ ID NO:78。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:
48，CDRL2包含SEQ ID NO:49，CDRL3包含SEQ ID NO:50，CDRH1包含SEQ ID NO:79，CDRH2包含SEQ ID NO:80，并且CDRH3包含SEQ ID NO:81。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:51，CDRL2包含SEQ ID NO:52，CDRL3包含SEQ ID NO:53，CDRH1包含SEQ ID NO:82，CDRH2包含SEQ ID NO:83，并且CDRH3包含SEQ ID NO:84。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:54，CDRL2包含SEQ ID NO:55，CDRL3包含SEQ ID NO:56，CDRH1包含SEQ ID NO:85，CDRH2包含SEQ ID NO:86，并且CDRH3包含SEQ ID NO:87。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:57，CDRL2包含SEQ ID NO:58，CDRL3包含SEQ ID NO:59，CDRH1包含SEQ ID NO:88，CDRH2包含SEQ ID NO:89，并且CDRH3包含SEQ ID NO:90。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:60，CDRL2包含SEQ ID NO:55，CDRL3包含SEQ ID NO:56，CDRH1包含SEQ ID NO:85，CDRH2包含SEQ ID NO:86，并且CDRH3包含SEQ ID NO:87。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:45，CDRL2包含SEQ ID NO:61，CDRL3包含SEQ ID NO:47，CDRH1包含SEQ ID NO:76，CDRH2包含SEQ ID NO:91，并且CDRH3包含SEQ ID NO:78。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:62，CDRL2包含SEQ ID NO:63，CDRL3包含SEQ ID NO:64，CDRH1包含SEQ ID NO:92，CDRH2包含SEQ ID NO:93，并且CDRH3包含SEQ ID NO:94。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:45，CDRL2包含SEQ ID NO:61，CDRL3包含SEQ ID NO:47，CDRH1包含SEQ ID NO:76，CDRH2包含SEQ ID NO:95，并且CDRH3包含SEQ ID NO:78。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:65，CDRL2包含SEQ ID NO:55，CDRL3包含SEQ ID NO:56，CDRH1包含SEQ ID NO:85，CDRH2包含SEQ ID NO:86，并且CDRH3包含SEQ ID NO:87。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:42，CDRL2包含SEQ ID NO:43，CDRL3包含SEQ ID NO:44，CDRH1包含SEQ ID NO:73，CDRH2包含SEQ ID NO:74，并且CDRH3包含SEQ ID NO:96。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:66，CDRL2包含SEQ ID NO:67，CDRL3包含SEQ ID NO:68，CDRH1包含SEQ ID NO:97，CDRH2包含SEQ ID NO:98，并且CDRH3包含SEQ ID NO:99。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:69，CDRL2包含SEQ ID NO:70，CDRL3包含SEQ ID NO:71，CDRH1包含SEQ ID NO:100，
CDRH2包含SEQ ID NO:101，并且CDRH3包含SEQ ID NO:102。在另一个实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:69，CDRL2包含SEQ ID NO:70，CDRL3包含SEQ ID NO:72，CDRH1包含SEQ ID 
NO:100，CDRH2包含SEQ ID NO:101，并且CDRH3包含SEQ ID NO:102。

[0036] 在任一上述序列定义的实施方案中，分离的抗原结合蛋白可为例如单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人(例如完全人)抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗原结合片段。此外，分离的抗原结合蛋白的抗体片段可为Fab片段和Fab'片段、F(ab')2片
段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。例如，分离的抗原结合蛋白可为人单克隆抗体并且可为例如IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型抗体。此外，分离的抗原结合蛋白可为中和抗原结合蛋白。

[0037] 在任一上述序列定义的实施方案中，分离的抗原结合蛋白可特异性结合人CRLR和人RAMP1，而未特异性结合AM1、AM2或人胰岛淀粉样肽受体(例如，AMY1)，例如，分离的抗原结合蛋白可以KD≤1μM、≤100nM、≤10nM或≤5nM特异性结合人CGRP R，例如正如使用FACS结合测定所测定，和例如使用Rathanaswami等，Biochemical and Biophysical Research Communications 334(2005) 1004-1013中描述的方法所分析。在任一上述序列定义的实施
方案中，相对于人AM1、AM2或AMY1受体，分离的抗原结合蛋白可例如以100或以上、250或以上、500或以上、750或以上、1,000或以上、2,500或以上、5,000或以上或10,000或以上的选择性比率选择性抑制人CGRP R，其中选择性抑制程度可使用任何合适的方法(例如，本文实施例中所述的cAMP测定)来测定。在任一上述序列定义的实施方案中，在CGRP结合竞争性测定，例如放射性标记的125I-CGRP结合竞争性测定(例如本文实施例5中所述的测定)中，分离的抗原结合蛋白可对来自表达人CGRP R的细胞的膜具有≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.5nM或≤0.1nM的Ki。

[0038] 另一组实施方案包括分离的抗原结合蛋白，其包括具有下述共有序列并任选地结合人CGRP R的CDR之一或组合。共有序列源于系统发生相关CDR序列。在一个方面，可将来自各种群的CDR混合并且与任何结合人CGRP R的特定的分离的抗原结合蛋白匹配。在另一个
方面，抗原结合蛋白包含源于抗体克隆的相同系统发生相关群的重链和轻链CDR。示例性
CDR共有序列如下：

[0039] K1共有序列

[0040] CDR1　RASQGIRX1DLG(SEQ ID NO:103)，其中X1选自N和K。

[0041] CDR2　X1ASSLQS(SEQ ID NO:104)，其中X1选自A和G。

[0042] CDR3　LQYNX1X2PWT(SEQ ID NO:105)，其中X1选自I和S，并且X2选自Y和F。

[0043] K4共有序列

[0044] CDR3　QQYGNSLX1R(SEQ ID NO:106)，其中X1选自S和C。

[0045] K1,4共有序列

[0046] CDR1　RASQX1X2X3X4GX5LX6(SEQ ID NO:107)，其中X1选自S和G、X2选自V和I，X3选自S和R，X4选自S、N和K，X5选自Y和D，并且X6选自T和G。

[0047] CDR2　X1ASSX2X3X4(SEQ ID NO:108)，其中X1选自G和A，X2选自R和L，X3选自A和Q，并且X4选自T和S。

[0048] CDR3　X1QYX2X3X4X5X6X7(SEQ ID NO:109)，其中X1选自Q和L，X2选自G和N，X3选自N和T，X4选自S、Y和F，X5选自L和P，X6选自C、W和S，并且X7选自R和T。

[0049] K3共有序列

[0050] CDR1　KSSQSLLHSX1GX2X3YLY(SEQ ID NO:110)，其中X1选自D和A，X2选自R和K，并且X3选自N和T。

[0051] K2,3共有序列

[0052] CDR1　X1SSQSLLHSX2GX3X4YLX5(SEQ ID NO:111)，其中X1选自R和K，X2选自F、D和A，X3选自Y、R和K，X4选自N和T，并且X5选自D和Y。

[0053] CDR2　X1X2SNRX3S(SEQ ID NO:112)，其中X1选自L和E，X2选自G和V，并且X3选自A和F。

[0054] CDR3　MQX1X2X3X4PX5T(SEQ ID NO:113)，其中X1选自A和S，X2选自L和F，X3选自Q和P，X4选自T和L，并且X5选自F和L。

[0055] Lm3共有序列

[0056] CDR2　RX1NQRPS(SEQ ID NO:114)，其中X1选自N和S。

[0057] Lm1,2,3共有序列

[0058] CDR1　SGSSSNIGX1NX2VX3(SEQ ID NO:115)，其中X1选自N和S，X2选自Y和T，并且X3选自S、N和Y。

[0059] CDR2　X1X2NX3RPS(SEQ ID NO:116)，其中X1选自D、T和R，X2选自N和S，并且X3选自K和Q。

[0060] CDR3　X1X2X3DX4X5LX6X7VV(SEQ ID NO:117)，其中X1选自G和A，X2选自T和A，X3选自W和R，X4选自S和D，X5选自R和S，X6选自S和N，并且X7选自A和G。

[0061] LmAll共有序列

[0062] CDR1　X1GX2X3SX4X5X6X7X8X9X10X11(SEQ ID NO:118)，其中X1选自S和Q，X2存在或不存在，并且如果存在，则为S，X3选自S和D，X4存在或不存在，并且如果存在，则为N，X5选自I和L，X6选自G和R，X7选自N和S，X8选自N和F，X9选自Y和T，X10选自V和A，并且X11选自S、N和Y。

[0063] CDR2　X1X2NX3RPS(SEQ ID NO:119)，其中X1选自D、G、T和R，X2选自N、K和S，并且X3选自K、N和Q。

[0064] CDR3　X1X2X3DX4X5X6X7X8X9V(SEQ ID NO:120)，其中X1选自G、N和A，X2选自T、S和A，X3选自W和R，X4选自S和D，X5选自R和S，X6选自L和V，X7选自S、Y和N，X8选自A、H和G，并且X9选自V和L。

[0065] HC1共有序列

[0066] CDR1　X1YYMX2(SEQ ID NO:121)，其中X1选自G和D，X2选自H和Y。

[0067] CDR2　WIX1PNSGGTNYAQKFQG(SEQ ID NO:122)，其中X1选自N和S。

[0068] CDR3　X1X2X3SX4X5X6X7X8GX9X10X11X12YYX13GMDV(SEQ ID NO:123)，其中X1选自D和G，X2选自Q和G，X3选自M和Y，X4选自I和G，X5选自I和Y，X6选自M和A，X7存在或不存在，并且如果存在，则为L，X8存在或不存在，并且如果存在，则为R，X9选自V和L，X10选自F和Y，X11选自P和S，X12选自P和H，并且X13存在或不存在，并且如果存在，则为Y。

[0069] HC2共有序列

[0070] CDR2　RIKSX1TDGGTTDYX2APVKG(SEQ ID NO:124)，其中X1选自K和T，并且X2选自T和A。

[0071] HC3共有序列

[0072] CDR1　X1YX2MX3(SEQ ID NO:125)，其中X1选自T和S，X2选自S和A，并且X3选自N和S。

[0073] CDR2　X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG(SEQ ID NO:126)，其中X1选自S和A，X2选自S和G，X3选自S和G，X4选自S和G，X5选自Y和R，并且X6选自R和T。

[0074] CDR3　X1X2X3X4X5X6X7PYSX8X9WYDYYYGMDV(SEQ ID NO:127)，其中X1选自E和D，X2选自G和Q，X3选自V和R，X4选自S和E，X5选自G和V，X6选自S和G，X7存在或不存在，并且如果存在，则为S，X8选自I和S，并且X9选自S和G。

[0075] HC4共有序列

[0076] CDR1　SX1GMH(SEQ ID NO:128)，其中X1选自F和Y。

[0077] CDR2　VISX1DGSX2KYX3X4DSVKG(SEQ ID NO:129)，其中X1选自F和Y，X2选自I和H，X3选自S和Y，并且X4选自V和A。

[0078] CDR3　X1RX2X3X4X5X6SX7X8YYX9X10X11YYGX12X13V(SEQ ID NO:130)，其中X1选自D和E，X2选自L和K，X3选自N和R，X4选自Y和V，X5选自Y和T，X6选自D和M，X7选自S和T，X8选自G和L，X9选自H和Y，X10存在或不存在，并且如果存在，则为Y，X11选自K和F，X12选自M和L，并且X13选自A和D。

[0079] HCA共有序列

[0080] CDR1　X1X2X3MX4(SEQ ID NO:131)，其中X1选自N和S，X2选自A、Y和F，X3选自W、A和G，并且X4选自S和H。

[0081] CDR2　X1IX2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X12X13X14VKG(SEQ ID NO:132)，其中X1选自R、A和V，X2选自K、S和W，X3选自S、G、F和Y，X4存在或不存在，并且如果存在，则选自K和T，X5存在或不存在，并且如果存在，则为T，X6选自D和S，X7选自G和S，X8选自T、R、I、N和H，X9选自T和K，X10选自D和Y，X11选自Y和S，X12选自T、A和V，X13选自A和D，并且X14选自P和S。

[0082] CDR3　X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17GX18X19V(SEQ ID NO:133)，其中X1选自D、A和E，X2选自R、Q和G，X3选自T、R、L、G和K，X4选自G、E、N、I和R，X5选自Y、V和A，X6选自S、G、Y、A和T，X7选自I、P、D、A和M，X8存在或不存在，并且如果存在，则选自S和Y，X9存在或不存在，并且如果存在，则选自W、S和T，X10选自S、G和L，X11选自S、G、L和Y，X12存在或不存在，并且如果存在，则选自W和Y，X13选自Y和H，X14存在或不存在，并且如果存在，则选自Y和D，X15选自Y、K和F，X16存在或不存在，并且如果存在，则为Y，X17存在或不存在，并且如果存在，则为Y，X18选自M和L，并且X19选自D和A。

[0083] HCB共有序列

[0084] CDR1　X1X2X3X4X5(SEQ ID NO:134)，其中X1选自N、G、D、S和A，X2选自A、F和Y，X3选自W、Y、A和G，X4选自M和L，并且X5选自S和H。

[0085] CDR2　X1IX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17G(SEQ ID NO:135)，其中X1选自R、W、A、V、S和F，X2选自K、N、S、W和R，X3选自S、P、G、F和Y，X4存在或不存在，并且如果存在，则选自K、T和R，X5存在或不存在，并且如果存在，则选自T和A，X6选自D、N、H、S和Y，X7选自G和S，X8选自G和S，X9选自T、G、R、I、N、H和Y，X10选自T、K、R和P，X11选自D、N、Y和E，X12选自Y和S，X13选自T、A和V，X14选自A、Q和D，X15选自P、K和S，X16选自V和F，并且X17选自K和Q。

[0086] CDR3　X1X2X3X4X5SX6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16GX17X18V(SEQ ID NO:136)，其中X1选自D、G、A和E，X2选自R、G和Q，X3选自T、M、Y、R、L、G和K，X4选自G、S、E、N、I和R，X5选自Y、I、G、V和A，X6选自S、I、Y、G、A和T，X7选自I、M、A、P和D，X8存在或不存在，并且如果存在，则选自S、L和Y，X9存在或不存在，并且如果存在，则选自W、R、S和T，X10选自S、G和L，X11选自S、V、L、G和Y，X12存在或不存在，并且如果存在，则选自F、Y和W，X13选自Y、P、S和H，X14存在或不存在，并且如果存在，则选自Y、P、D和H，X15选自Y、K和F，X16存在或不存在，并且如果存在，则为Y，X17存在或不存在，并且如果存在，则为Y，并且X18选自M和L。

[0087] 在任一上述共有序列定义的实施方案中，分离的抗原结合蛋白可为例如AVIMER多肽、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人(例如完全)抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗原结合片段。此外，分离的抗原结合蛋白的抗体片段可为Fab片段和Fab'片
段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。例如，分离的抗原结合蛋白可为人单克隆抗体并且可为例如IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型抗体。此外，分离的抗原结合蛋白可为中和抗原结合蛋白。

[0088] 在任一上述共有序列定义的实施方案中，分离的抗原结合蛋白可特异性结合人CRLR和人RAMP1，而未特异性结合AM1、AM2或人胰岛淀粉样肽受体(例如，AMY1)，例如，分离的抗原结合蛋白可以KD≤1μM、≤100nM、≤10nM或≤5nM特异性结合人CGRP R，例如，正如使用FACS结合测定所测定，和例如使用Rathanaswami等，Biochemical and Biophysical 
Research Communications 334(2005) 1004–1013中描述的方法所分析。在任一上述共有
序列定义的实施方案中，相对于人AM1、AM2或AMY1受体，分离的抗原结合蛋白可选择性地抑制人CGRP R，例如选择性比率为100或以上、250或以上、500或以上、750或以上、1,000或以上、2,500或以上、5,000或以上或10,000或以上，其中选择性抑制的程度可使用任何合适的方法(例如本文实施例中所述的cAMP测定)来测定。在任一上述共有序列定义的实施方案
中，在CGRP结合竞争性测定，例如放射性标记的125I-CGRP结合竞争性测定(例如本文实施例
5中所述的测定)中，分离的抗原结合蛋白可对来自表达人CGRP R的细胞的膜具有≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.5nM或≤0.1nM的Ki。

[0089] 一些所述分离的抗原结合蛋白包含与选自SEQ ID NO:158-170的氨基酸序列具有至少80%、85%和90%或95%序列同一性的重链可变区(VH)序列。一些所述分离的抗原结合蛋
白包含与选自SEQ ID NO:137-153的氨基酸序列具有至少80%、85%和90%或95%序列同一性
的轻链可变区(VL)序列。一些所述分离的抗原结合蛋白包含与选自SEQ ID NO:158-170的
氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%序列同一性的VH序列，和与选自SEQ ID NO:137-
153的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%序列同一性的VL。在一些实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(A)重链可变区(VH)，其包含的序列(i)选自SEQ ID NO:158-170或(ii)
如(i)所定义并含有一个或多个(例如，五、十、十五或二十个)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入；(B) VL，其包含的序列(iii)选自SEQ ID NO:137-153或(iv)如(iii)所定义并包含一个或多个(例如，五、十、十五或二十个)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入；或(C)(A)的VH和(B)的VL。在一些实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含含有选自SEQ ID NO:158-170的序列的重链可变区(VH)和含有选自SEQ ID NO:137-153的序
列的VL。

[0090] 在一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:158；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序
列；和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VH，其包含选自下列的氨基酸序
列：(i) SEQ ID NO:159；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VH，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:160；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所定义
并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VH，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:161；
(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含多达
十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VH，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:162；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取
代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VH，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:163；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VH，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:164；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%
同一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VH，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:165；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；
和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的
序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VH，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i) SEQ ID NO:166；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如
(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VH，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:167；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案
中，分离的抗原结合蛋白包含VH，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:168；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含多达十个
氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VH，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:169；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代
(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VH，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:170；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。

[0091] 在一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:137；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序
列；和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VL，其包含选自下列的氨基酸序
列：(i) SEQ ID NO:138；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VL，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:139；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所定义
并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VL，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:140；
(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含多达
十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VL，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:141；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取
代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VL，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:142；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VL，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:143；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%
同一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VL，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:144；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；
和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的
序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VL，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i) SEQ ID NO:145；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如
(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VL，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:146；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案
中，分离的抗原结合蛋白包含VL，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:147；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含多达十个
氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VL，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:148；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代
(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VL，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:149；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VL，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:150；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同
一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VL，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:151；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序
列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VL，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:152；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所
定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含VL，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:
153；(ii)与(i)定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列；和(iii)如(i)所定义并包含
多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。

[0092] 在任一上述VL和VH序列定义的实施方案中，分离的抗原结合蛋白可为例如单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人(例如完全)抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗原结合片段。此外，分离的抗原结合蛋白的抗体片段可为Fab片段和Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。例如，分离的抗原结合蛋白可为人单克隆抗体，并且可为例如IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型抗体。此外，分离的抗原结合蛋白可为中和抗原结合蛋白。

[0093] 在任一上述VL和VH序列定义的实施方案中，分离的抗原结合蛋白可特异性结合人CRLR和人RAMP1，而非特异性结合AM1、AM2或人胰岛淀粉样肽受体(例如，AMY1)，例如，分离的抗原结合蛋白可以KD≤1μM、≤100nM、≤10nM或≤5nM特异性结合人CGRP R，例如正如使用FACS结合测定所测定，和例如使用Rathanaswami等，Biochemical and Biophysical 
Research Communications 334(2005) 1004-1013中描述的方法所分析。在任一上述VL和VH序列定义的实施方案中，相对于人AM1、AM2或AMY1受体，分离的抗原结合蛋白可例如以100或以上、250或以上、500或以上、750或以上、1,000或以上、2,500或以上、5,000或以上或10,
000或以上的选择性比率选择性地抑制人CGRP R，其中选择性抑制程度可使用任何合适的
方法(例如，使用本文实施例中所述的cAMP测定)来测定。在任一上述VL和VH序列定义的实施方案中，在CGRP结合竞争性测定，例如放射性标记的125I-CGRP结合竞争性测定(例如本文实施例5中所述的测定)中，分离的抗原结合蛋白可对来自表达人CGRP R的细胞的膜具有≤
100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.5nM或≤0.1nM的Ki。

[0094] 在一个方面，分离的抗原结合蛋白包含与选自SEQ ID NO:29-41的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%序列同一性的重链序列。一些所述分离的抗原结合蛋白包含与选自SEQ ID NO:12-28的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%序列同一性的轻链序列。一些分离的抗原结合蛋白包含与选自SEQ ID NO:29-41的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%
或95%序列同一性的重链序列，和与选自SEQ ID NO:12-28的氨基酸序列具有至少80%、85%、
90%或95%序列同一性的轻链序列。在一些实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(A)重链，其包含的序列(i)选自SEQ ID NO:29-41或(ii)如(i)所定义并含有一个或多个(例如，五、
十、十五或二十个)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入；(B)轻链，其包含的序列(iii)选自SEQ ID NO:12-28或(iv)如(iii)所定义并包含一个或多个(例如，五、十、十五或二十个)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入；或(C)(A)的重链和(B)的轻
链。在一些实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含含有选自SEQ ID NO:29-41的序列的重链和含有选自SEQ ID NO:12-28的序列的轻链。

[0095] 在一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(A)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:29、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和
(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序
列；和(B)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:12、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例
如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。

[0096] 在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(A)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:30、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和
(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序
列；和(B)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:13、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和(iii)如(i)所定义并包含最多十个氨基酸取代(例
如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。

[0097] 在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(A)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:31、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和
(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序
列；和(B)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:14、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例
如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。

[0098] 在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(A)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:32、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和
(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序
列；和(B)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:15、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例
如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。

[0099] 在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(A)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:33、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和
(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序
列；和(B)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:16、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例
如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。

[0100] 在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(A)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:29、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和
(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序
列；和(B)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:17、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例
如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。

[0101] 在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(A)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:34、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和
(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序
列；和(B)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:18、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例
如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。

[0102] 在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(A)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:33、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和
(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序
列；和(B)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:19、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性性的序列和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例
如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。

[0103] 在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(A)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:29、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和
(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序
列；和(B)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:20、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例
如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。

[0104] 在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(A)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:35、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和
(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序
列；和(B)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:21、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例
如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。

[0105] 在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(A)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:36、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和
(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序
列；和(B)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:22、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例
如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。

[0106] 在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(A)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:37、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和
(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序
列；和(B)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:23、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例
如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。

[0107] 在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(A)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:38、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和
(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序
列；和(B)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:23、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例
如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。

[0108] 在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(A)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:33、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和
(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序
列；和(B)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:24、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例
如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。

[0109] 在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(A)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:39、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和
(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序
列；和(B)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:25、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例
如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。

[0110] 在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(A)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:40、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和
(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序
列；和(B)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:26、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例
如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。

[0111] 在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(A)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:41、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和
(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序
列；和(B)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:27、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例
如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。

[0112] 在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含(A)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:41、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和
(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序
列；和(B)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO:28、(ii)与(i)所定义的序列具有至少90%或95%同一性的序列和(iii)如(i)所定义并包含多达十个氨基酸取代(例
如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的序列。

[0113] 在任一上述轻链和重链序列定义的实施方案中，分离的抗原结合蛋白可包含指定的重链和/或轻链序列，但具有不同的信号肽或无信号肽。在任一上述轻链和重链序列定义的实施方案中，分离的抗原结合蛋白可为例如单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人(例如完全人)抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗原结合片段。此外，分离的抗原结合蛋白的抗体片段可为Fab片段和Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。例如，分离的抗原结合蛋白可为人单克隆抗体，并且可为例如IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型抗体。此外，分离的抗原结合蛋白可为中和抗原结合蛋白。

[0114] 在任一上述轻链和重链序列定义的实施方案中，分离的抗原结合蛋白可特异性结合人CRLR和人RAMP1，而非特异性结合AM1、AM2或人胰岛淀粉样肽受体(例如，AMY1)，例如，分离的抗原结合蛋白可以KD≤1μM、≤100nM、≤10nM或≤5nM特异性结合人CGRP R，例如，正如使用FACS结合测定所测定，和例如使用Rathanaswami等，Biochemical and Biophysical Research Communications 334(2005) 1004-1013中描述的方法所分析。在任一上述轻链
和重链序列定义的实施方案中，相对于人AM1、AM2或AMY1受体，分离的抗原结合蛋白可例如以100或以上、250或以上、500或以上、750或以上、1,000或以上、2,500或以上、5,000或以上或10,000或以上的选择性比率选择性抑制人CGRP R，其中选择性抑制程度可使用任何合适
的方法(例如，本文实施例中所述的cAMP测定)来测定。在任一上述轻链和重链序列定义的
实施方案中，在CGRP结合竞争性测定，例如放射性标记的125I-CGRP结合竞争性测定(例如，本文实施例5中所述的测定)中，分离的抗原结合蛋白可对来自表达人CGRP R的细胞的膜具
有≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.5nM或≤0.1nM的Ki。

[0115] 在另一个方面，还提供了对任一种上文所概述的CGRP R 抗原结合蛋白进行编码的分离的核酸多核苷酸。在一个实施方案中，分离的多核苷酸包含选自下列的序列：SEQ ID NO:175、176、178、179、180、181、182、183、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、
197、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209和210。在另一个实施方案中，分离的多核苷酸包含选自SEQ ID NO:224-258的序列。在另一个实施方案中，分离的多核苷酸包含能够在严格杂交条件下与选自SEQ ID NO:224-258的序列进行杂交的序列。在另一个实施方
案中，分离的多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:224-258的序列具有约80%、85%、90%或95%或以上同一性的序列。在某些情况下，分离的核酸分子可操作地连接至控制序列。在相关实施方案中，分离的多核苷酸并入表达载体中。

[0116] 还包括经表达载体转化的细胞系，所述表达载体包含如上所述的分离的多核苷酸。在一个相关方面，还提供了表达载体和经其转化或转染的宿主细胞，所述表达载体包含上述分离的核酸分子，这些核酸分子编码上述CGRP R抗原结合蛋白。

[0117] 在另一个方面，还提供了一种制备抗原结合蛋白的方法，其包括由分泌抗原结合蛋白的宿主细胞制备抗原结合蛋白的步骤。在一些实施方案中，使用包含可溶性CGRP受体
的免疫原产生抗原结合蛋白。在一些实施方案中，通过共表达和纯化人CRLR的N末端胞外域(ECD)和人RAMP1的ECD(例如，含有SEQ ID NO:6的人CRLR的ECD和含有SEQ ID NO:8的RAMP1
的ECD)来获得此类可溶性CGRP受体，例如，如本文实施例1和2中所述。

[0118] 在另一个方面，提供一种药物组合物，其包含至少一种上文概述的抗原结合蛋白和药学上可接受的赋形剂。在一个实施方案中，药物组合物可包含选自放射性同位素、放射性核素、毒素或治疗剂和化学治疗剂组的附加活性剂。

[0119] 在一个方面，分离的抗原结合蛋白在施用至患者时可有效抑制血管舒张和/或减少神经源性炎症。在一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白可有效降低头痛(例如，偏头痛)的频率和/或严重程度。例如，抗原结合蛋白可用作偏头痛的急性治疗，和/或用作预防性治疗，以预防或降低与偏头痛发作相关的症状(尤其为疼痛症状)的频率和/或严重程度。

[0120] 其它方面还提供了治疗或预防与患者CGRP R相关的病症的方法，其包括向患者施用有效量的至少一种上文概述的分离的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，病症为头痛，例如，偏头痛或丛集性头痛或另一种类型的疼痛(例如，慢性疼痛)；在另一个实施方案中，其为糖尿病(II型)；在另一个实施方案中，其为炎症，尤其为神经源性炎症；在另一个实施方案中，其为心血管病症；在另一个实施方案中，其为与内毒素血症和败血症相关的血液动力学紊乱；在另一个实施方案中，其为血管舒张。

[0121] 在另一个方面，还提供了一种在患者中抑制CGRP与人CGRP R(例如，CGRP R的细胞外部分)结合的方法，其包括施用有效量的至少一种本文所提供和/或上文概述的抗原结合
蛋白。

[0122] 本文将对这些方面和其它方面进行更为详细的描述。所提供的各方面可涵盖本文所提供的各个实施方案。因此预期所述的各方面可包括涉及一种要素或要素组合的实施方
案，并且明确考虑了上述方面和实施方案的所有此类组合。本发明的其它特征、目的和优点在以下详细描述中显而易见。

附图说明

[0123] 图1示出人、食蟹猴和大鼠的RAMP-1序列比对。

[0124] 图2示出人、食蟹猴和大鼠的CRLR序列比对。

[0125] 图3A和3B示出具有κ轻链的指定抗CGRP受体抗体克隆的轻链CDR和某些相应共有序列的基于系统发生的序列比对。

[0126] 图4示出具有λ轻链的指定抗CGRP受体抗体克隆的轻链CDR和某些相应共有序列的基于系统发生的序列比对。

[0127] 图5A、5B、5C、5D和5E示出指定抗CGRP受体抗体克隆的重链CDR和某些相应共有序列的基于系统发生的序列比对。

[0128] 图5F示出本文所公开的示例性抗CGRP受体抗体重链CDR的共有序列。

[0129] 图6为两次实验的数据图，其示出通过1092抗CGRP R杂交瘤上清液(菱形)和68阴性对照上清液(方形)对标记的配体结合CGRP R的抑制百分比。

[0130] 图7A-D示出三种指定抗CGRP R mAb对表达hCGRP受体(图7A)、hAM1(图7B)、hAM2(图7C)和人胰岛淀粉样肽受体(图7D)的细胞的示例性cAMP测定IC50数据。

[0131] 图8示出125I-CGRP结合数据的实例，其例如可用于测定mAb对人CGRP受体的Ki。

[0132] 图9A-D示出本文所公开的选定抗体的Biacore竞争性数据。

[0133] 图10示出mAb 12G8的FACS Kd测定。

[0134] 图11示出食蟹猴、人、人嵌合体、大鼠和恒河猴RAMP1序列的比对。

[0135] 图12A-B示出人、食蟹猴、恒河猴、大鼠、人嵌合体和共有CRLR序列的比对。

[0136] 图13A-13C示出不同嵌合CGRP受体与抗CGRP R抗体结合的代表性FACS数据。

[0137] 图14示出由单独CGRP R的AspN消化(色谱图A)和由包含CGRP R 单克隆抗体12G8的对照样本的消化(色谱图B)获得的肽图。

[0138] 图15示出在存在不同浓度的CGRP R中和抗体的情况下CGRP R的AspN消化。

[0139] 图16示出在存在不同浓度的CGRP R中和抗体、4E4的情况下CGRP R的AspN消化。

[0140] 图17示出在抗体32H7的存在下表达各种受体组分的细胞的免疫组化学染色强度。

[0141] 发明详述

[0142] 本文中所用的章节标题仅用于组织目的且不应理解为对所述主题进行限制。

[0143] 除非本文中另有定义，所使用的和本申请有关的科学和技术术语应具有本领域的普通技术人员通常所理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。

[0144] 一般而言，所使用的与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质和核酸化学以及杂交有关的命名法和上述这些的技术是本领域所熟知和常用的那些。除非另外指明，本申请的方法和技术一般根据常规方法来进行，这些常规方法为本领域所熟知并且本说明书中通篇所引用并论述的各种一般以及更具体的参考文献
中有所描述。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992)和
Harlow和Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory 
Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)，这些文献以引用的方式并入本文。如本领域中通常所实现或如本文所述，根据制造商说明书来进行酶促反应和纯化技术。所使用的与本文
所述的分析化学、合成有机化学和医学及药物化学有关的术语以及上述这些的实验室程序
和技术是本领域中所熟知和常用的那些。标准技术可用于化学合成、化学分析、医药制备、配制和递送以及患者治疗。

[0145] 应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，并且可发生变化。本文中所使用的术语仅用于描述特定实施方案，并未旨在限制仅由权利要求所限定的本发
明范围。

[0146] 除在操作实施例或其它地方另外指明外，本文中用于表示成分含量或反应条件的所有数字在所有情况下均应视为由术语“约”修饰。术语“约”在结合百分比使用时是指±
1%。

[0147] 定义

[0148] 术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链和双链核苷酸聚合物。构成多核苷酸的核苷酸可为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一种类型的核苷酸的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰，诸如溴尿核苷和肌苷衍生物；核糖修饰，诸如2’,3’-二脱氧核糖；和核苷酸间键合修饰，诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯
(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)和磷酰胺酯
(phosphoroamidate)。

[0149] 术语“寡核苷酸”是指包含200个或200个以下核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为10至60个碱基。在其它实施方案中，寡核苷酸的长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个核苷酸。寡核苷酸可为例如用于构建突变基因的单链或双链寡核苷酸。寡核苷酸可为正义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可包括用于检测测定的标记，包括放射标记、荧光标记、半抗原或抗原标记。寡核苷酸可用作例如PCR引物、克隆引物或杂交探针。

[0150] “分离的核酸分子”是指基因组DNA或RNA、mRNA，cDNA或合成来源的基因组DNA或RNA、mRNA，cDNA，或其一些组合，其不与其中分离的多核苷酸存在于自然界中的多核苷酸的全部或一部分缔合，或与自然界中不与其连接的多核苷酸连接。为了本公开的目的，应理解“包含特定核苷酸序列的核酸分子”不涵盖完整染色体。“包含”指定核酸序列的分离的核酸分子除了指定序列外还可包括多达十个或甚至多达二十个其它蛋白质或其部分的编码序
列，或可包括可操作地连接的调节序列，其控制所述核酸序列的编码区的表达，和/或可包括载体序列。

[0151] 除非另有规定，否则本文讨论的任何单链多核苷酸序列的左手端为5’端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5’方向。新生RNA转录物的5'至3'添加方向称为转录方向；DNA链上与RNA转录物(RNA转录物的5'至5'端)具有相同序列的序列区域称为“上游序列”；DNA链上与RNA转录物(RNA转录物的3'至3'端)具有相同序列的序列区域称为“下游序列”。

[0152] 术语“控制序列”是指多核苷酸序列，其可影响与其连接的编码序列的表达和加工。此类控制序列的性质取决于宿主生物体。在特定实施方案中，原核生物的控制序列可包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。例如，真核生物的控制序列可包括启动子，这些启动子包含转录因子、转录增强子序列和转录终止序列的一个或多个识别位点。“控制序列”可包括前导序列和/或融合伴侣序列。

[0153] 术语“载体”是指用于将蛋白编码信息转移到宿主细胞中的分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。

[0154] 术语“表达载体”或“表达构建体”是指适于宿主细胞转化并包含核酸序列的载体，所述核酸序列引导和/或控制(与宿主细胞一起)与其可操作地连接的一个或多个异源编码区的表达。表达构建体可包括但不限于影响或控制转录、翻译且当存在内含子时影响与其
可操作地连接的编码区的RNA剪接的序列。

[0155] 如本文所用，“可操作地连接”是指所述术语应用于其的组分具有使得其在合适条件下可实现其固有功能的关系。例如，载体中“可操作地连接”至蛋白编码序列的控制序列是以在与控制序列的转录活性相容的条件下实现蛋白编码序列的表达的方式与其连接。

[0156] 术语“宿主细胞”是指已经或能够经核酸序列转化并从而表达目标基因的细胞。该术语包括亲本细胞的子代，无论子代在形态方面或在基因组成方面是否与原始亲本细胞一致，只要存在目标基因即可。

[0157] 术语“转导”是指通常通过噬菌体使基因从一个细菌转移至另一者中。“转导”还指通过复制缺陷反转录病毒而获得并转移真核细胞序列。

[0158] 术语“转染”是指细胞吸收外来或外源DNA，并且当外源DNA已引入细胞膜内时，该细胞已被“转染”。许多转染技术为本领域所熟知且公开于本文中。参见例如Graham等，1973，Virology52:456；Sambrook等，2001，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，见上文；Davis等，1986，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier；Chu等，1981，Gene13:197。此类技术可用于将一个或多个外源DNA部分引入合适的宿主细胞中。

[0159] 术语“转化”是指细胞遗传特征的改变，并且当细胞已经过修饰而包含新DNA或RNA时，该细胞已被转化。例如，当细胞经由转染、转导或其它技术引入新遗传物质而自其天然状态经基因改造时，该细胞已经被转化。转染或转导后，转化DNA可通过实体整合到细胞的染色体中而与细胞DNA重组，或可短暂地保持为游离型元件而不复制，或可以质粒形式独立复制。当转化DNA随细胞分裂而复制时，认为该细胞已被“稳定转化”。

[0160] 术语“多肽”或“蛋白质”在本文中互换使用来指氨基酸残基的聚合物。这些术语还适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应天然存在的氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物，并且适用于天然存在的氨基酸聚合物。这些术语还可涵盖经修饰(例如，添加碳水化合物残基以形成糖蛋白，或经磷酸化)的氨基酸聚合物。多肽和蛋白质可通过天然存在和非重组的细胞产生；或其可经遗传工程或重组细胞产生，并包含具有天然蛋白质的氨基酸
序列的分子或具有原生序列的一个或多个氨基酸缺失、添加和/或取代的分子。术语“多肽”和“蛋白质”具体涵盖抗原结合蛋白，例如，CGRP R抗原结合蛋白、CGRP R结合蛋白、抗体或具有抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸缺失、添加、和/或取代的序列。术语“多肽片段”是指与全长蛋白质相比，具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。相比全长蛋白质，此类片段还可包含修饰的氨基酸。在某些实施方案中，片段的长度为约5至500个氨基酸。例如，片段的长度为至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、
400或450个氨基酸。有用的多肽片段包括抗体的免疫功能片段，包括结合域。就CGRP R结合抗体而言，有用的片段包括但不限于CDR区、重链或轻链可变域、抗体链的一部分或仅其可变域(包括两个CDR)等。将“CGRP受体”或“CGRP R”理解为包含RAMP1和CRLR。

[0161] 术语“分离的蛋白质”(例如，分离的抗原结合蛋白)、“分离的多肽”或“分离的抗体”是指本发明的蛋白质、多肽或抗体(1)不含在正常情况下存在的至少一些其它蛋白质；(2)基本上不含相同来源(例如，相同物种)的其它蛋白质；(3)可通过不同物种的细胞表达；
(4)已与在自然界中与其缔合的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其它物质的至少约50%分离；
(5)与在自然界中与其未缔合的多肽可操作地缔合(通过共价或非共价相互作用)；或(6)不
存在于自然界中。通常，“分离的蛋白质”、“分离的多肽”或“分离的抗体”构成给定样本的至少约5%、至少约10%、至少约25%或至少约50%。基因组DNA，cDNA、mRNA或其它RNA、合成来源的基因组DNA，CDNA、mRNA或其它RNA或其任何组合可编码此类分离的蛋白质。优选地，分离的蛋白质多肽或抗体基本上不含其自然环境中存在的干扰其治疗、诊断、预防、研究或其它用途的其它蛋白质或其它多肽或其它污染物。

[0162] 多肽(例如，抗原结合蛋白或抗体)的“变体”包含这样的氨基酸序列，其中相对于另一多肽序列，该氨基酸序列中已插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基。变体包括融合蛋白。

[0163] 多肽的“衍生物”为以不同于插入、缺失或取代变体的一些方式(例如，经由与另一化学部分缀合)经化学修饰的多肽(例如，抗原结合蛋白或抗体)。

[0164] 本说明书中通篇使用的关于生物物质(诸如多肽、核酸、宿主细胞等)的术语“天然存在的”是指存在于自然界中的物质。

[0165] 如本文所用，“抗原结合蛋白”是指特异性结合指定靶抗原(诸如CGRP R，尤其是灵长类动物例如人CGRP R)的蛋白质。CGRP R抗原结合蛋白特异性结合人CGRP受体。

[0166] 当解离常数(KD)≤10-6M时，称抗原结合蛋白“特异性结合”其标靶。当KD≤1×10-8M时，抗体以“高亲和力”特异性结合靶抗原。在一个实施方案中，抗体以KD≤5×10-7结合CGRP R或人CGRP R；在另一个实施方案中，抗体以KD≤1×10-7结合；在另一个实施方案中，抗体以KD≤5×10-8结合；在另一个实施方案中，抗体以KD≤1×10-8结合；在另一个实施方案中，抗体以KD≤5×10-9结合；在另一个实施方案中，抗体以KD≤1×10-9结合；在另一个实施方案-10 -10
中，抗体以KD≤5×10 结合；在另一个实施方案中，抗体以KD≤1×10 结合。

[0167] 当抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白在特异性受体的抑制分析中的IC50比在另一种“参考”受体的抑制分析中的IC50小至少50倍时，该抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白相对于其它受体“选择性抑制”特异性受体。“选择性比率”为参考受体的IC50除以特异性受体的IC50。如果抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白在cAMP测定(例如，本文实施例4所述的cAMP抑制测定)中的IC50比该抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白在人AM1、
AM2或胰岛淀粉样肽受体(例如，AMY1)的抑制分析中的IC50小至少50倍，则该抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白选择性抑制人CGRP受体。通过非限制性的实施例，如果特异性抗
CGRP R抗体在hCGRP R的cAMP测定中的IC50为例如介于0.1nM和20nM之间，并且该抗体在
hAM1、hAM2或人AMY1受体的cAMP测定中的IC50为1000nM或以上，则该抗体选择性抑制hCGRP受体。还应理解，选择性抑制特异性受体的抗原结合蛋白相对于该受体而言是中和抗原结
合蛋白。

[0168] “抗原结合区”是指特异性结合指定抗原的蛋白质或蛋白质的一部分。例如，包含与抗原相互作用并赋予抗原结合蛋白针对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的抗原结合蛋白的部分称为“抗原结合区”。抗原结合区通常包括一个或多个“互补结合区”(“CDR”)。
某些抗原结合区还包括一个或多个“构架”区。“CDR”为有助于抗原结合特异性和亲和力的氨基酸序列。“构架”区可有助于保持CDR的适当构象，以促进抗原结合区和抗原之间的结合。

[0169] 在某些方面，提供了结合CGRP R蛋白或人CGRP R的重组抗原结合蛋白。在上下文中，“重组蛋白”为使用重组技术(即，通过本文所述的重组核酸的表达)制备的蛋白质。制备重组蛋白的方法和技术在本领域中是熟知的。

[0170] 术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白或其抗原结合片段，其可与全抗体竞争与靶抗原的特异性结合，并包括例如嵌合、人源化、完全人和双特异性抗体。像这样的“抗体”为一种抗原结合蛋白。全抗体通常包括至少两条全长重链和两条全长轻链，但在一些情况中可包括更少的链，诸如天然存在于骆驼中且仅包括重链的抗体。抗体可仅来源于单一来源或可为“嵌合的”，即，抗体的不同部分可源于两种不同的抗体(如下文进一步描述)。可通过重组DNA技术或通过全抗体的酶促或化学裂解，在杂交瘤中产生抗原结合蛋白、抗体或结合片段。除非另外指明，术语“抗体”除了包括包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体外，还包括其衍生物、变体、片段和突变体，其实例在下文中进行描述。

[0171] 术语“轻链”包括具有足够可变区序列以赋予结合特异性的全长轻链及其片段。全长轻链包括可变区域VL和恒定区域CL。轻链的可变区域位于多肽的氨基末端。轻链包括κ链和λ链。

[0172] 术语“重链”包括具有足够可变区序列以赋予结合特异性的全长重链及其片段。全长重链包括可变区域VH和三个恒定区域CH1、CH2和CH3。VH域位于多肽的氨基末端，并且CH域位于羧基末端，其中CH3最接近多肽的羧基末端。重链可为任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。

[0173] 术语“信号序列”、“前导序列”或“信号肽”是指引导蛋白质转运的短(长度为3-60个氨基酸)肽链。信号肽也可称为导向信号、信号序列、转运肽或定位信号。一些信号肽在蛋白质转运后通过信号肽酶从蛋白质裂解，使得蛋白质的生物活性形式(例如，本文所述的抗原结合蛋白)为裂解的较短形式。因此，应理解，在抗体的特征为重链和/或轻链具有经鉴别的特定序列的情况下，诸如“包含重链…的抗体”、“包含轻链…的抗体”等的术语包括具有经鉴别的特定序列的抗体、具有经鉴别的特定序列但信号序列被不同信号序列置换的抗体，以及具有鉴别序列但无任何信号序列的抗体。

[0174] 如本文所用，术语抗体或免疫球蛋白链(重链或轻链)的“抗原结合片段”(或简称“片段”)包括缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但能够特异性结合抗原的抗体的一部分(无论该部分以何种方式获得或合成)。此类片段具有生物活性，因为其特异性结合靶抗
原，并且可与其它抗原结合蛋白(包括全抗体)竞争与给定表位的特异性结合。在一个方面，此类片段保留至少一个存在于全长轻链或重链中的CDR，并在一些实施方案中包含单个重
链和/或轻链或其一部分。这些生物活性片段可通过重组DNA技术产生，或可通过抗原结合
蛋白(包括全抗体)的酶促或化学裂解来产生。免疫功能性免疫球蛋白片段包括但不限于
Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、域抗体和单链抗体，并可来源于任何哺乳动物来源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、骆驼或兔子。还认为，本文所公开的抗原结合蛋白的功能部分(例如，一个或多个CDR)可与第二种蛋白质或与小分子共价结合，以形成针对体内特定靶标的治疗剂，从
而具有双功能治疗特性或具有延长的血清半衰期。

[0175] “Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1和可变区构成。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。

[0176] “Fc”区包含含有抗体CH1和CH2域的两个重链片段。这两个重链片段通过两个或两个以上的二硫键并通过CH3域的疏水性相互作用结合在一起。

[0177] “Fab'片段”包含一条轻链和含有VH域和CH1域的一条重链的一部分，以及介于CH1域和CH2域之间的区，使得可在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键，从而形成F(ab')2分子。

[0178] “F(ab')2片段”包含两条轻链和两条重链，这两条重链包含CH1域和CH2域之间的恒定区的一部分，使得两条重链之间可形成链间二硫键。因此，F(ab')2片段由两个Fab'片段构成，这两个Fab'片段通过两条重链之间的二硫键结合在一起。

[0179] “Fv区”包括来自重链和轻链的可变区，但缺乏恒定区。

[0180] “单链抗体”为Fv分子，其中重链可变区和轻链可变区已通过柔性连接子相连而形成单条多肽链，从而形成抗原结合区。单链抗体详细描述于国际专利申请公开No.WO 88/01649和美国专利No. 4,946,778和No. 5,260,203中，这些专利的公开内容以引用的方式
并入本文。

[0181] “域抗体”为仅包含重链可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或两个以上的VH区可经由肽连接子共价结合，从而形成二价域抗体。二价域抗体的两个VH区可靶向相同或不同的抗原。

[0182] “二价抗原结合蛋白”或“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在某些情况下，两个结合位点具有相同的抗原特异性。二价抗原结合蛋白和二价抗体可为双特异性(见下文)。

[0183] “多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”靶向不止一个抗原或表位。

[0184] “双特异性”、“双重特异性”或“双功能”抗原结合蛋白或抗体分别为具有两个不同抗原结合位点的杂交抗原结合蛋白或抗体。双特异性抗原结合蛋白和抗体为一种多特异性抗原结合蛋白或多特异性抗体，并且可通过多种方法(包括但不限于杂交瘤的融合或Fab'
片段的连接)制备。参见例如Songsivilai和Lachmann，1990，Clin. Exp. Immunol.79:315-
321；Kostelny等，1992，J. Immunol.148:1547-1553。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点会结合可驻留在相同或不同蛋白质标靶上的两个不同表位。

[0185] 术语“中和抗原结合蛋白”或“中和抗体”分别是指结合配体，防止配体与其结合配偶体结合并中断生物应答(否则配体与其结合配偶体的结合会引起生物应答)的抗原结合蛋白或抗体。在评估抗原结合蛋白(例如，抗体或其免疫功能性抗原结合片段)的结合和特
异性时，当过量抗体使与配体结合的结合配偶体的量减少至少约20%、30%、40%、50%、60%、
70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或以上(如在体外竞争结合测定中所测量)时，抗体或片段将基本上抑制配体与其结合配偶体的结合。就CGRP R结合蛋白而言，此类中和分子将减弱
CGRP R与CGRP结合的能力。

[0186] 当在可结合靶抗原上相同区的抗原结合蛋白的情况下使用时，术语“竞争”是指抗原结合蛋白之间的竞争，可通过一种测定来测定，在该测定中，经测试的抗原结合蛋白(例如，抗体或其免疫功能性抗原结合片段)防止或抑制参考抗原结合蛋白(例如，配体或参考抗体)与共同抗原(例如，CGRP R或其抗原结合片段)的特异性结合。可使用许多竞争性结合测定中的任一种，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等，1983，Methods in Enzymology9:242-253)、固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Kirkland等，1986，J. Immunol.137:3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，A 
Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press)；采用I-125标记的固相直接标记RIA(参见例如Morel等，1988，Molec. Immunol.25:7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Cheung等，1990，Virology176:546-552)和直接标记RIA(Moldenhauer等，1990，Scand. J. Immunol.32:77-82)。此类测定可涉及使用与固体表面或细胞结合的纯化抗原，所述固体表面或细胞载有未标记的测试抗原结合蛋白和标记的参考抗原结合蛋白中的任何一种。可通
过在测试抗原结合蛋白存在下测定与固体表面或细胞结合的标记的量来测量竞争性抑制。
通过竞争性测定鉴别的抗原结合蛋白(竞争性抗原结合蛋白)包括与参考抗原结合蛋白结
合相同表位的抗原结合蛋白，以及因出现位阻而与参考抗原结合蛋白所结合的表位足够近
的相邻表位结合的抗原结合蛋白。通常，当竞争性抗原结合蛋白过量存在时，其将参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合抑制至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在某些情况下，将结合抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或以上。竞争性抑制还可如下测量：将参考抗原结合蛋白固定至基底(例如，“感测芯片”)，经由与参考抗体结合来捕获基底上的抗原，并测定不同的抗原结合蛋白(竞争性抗原结合蛋白)是否可另外与抗原结合。后一竞争性结
合测定的实例采用Biacore分析，并描述于本文的实施例7中。

[0187] 术语“抗原”或“免疫原”是指分子或分子的一部分，其能够被选择性结合剂(诸如抗原结合蛋白，包括例如抗体或其免疫功能性抗原结合片段)结合，并且另外能够用于动物中以产生能够与该抗原结合的抗体。抗原可具有能够与不同的抗原结合蛋白(例如，抗体)相互作用的一个或多个表位。

[0188] 术语“表位”为由抗原结合蛋白(例如，抗体)结合的分子的一部分。该术语包括能够与抗原结合蛋白(诸如抗体)或与T细胞受体特异性结合的任何决定簇。表位可为邻接的或非邻接的(例如，(i)在单链多肽中，氨基酸残基在多肽序列中彼此未邻接，但在分子由抗原结合蛋白结合的情况下邻接，或(ii)在包含两种或更多种单个组分(例如，RAMP1和CRLR)的多聚体受体(例如，CGRP R)中，存在于两种或更多种单个组分上的氨基酸残基不邻接，但在多聚体受体由抗原结合蛋白结合的情况下邻接)。在某些实施方案中，表位可为模拟物，因为其包含与用于产生抗原结合蛋白的表位类似的三维结构，但不包含或仅包含一些用于
产生抗原结合蛋白的表位中存在的氨基酸残基。通常情况下，表位驻留在蛋白质上，但有时可驻留在其它类型的分子(诸如核酸)上。表位决定簇可包括根据化学活性表面分组的分
子，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且可具有特定的三维结构特性和/或比电荷特性。一般而言，对特定靶抗原特异的抗体会优选地识别蛋白质和/或大分子的复合混合物中的靶抗原上的表位。

[0189] 术语“同一性”是指两种或更多种多肽分子或两种或更多种核酸分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列所测定。“同一性百分比”是指所比较分子中的氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并根据所比较的最小分子的大小来计算。对于这些计算，必须通过特定的数学模型或计算机程序(即，“算法”)来处理比对中的空位(如果存在)。可用于计算所比对核酸或多肽的同一性的方法包括下列文献中所述的那些：Computational 
Molecular Biology(Lesk，A. M.编著)，1988，New York: Oxford University Press；
Biocomputing Informatics and Genome Projects(Smith，D. W.编著)，1993，New York: Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分(Griffin，A M.和
Griffin，H. G.编著)，1994，New Jersey: Humana Press；von Heinje，G.，1987，Sequence Analysis in Molecular Biology，New York: Academic Press; Sequence Analysis 
Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.编著)，1991，New York: M. Stockton Press；和
Carillo等，1988，SIAM J. Applied Math.48:1073。

[0190] 在计算同一性百分比时，以得到序列之间最大匹配的方式对所比较序列进行比对。用于测定同一性百分比的计算机程序为GCG程序包，其包括GAP(Devereux等，1984，
Nucl. Acid Res.12:387；Genetics Computer Group，University of Wisconsin，
Madison，WI)。计算机算法GAP用于比对两种多肽或多核苷酸，以测定其序列同一性的百分比。对序列进行比对，以实现其各自氨基酸或核苷酸的最佳匹配(“匹配范围(matched 
span)”，如算法所测定)。联合算法使用空位开放罚分(gap opening penalty)(其按照平均对角线的3倍来计算，其中“平均对角线”为所用比较矩阵中对角线的平均值；“对角线”为特定比较矩阵赋予各完全氨基酸匹配的分数或数字)和空位拓展罚分(其通常为空位开放罚
分的1/10倍)，以及诸如PAM 250或BLOSUM 62的比较矩阵。在某些实施方案中，算法还使用标准比较矩阵(参见Dayhoff等，1978，Atlas of Protein Sequence and Structure5:345-
352(对于PAM 250比较矩阵)；Henikoff等，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:
10915-10919(对于BLOSUM 62比较矩阵))。

[0191] 使用GAP程序测定多肽或核苷酸序列的同一性百分比的推荐参数如下：

[0192] 算法：Needleman等，1970，J. Mol. Biol.48:443-453；

[0193] 比较矩阵：BLOSUM 62，得自Henikoff等，1992，见上文；

[0194] 空位罚分：12(但末端空位无罚分)

[0195] 空位长度罚分：4

[0196] 相似性阈值：0

[0197] 比对两种氨基酸序列的某些比对方案仅可产生两种序列的短区的匹配，并且此小比对区可具有极高的序列同一性，尽管这两种全长序列之间不存在显著联系。因此，所选比对方法(CAP程序)可根据需要进行调整，以产生范围为在靶多肽的至少50个邻接氨基酸的
比对。

[0198] 如本文所用，“基本上纯的”是指所述的分子种类为主要存在物质，即，以摩尔计，其丰度大于同一混合物中的任何其它各物质。在某些实施方案中，基本上纯的分子为其中目标物质占存在的所有大分子物质的至少50%(以摩尔计)的组合物。在其它实施方案中，基本上纯的组合物将占存在于组合物中的所有大分子物质的至少80%、85%、90%、95%或99%。在其它实施方案中，将目标物质纯化至基本均质，其中通过常规的检测方法检测不到组合物
中的污染物质，因此该组合物由单一的可检测的大分子物质组成。

[0199] 术语“治疗”是指治疗或改善损伤、病变或病症的任何成功指标，包括任何客观或主观参数，诸如症状的减轻、缓解、减弱或使得患者更耐受损伤、病变或病症；减缓退化或衰退的速率；减轻退化终点时的虚弱；改善患者的身体或心理健康。症状的治疗或改善可根据客观或主观参数；包括身体检查、神经精神病学检查和/或精神病学评估的结果。例如，本文提供的某些方法以预防方式或以急性治疗形式对偏头痛成功地进行治疗，从而降低了偏头痛的频率、降低了偏头痛的严重程度和/或改善了与偏头痛相关的症状。

[0200] “有效量”通常为足以降低症状的严重程度和/或频率、消除症状和/或潜在病因、预防症状和/或其潜在病因的发生和/或改善或矫治(remediate)由偏头痛引起或与偏头痛相关的损伤的量。在一些实施方案中，有效量为治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”为足以治愈病情(例如偏头痛)或症状、尤其是与该病情相关的病情或症状的量，或以其它方
式(以无论任何方式)预防、阻滞、延缓或逆转病情或与该疾病相关的任何其它不良症状的
进展的量。“预防有效量”为当施用至受试者时将具有预期预防作用(例如，预防或延迟偏头痛发作(或复发)，或降低偏头痛或偏头痛症状发作(或复发)的可能性)的药物组合物的量。
完全治疗或预防作用未必经施用一次剂量而出现，并且可能在施用一系列剂量之后出现。
因此，治疗或预防有效量可分一次或多次来施用。

[0201] “氨基酸”包括其在本领域中的一般含义。二十种天然存在的氨基酸及其缩写遵循常规的用法。参见Immunology-A Synthesis第2版(E. S. Golub和D. R. Green编著)，Sinauer Associates: Sunderland、Mass.(1991)，该文献以引用的方式并入本文以用于任何用途。二十种常规氨基酸、非天然氨基酸(诸如α-,α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸)和其它非常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)还可为多肽的合适组分，并包括在用语“氨基酸”中。非常规氨基酸的实例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽符号中，根据标准用法及惯例，左手方向为氨基末端方向，并且右手方向为羧基末端方向。

[0202] 总体概述

[0203] 本文提供了结合CGRP R蛋白(包括人CGRP R(hCGRP R)蛋白)的抗原结合蛋白。所提供的抗原结合蛋白为如本文所述在其中嵌入和/或接合一个或多个互补决定区(CDR)的
多肽。在一些抗原结合蛋白中，CDR嵌入“框架”区中，其使CDR定向，从而实现CDR的适当抗原结合特性。一般而言，所提供的抗原结合蛋白可干扰、阻断、减小或调节CGRP与CGRP R之间的相互作用。

[0204] 本文所述的某些抗原结合蛋白为抗体或源于抗体。在某些实施方案中，抗原结合蛋白的多肽结构基于抗体，包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、微抗体、域抗体、合成抗体(在本文中有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合物(在本文中有时称为“抗体缀合物”)及其片段。下文进一步描述各种结构。

[0205] 经证实，本文所提供的抗原结合蛋白可结合CGRP R，尤其是人CGRP R。如下文实施例中进一步描述，经测试发现，某些抗原结合蛋白可结合表位，这些表位不同于针对CGRP R的一种或其它组分的多种其它抗体所结合的表位。所提供的抗原结合蛋白与CGRP竞争，从而防止CGRP与其受体结合。因此，本文所提供的抗原结合蛋白能够抑制CGRP R活性。具体而言，结合这些表位的抗原结合蛋白可具有一种或多种下列活性：抑制，尤其是诱导CGRP R信号转导途径、抑制血管舒张、引起血管收缩、减少炎症(例如，神经源性炎症)以及由CGRP R结合CGRP所诱导的其它生理效应。

[0206] 本文所公开的抗原结合蛋白具有多种效用。一些抗原结合蛋白例如可用于CGRP R(尤其为hCGRP R或其配体)的特异性结合测定、亲和纯化，以及鉴别CGRP R活性的其它拮抗剂的筛选测定中。一些抗原结合蛋白可用于抑制CGRP与CGRP R的结合。

[0207] 如本文所解释，抗原结合蛋白可用于多种治疗应用中。例如，某些CGRP R抗原结合蛋白可用于治疗患者的与CGRP R介导信号转导相关的病症，诸如降低、缓解或治疗偏头痛的频率和/或严重程度；减轻、缓解或治疗丛集性头痛；减轻、缓解或治疗慢性疼痛；缓解或治疗糖尿病(II型)；减轻、缓解或治疗心血管病症；和减轻、缓解或治疗与内毒素血症和败血症相关的血液动力学紊乱。抗原结合蛋白的其它用途包括例如CGRP R相关疾病或病症的
诊断以及测定CGRP R存在与否的筛选测定。本文所述的一些抗原结合蛋白可用于治疗与
CGRP R活性相关的后果、症状和/或病变。这些包括但不限于各种类型的偏头痛。

[0208] CGRP受体

[0209] 本文所公开的抗原结合蛋白可结合CGRP R，尤其是人CGRP R。CGRP R为包括CRLR和RAMP1的多聚体。人CRLR的核苷酸序列在本文中以SEQ ID NO:1提供。人CRLR的氨基酸序
列在本文中以SEQ ID NO:2提供。人RAMP1的核苷酸序列在本文中以SEQ ID NO:3提供。人
RAMP1的氨基酸序列在本文中以SEQ ID NO:4提供。本文所述的抗原结合蛋白结合CGRP R的
细胞外部分，包括CRLR和RAMP1的细胞外部分。人CRLR的示例性胞外域(“ECD”)由SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列编码，并具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。此序列包括信号肽；
示例性成熟(无信号肽)CRLR ECD具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。人RAMP1的示例性
ECD由SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列编码，并具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。此序列包括信号肽；示例性成熟(无信号肽)RAMP1 ECD具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。如下文所述，CGRP R蛋白还可包括片段。如本文所用，这些术语可互换使用并且是指受体，具体而言是指特异性结合CGRP的人受体，除非另外指明。

[0210] 术语CGRP R还包括CGRP R氨基酸序列的翻译后修饰，例如可能的N连接糖基化位点。因此，抗原结合蛋白可结合一个或多个位置处糖基化的蛋白质或由其产生。

[0211] CGRP受体结合蛋白

[0212] 提供了可用于调节CGRP R活性的多种选择性结合剂。这些试剂包括例如包含抗原结合域的抗原结合蛋白(例如，具有抗原结合区的单链抗体、域抗体、免疫粘附物和多肽)并特异性结合CGRP R，尤其是人CGRP R。一些试剂例如可用于抑制CGRP与CGRP R的结合，因此可用于抑制、干扰或调节一种或多种与CGRP R信号转导相关的活性。

[0213] 一般而言，所提供的抗原结合蛋白通常包含一个或多个(例如1、2、3、4、5或6个)本文所述的CDR。在某些情况下，抗原结合蛋白包含(a)多肽结构和(b)一个或多个插入和/或接合于多肽结构中的CDR。多肽结构可呈多种不同的形式。例如，其可为或包含天然存在的抗体或其片段或变体的框架，或在本质上为可完全合成的。下文进一步描述各种多肽结构
的实例。

[0214] 在某些实施方案中，抗原结合蛋白的多肽结构为抗体或源于抗体，包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、微抗体、域抗体、合成抗体(在本文中有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合物(在本文中有时称为“抗体缀合物”)及其各自的部分或片段。在某些情况下，抗原结合蛋白为抗体的免疫片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2或scFv)。
本文进一步描述和定义各种结构。

[0215] 本文所提供的某些抗原结合蛋白特异性结合人CGRP R。在具体实施方案中，抗原结合蛋白特异性结合人CGRP R蛋白，该人CGRP R蛋白包含具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的
人CRLR和具有SEQ ID NO:4氨基酸序列的人RAMP1。

[0216] 在抗原结合蛋白用于治疗应用的实施方案中，抗原结合蛋白可抑制、干扰或调节CGRP R的一种或多种生物活性。在这种情况下，当过量抗体将与CGRP结合的人CGRP R的量
(反之亦然)减少至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或以上(例如通过在体外竞争性结合测定中测量结合)时，抗原结合蛋白特异性结合和/或基本上抑制
人CGRP R与CGRP的结合。

[0217] 天然存在的抗体结构

[0218] 所提供的一些抗原结合蛋白具有通常与天然存在的抗体相关的结构。这些抗体的结构单元通常包含各自由两个相同的多肽链偶联体组成的一个或多个四聚体，尽管一些哺
乳动物物种也产生仅具有单条重链的抗体。在典型的抗体中，各对或偶联体包括一条全长
“轻”链(在某些实施方案中，约25kDa)和一条全长“重”链(在某些实施方案中，约50-
70kDa)。各单个免疫球蛋白链由若干“免疫球蛋白域”组成，各“免疫球蛋白域”由大约90至
110个氨基酸组成并表达特征折叠模式。这些域为组成抗体多肽的基本单位。各链的氨基末端部分通常包括负责抗原识别的可变域。羧基末端部分在进化上比链的另一端更保守并称
为“恒定区”或“C区”。人轻链通常分类为κ和λ轻链，并且这些链各自包含一个可变域和一个恒定域。重链通常分类为μ、δ、γ、α或ε链，并且这将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干亚型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM亚型包括IgM和IgM2。IgA亚型包括IgA1和IgA2。在人类，IgA和IgD同种型包含四条重链和四条轻链；IgG和IgE同种型包含两条重链和两条轻链；并且IgM同种型包含五条重链和五条轻链。重链C区通常包含可负责效应器功能的一个或多个域。重链恒定区域的数目将取决于同种型。例如，
IgG重链各自包含三个C区域，称为CH1、CH2和CH3。所提供的抗体可具有这些同种型和亚型中的任一种。在某些实施方案中，CGRP R抗体为IgG1、IgG2或IgG4亚型。

[0219] 在全长轻链和重链中，可变区和恒定区通过约十二个或更多个氨基酸的“J”区接合，其中重链还包括约十个以上氨基酸的“D”区。参见例如Fundamental Immunology第2版第7章(Paul，W.编著)，1989，New York: Raven Press(其全文在此以引用的方式并入本文以用于所有目的)。各轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。

[0220] 示例性CGRP R单克隆抗体的IgG2重链恒定域的一个实例具有下列氨基酸序列：

[0221] ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD
VSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKG
QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(该序列的最后326个残基如SEQ. ID NO:29所示)。

[0222] 示例性CGRP R单克隆抗体的κ轻链恒定域的一个实例具有下列氨基酸序列：

[0223] RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(该序列的最后107个残基如SEQ ID NO:14所
示)。

[0224] 免疫球蛋白链的可变区通常表现出相同的整体结构，包含经由三个高变区(更通常称为“互补决定区”或CDR)接合的相对保守的框架区(FR)。来自上述各重链/轻链对的两条链的CDR通常通过框架区对齐，以形成与靶蛋白(例如，CGRP R)上的特定表位特异性结合的结构。从N末端至C末端，天然存在的轻链和重链可变区均通常符合这些元件的下列顺序：
FR1，CDR1、FR2，CDR2、FR3，CDR3和FR4。已设计出对占据这些域中每个的位置的氨基酸指定编号的编号系统。此编号系统在Kabat Sequences of Proteins of Immunological 
Interest(1987和1991，NIH，Bethesda，MD)或Chothia &Lesk，1987，J. Mol. Biol.196:
901-917；Chothia等，1989，Nature342:878-883中有所定义。

[0225] 本文所提供的各种重链和轻链可变区在表3中示出。这些可变区的每个可连接至上述重链和轻链恒定区，以分别形成完整的抗体重链和轻链。此外，如此产生的各重链和轻链序列的每个可组合形成完整的抗体结构。应当理解，本文所提供的重链和轻链可变区还
可连接到其它恒定域，这些恒定域具有与上列示例性序列不同的序列。

[0226] 表2A和2B中汇总了所提供的抗体的一些全长轻链和重链的具体实例及其相应氨基酸序列。表2A示出示例性轻链序列，并且表2B示出示例性重链序列。

[0227] 表2A–示例性抗体轻链氨基酸序列

[0228]

[0229]

[0230]

[0231]

[0232]

[0233] 表2B–示例性抗体重链氨基酸序列

[0234]

[0235]

[0236]

[0237]

[0238]

[0239]

[0240]

[0241] 除32H7和32H7 CS外，表2A中各轻链序列的前22个氨基酸为信号序列。就32H7和32H7 CS而言，信号序列为20个氨基酸。类似地，表2B中各重链序列的前22个氨基酸为信号序列。信号肽可更换为具有不同序列的信号肽，例如，在某些宿主细胞中表达更佳的信号
肽。因此应理解，本发明还包括具有表2A和2B中指定的轻链和/或重链序列但具有不同信号序列的抗体。

[0242] 而且，表2B中所列的各示例性重链(H1、H2、H3等)可与表2A中所示的任一示例性轻链组合以形成抗体。此类组合的实例包括与L1至L17中任一者组合的H1；与L1至L17中任一者组合的H2；与L1至L17中任一者组合的H3等。在一些情况下，抗体包括表2A和2B中列出的至少一条重链和一条轻链。在一些情况下，抗体包含表2A和2B中列出的两条不同的重链和
两条不同的轻链。在其它情况下，抗体包含两条相同的轻链和两条相同的重链。举例而言，抗体或免疫功能片段可包括两条H1重链和两条L1轻链，或两条H2重链和两条L2轻链，或两
条H3重链和两条L3轻链，以及表2A和2B中列出的轻链对和重链对的类似组合。

[0243] 所提供的其它抗原结合蛋白为由表2A和2B所示的重链和轻链的组合所形成的抗体的变体，并且包含的轻链和/或重链各自与这些链的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、
85%、90%、95%、97%或99%的同一性。在一些情况下，此类抗体包括至少一条重链和一条轻链，而在其它情况下，变体形式包含两条相同的轻链和两条相同的重链。

[0244] 抗体的可变域

[0245] 还提供了抗原结合蛋白，其包含选自VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12和VH13的抗体重链可变区，和/或选自VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16和VL17的抗体轻链可变区(如下表3中所示)；以及这些轻链和重链可变区的免疫功能片段、衍生物、突变蛋白和变体。

[0246] 图1A和1B分别提供各种重链和轻链可变区的序列比对。

[0247] 此类型的抗原结合蛋白通常可由式"VHx/VLy"表示，其中"x"对应于重链可变区的编号，并且"y"对应于轻链可变区的编号。

[0248] 表3：示例性VH和VL链氨基酸序列

[0249]

[0250]

[0251]

[0252]

[0253]

[0254]

[0255]

[0256] 表3中列出的各重链可变区可与表3中示出的任一轻链可变区组合，以形成抗原结合蛋白。此类组合物的实例包括与VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16或VL17中任一者组合的VH1；与VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16或VL17中任一者组合的VH2；与VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16或VL17中任一者组合的VH3等。

[0257] 在一些情况下，抗原结合蛋白包括表3中列出的至少一个重链可变区和/或一个轻链可变区。在一些情况下，抗原结合蛋白包括表3中列出的至少两个不同的重链可变区和/
或轻链可变区。此类抗原结合蛋白的实例包含(a)一个VH1和(b)VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12或VH13中的一者。另一个实例包含(a)一个VH2和(b) VH1、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12或VH13中的一者。另一个实例包含(a)一个VH3和(b) VH1、VH2、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12或VH13等中的一者。此类抗原结合蛋白的另一个实例包含(a)一个VL1和(b) VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16或VL17、VL18、VL19、VL20或VL21中的一者。此类抗原结合蛋白的另一个实例包含(a)一个VL2和(b) VL1、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16、VL17、VL18、VL19、VL20或VL21中的一者。此类抗原结合蛋白的另一个实例包含(a)一个VL3和(b) VL1、VL2、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16、VL17、VL18、VL19、VL20或VL21等中的一者。

[0258] 对本领域的技术人员显而易见的是，重链可变区的各种组合可与轻链可变区的各种组合中的任一者进行组合。

[0259] 在其它情况下，抗原结合蛋白包含两个相同的轻链可变区和/或两个相同的重链可变区。举例而言，抗原结合蛋白可为抗体或免疫功能片段，其包括与表3中列出的轻链可变区对和重链可变区对组合的两个轻链可变区和两个重链可变区。

[0260] 所提供的一些抗原结合蛋白包含具有氨基酸序列的重链可变域，该氨基酸序列中仅在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基处不同于选自VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12和VH13的重链可变域的序列，其中此类序列差异各自独立地为一个氨基酸的缺失、插入或取代，其中所述缺失、插入和/或取代形成不超过
15个氨基酸改变(相对于上述可变域序列)。一些抗原结合蛋白中的重链可变区包含氨基酸
序列，该氨基酸序列与VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12和VH13的重链可变区的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的序列同一性。

[0261] 某些抗原结合蛋白包含具有氨基酸序列的轻链可变域，该氨基酸序列中仅在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基处不同于选自VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16或VL17的轻链可变域的序列，其中此类序列差异各自独立地为一个氨基酸的缺失、插入或取代，其中所述缺失、插入和/或取代形成不超过15个氨基酸改变(相对于上述可变域序列)。一些抗原结合蛋白中的轻链可变区
包含氨基酸序列，该氨基酸序列与VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16或VL17的轻链可变区的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、
95%、97%或99%的序列同一性。

[0262] 在其它情况下，抗原结合蛋白包含下列轻链和重链可变域的配对：VL1与VH1、VL2与VH2、VL3与VH3、VL4与VH4、VL5与VH5、VL6与VH1、VL7与VH6、VL8与VH5、VL9与VH1、VL10与VH7、VL11与H8、VL12与VH9、VL12与VH10、VL13与VH5、VL14与VH11、VL15与VH12、VL16与VH13和VL17与VH13。在一些情况下，上述配对中的抗原结合蛋白可包含与指定可变域具有70%、
75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%序列同一性的氨基酸序列。

[0263] 其它抗原结合蛋白，例如，抗体或免疫功能片段包括刚才所述的变体重链和变体轻链的变体形式。

[0264] CDR

[0265] 本文所公开的抗原结合蛋白为一个或多个CDR移植、插入和/或接合于其中的多肽。抗原结合蛋白可具有1、2、3、4、5或6个CDR。因此，抗原结合蛋白可具有例如，一个重链CDR1(“CDRH1”)，和/或一个重链CDR2(“CDRH2”)，和/或一个重链CDR3(“CDRH3”)，和/或一个轻链CDR1(“CDRL1”)，和/或一个轻链CDR2(“CDRL2”)，和/或一个轻链CDR3(“CDRL3”)。一些抗原结合蛋白包括CDRH3和CDRL3。特定的重链和轻链CDR分别标识于表4A和4B中。

[0266] 给定抗体的互补决定区(CDR)和构架区(FR)可使用下列文献中所述的系统来鉴别：Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest第5版中，美国卫生和公众服务部(US Dept. of Health and Human Services)，PHS，NIH，NIH公开号91-3242，
1991。本文所公开的某些抗体包含一个或多个氨基酸序列，所述氨基酸序列与表4A(CDRH)
和表4B(CDRL)中示出的一个或多个CDR的氨基酸序列相同或具有基本的序列同一性。

[0267] 表4A：示例性重链CDR氨基酸序列

[0268]

[0269]

[0270]

[0271] 表4B：示例性轻链CDR氨基酸序列

[0272]

[0273]

[0274]

[0275] 天然存在的抗体内的CDR的结构和特性已描述于上文中。简言之，在常规抗体中，CDR嵌入重链和轻链可变区的框架内，在其中构成负责抗原结合和识别的区。可变区在框架区(命名为框架区1-4、FR1、FR2、FR3和FR4，根据Kabat等，1991，见上文；还参见Chothia和Lesk，1987，见上文)内包含至少三条重链或轻链CDR，参见上文(Kabat等，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，公共卫生署(Public Health Service) 
N.I.H.，Bethesda，MD；还参见Chothia和Lesk，1987，J. Mol. Biol.196:901-917；Chothia等，1989，Nature342: 877-883)。然而，本文提供的CDR不仅用于定义常规抗体结构的抗原结合域，而且可嵌入本文所述的多种其它多肽结构。

[0276] 在一个方面，所提供的CDR为(a)选自下列的CDRH：(i) CDRH1，其选自SEQ ID NO:73、76、79、82、85、88、92、97和100；(ii) CDRH2，其选自SEQ ID NO:74、77、80、83、86、89、91、
93、95、98、101和129；(iii) CDRH3，其选自SEQ ID NO:75、78、81、84、87、90、96、99、102和
123；和(iv)包含一个或多个(例如，一、二、三、四或四个以上)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRH，所述氨基酸取代、缺失或插入不超过五、四、三、二或一个氨基酸；(B)选自下列的CDRL：(i) CDRL1，其选自SEQ ID NO:42、45、48、51、
54、57、62、65、66和69；(ii) CDRL2，其选自SEQ ID NO:43、46、49、52、55、58、61、63、67和70；
(iii) CDRL3，其选自SEQ ID NO:44、47、50、53、56、59、64、68、71和72；和(iv)包含一个或多个(例如，一、二、三、四或四个以上)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRL，所述氨基酸取代、缺失或插入不超过五、四、三、二或一个氨基酸。

[0277] 在另一个方面，抗原结合蛋白包括表4A和4B中列出的CDR的1、2、3、4、5或6个变体形式，其各自与表4A和4B中列出的CDR序列具有至少80%、85%、90%或95%的序列同一性。一些抗原结合蛋白包括表4A和4B中列出的1、2、3、4、5或6个CDR，每个与这些表中列出的CDR相差不超过1、2、3、4或5个氨基酸。

[0278] 在另一个方面，本文所公开的CDR包括源于相关单克隆抗体组的共有序列。如本文所述，“共有序列”是指氨基酸序列，其具有许多序列中共有的保守氨基酸和在给定氨基酸序列内变化的可变氨基酸。所提供的CDR共有序列包括对应于CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3中每个的CDR。

[0279] 在另一个方面，抗原结合蛋白包括下列缔合：CDRL1、CDRL2和CDRL3：SEQ ID NO:42、43和44；SEQ ID NO:45、46和47；SEQ ID NO:48、49和50；SEQ ID NO:51、52和53；SEQ ID NO:54、55和56；SEQ ID NO:57、58和59；SEQ ID NO:60、55和56；SEQ ID NO:45、61和47；SEQ ID NO:62、63和64；SEQ ID NO:65、55和56；SEQ ID NO:66、67和68；SEQ ID NO:69、70和71；
以及SEQ ID NO:69、70和72。

[0280] 在另一个方面，抗原结合蛋白包括下列缔合：CDRH1、CDRH2和CDRH3：SEQ ID NO:73、74和75；SEQ ID NO:76、77和78；SEQ ID NO:79、80和81；SEQ ID NO:82、83和84；SEQ ID NO:85、86和87；SEQ ID NO:88、89和90；SEQ ID NO:76、91和78；SEQ ID NO:92、93和94；SEQ ID NO:76、95和78；SEQ ID NO:73、74和96；SEQ ID NO:97、98和99；以及SEQ ID NO:100、101和102。

[0281] 在另一个方面，抗原结合蛋白包括下列缔合：CDRL1、CDRL2和CDRL3与CDRH1、CDRH2和CDRH3：SEQ ID NO:42、43和44与SEQ ID NO:73、74和75；SEQ ID NO:45、46和47与SEQ ID NO:76、77和78；SEQ ID NO:48、49和50与SEQ ID NO:79、80和81；SEQ ID NO:51、52和53与SEQ ID NO:82、83和84；SEQ ID NO:54、55和56与SEQ ID NO:85、86和87；SEQ ID NO:57、58和59与SEQ ID NO:88、89和90；SEQ ID NO:60、55和56与SEQ ID NO:85、86和87；SEQ ID NO:45、61和47与SEQ ID NO:76、91和78；SEQ ID NO:62、63和64与SEQ ID NO:92、93和94；SEQ ID NO:45、61和47与SEQ ID NO:76、95和78；SEQ ID NO:65、55和56与SEQ ID NO:85、86和
87；SEQ ID NO:42、43和44与SEQ ID NO:73、74和96；SEQ ID NO:66、67和68与SEQ ID NO:
97、98和99；SEQ ID NO:69、70和71与SEQ ID NO:100、101和102；和SEQ ID NO:69、70和72与SEQ ID NO:100、101和102。

[0282] 对与抗CGRP R抗体的VH和VL对应的CDR，采用标准系统发生分析来测定共有序列。通过保持CDR在相同序列内对应于VH或VL邻接来测定共有序列。

[0283] 如图3A、3B、4、5A、5B、5C、5D和5E中所示，对本文所提供的多种抗原结合蛋白进行系谱分析可形成相关序列组，命名为轻链CDR组K1、K2、K3和K4(图3A和3B)、轻链CDR组L1、L2、L3和L4(图4)和重链CDR组HC1(图5A)、HC2(图5B)、HC3(图5C)、HC4(图5C)、HC5(图5D)和HC6(图5E)。如图3A、3B、4和5F中所示，上述序列组中的一些用于产生其它共有序列，从而得到轻链CDR组K1,4(图3A)、K2,3(图3B)、L1,2,3(Fig4)和LAll(图4)以及重链CDR组HCA和HCB(图5F)。

[0284] 下文提供各种CDR区组的共有序列：

[0285] K1共有序列

[0286] CDR1　RASQGIRX1DLG(SEQ ID NO:103)，其中X1选自N和K。

[0287] CDR2　X1ASSLQS(SEQ ID NO:104)，其中X1选自A和G。

[0288] CDR3　LQYNX1X2PWT(SEQ ID NO:105)，其中X1选自I和S，并且X2选自Y和F。

[0289] K4共有序列

[0290] CDR3　QQYGNSLX1R(SEQ ID NO:106)，其中X1选自S和C。

[0291] K1,4共有序列

[0292] CDR1　RASQX1X2X3X4GX5LX6(SEQ ID NO:107)，其中X1选自S和G、X2选自V和I，X3选自S和R，X4选自S、N和K，X5选自Y和D，并且X6选自T和G。

[0293] CDR2　X1ASSX2X3X4(SEQ ID NO:108)，其中X1选自G和A，X2选自R和L，X3选自A和Q，并且X4选自T和S。

[0294] CDR3　X1QYX2X3X4X5X6X7(SEQ ID NO:109)，其中X1选自Q和L，X2选自G和N，X3选自N和T，X4选自S、Y和F，X5选自L和P，X6选自C、W和S，并且X7选自R和T。

[0295] K3共有序列

[0296] CDR1　KSSQSLLHSX1GX2X3YLY(SEQ ID NO:110)，其中X1选自D和A，X2选自R和K，并且X3选自N和T。

[0297] K2,3共有序列

[0298] CDR1　X1SSQSLLHSX2GX3X4YLX5(SEQ ID NO:111)，其中X1选自R和K，X2选自F、D和A，X3选自Y、R和K，X4选自N和T，并且X5选自D和Y。

[0299] CDR2　X1X2SNRX3S(SEQ ID NO:112)，其中X1选自L和E，X2选自G和V，并且X3选自A和F。

[0300] CDR3　MQX1X2X3X4PX5T(SEQ ID NO:113)，其中X1选自A和S，X2选自L和F，X3选自Q和P，X4选自T和L，并且X5选自F和L。

[0301] Lm3共有序列

[0302] CDR2　RX1NQRPS(SEQ ID NO:114)，其中X1选自N和S。

[0303] Lm1,2,3共有序列

[0304] CDR1　SGSSSNIGX1NX2VX3(SEQ ID NO:115)，其中X1选自N和S，X2选自Y和T，并且X3选自S、N和Y。

[0305] CDR2　X1X2NX3RPS(SEQ ID NO:116)，其中X1选自D、T和R，X2选自N和S，并且X3选自K和Q。

[0306] CDR3　X1X2X3DX4X5LX6X7VV(SEQ ID NO:117)，其中X1选自G和A，X2选自T和A，X3选自W和R，X4选自S和D，X5选自R和S，X6选自S和N，并且X7选自A和G。

[0307] LAll共有序列

[0308] CDR1　X1GX2X3SX4X5X6X7X8X9X10X11(SEQ ID NO:118)，其中X1选自S和Q，X2存在或不存在，并且如果存在，则为S，X3选自S和D，X4存在或不存在，并且如果存在，则为N，X5选自I和L，X6选自G和R，X7选自N和S，X8选自N和F，X9选自Y和T，X10选自V和A，并且X11选自S、N和Y。

[0309] CDR2　X1X2NX3RPS(SEQ ID NO:119)，其中X1选自D、G、T和R，X2选自N、K和S，并且X3选自K、N和Q。

[0310] CDR3　X1X2X3DX4X5X6X7X8X9V(SEQ ID NO:120)，其中X1选自G、N和A，X2选自T、S和A，X3选自W和R，X4选自S和D，X5选自R和S，X6选自L和V，X7选自S、Y和N，X8选自A、H和G，并且X9选自V和L。

[0311] HC1共有序列

[0312] CDR1　X1YYMX2(SEQ ID NO:121)，其中X1选自G和D，X2选自H和Y。

[0313] CDR2　WIX1PNSGGTNYAQKFQG(SEQ ID NO:122)，其中X1选自N和S。

[0314] CDR3　X1X2X3SX4X5X6X7X8GX9X10X11X12YYX13GMDV(SEQ ID NO:123)，其中X1选自D和G，X2选自Q和G，X3选自M和Y，X4选自I和G，X5选自I和Y，X6选自M和A，X7存在或不存在，并且如果存在，则为L，X8存在或不存在，并且如果存在，则为R，X9选自V和L，X10选自F和Y，X11选自P和S，X12选自P和H，并且X13存在或不存在，并且如果存在，则为Y。

[0315] HC2共有序列

[0316] CDR2　RIKSX1TDGGTTDYX2APVKG(SEQ ID NO:124)，其中X1选自K和T，并且X2选自T和A。

[0317] HC3共有序列

[0318] CDR1　X1YX2MX3(SEQ ID NO:125)，其中X1选自T和S，X2选自S和A，并且X3选自N和S。

[0319] CDR2　X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG(SEQ ID NO:126)，其中X1选自S和A，X2选自S和G，X3选自S和G，X4选自S和G，X5选自Y和R，并且X6选自R和T。

[0320] CDR3　X1X2X3X4X5X6X7PYSX8X9WYDYYYGMDV(SEQ ID NO:127)，其中X1选自E和D，X2选自G和Q，X3选自V和R，X4选自S和E，X5选自G和V，X6选自S和G，X7存在或不存在，并且如果存在，则为S，X8选自I和S，并且X9选自S和G。

[0321] HC4共有序列

[0322] CDR1　SX1GMH(SEQ ID NO:128)，其中X1选自F和Y。

[0323] CDR2　VISX1DGSX2KYX3X4DSVKG(SEQ ID NO:129)，其中X1选自F和Y，X2选自I和H，X3选自S和Y，并且X4选自V和A。

[0324] CDR3　X1RX2X3X4X5X6SX7X8YYX9X10X11YYGX12X13V(SEQ ID NO:130)，其中X1选自D和E，X2选自L和K，X3选自N和R，X4选自Y和V，X5选自Y和T，X6选自D和M，X7选自S和T，X8选自G和L，X9选自H和Y，X10存在或不存在，并且如果存在，则为Y，X11选自K和F，X12选自M和L，并且X13选自A和D。

[0325] HCA共有序列

[0326] CDR1　X1X2X3MX4(SEQ ID NO:131)，其中X1选自N和S，X2选自A、Y和F，X3选自W、A和G，并且X4选自S和H。

[0327] CDR2　X1IX2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X12X13X14VKG(SEQ ID NO:132)，其中X1选自R、A和V，X2选自K、S和W，X3选自S、G、F和Y，X4存在或不存在，并且如果存在，则选自K和T，X5存在或不存在，并且如果存在，则为T，X6选自D和S，X7选自G和S，X8选自T、R、I、N和H，X9选自T和K，X10选自D和Y，X11选自Y和S，X12选自T、A和V，X13选自A和D，并且X14选自P和S。

[0328] CDR3　X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17GX18X19V(SEQ ID NO:133)，其中X1选自D、A和E，X2选自R、Q和G，X3选自T、R、L、G和K，X4选自G、E、N、I和R，X5选自Y、V和A，X6选自S、G、Y、A和T，X7选自I、P、D、A和M，X8存在或不存在，并且如果存在，则选自S和Y，X9存在或不存在，并且如果存在，则选自W、S和T，X10选自S、G和L，X11选自S、G、L和Y，X12存在或不存在，并且如果存在，则选自W和Y，X13选自Y和H，X14存在或不存在，并且如果存在，则选自Y和D，X15选自Y、K和F，X16存在或不存在，并且如果存在，则为Y，X17存在或不存在，并且如果存在，则为Y，X18选自M和L，并且X19选自D和A。

[0329] HCB共有序列

[0330] CDR1　X1X2X3X4X5(SEQ ID NO:134)，其中X1选自N、G、D、S和A，X2选自A、F和Y，X3选自W、Y、A和G，X4选自M和L，并且X5选自S和H。

[0331] CDR2　X1IX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17G(SEQ ID NO:135)，其中X1选自R、W、A、V、S和F，X2选自K、N、S、W和R，X3选自S、P、G、F和Y，X4存在或不存在，并且如果存在，则选自K、T和R，X5存在或不存在，并且如果存在，则选自T和A，X6选自D、N、H、S和Y，X7选自G和S，X8选自G和S，X9选自T、G、R、I、N、H和Y，X10选自T、K、R和P，X11选自D、N、Y和E，X12选自Y和S，X13选自T、A和V，X14选自A、Q和D，X15选自P、K和S，X16选自V和F，并且X17选自K和Q。

[0332] CDR3　X1X2X3X4X5SX6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16GX17X18V(SEQ ID NO:136)，其中X1选自D、G、A和E，X2选自R、G和Q，X3选自T、M、Y、R、L、G和K，X4选自G、S、E、N、I和R，X5选自Y、I、G、V和A，X6选自S、I、Y、G、A和T，X7选自I、M、A、P和D，X8存在或不存在，并且如果存在，则选自S、L和Y，X9存在或不存在，并且如果存在，则选自W、R、S和T，X10选自S、G和L，X11选自S、V、L、G和Y，X12存在或不存在，并且如果存在，则选自F、Y和W，X13选自Y、P、S和H，X14存在或不存在，并且如果存在，则选自Y、P、D和H，X15选自Y、K和F，X16存在或不存在，并且如果存在，则为Y，X17存在或不存在，并且如果存在，则为Y，并且X18选自M和L。

[0333] 在一些情况下，抗原结合蛋白包含具有上述共有序列之一的至少一个重链CDR1、CDR2或CDR3。在一些情况下，抗原结合蛋白包含具有上述共有序列之一的至少一个轻链
CDR1，CDR2或CDR3。在其它情况下，抗原结合蛋白包含根据上述共有序列的至少两个重链
CDR，和/或根据上述共有序列的至少两个轻链CDR。在其它情况下，抗原结合蛋白包含根据上述共有序列的至少三个重链CDR，和/或根据上述共有序列的至少三个轻链CDR。

[0334] 示例性抗原结合蛋白

[0335] 根据一个方面，提供了一种结合CGRP R的分离的抗原结合蛋白，其包含(A)一个或多个选自下列的重链互补决定区(CDRH)：(i) CDRH1，其选自SEQ ID NO:73、76、79、82、85、
88、92、97和100；(ii) CDRH2，其选自SEQ ID NO:74、77、80、83、86、89、91、93、95、98、101和
129；(iii) CDRH3，其选自SEQ ID NO:75、78、81、84、87、90、96、99、102和123；和(iv)包含一个或多个(例如一、二、三、四或四个以上)氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRH，所述氨基酸取代、缺失或插入不超过五、四、三、四、二或一个氨基酸；(B)一个或多个选自下列的轻链互补决定区(CDRL)：(i) CDRL1，其选自SEQ ID NO:42、45、48、51、54、57、
62、65、66和69；(ii) CDRL2，其选自SEQ ID NO:43、46、49、52、55、58、61、63、67和70；(iii) CDRL3，其选自SEQ ID NO:44、47、50、53、56、59、64、68、71和72；和(iv)包含一个或多个(例如一、二、三、四或四个以上)氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRL，所述氨基酸取代、缺失或插入不超过五、四、三、四、二或一个氨基酸；或(C)(A)的一个或多个重链CDRH和(B)的一个或多个轻链CDRL。

[0336] 在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白可包含(A)选自下列的CDRH：(i) CDRH1，其选自SEQ ID NO:73、76、79、82、85、88、92、97和100；(ii) CDRH2，其选自SEQ ID NO:74、77、80、83、86、89、91、93、95、98、101和129；和(iii) CDRH3，其选自SEQ ID NO:75、
78、81、84、87、90、96、99、102和123；(B)选自下列的CDRL：(i) CDRL1，其选自SEQ ID NO:42、
45、48、51、54、57、62、65、66和69；(ii) CDRL2，其选自SEQ ID NO:43、46、49、52、55、58、61、
63、67和70；和(iii) CDRL3，其选自SEQ ID NO:44、47、50、53、56、59、64、68、71和72；或(C)(A)的一个或多个重链CDRH和(B)的一个或多个轻链CDRL。在一个实施方案中，分离的抗原
结合蛋白可包括(A) SEQ ID NO:73、76、79、82、85、88、92、97和100的CDRH1、SEQ ID NO:74、
77、80、83、86、89、91、93、95、98、101和129的CDRH2和SEQ ID NO:75、78、81、84、87、90、96、
99、102和123的CDRH3；和(B) SEQ ID NO:42、45、48、51、54、57、62、65、66和69的CDRL1、SEQ ID NO:43、46、49、52、55、58、61、63、67和70的CDRL2和SEQ ID NO:44、47、50、53、56、59、64、
68、71和72的CDRL3。

[0337] 在另一个实施方案中，重链可变区(VH)与选自SEQ ID NO:158-170的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的序列同一性，和/或VL与选自SEQ ID NO:
137-153的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的序列同一性。在另一个实施方案中，VH选自SEQ ID NO:158-170，和/或VL选自SEQ ID NO:137-153。

[0338] 在另一个方面，还提供了一种特异性结合(由CGRP R的CRLR和RAMP1组分的氨基酸残基形成的)表位的分离的抗原结合蛋白。

[0339] 在另一个实施方案中，上述所述分离的抗原结合蛋白包含含有至少一个本文所公开的CDRH共有序列的第一氨基酸序列和含有至少一个本文所公开的CDRL共有序列的第二
氨基酸序列。在一个方面，第一氨基酸序列包含至少两个CDRH共有序列，和/或第二氨基酸序列包含至少两个CDRL共有序列。

[0340] 在某些实施方案中，第一和第二氨基酸序列彼此共价键合。

[0341] 在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包括SEQ ID NO:75、78、81、84、87、90、96、99、102和123的CDRH3、SEQ ID NO:74、77、80、83、86、89、91、93、95、
98、101和129的CDRH2和SEQ ID NO:73、76、79、82、85、88、92、97和100的CDRH1；和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包括SEQ ID NO:44、47、50、53、56、59、64、68、71和72的CDRL3、SEQ ID NO:43、46、49、52、55、58、61、63、67和70的CDRL2和SEQ ID NO:42、45、48、51、
54、57、62、65、66和69的CDRL1。

[0342] 在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含重链序列H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12或H13的至少两个CDRH序列，如表5A所示。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含轻链序列L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16或L17的至少两个CDRL序列，如表5B中所示。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含重链序列H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12或H13的至少两个CDRH序列(如表5A中所示)，和轻链序列L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16或L17的至少两个CDRL(如表5B中所示)。

[0343] 在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含重链序列H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12或H13的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列，如表5A中所示。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含轻链序列L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16或L17的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列，如表5B中所示。

[0344] 在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含L1和H1，或L2和H2，或L3和H3，或L4和H4，或L5和H5，或L6和H1，或L7和H6，或L8和H5，或L9和H1，或L10和H7，或L11和H8，或L12和H9，或L12和H10，或L13和H5，或L14和H11，或L15和H12，或L16和H13，或L17和H13的所有六个CDR，如表5A和5B中所示。

[0345] 表5A–示例性重链氨基酸序列区域

[0346]

[0347]

[0348] 表5B–示例性轻链氨基酸序列区域

[0349]

[0350]

[0351] 在一个方面，本文所提供的分离的抗原结合蛋白可为单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体抗原结合片段。

[0352] 在另一个实施方案中，本文所提供的分离的抗原结合蛋白的抗体片段可为Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。

[0353] 在另一个实施方案中，本文所提供的分离的抗原结合蛋白为人抗体，并且可为IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。

[0354] 在另一个实施方案中，抗原结合蛋白仅由表5A-5B中所述的轻链或重链多肽组成。在一些实施方案中，抗原结合蛋白仅由表5A-5B中列出的轻链可变域或重链可变域组成。此类抗原结合蛋白可通过一个或多个PEG分子进行聚乙二醇化。

[0355] 在另一个方面，本文所提供的分离的抗原结合蛋白可偶联至标记基团，并且可与本文所提供的分离的抗原结合蛋白之一竞争结合人CGRP R的细胞外部分。在一个实施方案
中，本文所提供的分离的抗原结合蛋白在施用给患者时可降低单核细胞趋化性、抑制单核
细胞迁移到肿瘤中或抑制肿瘤中肿瘤相关巨噬细胞的聚集和功能。

[0356] 正如本领域的技术人员所理解，对于具有不止一个来自所述序列的CDR的任何抗原结合蛋白，独立选自所述序列的CDR的任何组合均可用。因此，可产生具有一、二、三、四、五或六个独立选择的CDR的抗原结合蛋白。然而，正如本领域的技术人员所理解，具体实施方案通常利用非重复CDR的组合，例如，抗原结合蛋白通常不具有两个CDRH2区等。

[0357] 下文中对所提供的一些抗原结合蛋白进行更详细的描述。

[0358] 抗原结合蛋白和结合表位及结合域

[0359] 当称抗原结合蛋白结合表位(诸如CGRP R中的一种或两种组分，或CGRP R的胞外域)时，(例如)是指抗原结合蛋白特异性结合CGRP R的特定部分，其可位于CRLR、RAMP1上或CRLR和RAMP1的全长部分(span portion)上。在抗原结合蛋白仅结合CRLR(而不结合RAMP1)
的情况下，预期抗原结合蛋白不会选择性结合CGRP R，因为CRLR尤其与AM1和AM1受体相似。
类似地，在抗原结合蛋白仅结合RAMP1(而不结合CRLR)的情况下，预期抗原结合蛋白不会选择性结合CGRP R，因为RAMP1尤其与AMY1受体相似。在抗原结合蛋白与CRLR和RAMP1均相互
作用的情况下，预期抗原结合蛋白会结合CRLR和RAMP1的残基或残基序列或区域。上述实施方案中均未预期抗原结合蛋白接触CRLR或RAMP1内的每个残基。类似地，预期到并非CRLR、RAMP1或其胞外域内的每个氨基酸取代或缺失均会显著影响结合亲和力。

[0360] 例如实施例10中详述的方法可用于评估多聚体受体(诸如CGRP R)中涉及结合所选抗原结合蛋白的区。

[0361] 竞争性抗原结合蛋白

[0362] 在另一个方面，所提供的抗原结合蛋白与结合上述表位的示例性或“参考”抗体或官能片段之一竞争特异性结合CGRP R。此类抗原结合蛋白还可与本文所例示的抗原结合蛋白之一结合相同表位或重叠表位。预期与所例示或参考抗原结合蛋白竞争或结合相同表位
的抗原结合蛋白和片段可表现出类似的功能特性。所例示的抗原结合蛋白和片段包括表
2A、2B、3、4A、4B、5A和5B中所包括的具有重链和轻链、可变区域VL1-VL17和VH1-VH13以及CDR的那些。因此，作为具体实例，所提供的抗原结合蛋白包括与具有下列序列的抗体竞争的那些：(a)针对表5A和5B所列抗体的所有6个CDR；(b)选自VL1-VL17和VH1-VH13和针对表5A和5B所列抗体所列出的VH和VL；或(c)针对表5A和5B所列抗体而指定的两条轻链和两条重链。合适的参考抗体的其它实例包括其中重链可变区具有对应于鉴别为SEQ ID NO:158-170中任
一序列的序列以及其中轻链可变区具有对应于鉴别为SEQ ID NO:137-153中任一序列的序
列的那些。

[0363] 可例如使用结合测定，诸如下文实施例7中所述的Biacore测定来评估结合竞争性。在该实施例中，针对六种“参考”抗体--五种中和抗体(11D11、3B6、4H6、12G8和9F5)和一种非中和抗体(34E3)中每一者来测试本文所述的19种抗体。表13中所示的测定结果表明，
所有经测试的中和抗体(1E11、1H7、2E7、3B6、3C8、4E4、4H6、5F5、9D4、9F5、10E4、11D11、
11H9、12E8、12G8、13H2和32H7)均结合CGRP R的基本上相同的区，该区不同于所测非中和抗体(32H8、33B5、33E4和34E3)所结合的CGRP R的区。基于这些数据，任一中和抗体在竞争性测定中均可成为示例性参考抗原结合蛋白，尤其是实施例7所述测定中固定的任一种中和
抗体：11D11、3B6、4H6、12G8和9F5。

[0364] 单克隆抗体

[0365] 所提供的抗原结合蛋白包括结合CGRP R的单克隆抗体。可使用本领域中已知的任何技术(例如，使免疫程序完成后自转基因动物收获的脾细胞永生化)产生单克隆抗体。可
使用本领域中已知的任何技术使脾细胞永生化，例如，使其与骨髓瘤细胞融合以产生杂交
瘤。用于产生杂交瘤的融合工序中的骨髓瘤细胞优选地不产生抗体，具有高融合效率，并缺乏酶，使得其不能生长于某些仅支持所需融合细胞(杂交瘤)生长的选择性培养基中。用于
小鼠融合的合适细胞系的实例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XXO Bul；用于大鼠融合的细胞系包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210。可用于细胞融合的其它细胞系为U-
266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。下文实施例2描述了制备单克隆抗体的示例性方法。

[0366] 在某些情况下，按如下步骤制备杂交瘤细胞系：用CGRP R免疫原使动物(例如，具有人免疫球蛋白序列的转基因动物)免疫；从免疫的动物收获脾细胞；使收获的脾细胞与骨髓瘤细胞系融合，从而产生杂交瘤细胞；由杂交瘤细胞建立杂交瘤细胞系，并鉴别产生结合CGRP R的抗体的杂交瘤细胞系(例如，如下面实施例1-3中所述)。此类杂交瘤细胞系及其所产生的抗CGRP R单克隆抗体为本申请的各个方面。

[0367] 可使用本领域中已知的任何技术纯化杂交瘤细胞系所分泌的单克隆抗体。可例如使用cAMP测定(例如下文所述)进一步筛选杂交瘤或mAb，以鉴别具有特定特性的mAb，诸如
结合表达CGRP的细胞的能力、阻断或干扰CGRP配体或CGRP8-37肽结合的能力或在功能上阻
断受体的能力。

[0368] 嵌合及人源化抗体

[0369] 还提供了基于上述序列的嵌合及人源化抗体。用作治疗剂的单克隆抗体可在使用前以多种方式修饰。一个实例为嵌合抗体，其为由不同抗体的蛋白区段组成的抗体，这些蛋白区段共价接合以产生功能性免疫球蛋白轻链或重链或其免疫功能部分。一般而言，该重
链和/或轻链的一部分与源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相
同或同源，而一条或多条链的其余部分与源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体
中的相应序列相同或同源。就与嵌合抗体有关的方法而言，参见例如，美国专利No. 4,816,
567；和Morrison等，1985，Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:6851-6855，这些文献以引用的方式并入本文。CDR移植描述于例如美国专利No. 6,180,370、No. 5,693,762、No. 5,693,
761、No. 5,585,089和No. 5,530,101中。

[0370] 一般而言，制备嵌合抗体的目标为产生其中来自预定患者物种的氨基酸数目最大化的嵌合体。一个实例为“CDR移植”抗体，其中该抗体包含源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的一个或多个互补决定区(CDR)，而一条或多条抗体链的其余部分与源于另一物
种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源。为用于人类，通常将来自
啮齿类动物抗体的可变区或所选CDR移植于人抗体中，从而置换人抗体的天然存在的可变
区或CDR。

[0371] 一种有用类型的嵌合抗体为“人源化”抗体。一般而言，人源化抗体由非人类动物中初始形成的单克隆抗体产生。此单克隆抗体中的某些氨基酸残基(通常来自抗体的非抗原识别部分)经修饰而与相应同种型的人抗体中相应残基同源。可使用多种方法进行人源
化，例如用啮齿类动物可变区的至少一部分取代人抗体的相应区(参见，例如美国专利No. 
5,585,089和No. 5,693,762；Jones等，1986，Nature321:522-525；Riechmann等，1988，Nature332:323-27；Verhoeyen等，1988，Science239:1534-1536)。

[0372] 在一个方面，将本文所提供的抗体的轻链和重链可变区的CDR(参见表4)移植到来自相同或不同系统发生物种的抗体的框架区(FR)。例如，可将重链和轻链可变区VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12和VH13，和/或VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16和VL17的CDR移植到人FR的共有序列中。为形成共有序列人FR，可比对若干人重链或轻链氨基酸序列的FR，以鉴别共有氨基酸序列。在其它实施方案中，用来自不同重链或轻链的FR置换本文所公开的重链或轻链的FR。在一个方
面，抗CGRP R抗体的重链和轻链的FR中的稀有氨基酸未被置换，而其余FR氨基酸被置换。
“稀有氨基酸”为在FR中通常不会发现此特定氨基酸的位置中的特定氨基酸。作为另外一种选择，来自一条重链或轻链的移植可变区可与不同于本文所公开的特定重链或轻链的恒定
区的恒定区一起使用。在其它实施方案中，移植的可变区为单链Fv抗体的一部分。

[0373] 在某些实施方案中，来自除人类以外的物种的恒定区可与一个或多个人可变区一起使用，以产生杂交抗体。

[0374] 完全人抗体

[0375] 还提供完全人抗体。多种方法可用于在不将人暴露于给定抗原的情况下，制备对所述抗原具有特异性的完全人抗体(“完全人抗体”)。所提供的一种用于实施完全人抗体制备的特定方法为小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座引入内源性Ig基因已失活的小鼠中，是一种在小鼠(一种可以用任何所需抗原免疫的动物)体内产生完全
人单克隆抗体(mAb)的方法。使用完全人抗体可使有时会因对人施用作为治疗剂的小鼠mAb
或由小鼠得到的mAb所引起的免疫原性和变应性反应减至最少。

[0376] 可通过免疫能够在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生人抗体库的转基因动物(通常为小鼠)来制备完全人抗体。为此，用于此目的的抗原通常具有六个或六个以上邻
接氨基酸，并且任选地与载体(例如半抗原)缀合。参见，例如Jakobovits等，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:2551-2555；Jakobovits等，1993，Nature362:255-258；和
Bruggermann等，1993，Year in Immunol.7:33。在此类方法的一个实例中，通过使小鼠中编码小鼠重链和轻链免疫球蛋白链的内源性小鼠免疫球蛋白基因座失能，并将含有编码人重
链和轻链蛋白质的基因座的人基因组DNA大片段插入小鼠基因组中，由此产生转基因动物。
随后，对不与人免疫球蛋白基因座完全互补的经部分修饰的动物进行杂交，获得具有所有
所需免疫系统修饰的动物。当施用免疫原时，这些转基因动物产生对免疫原具有免疫特异
性而且具有人而非鼠氨基酸序列(包括可变区)的抗体。有关此类方法的其它细节，参见例
如WO96/33735和WO94/02602。关于用于制备人抗体的转基因小鼠的其它方法描述于美国专
利No. 5,545,807；No. 6,713,610；No. 6,673,986；No. 6,162,963；No. 5,545,807；No. 
6,300,129；No. 6,255,458；No. 5,877,397；No. 5,874,299和No. 5,545,806中；PCT公开案WO91/10741、WO90/04036以及EP 546073B1和EP 546073A1中。

[0377] 上述转基因小鼠(在本文中称为“HuMab小鼠”)包含编码未重排人重链([μ]和[γ])和[κ]轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微小基因座，以及使内源性[μ]和[κ]链基因座失活的靶向突变(Lonberg等，1994，Nature368:856-859)。因此，小鼠表现出低表达的小鼠IgM或[κ]和对免疫的应答，并且所引入的人重链和轻链转基因也经历类别转换和体细胞突变，以产生高亲和力人IgG [κ]单克隆抗体(Lonberg等，见上文；Lonberg和
Huszar，1995，Intern. Rev. Immunol.13: 65-93；Harding和Lonberg，1995，Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546)。HuMab小鼠的制备详细描述于Taylor等，1992，Nucleic Acids Research20:6287-6295；Chen等，1993，International Immunology5:647-656；Tuaillon等，1994，J. Immunol.152:2912-2920；Lonberg等，1994，Nature368:856-859；Lonberg，
1994，Handbook of Exp. Pharmacology113:49-101；Taylor等，1994，International 
Immunology6:579-591；Lonberg和Huszar，1995，Intern. Rev. Immunol.13:65-93；
Harding和Lonberg，1995，Ann. N.Y Acad. Sci.764:536-546；Fishwild等，1996，Nature Biotechnology14:845-851；上述参考文献的全文在此以引用的方式并入本文以用于所有
目的。另外参见美国专利No. 5,545,806；No. 5,569,825；No. 5,625,126；No. 5,633,425；
No. 5,789,650；No. 5,877,397；No. 5,661,016；No. 5,814,318；No. 5,874,299；和No. 
5,770,429；以及美国专利No. 5,545,807；国际公开案No.WO 93/1227；No.WO 92/22646；和No.WO 92/03918，所有这些专利的公开内容的全文以引用的方式并入本文以用于所有目
的。用于在这些转基因小鼠中产生人抗体的技术还公开于WO 98/24893和Mendez等，1997，Nature Genetics15:146-156，这些文献以引用方式并入。例如，可使用HCo7和HCo12转基因小鼠品系产生抗CGRP R抗体。有关使用转基因小鼠产生人抗体的其它细节提供于下文各实
施例中。

[0378] 使用杂交瘤技术，可产生具有所需特异性的抗原特异性人mAb，并且所述mAb可选自诸如上文所述的转基因小鼠。可使用合适的载体和宿主细胞来克隆和表达此类抗体，或
可从培养杂交瘤细胞中收获所述抗体。

[0379] 完全人抗体也可源于噬菌体展示文库(如Hoogenboom等，1991，J. Mol. Biol.227:381；和Marks等，1991，J. Mol. Biol.222:581中所公开)。噬菌体展示技术通过在丝状噬菌体的表面上展示抗体谱，随后通过其与所选抗原的结合来选择噬菌体，从而模
拟免疫选择。一种此类技术描述于PCT公开案No.WO 99/10494(以引用的方式并入本文)，其描述使用此类方法分离针对MPL受体和msk受体的具有高亲和力和功能性的激动型抗体。

[0380] 双特异性或双功能抗原结合蛋白

[0381] 所提供的抗原结合蛋白还包括双特异性和双功能抗体，其包括如上文所述的一个或多个CDR或一个或多个可变区。在一些情况下，双特异性或双功能抗体是具有两个不同重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可通过多种方法产生，包括但不限于融合杂交瘤或连接Fab'片段。参见例如、Songsivilai和Lachmann，1990，Clin. Exp. Immunol.79:315-321；Kostelny等，1992，J. Immunol.148:1547-1553。

[0382] 各种其它形式

[0383] 所提供的一些抗原结合蛋白为上文所公开的抗原结合蛋白(例如，具有表2-5中所列序列的那些)的变体形式。例如，一些抗原结合蛋白在一个或多个表2-5中所列的重链或
轻链、可变区或CDR中具有一个或多个保守氨基酸取代。

[0384] 可根据常见的侧链特性将天然存在的氨基酸分成以下几类：

[0385] 1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

[0386] 2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

[0387] 3)酸性：Asp、Glu；

[0388] 4)碱性：His、Lys、Arg；

[0389] 5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和

[0390] 6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

[0391] 保守氨基酸取代可涉及这些类别之一的成员与同一类别中的另一成员的交换。保守氨基酸取代可涵盖非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而非生物系统中的
合成并入。这些氨基酸残基包括拟肽和其它反向或逆向形式的氨基酸部分。

[0392] 非保守取代可涉及一种上述类别中的成员与另一类别成员的交换。可将所述经取代的残基引入与人抗体同源的抗体区中，或引入所述分子的非同源区中。

[0393] 在进行此类改变的过程中，根据某些实施方案，可考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。通过对各氨基酸指定数值(“亲水指数”)，随后沿肽链对所述值反复求平均值，以此计算出蛋白质的亲水性分布。已根据各氨基酸的疏水性和电荷特征指定其
亲水指数。所述亲水指数为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯基丙氨酸(+
2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-
0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-
4.5)。

[0394] 本领域中己了解亲水性分布对赋予蛋白质以相互作用生物功能中的重要性(参见，例如Kyte等，1982，J. Mol. Biol.157:105-131)。己知某些氨基酸可取代亲水指数或分数类似的其它氨基酸，并且仍保持类似的生物活性。在根据亲水性指数进行变化时，在某些实施方案中，包括亲水指数在±2以内的氨基酸的取代。在一些方面中，包括亲水指数在±1
以内的氨基酸取代，而在其它方面中，包括亲水指数在±5以内的氨基酸取代。

[0395] 在本领域中还可理解，在本案中，可根据亲水性来有效进行类似氨基酸的取代，尤其在打算将由此产生的生物功能性蛋白质或肽用于免疫学实施方案中时。在某些实施方案中，当受到相邻氨基酸的亲水性影响时，蛋白质的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗
原结合或免疫原性相关，即，与所述蛋白质的生物特性相关。

[0396] 已指定这些氨基酸胺基酸残基以下亲水值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸盐(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯基丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在根据类似亲水值进行变化时，在某些实施方案中，包括亲水值在±2内的氨基酸取代，在其它实施方案中，包括亲水值在±1内的氨基酸取代，而在其它实
施方案中，包括亲水值在±0.5内的氨基酸取代。在某些情况下，还可根据亲水性鉴别来自
主要氨基酸序列的表位。这些区域也称为“表位核心区”。

[0397] 表6中阐述了示例性保守氨基酸取代。

[0398] 表6：保守氨基酸取代

[0399] 初始残基 示例性取代Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln、His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn、Gln
Ile Leu、Val
Leu Ile、Val
Lys Arg、Gln、Glu
Met Leu、Ile
Phe Met、Leu、Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp、Phe
Val Ile、Leu

[0400] 技术人员将能够使用熟知的技术确定本文所述多肽的适当变体。本领域的技术人员可通过靶向被认为对活性而言并不重要的区来鉴别可在不破坏活性的情况下发生变化
的分子的合适区域。技术人员也将能鉴别在类似多肽间保守的分子残基和部分。在其它实
施方案中，甚至还可以对可能对生物活性或结构重要的区域进行保守氨基酸取代，而不会
破坏生物活性或不会对多肽结构产生不利影响。

[0401] 另外，本领域的技术人员可回顾用于鉴别类似多肽中对活性或结构重要的残基的结构-功能研究。鉴于此类比较，可预测一种蛋白质中与相似蛋白质中对活性或结构重要的氨基酸残基对应的氨基酸残基的重要性。对于此类所预测的重要氨基酸残基，本领域的技
术人员可选用化学上类似的氨基酸取代。

[0402] 本领域的技术人员还可相对于类似多肽的结构来分析三维结构和氨基酸序列。鉴于此类信息，本领域的技术人员可针对抗体的氨基酸残基的三维结构预测其比对。本领域
的技术人员可选择使预测位于蛋自质表面上的氨基酸残基不发生根本变化，因为此类残基
可能涉及与其它分子的重要相互作用。此外，本领域的技术人员可产生在各所需氨基酸残
基处含有单一氨基酸取代的测试变体。随后可使用针对CGRP R中和活性的测定(参见下文
的实施例)筛选这些变体，从而得到有关何种氨基酸能改变，而何种氨基酸不能改变的信
息。换句话讲，根据从这些常规实验收集到的信息，本领域的技术人员易于确定其中应避免进一步取代(单独或与其它突变组合)的氨基酸位置。

[0403] 许多科学出版物已致力于预测二级结构。参见Moult1996，Curr. Op. in Biotech.7:422-427；Chou等，1974，Biochem.13:222-245；Chou等，1974，Biochemistry113:
211-222；Chou等，1978，Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol.47:45-148；Chou等，
1979，Ann. Rev. Biochem.47:251-276；和Chou等，1979，Biophys. J.26:367-384。此外，当前可使用计算机程序来辅助预测二级结构。一种预测二级结构的方法是基于同源建模。例
如，序列同一性大于30%或相似性大于40%的两种多肽或蛋白质可具有类似的拓扑结构。近
来蛋白质结构数据库(CDB)的扩充己使得二级结构(包括多肽结构或蛋白质结构内的可能
折叠数量)的可预测性增强。参见Holm等，1999，Nucl. Acid. Res.27:244-247。己提出
(Brenner等，1997，Curr. Op. Struct. Biol.7:369-376)给定多肽或蛋白质中存在有限数量的折叠，并且一旦解析出临界数量的结构后，结构预测就会明显变得更为准确。

[0404] 预测二级结构的其它方法包括“穿引法(threading)”(Jones1997，Curr. Opin. Struct. Biol.7:377-387；Sippl等，1996，Structure4:15-19)、“概况分析法(profile analysis)”(Bowie等，1991，Science253:164-170；Gribskov等，1990，Meth. Enzym.183:
146-159；Gribskov等，1987，Proc. Nat. Acad. Sci.84:4355-4358)和“进化关联法
(evolutionary linkage)”(参见Holm，1999，见上文；和Brenner，1997，见上文)。

[0405] 在一些实施方案中，进行氨基酸取代，从而：(1)降低对蛋白水解的敏感性；(2)降低对氧化的敏感性；(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力；(4)改变配体或抗原结合亲和力；和/或(4)赋予或修饰此类多肽的其它物理化学或功能特性。例如，可在天然存在的序列中进行单一或多个氨基酸取代(在某些实施方案中为保守氨基酸取代)。可在抗体中位于形
成分子间接触面的一个或多个域外的部分中进行取代。在此类实施方案中，可使用基本上
不会改变亲本序列的结构特征的保守氨基酸取代(例如，不会破坏表征亲本或天然抗原结
合蛋自的二级结构的一个或多个取代氨基酸)。本领域公认的多肽二级结构和三级结构的
实例描述于Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton编著)，1984，W. H. New York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure(Branden和
Tooze编著)，1991，New York: Garland Publishing；和Thornton等，1991，Nature354:105，这些文献各自以引用的方式并入本文。

[0406] 其它优选的抗体变体包括半胱氨酸变体，其中亲本或天然氨基酸序列中的一个或多个半胱氨酸残基已缺失或被另一氨基酸(例如，丝氨酸)取代。半胱氨酸变体是有用的，尤其当必须将抗体再折叠成生物活性构象时。半胱氨酸变体可具有比天然抗体少的半胱氨酸
残基，并且通常具有偶数个半胱氨酸残基，以将不成对的半胱氨酸所产生的相互作用减到
最小。

[0407] 所公开的重链和轻链、可变区域和CDR均可用于制备包含可特异性结合CGRP R的抗原结合区的多肽。例如，可将表4和5中所列的一个或多个CDR共价或非共价并入分子(例
如，多肽)中以产生免疫粘附。免疫粘附可合并一个或多个CDR作为较大多肽链的一部分，可使一个或多个CDR与另一多肽链共价连接，或可以非共价方式合并一个或多个CDR。一个或
多个CDR使免疫粘附能够与特定目标抗原(例如，CGRP R或其表位)特异性结合。

[0408] 还提供了基于本文所述的可变区域和CDR的模拟物(例如，“肽模拟物”或“拟肽”)。这些类似物可为肽、非肽或肽与非肽区的组合。Fauchere，1986，Adv。Drug Res。15:29；
Veber和Freidinger，1985，TINS第392页；和Evans等，1987，J. Med. Chem.30:1229，这些文献均以引用的方式并入本文而用于任何目的。结构类似于治疗上有用肽的肽模拟物可用于
产生类似的治疗或预防效果。通常借助于计算机分子建模开发此类化合物。一般而言，模拟肽是结构类似于呈现所需生物活性(例如本文中与CGRP R特异性结合的能力)的抗体但一
个或多个肽键任选通过本领域中熟知的方法被选自以下的键取代的蛋白质：-CH2NH-、-
CH2S-、-CH2-CH2-、-CH-CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-。在某些实施方案中，用相同类型的D-氨基酸系统性取代共有序列中的一个或多个氨基酸(例如，以D-赖氨酸替代L-赖氨酸)，可用于产生更为稳定的蛋白质。此外，可通过本领域中已知的方法(Rizo和Gierasch，1992，Ann. Rev. Biochem. 61:387，其以引用的方式方并入本文)，例如通过添加能够形成使肽环化的分子内二硫桥键的内部半胱氨酸残基，来产生包含共有序列或基本
上相同的共有序列变异的有序结构肽。

[0409] 还提供本文所述的抗原结合蛋白的衍生物。衍生化抗原结合蛋白可包含赋予抗体或片段以所需特性(例如在特定用途中较长的半衰期)的任何分子或物质。衍生化抗原结合
蛋白可包含例如可检测(或标记)部分(例如，放射性、比色、抗原或酶分子)、可检测珠粒(诸如磁性珠粒或电致密(例如金)珠粒)，或与另一分子结合的分子(例如生物素或抗生蛋白链
菌素)、治疗或诊断部分(例如放射性、细胞毒性或药学活性部分)，或增加抗原结合蛋白用于特定用途(例如，施用给诸如人类受试者的受试者，或其它体内或体外用途)的适用性的
分子。可用于使抗原结合蛋白衍生化的分子的实例包括白蛋白(例如，人血清白蛋白)和聚
乙二醇(PEG)。使用本领域的技术人员熟知的技术来制备抗原结合蛋白的白蛋白连接衍生
物和聚乙二醇化衍生物。某些抗原结合蛋白包括本文所述的聚乙二醇化单链多肽。在一个
实施方案中，抗原结合蛋白缀合至或以其它方式连接至运甲状腺素蛋白(TTR)或TTR变体。
可通过例如选自下列的化学物质对TTR或TTR变体进行化学修饰：葡聚糖、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇和聚乙烯醇。

[0410] 其它衍生物包括例如通过表达重组融合蛋白得到的CGRP R结合蛋白与其它蛋白质或多肽的共价或聚集缀合物，该重组融合蛋白包含与CGRP R结合蛋白的N末端或C末端融
合的异源多肽。例如，缀合肽可为异源信号(或前导)多肽，例如，酵母α因子前导肽或诸如表位标记之类的肽。包含CGRP抗原结合蛋白的融合蛋白可包含经添加以利于CGRP R结合蛋白
的纯化或鉴别的肽(例如，多组氨酸)。CGRP R结合蛋白还可连接至FLAG肽，如Hopp等，1998，Bio/Technology6:1204；和美国专利No. 5,011,912中所述。FLAG肽具有高抗原性，并且提供特异性单克隆抗体(mAb)能可逆结合的表位，从而能够快速分析和易于纯化所表达的重
组蛋白。适用于制备其中FLAG肽与给定多肽融合的融合蛋白的试剂可商购获得(Sigma，St. Louis，MO)。

[0411] 包含一个或多个CGRP R结合蛋白的寡聚物可用作CGRP R拮抗剂。寡聚物可为共价连接或非共价连接的二聚体、三聚体或更高寡聚物的形式。设想包含两个或更多个CGRP R
结合蛋白的寡聚物以供使用，其中一个实例为同源二聚体。其它寡聚物包括异源二聚体、同源三聚体、异源三聚体、同源四聚体、异源四聚体等。

[0412] 一个实施方案针对包含多个CGRP R结合多肽的寡聚物，所述CGRP R结合多肽经由与CGRP R结合蛋白融合的各个肽部分之间的共价或非共价相互作用接合。此类肽可为肽连
接子(间隔子)或具有促进寡聚化特性的肽。如下文将更详细地描述，亮氨酸拉链和某些来
源于抗体的多肽为可促进与其连接的CGRP R结合蛋白寡聚化的肽。

[0413] 在特定的实施方案，寡聚物包含两个至四个CGRP R结合蛋白。寡聚物中的CGRP R结合蛋白部分可以是上述任何形式，例如，变体或片段。优选地，寡聚物包含具有CGRP R结合活性的CGRP R结合蛋白。

[0414] 在一个实施方案中，使用源于免疫球蛋白的多肽制备寡聚物。包含某些异源多肽与抗体来源多肽的各个部分(包括Fc域)融合的融合蛋白的制备已描述于例如Ashkenazi
等，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:10535；Byrn等，1990，Nature344:677；和
Hollenbaugh等，1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins"，Current 
Protocols in Immunology，增刊4，第10.19.1-10.19.11页。

[0415] 一个实施方案针对包含通过将CGRP R结合蛋白与抗体Fc区融合而形成的两个融合蛋白的二聚体。例如，可通过如下方式制备二聚体：将编码融合蛋白的基因融合物插入适当表达载体中，在用重组表达载体转化过的宿主细胞中表达该基因融合物，并使所表达的
融合蛋白组装成极为类似的抗体分子，随后在Fc部分之间形成链间二硫键，由此得到二聚
体。

[0416] 如本文所使用，术语“Fc多肽”包括源于抗体Fc区的多肽的天然和突变蛋白形式。也包括含有促进二聚化的铰链区的此类多肽的截短形式。包含Fc部分的融合蛋白(和由其
形成的寡聚物)提供了有利于在蛋白质A或蛋白质G柱上经由亲和层析纯化的优点。

[0417] PCT申请案WO 93/10151和美国专利No. 5,426,048和No. 5,262,522中描述了一种合适的Fc多肽，其为从人IgG1抗体的Fc区的N末端铰链区延伸至天然C末端的单链多肽。
另一种有用的Fc多肽为美国专利No. 5,457,035和Baum等，1994，EMBO J.13:3992-4001中
所述的Fc突变蛋白。除了氨基酸19从Leu变为Ala，氨基酸20从Leu变为Glu并且氨基酸22从
Gly变为Ala外，此突变蛋白的氨基酸序列与WO 93/10151中所提供的天然Fc序列具有同一
性。突变蛋白表现出对Fc受体的降低的亲和力。

[0418] 在其它实施方案中，诸如本文所公开的CGRP R结合蛋白的重链和/或轻链可变部分可取代抗体重链和/或轻链的可变部分。

[0419] 作为另外一种选择，寡聚物为包含多个CGRP R结合蛋白、具有或不具有肽连接子(间隔肽)的融合蛋白。合适的肽连接子为美国专利 No. 4,751,180和No. 4,935,233中所
述的连接子。

[0420] 另一种制备寡聚CGRP R结合蛋白衍生物的方法涉及使用亮氨酸拉链。亮氨酸拉链域为促进其所存在的蛋白质寡聚化的肽。亮氨酸拉链最初是在若干种DNA结合蛋白中得以
鉴别(Landschulz等，1998，Science240:1759)并且现已在多种不同的蛋白质中发现。已知的亮氨酸拉链为天然存在的肽及其二聚或三聚衍生物。适于产生可溶性寡聚蛋白质的亮氨
酸拉链域的实例描述于PCT申请案WO 94/10308中，并且源于肺表面活性蛋白D(SPD)的亮氨
酸拉链描述于Hoppe等，1994，FEBS Letters344:191中，其在此以引用的方式并入。使与其融合的异源蛋白质稳定三聚化的经修饰的亮氨酸拉链的用途描述于Fanslow等，1994，
Semin. Immunol.6:267-278中。在一种方法中，在合适的宿主细胞中表达包含CGRP R结合
蛋白片段或衍生物的与亮氨酸拉链肽融合的重组融合蛋白，并且从培养物上清液中回收所
形成的可溶性寡聚CGRP R结合蛋白片段或衍生物。

[0421] 在某些实施方案中，抗原结合蛋白具有小于1pM、10pM、100pM、1nM、2nM、5nM、10nM、25nM或50nM的KD(平衡结合亲和力)。

[0422] 另一方面提供一种在体外或体内(例如，当施用给人受试者时)的半衰期为至少一天的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，抗原结合蛋白的半衰期为至少三天。在另一个实施方案中，抗体或其部分的半衰期为四天或更长。在另一个实施方案中，抗体或其部分的半衰期为八天或更长。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分经衍生化或修饰，使得其半衰期比未衍生化或未经修饰的抗体长。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含点突变以
增加血清半衰期，例如2000年2月14日公开的WO 00/09560中所述，其以引用的方式并入。

[0423] 糖基化

[0424] 抗原结合蛋白可具有与天然物种中存在的糖基化模式不同或由其改变而来。糖基化模式可取决于蛋白质的序列(例如，特定糖基化氨基酸残基的存在或不存在，如下文所讨论)或产生蛋白质的宿主细胞或生物体。特定表达系统将于下文中讨论。

[0425] 多肽的糖基化通常为N连接或O连接。N连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为除脯氨酸外的任
何氨基酸)是将碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列的任一者的存在均会产生潜在糖基化位点。O连接糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一者与羟氨基酸(最通常为丝氨酸或苏氨酸)的连接，但也可使用5-羟脯氨
酸或5-羟赖氨酸。

[0426] 宜通过改变氨基酸序列以使其含有一个或多个上述三肽序列，从而实现抗原结合蛋白中糖基化位点的添加(对于N连接糖基化位点而言)。可通过将一个或多个丝氨酸或苏
氨酸残基添加至起始序列或被这些残基取代来进行改变(对于O连接糖基化位点而言)。出
于简易起见，可通过在DNA水平上的改变，尤其通过使编码目标多肽的DNA在预先选择的碱
基处突变(以产生将翻译成所需氨基酸的密码子)来改变抗原结合蛋白氨基酸序列。

[0427] 另一种增加抗原结合蛋白上碳水化合物部分的数量的方式为使糖苷与蛋白质化学或酶促偶合。这些工序的优点在于其不需要在宿主细胞内产生具有糖基化能力(针对N-
连接糖基化和O-连接糖基化)的蛋白质。根据所用偶合模式，可将一种或多种糖连接至(a)
精氨酸和组氨酸、(b)游离羧基、(c)游离巯基(诸如半胱氨酸的巯基)、(d)游离羟基(诸如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基)、(e)芳族残基(诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基)或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于1987年9月11日公开的WO 87/05330以及
Aplin和Wriston，1981，CRC Crit. Rev，Biochem.，第259-306页中。

[0428] 可通过化学或酶促方式移除起始抗原结合蛋白上存在的碳水化合物部分。化学去糖基化需要将蛋白质暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物中。此处理会导致除连接糖
(N-乙酰氨基葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外的大部分或所有糖裂解，同时保留多肽完整性。
化学去糖基化由Hakimuddin等，1987，Arch. Biochem. Biophys.259:52和Edge等，1981，Anal. Biochem.118:131描述。可使用多种内切和外切糖苷酶来实现多肽上的碳水化合物
部分的酶促裂解，如Thotakura等，1987，Meth. Enzymol.138:350中所述。可使用化合物衣霉素来防止潜在糖基化位点上的糖基化，如Duskin等，1982，J. Biol. Chem.257:3105所
述。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键的形成。

[0429] 因此，各个方面包括抗原结合蛋白的糖基化变体，其中(多个)糖基化位点的数量和/或类型相比亲本多肽的氨基酸序列己经改变。在某些实施方案中，抗体蛋白质变体包含的N连接糖基化位点的数量多于或少于天然抗体。N连接糖基化位点以序列：Asn-X-Ser或
Asn-X-Thr为特征，其中X所表示的氨基酸残基可为除脯氨酸外的任何氨基酸残基。取代氨
基酸残基以形成此序列提供了用于添加N连接碳水化合物链的潜在新位点。作为另外一种
选择，消除或改变此序列的取代将防止天然多肽中存在的N连接碳水化合物链的增加。例
如，可通过缺失Asn或通过用不同氨基酸取代Asn来减少糖基化。在其它实施方案中，形成一个或多个新N连接位点。抗体通常在Fc区中具有N连接糖基化位点。

[0430] 标记和效应器基团

[0431] 在一些实施方案中，抗原结合包含一个或多个标记。术语“标记基团”或“标记”是指任何可检测的标记。合适的标记基团的实例包括但不限于下列标记基团：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如，FITC、若丹明、镧系元素磷光体)、酶基团(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团或由第二报告基因识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合域、附加表位)。在一些实施方案中，标记基团经由各种长度的间隔臂偶联至抗原结合蛋白，以降低潜在的空间位阻。多种标记蛋白质的方法是本
领域中已知的，并在适当时可进行使用。

[0432] 术语“效应器基团”是指充当细胞毒素剂的与抗原结合蛋白偶联的任何基团。合适的效应基团的实例为放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I131
、 I)。其它合适的基团包括毒素、治疗基团或化学治疗基团。合适基团的实例包括卡奇霉素(calicheamicin)、奥瑞他汀(auristatins)、格尔德霉素(geldanamycin)和美登素
(maytansine)。在一些实施方案中，效应基团经由各种长度的间隔臂偶联至抗原结合蛋白，以降低潜在的空间位阻。

[0433] 一般而言，根据检测标记的分析将其分为以下类别：a)同位素标记，其可为放射性同位素或重同位素；b)磁性标记(例如，磁性粒子)；c)氧化还原活性部分；d)光学染料；酶基团(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；e)生物素酰化基团；和f)第二报告基因识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合域、表位标记等)。在一些实施方案中，标记基团经由各种长度的间隔臂偶联至抗原结合蛋白，以降低潜在的空间位阻。多种标记蛋白质的方法是本领域中已知的。

[0434] 特异性标记包括光学染料，包括但不限于发色团、磷光体和荧光团，其中荧光团在许多情况具有特异性。荧光团可为“小分子”荧光团或蛋白质荧光团。

[0435] 所谓“荧光标记”是指可经由固有荧光特性检测的任何分子。合适的荧光标记包括但不限于荧光素、若丹明、四甲基若丹明、伊红(eosin)、赤藓红(erythrosin)、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿(Malacite green)、芪、萤光黄(Lucifer Yellow)、层叠蓝J(Cascade BlueJ)、德克萨斯红(Texas Red)、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、俄勒冈绿(Oregon green)、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、层叠蓝、层叠黄
(Cascade Yellow)和R-藻红蛋白(PE)(Molecular Probes，Eugene，OR)、FITC、若丹明和德克萨斯红(Pierce，Rockford，IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science，Pittsburgh，PA)。合适的光学染料(包括荧光团)描述于Richard P. Haugland的Molecular Probes 
Handbook中，其在此以引用的方式清楚地并入。

[0436] 合适的蛋白质荧光标记还包括但不限于绿色荧光蛋白，包括海肾(Renilla)、海笔(Ptilosarcus)或水母(Aequorea)物种的GFP(Chalfie等，1994，Science263:802-805)、
EGFP(Clontech Labs.，Inc.，Genbank Accession Number U55762)、蓝色荧光蛋白(BFP，Quantum Biotechnologies，Inc.，Quebec，Canada；Stauber，1998，Biotechniques24:462-
471；Heim等，1996，Curr. Biol.6:178-182)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP，Clontech Labs.，Inc.)、荧光素酶(Ichiki等，1993，J. Immunol.150:5408-5417)、β半乳醣苷酶(Nolan等，
1998，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.85:2603-2607)和海肾(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美国专利No. 5292658、No. 5418155、No. 5683888、No. 5741668、No. 5777079、No. 5804387、No. 5874304、No. 5876995、No. 5925558)。

[0437] 编码CGRP抗原结合蛋白的核酸序列

[0438] 还提供编码本文所述的抗原结合蛋白或其部分的核酸，包括编码抗体或其片段、衍生物、突变蛋白或其变异体的一条链或两条链的核酸；编码重链可变区或仅CDR的多核苷酸；足以用作杂交探针的多核苷酸；用于鉴别、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸的PCR引物或测序引物；用于抑制多核苷酸表达的反义核酸；以及前述的互补序列。核酸可具有任何长度。其长度可为例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、
300、350、400、450、500、750、1,000、1,500或以上核苷酸，和/或可包含一个或多个附加序列，例如调节序列和/或为较大核酸(例如载体)的一部分。该核酸可为单链或双链，并且可包含RNA和/或DNA核苷酸和其人工变体(例如，肽核酸)。

[0439] 表7示出编码IgG2重链恒定区、κ轻链恒定区和λ hCL-1轻链恒定区的示例性核酸序列。可将本文所提供的任何可变区与这些恒定区连接，以形成完整的重链和轻链序列。然而，应理解，这些恒定区序列只是作为具体实例而提供，本领域的技术人员可采用其它恒定区，包括IgG1重链恒定区、IgG3或IgG4重链恒定区、七个λ轻链恒定区(包括hCL-1、hCL-2、hCL-3和hCL-7)中的任一者；已经修饰以改善稳定性、表达、可制造性或其它所需特性等的恒定区。在一些实施方案中，可变区序列与本领域中己知的其它恒定区序列接合。表8提供了编码重链和轻链可变区的示例性核酸序列。

[0440] 表7：示例性重链和轻链恒定区核酸序列

[0441]

[0442]

[0443] 表8示出编码重链和轻链可变区的示例性核酸序列，其中有不同的CDRL1、CDRL2和CDRL3或CDRH1、CDRH2和CDRH3序列嵌入。

[0444] 表8：示例性轻链和重链可变区核酸序列

[0445]

[0446]

[0447]

[0448]

[0449]

[0450]

[0451]

[0452]

[0453]

[0454]

[0455]

[0456]

[0457]

[0458] 表9示出编码本文所公开的示例性分离抗原结合蛋白(特别是hCGRP R结合蛋白)的完整重链和轻链以及重链和轻链可变区的示例性核酸序列的SEQ ID NO。

[0459] 表9-示例性HC、LC、VH和VL核酸序列SEQ ID NO

[0460]

[0461]

[0462] 可从小鼠的B细胞中分离出编码某些抗原结合蛋白或其部分(例如，全长抗体、重链或轻链、可变域或CDRH1、CDRH2，CDRH3，CDRL1、CDRL2或CDRL3)的核酸，该小鼠已用CGRP R或其免疫原性组分免疫，例如通过用以下来免疫：全长CGRP R(包含CRLR和RAMP1)、CGRP R的胞外域(包含CRLR和RAMP1的胞外域)、表达CGRP R的全细胞、由表达CGRP R的细胞所制备的膜、融合蛋白(例如包含CRLR、RAMP1(或其胞外域)与Fc融合的Fc融合物)，以及本领域中已知的其它方法，例如，本文实施例1-3中所述。可通过常规工序(诸如聚合酶链反应(PCR))分离核酸。噬菌体展示是另一种可用以制备抗体和其它抗原结合蛋白的衍生物的已知技术
的实例。在一种方法中，作为目标抗原结合蛋白的组分的多肽在任何合适的重组表达系统
中表达，并且使所表达的多肽组装形成抗原结合蛋白分子。

[0463] 表7-9中所提供的核酸仅为示例性的。由于遗传密码的简并性，表2-5中所列或在本文中以其它方式描述的各多肽序列也可由除所提供的核酸序列外的大量其它核酸序列
编码。本领域的技术人员将了解，本申请因此提供编码各抗原结合蛋白的各简并核苷酸序
列的适当书面描述和实现。

[0464] 一个方面还提供了在特定杂交条件下与其它核酸(例如，包含表7、表8、表9中所列的核苷酸序列的核酸)杂交的核酸。用于核酸杂交的方法为本领域所熟知。参见例如Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-
6.3.6。如本文所定义，中等严格杂交条件使用含有5×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5% SDS、
1.0mM EDTA(pH 8.0)的预洗溶液，含有约50%甲酰胺、6×SSC的杂交缓冲液，和55℃的杂交
温度(或其它类似杂交溶液，例如在42℃的杂交温度下，含有约50%甲酰胺的溶液)，以及60℃、0.5×SSC、0.1%SDS的洗涤条件。严格的杂交条件是在6×SSC中于45℃下杂交，然后在68℃下于0.1×SSC、0.2%SDS中洗涤一次或多次。此外，本领域的技术人员可操纵杂交和/或洗涤条件，以增加或降低杂交的严格度，使得包含彼此具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、
95%、98%或99%同一性的核苷酸序列的核酸通常仍能彼此杂交。

[0465] 影响杂交条件选择的基本参数和设计适合条件的规则已例如描述于下列文献中：Sambrook，Fritsch，and Maniatis(2001，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，
Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，见上文；和Current Protocols in Molecular Biology，1995，Ausubel等编著，John Wiley &Sons，Inc.，第
2.10节和第6.3-6.4节)中，并且本领域的技术人员可例如根据核酸的长度和/或碱基组成
来容易地确定。

[0466] 可通过突变将变化引入核酸中，从而导致其所编码的多肽(例如，抗体或抗体衍生物)的氨基酸序列变化。突变可使用本领域中已知的任何技术引入。在一个实施方案中，使用例如定点诱变方案来改变一个或多个特定氨基酸残基。在另一个实施方案中，使用例如
随机诱变方案来改变一个或多个随机选择的残基。无论如何改变，均可针对突变型多肽的
所需特性进行表达和筛选。

[0467] 可将突变引入核酸中，而不显著改变该核酸所编码的多肽的生物活性。例如，可进行核苷酸取代，从而在非必需氨基酸残基处进行氨基酸取代。作为另外一种选择，可将一个或多个突变引入核酸中，该核酸选择性改变所述核酸所编码的多肽的生物活性。例如，突变可使生物活性发生量变或质变。量变的实例包括增加、减少或消除活性。质变的实例包括改变抗体的抗原特异性。在一个实施方案中，可使用本领域中已确立的分子生物学技术，使编码本文所述的任何抗原结合蛋白的核酸突变以改变氨基酸序列。

[0468] 另一方面提供了适用于检测核酸序列的引物或杂交探针的核酸分子。核酸分子可仅包含编码全长多肽的核酸序列的一部分，例如可用作探针或引物的片段或者编码多肽活
性部分(例如，CGRP R结合部分)的片段。

[0469] 基于核酸序列的探针可用于检测核酸或类似核酸，例如编码多肽的转录物。探针可包含标记基团，例如，放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。此类探针可用于鉴别表达多肽的细胞。

[0470] 另一方面提供包含编码多肽或其部分(例如，包含一个或多个CDR或者一个或多个可变区域的片段)的核酸的载体。载体的实例包括但不限于质粒、病毒载体、非游离型哺乳动物载体和表达载体，例如重组表达载体。重组表达载体可包含以适于在宿主细胞中表达
核酸的形式的核酸。重组表达载体包括根据待用于表达的宿主细胞而选择的一个或多个调
节序列，其可操作连接到待表达的核酸序列。调节序列包括指导核苷酸序列在多种宿主细
胞中组成型表达的调节序列(例如，SV40早期基因增强子、劳氏肉瘤病毒启动子和巨细胞病毒启动子)、指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中表达的调节序列(例如，组织特异性调节
序列，参见Voss等，1986，Trends Biochem. Sci.11:287，Maniatis等，1987，Science236:
1237，这些文献的全文以引用方式并入本文)以及指导核苷酸序列的诱导型表达以响应特
定处理或条件的调节序列(例如，哺乳动物细胞中的金属硫蛋白启动子，和原核和真核系统中的四环素应答性和/或链霉素应答性启动子(参见上文)。本领域的技术人员应了解，表达载体的设计可取决多种因素，诸如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等。可将表达载体引入宿主细胞中，由此产生由本文所述的核酸编码的蛋白质或肽，包括融合蛋
白或肽。

[0471] 另一方面提供已引入重组表达载体的宿主细胞。宿主细胞可为任何原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如酵母、昆虫或哺乳动物细胞(例如，CHO细胞))。可经由常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。为了能稳定转染哺乳动物细胞，己知根据所用的表达载体和转染技术，仅一小部分细胞可将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴别和选择这些整合体，通常将编码可选择标记(例如，对抗生素的抗性)的基因连同目标基因一
起引入宿主细胞中。优选的可选择标记包括赋予对药物(如G418、潮霉素和甲氨蝶呤)具有
抗性的标记。除了别的方法外，可通过药物选择(例如，已并入可选标记基因的细胞将存活，而其它细胞将死亡)鉴别经所引入的核酸稳定转染的细胞。

[0472] 抗原结合蛋白的制备

[0473] 所提供的非人类抗体可为例如来源于任何产生抗体的动物，诸如小鼠、大鼠、兔、山羊、驴或非人类灵长类动物(诸如猴(例如，食蟹猴或恒河猴)或猿(例如，黑猩猩))。非人抗体可例如用于体外细胞培养和基于细胞培养物的应用中，或不发生对抗体的免疫应答或其不显著、可防止免疫应答、免疫应答无关紧要或期望免疫应答的任何其它应用中。在某些实施方案中，可通过使用本领域中已知的方法使动物免疫，以产生抗体，如上文中和/或下文实施例1-3中所述。这些实施例描述了使用三种不同的免疫原制剂来产生抗CGRP R抗体，所述试剂为(i)表达CGRP的两种主要组分(R–RAMP1和CRLR)的全长型式的全细胞；(ii)来自此类细胞的膜提取物；和(iii)通过共表达和纯化CRLR和RAMP1的N末端胞外域得到的可溶
性CGRP R。抗体可为多克隆、单克隆或可在宿主细胞中通过表达重组DNA来合成。可如上文所述通过免疫含有人免疫球蛋白基因座的转基因动物，或通过选择表达人抗体库的噬菌体
展示文库，来制备完全人抗体。

[0474] 可通过多种技术来制备单克隆抗体(mAb)，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein，1975，Nature256:495中的标准体细胞杂交技术。也可采用其它单克隆抗体制备技术，例如B淋巴细胞的病毒性或致癌性转化。一种制备杂交瘤的合适动物系统为鼠类系统，其为已确立的程序。用于分离免疫脾细胞以进行融合的免疫方案和技术在本领域中是
已知的，并且示例性方法描述于下面的实施例中。就此类程序而言，通常将来自免疫小鼠的B细胞与合适的永生化融合配偶体(partener)(例如，鼠类骨髓瘤细胞系)融合。需要时，可免疫大鼠或除大鼠以外的其它动物来替代小鼠，并且可以将来自此类动物的B细胞与鼠类
骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤。作为另外一种选择，可使用除小鼠外的其它来源的骨髓
瘤细胞系。制备杂交瘤的融合程序也是众所周知的。

[0475] 可经由氨基酸桥(短肽连接子)连接重链和轻链可变域(Fv区)片段产生单一多肽链来形成所提供的单链抗体。可通过在编码两个可变域多肽(VL和VH)的DNA之间融合编码肽连接子的DNA，来制备此类单链Fv(scFv)。所得多肽可自身对折形成抗原结合单体，或其可形成多聚体(例如，二聚体、三聚体或四聚体)，这取决于两个可变域之间的柔性连接子的长度(Kortt等，1997，Prot. Eng.10:423；Kortt等，2001，Biomol. Eng.18:95-108)。通过组合包含不同VL和VH的多肽，可形成与不同表位结合的多聚体scFv(Kriangkum等，2001，Biomol. Eng.18:31-40)。所开发的用于制备单链抗体的技术包括下列文献中描述的那些：美国专利No. 4,946,778；Bird，1998，Science242:423；Huston等，1998，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879；Ward等，1989，Nature334:544；de Graaf等，2002，Methods Mol 
Biol.178:379-387。来源于本文所提供的抗体的单链抗体包括但不限于包含下列的scFv：
表3中所述的重链与轻链可变区的可变域组合或包括表4A和4B中所述CDR的轻链与重链可
变域的组合。

[0476] 可使用亚类转换(subclass switching)方法将本文所提供的属于一种亚类的抗体变为不同亚类的抗体。因此，例如IgG抗体可源于IgM抗体，反之亦然。此类技术可制备新颖抗体，其不仅具有给定抗体(亲本抗体)的抗原结合特性，而且还表现出与抗体同种型或
亚类相关的生物特性，所述生物特性与亲本抗体的生物特性不同。可采用重组DNA技术。可将克隆的编码特定抗体多肽的DNA用于此类工序中，例如，编码所需同种型的抗体的恒定域的DNA。参见例如Lantto等，2002，Methods Mol. Biol. 178:303-316。

[0477] 因此，所提供的抗体包括包含例如上述可变域组合、具有所需同种型(例如IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE和IgD)及其Fab或F(ab’)2片段的抗体。此外，如果需要IgG4，则可能需要在铰链区引入点突变(CPSCP->CPPCP)(如Bloom等，1997，Protein Science6:407
中所述，其以引用方式并入本文)，以降低形成可导致IgG4抗体异质性的重链内二硫键的趋势。

[0478] 此外，也已知可得到具有不同特性(即，对抗体所结合的抗原具有不同亲和力)的抗体的技术。一种称为链改组(chain shuffling)的此类技术涉及在丝状噬菌体的表面上
展示免疫球蛋白可变域基因库，通常称为噬菌体展示。已使用链改组来制备对半抗原2-苯
基噁唑-5-酮具有高亲和力的抗体，如Marks等，1992，BioTechnology10:779中所述。

[0479] 可对表3中所述的重链和轻链可变区或表4A和4B中所述的CDR进行保守性修饰(并对编码核酸进行相应修饰)，以产生具有某些期望的功能特征和生物化学特征的CGRP R结
合蛋白。实现此类修饰的方法己于上文描述。

[0480] 可以多种方式对CGRP抗原结合蛋白进行进一步修饰。例如，如果将其用于治疗目的，则可将其与聚乙二醇缀合(聚乙二醇化)以延长血清半衰期或增强蛋白质递送。作为另
外一种选择，可将本发明抗体或其片段的V区与不同抗体分子的Fc区融合。可对用于此目的的Fc区进行修饰，从而使其不结合补体，由此降低当将融合蛋白用作治疗剂时在患者体内
诱发细胞溶解的可能性。此外，可将本发明抗体或其功能片段与人血清白蛋白缀合，以增加所述抗体或其抗原结合片段的血清半衰期。抗原结合蛋白或其片段的另一有用的融合配偶
体为运甲状腺素蛋白(TTR)。TTR具有形成四聚体的能力，因此抗体-TTR融合蛋白可形成能
增加其结合亲和力的多价抗体。

[0481] 作为另外一种选择，可通过在重链和轻链的氨基酸序列中产生取代来对本文所述抗原结合蛋白的功能特征和/或生物化学特征的进行实质性修饰，所述取代对保持(a)取代
区域中分子主链的结构，例如折叠或螺旋构象；(b)靶位点处分子的电荷或疏水性；或(c)侧链的膨松度具有显著不同的影响。“保守氨基酸取代”可涉及使用对所述位置处的氨基酸残基的极性或电荷具有极少影响或无影响的非天然残基取代天然氨基酸残基。参见表4，如上文。另外，如先前关于丙氨酸扫描诱变中所述，多肽中的任何天然残基也可以用丙氨酸取
代。

[0482] 本领域的技术人员可通过应用常规技术实施本发明抗体的氨基酸取代(无论为保守取代或非保守取代)。氨基酸取代可用于鉴别本文所提供的抗体中的重要残基，或增加或降低这些抗体对人CGRP R的亲和力，或改变本文所述的其它抗原结合蛋白的结合亲和力。

[0483] 表达抗原结合蛋白的方法

[0484] 本文中还提供包含至少一个上文所述的多核苷酸的呈质粒、表达载体、转录或表达盒形式的表达系统和构建体，以及包含此类表达系统或构建体的宿主细胞。

[0485] 本文所提供的抗原结合蛋白可通过多种常规技术中任一种制备。例如，可使用本领域中已知的任何技术，通过重组表达系统来产生CGRP  R抗原结合蛋白。参见例如
Monoclonal Antibodies，Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses，
Kennet等(编著)，Plenum Press，New York(1980)；和Antibodies: A Laboratory Manual，Harlow和Lane(编著)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，
N.Y.(1988)。

[0486] 抗原结合蛋白可在杂交瘤细胞系(例如，尤其抗体可在杂交瘤中表达)或除杂交瘤以外的其它细胞系中表达。可使用编码抗体的表达构建体转化哺乳动物、昆虫或微生物宿
主细胞。如美国专利No. 4,399,216；No. 4,912,040；No. 4,740,461；No. 4,959,455中所例示，可使用将多核苷酸引入宿主细胞中的任何已知方法进行转化，包括例如将多核苷酸
包装于病毒或噬菌体中，并通过本领域中已知的转染程序用所述构建体转导宿主细胞。所
用最佳转化程序将取决于被转化的何种类型的宿主细胞。将异源多核苷酸引入哺乳动物细
胞中的方法为本领域所熟知，且包括但不限于葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将一种或多种多核苷酸包封于脂质体中、将核酸与带正电脂质混合以及将DNA直接显微注射到细胞核中。

[0487] 重组表达构建体通常含有编码包含以下一种或多种的多肽的核酸分子：一个或多个本文所提供的CDR；轻链恒定区；轻链可变区；重链恒定区(例如，CH1、CH2和/或CH3))；和/或CGRP R抗原结合蛋白的另一支架部分。使用标准连接技术将这些核酸序列插入适当表达
载体中。在一个实施方案中，将重链或轻链恒定区附接至抗CGRP R特异性重链或轻链可变
区的C末端，并与表达载体连接。通常选择在所使用的特定宿主细胞中具有功能性的载体
(即，该载体可与宿主细胞机构相容，从而可使发生基因的扩增和/或表达)。在一些实施方案中，将载体用于使用报告蛋白(例如二氢叶酸还原酶)进行的蛋白质片段互补测定中(参
见，例如美国专利No. 6,270,964，其据此以引用的方式并入)。合适的表达载体可购自例如Invitrogen Life Technologies或BD Biosciences(前身为“Clontech”)。用于克隆和表达抗体和片段的其它有用的载体包括Bianchi和McGrew，2003，Biotech. Biotechnol. 
Bioeng. 84:439-44中所述的载体，该文献据此以引用的方式并入。其它合适的表达载体在例如Methods Enzymol，第185卷(185(D. V. Goeddel编著)，1990，New York: Academic 
Press中有所论述。

[0488] 通常，任何宿主细胞中所用的表达载体都将包含维持质粒以及克隆与表达外源核苷酸序列的序列。在某些实施方案中，此类序列(统称为“旁侧序列”)通常包括下列一个或多个核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、包含供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、供插入编码待表达的多肽的核酸的多接头区和可选择标记元件。这些序列
的每一者均在下文中讨论。

[0489] 任选地，载体可包含“标签”编码序列，即，位于CGRP R结合蛋白编码序列的5′或3′端的寡核苷酸分子；寡核苷酸序列编码多聚组氨酸(例如六聚组氨酸)或另一“标签”，诸如®FLAG 、HA(血球凝集素流感病毒)或myc，存在针对其的可商购抗体。此标签通常在多肽表达时与多肽融合，并且可用作亲和纯化或检测宿主细胞中的CGRP R结合蛋白的方式。亲和纯
化可例如通过使用针对标签的抗体作为亲和基质进行的柱层析实现。随后可任选地通过各
种方式，例如使用某些用于切割的肽酶，从经纯化的CGRP R结合蛋白移除标签。

[0490] 旁侧序列可为同源序列(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或品系)、异源序列(即，来自与宿主细胞物种或品系不同的物种)、杂交序列(即，不止一种来源的旁侧序列的组合)、合成序列或天然序列。因此，旁侧序列的来源可为任何原核或真核生物体、任何脊椎动物或非脊椎动物生物体或任何植物，前提是旁侧序列可在宿主细胞机构中起作用，并且
可由宿主细胞机构活化。

[0491] 可用于载体中的旁侧序列可通过本领域中熟知的若干种方法中的任一种获得。通常，本文中有用的旁侧序列预先已通过定位和/或限制性内切核酸酶消化加以鉴别，因此可使用适当的限制性内切核酸酶将其从适当的组织来源中分离。在一些情况下，旁侧序列的
全核苷酸序列可能是已知的。在本文中，可使用本文所述的用于核酸合成或克隆的方法合
成旁侧序列。

[0492] 不管已知全部或仅一部分的旁侧序列，均可使用聚合酶链式反应(PCR)，和/或通过用合适的探针(诸如寡核苷酸和/或来自相同物种或另一物种的旁侧序列片段)筛选基因
组文库来获得所述旁侧序列。如果旁侧序列是未知的，则可从可能含有例如编码序列或甚
至另一种或多种基因的较大DNA片段中分离出含有旁侧序列的DNA片段。分离可如下实现：
通过限制性内切核酸酶消化产生适当DNA片段，随后使用琼脂糖凝胶纯化(Qiagen®柱层析
(Chatsworth，CA))加以分离；或技术人员已知的其它方法。实现此目的的合适的酶的选择对于本领域的技术人员所而言将是显而易见的。

[0493] 复制起点通常为商购获得的原核表达载体的一部分，并且该起点有助于载体在宿主细胞中的扩增。如果所选载体不含复制起点位点，则可根据已知序列化学合成并与该载
体连接。例如，质粒pBR322(New England Biolabs，Beverly，MA)的复制起点适于大多数革兰氏阴性菌，而各种病毒起点(例如，SV40、多瘤病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒(VSV)或乳头瘤病毒，诸如HPV或BPV)可用于在哺乳动物细胞中克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体无需复制组分起点(例如，通常仅用SV40起点，因为其也包含病毒早期启动子)。

[0494] 转录终止序列通常位于多肽编码区末端的3'处，用于终止转录。通常，原核细胞中的转录终止序列为富含G-C的片段，随后为多聚T序列。尽管该序列易于由文库克隆或甚至可商购获得以作为载体的一部分，但其也可使用核酸合成方法(诸如本文所述的方法)容易
地合成。

[0495] 可选择的标记基因编码在选择性培养基中对生长的宿主细胞存活和生长必需的蛋白质。典型的选择标记基因编码下列蛋白质，其：(a)赋予原核宿主细胞对抗生素或其它毒素(例如，氨苄青霉素、四环素或卡那霉素)的抗性；(b)补充细胞的营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基或确定成分培养基中得到的关键养分。特异性可选择标记为卡那霉素抗
性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。有利地，还可使用新霉素抗性基因进行原核与真核宿主细胞的选择。

[0496] 可使用其它可选择基因来扩增要表达的基因。扩增是基因在继代重组细胞的染色体内连续复制的过程，其中所述基因对于生长或细胞存活的关键蛋白质的产生而言是必须
的。哺乳动物细胞的合适的可选择标记的实例包括二氢叶酸还原酶(DHHR)和无启动子胸苷
激酶基因。使哺乳动物细胞转化体处于选择压力下，其中由于载体中存在可选择基因，仅所述转化体唯一适于存活。通过在培养基中连续增加选择剂浓度的条件下培养经转化的细胞
来施加选择压力，从而引起可选择基因与编码另一基因(诸如与CGRP R结合的抗原结合蛋
白)的DNA的扩增。因此，由所扩增DNA合成增加量的多肽，例如抗原结合蛋白。

[0497] 核糖体结合位点通常是mRNA翻译起始所必需的，并且通过Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)表征。该元件通常位于启动子的3'和待表达多肽的编
码序列的5'。

[0498] 在一些情况下，例如当需要在真核宿主细胞表达系统中进行糖基化时，可操纵不同的前置序列或前导序列以改善糖基化或产率。例如，可改变特定信号肽的肽酶切割位点，或添加前导序列，这也可影响糖基化。最终的蛋白质产物可能在-1位(相对于成熟蛋白质的第一个氨基酸)具有一个或多个可能末完全移除的易于表达的其它氨基酸。例如，最终的蛋白质产物可能具有一个或两个存在于肽酶切割位点的氨基酸残基，其与氨基末端连接。作
为另外一种选择，如果酶在成熟多肽内的某些酶切割位点处切割，则使用此类区域可能产
生呈略微截短形式的所需多肽。

[0499] 表达和克隆通常将包含由宿主生物体识别并与编码CGRP R结合蛋白的分子可操作连接的启动子。启动子是位于结构基因的起始密码子上游(即5')，控制该结构基因转录
的非转录序列(通常在约100至1000个碱基对(bp)以内)。将启动子通常分为两类之一：诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子为应答培养条件的一些改变(例如，养分的存在或不存在或温度变化)而引发DNA在其控制下增加水平的转录，另一方面，组成型启动子均一
地转录与其可操作连接的基因，即，对基因表达具有极少控制或无控制。由多种潜在宿主细胞识别的大量启动子为人们所熟知。通过限制酶消化将启动子从源DNA中移除，并将所需启动子序列插入载体中，从而将合适的启动子可操作地连接至编码构成CGRP R结合蛋白的重
链或轻链的DNA。

[0500] 与酵母宿主一起使用的合适的启动子也为本领域所熟知。酵母增强子可有利地与酵母启动子一起使用。与哺乳动物宿主细胞一起使用的合适的启动子为本领域所熟知，且
包括但小限于从诸如下列病毒的基因组获得的启动子：多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒
40(SV40)。其它合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如，热休克启动子和肌动蛋白启动子。

[0501] 可能值得关注的其它启动子包括但不限于：SV40早期启动子(Benoist和Chambon1981，Nature290:304-310)；CMV启动子(Thornsen等，1984，Proc. Natl. Acad. U.S.A.81:659-663)；劳氏肉瘤病毒的3'长末端重复中所含的启动子(Yamamoto等，1980，
Cell22:787-797)；疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，Proc. Natl. Acad. Sci. 
U.S.A.78:1444-1445)；来自金属硫蛋白基因的启动子和调节序列(Prinster等，1982，
Nature296:39-42)；和原核启动子，诸如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978，
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.75:3727-3731)；或tac启动子(DeBoer等，1983，Proc. 
Natl. Acad. Sci. U.S.A.80:21-25)。以下表现组织特异性并且已用于转基因动物中的动
物转录控制区也值得关注：在胰腺腺泡细胞中具有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift
等，1984，Cell38:639-646；Ornitz等，1986，Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.50:
399-409；MacDonald 1987，Hepatology7:425-515)；在胰腺β细胞中具有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan 1985，Nature315:115-122)；在淋巴细胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等，1984，Cell38:647-658；Adames等，1985，Nature318:533-538；
Alexander等，1987，Mol. Cell. Biol.7:1436-1444)；在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中具有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder等，1986，Cell45:485-495)；在肝脏中具有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等，1987，Genes and Devel.1 :268-276)；在肝脏中具有活性的α胎蛋白基因控制区(Krumlauf等，1985，Mol. Cell. Biol.5:1639-1648；Hammer等，
1987，Science253:53-58)；在肝脏中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等，
1987，Genes and Devel.1:161-171)；在骨髓细胞中具有活性的β-珠蛋白基因控制区
(Mogram等，1985，Nature315:338-340；Kollias等，1986，Cell46:89-94)；在脑中的少突胶质细胞中具有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead等，1987，Cell48:703-712)；在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链2基因控制区(Sani1985，Nature314:283-286)；以及在下
丘脑中具有活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason等，1986，Science234:1372-1378)。

[0502] 将增强子序列插入载体中以增强高等真核生物对编码构成人CGRP R结合蛋白的轻链或重链的转录。增强子为DNA的顺式作用元件，通常长度为约10-300个碱基对，其作用于启动子以增强转录。增强子的取向和位置相对独立，已发现其位于转录单元的位置5'和
3'。己知可从多种哺乳动物基因获得若干增强子序列(例如，珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α胎蛋白和胰岛素)。然而，通常使用来自病毒的增强子。本领域中已知的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子和腺病毒增强子为用于活化真核启动子的示例性
增强元件。虽然增强子可能位于载体中编码序列的5'或3'端，但其通常位于启动子的5'位
点。可将编码适当天然或异源信号序列(前导序列或信号肽)的序列并入表达载体中，以促
进抗体的细胞外分泌。信号肽或前导序列的选择取决于在其中产生抗体的宿主细胞的类
型，并且异源信号序列可取代天然信号序列。在哺乳动物宿主细胞中起作用的信号肽的实
例包括以下：美国专利No. 4,965,195中所述的白介素-7(IL-7)的信号序列；Cosman等，
1984，Nature312:768中所述的白介素-2受体的信号序列；欧洲专利No. 0367 566中所述的白介素-4受体信号肽；美国专利No. 4,968,607中所述的I型白介素-1受体信号肽；欧洲专
利No. 0 460 846中所述的II型白介素-1受体信号肽。

[0503] 所提供的表达载体可由起始载体(例如市售载体)构建。此类载体可能含有或可能不含所有所需的旁侧序列。如果本文所述的一个或多个旁侧序列已不存在于载体中时，则
其可独立获得并连接到载体中。用于获得各旁侧序列的方法为本领域技术人员所熟知。

[0504] 在已构建载体并已将编码轻链、重链或包含CGRP R抗原结合序列的轻链和重链的核酸分子插入载体的适当位点中后，可将完成的载体插入合适的宿主细胞中以进行扩增
和/或多肽表达。可通过众所周知的方法(包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其它已知技术)将抗原结合蛋白的表达载体转化
至所选宿主细胞中。所选方法将部分部分取决于待使用的宿主细胞类型。这些方法和其它
合适的方法为本领域的技术人员所熟知，并且描述于例如Sambrook等，2001中，见上文。

[0505] 当在适当条件下培养时，宿主细胞将合成抗原结合蛋白，随后可从培养基(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)或直接从产生该蛋白质的宿主细胞中(如果未分泌)收集该抗
原结合蛋白。适当宿主细胞的选择取决于多种因素，诸如所需表达水平、对活性所需或必需的多肽修饰(诸如糖基化或磷酸化)以及折叠成生物活性分子的容易度。

[0506] 可用作宿主以供表达的哺乳动物细胞系为本领域所熟知，并且包括但不限于可得自美国模式培养物保藏所(ATCC)的永生化细胞系，其包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细
胞、海拉细胞、幼仓鼠肾(BIIK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)和多种其它细胞系。在某些实施方案中，可通过确定何种细胞系具有高表达水平且构成性地
产生具有CGRP R结合特性的抗原结合蛋白来选择细胞系。在另一个实施方案中，可选择无
法产生自身抗体但能够产生和分泌异源抗体的B细胞谱系中的细胞系。

[0507] 人CGRP抗原结合蛋白用于诊断和治疗目的的用途

[0508] 抗原结合蛋白可用于检测生物样本中的CGRP R和鉴别产生CGRP R的细胞或组织。例如，CGRP R抗原结合蛋白可用于诊断分析中，例如用于检测和/或定量组织或细胞中所表达的CGRP R的结合测定。与CGRP R特异性结合的抗原结合蛋白还可用于治疗有需要的患者
的与CGRP R相关的疾病。此外，CGRP R抗原结合蛋白可用于抑制CGRP R与其配体CGRP形成
复合物，从而调节细胞或组织中CGRP R的生物活性。活性可调节的实例包括但不限于抑制
血管舒张和/或减少神经源性炎症。因此，与CGRP R结合的抗原结合蛋白可调节和/或阻断
与其它结合化合物的相互作用，并由此可在改善与CGRP R相关的疾病中具有治疗用途。

[0509] 适应症

[0510] 与人CGRP R相关的疾病或病症包括患者的发作至少部分是由CGRP R与其配体CGRP相互作用所引起的任何疾病或病症。CGRP R与CGRP的相互作用也可增加或降低疾病或
病症的严重程度。可用本文所述的抗原结合蛋白治疗的疾病和病症的实例包括头痛，诸如
丛集性头痛、偏头痛，包括偏头痛；慢性疼痛；II型糖尿病；炎症，例如神经源性炎症；心血管病症；以及与内毒素血症和败血症相关的血液动力学紊乱。

[0511] 具体而言，本文所述的抗原结合蛋白可作为偏头痛发作开始后进行的急性治疗来用于治疗偏头痛，和/或作为预防性治疗(例如以每日一次、每周一次、两周一次、每月一次、两月一次、一年两次等施用)来预防或降低与偏头痛发作相关的症状(例如，疼痛症状)的频率和/或严重程度。

[0512] 诊断方法

[0513] 本文所述的抗原结合蛋白可用于诊断目的，以检测、诊断或监测与CGRP R相关的疾病和/或病症。还提供了使用本领域的技术人员所熟知的经典免疫组织学方法检测样本
中CGRP R的存在的方法(例如，Tijssen1993，Practice and Theory of Enzyme 
Immunoassays，第15卷(R.H.  Burdon和P.H. van Knippenberg编著，Elsevier，
Amsterdam)；Zola，1987，Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques，第147-158页(CRC Press，Inc.)；Jalkanen等，1985，J. Cell. Biol.101:976-985；Jalkanen等，1987，J. Cell Biol.105:3087-3096)。CGRP R的检测可在体内或体外进行。

[0514] 本文所提供的诊断应用包括使用抗原结合蛋白来检测CGRP R的表达以及配体与CGRP R的结合。可用于检测CGRP R存在的方法的实例包括免疫分析，例如酶联免疫吸附测
定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。

[0515] 就诊断应用而言，通常用可检测标记基团来标记抗原结合蛋白。合适的标记基团包括但不限于下列基团：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In
125 131
、 I、 I)、荧光基团(例如，FITC、若丹明、镧系元素磷光体)、酶基团(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团或通过第二报告基因识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合域、表位标
记)。在一些实施方案中，标记基团经由不同长度的间隔臂偶联至抗原结合蛋白，以降低潜在的空间位阻。多种标记蛋白质的方法是本领域中已知的并可以使用。

[0516] 在另一个方面，可使用抗原结合蛋白鉴别一个或多个表达CGRP R的细胞。在具体实施方案中，将抗原结合蛋白用标记基团标记，并检测标记的抗原结合蛋白与CGRP R的结
合。在另一具体实施方案中，在体内检测抗原结合蛋白与CGRP R的结合。在另一具体实施方案中，使用本领域中已知的技术分离和测量CGRP R抗原结合蛋白。参见例如Harlow和Lane，
1998，Antibodies: A Laboratory Manual，New York: Cold Spring Harbor(1991年版和
定期增刊)；John E. Coligan编著，1993，Current Protocols In Immunology New York: John Wiley & Sons。

[0517] 另一方面提供了对与所提供的抗原结合蛋白竞争结合CGRP R的测试分子存在的检测。一种此类测定的实例将涉及在存在或不存在测试分子的情况下检测含有一定量CGRP R的溶液中游离的抗原结合蛋白的量。游离的抗原结合蛋白(即，未与CGRP R结合的抗原结
合蛋白)的量的增加表明测试分子能够与抗原结合蛋白竞争结合CGRP R。在一个实施方案
中，抗原结合蛋白用标记基团标记。作为另外一种选择，将测试分子标记，并在存在和不存在抗原结合蛋白的情况下，监测游离测试分子的量。

[0518] 治疗方法：药物制剂、施用途径

[0519] 还提供了使用抗原结合蛋白的方法。在一些方法中，对患者提供抗原结合蛋白。抗原结合蛋白抑制CGRP与人CGRP R的结合。

[0520] 还提供药物组合物，其包含治疗有效量的一种或多种抗原结合蛋白和药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。此外，包括通过施用此类药物组合物来治疗患者(例如偏头痛)的方法。术语“患者”包括人患者。

[0521] 可接受的制剂材料在所用的剂量和浓度下对接受者无毒性。在具体实施方案中，提供包含治疗有效量的人CGRP R抗原结合蛋白的药物组合物。

[0522] 在某些实施方案中，可接受的制剂材料优选地在所用剂量和浓度下对接受者无毒性。在某些实施方案中，药物组合物可含有调节、维持或保持例如组合物的pH、克分子渗透压浓度、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透性的制剂材料。在此类实施方案中，合适的制剂材料包括但不限于氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(诸如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲液(诸如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)；增量剂(诸如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(诸如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(诸如咖啡碱、聚乙烯吡咯烷酮、β环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；二糖；和其它碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐平衡离子(诸如钠)；防腐剂(诸如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、洗必泰、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(诸如甘露醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(诸如普朗尼克(pluronics)、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯类(诸如聚山梨醇酯20)、聚山梨醇酯、三硝基甲苯、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；稳定性增强剂(诸如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(诸如碱金属卤化物、优选氯化钠或氯化钾、甘露醇、山梨糖醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。参见REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(A.R. Genrmo编著)，1990，Mack Publishing Company。

[0523] 在某些实施方案中，本领域的技术人员将根据例如预期施用途径、递送形式和所需剂量来确定最佳药物组合物。参见例如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，见上
文。在某些实施方案中，此类组合物可能会影响所公开的抗原结合蛋白的物理状态、稳定
性、体内释放速率和体内清涂速率。在某些实施方案中，药物组合物中的主要媒介物或载体本质上可为水性的或非水性的。例如，合适的媒介物或载体可为注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，其可能会补充有经肠胃外施用的组合物中常见的其它材料。中性缓冲盐水或
与血清白蛋白混合的盐水为其它示例性媒介物。在具体实施方案中，药物组合物包含pH值
约为7.0-8.5的Tris缓冲液，或pH值约为4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，并且还可包括山梨醇或
合适的替代物。在某些实施方案中，人CGRP R抗原结合蛋白组合物可通过将具有所需纯度
的所选组合物与任选的制剂(REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，见上文)混合而制
备成冻干饼或水溶液形式以便储存。此外，在某些实施方案中，可使用适当赋形剂(诸如蔗糖)将人CGRP R抗原结合蛋白配制成冻干产物形式。

[0524] 可选择用于肠胃外递送的药物组合物。作为另外一种选择，可选择用于吸入或通过消化道(例如口服)递送的组合物。此类药学上可接受的组合物的制备在本领域的技术范
围内。

[0525] 制剂组分优地以施用部位可接受的浓度提供。在某些实施方案中，使用缓冲液将组合物的pH值维持在生理pH或稍低的pH，通常在约5至约8的pH范围内。

[0526] 当考虑肠胃外施用时，可以不含热原、肠胃外可接受的水溶液形式提供治疗组合物，该水溶液包含药学上可接受的媒介物中的期望的人CGRP R结合蛋白。特别适用于肠胃
外注射的媒介物为无菌蒸馏水，其中将人CGRP R抗原结合蛋白配制为经适当防腐的无菌等
渗溶液。在某些实施方案中，制备可涉及用试剂(诸如可注射微球体、生物侵蚀性粒子、聚合物(诸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体)制备所需分子，这些试剂可使经由贮库式注射递送的产物控制释放或持续释放。在某些实施方案中，也可使用透明质酸，其具有在循环中促进持续释放时间的作用。在某些实施方案中，可用可植入的药物递送装置引入所需抗原
结合蛋白。

[0527] 某些药物组合物配制为用于吸入。在一些实施方案中，将人CGRP R抗原结合蛋白配制为干燥、可吸入的粉末。在具体实施方案中，还可将人CGRP R抗原结合蛋白吸入溶液用推进剂配制，以供气雾剂递送。在某些实施方案中，可将溶液雾化。因此，经肺施用和配制方法进一步描述于国际专利申请案PCT/US94/001875中，其以引用的方式并入本文中，并且描述了经化学修饰的蛋白质的经肺递送。一些制剂可口服施用。可在存在或不存在常规用于
配混固体剂型(例如片剂和胶囊)的载剂的情况下，对以此方式施用的人CGRP R抗原结合蛋
白进行配制。在某些实施方案中，可将胶囊设计成当生物可用性最大并且全身降解前最小
时在胃肠道中的某点处释放制剂的活性部分。可包括附加试剂以促进人CGRP R抗原结合蛋
白的吸收。也可采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。

[0528] 一些药物组合物包含有效量的一种或多种人CGRP R抗原结合蛋白与适于制造片剂的无毒赋形剂的混合物。通过将片剂溶解于无菌水或另一适当的媒介物中，可制备单位
剂型的溶液。合适的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，诸如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。

[0529] 其它药物组合物对本领域的技术人员而言将是显而易见的，包括涉及持续或控制递送制剂中的人CGRP R抗原结合蛋白的制剂。本领域的技术人员也已知用于配制多种其它
持续或控制递送方式(例如脂质体载体、生物侵蚀性微粒或多孔珠粒和贮库式注射)的技
术。参见例如国际专利申请案PCT/US93/00829，其以引用的方式并入，并描述了用于递送药物组合物的多孔聚合微粒的控制释放。持续释放制剂可包括呈成形制品形式的半渗透性聚
合物基质，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质可包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯(如美国专利No. 3,773,919和欧洲专利申请公开案No. EP 058481中所公开，其各自以引用的方式并
入)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙酯的共聚物(Sidman等，1983，Biopolymers2:547-556)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(Langer等，1981，J. Biomed. Mater. Res.15:167-277和Langer，
1982，Chem. Tech.12:98-105)、乙烯-醋酸乙烯酯(Langer等，1981，见上文)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公开案No. EP 133,988)。持续释放组合物还可包括可通过本领域
中已知的若干种方法中的任一种制备的脂质体。参见例如Eppstein等，1985，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.82:3688-3692；欧洲专利申请公开案No. EP 036,676；No. EP 088,046和No. EP 143,949，这些文献以引用的方式并入。

[0530] 用于体内施用的药物组合物通常是以无菌制剂的形式提供。可通过用无菌滤过膜过滤实现灭菌。当将组合物冻干时，可在冻干和复原之前或之后使用此方法进行灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或溶液形式储存。通常将肠胃外组合物置于具有无菌存
取口的容器中，例如静脉注射溶液袋或具有可经皮下注射针穿透的塞子的小瓶。

[0531] 在某些实施方案中，将本文所公开的表达重组抗原结合蛋白的细胞包封以供递送(Invest. Ophthalmol Vis Sci 43:3292-3298，2002和Proc. Natl. Acad. Sciences 
103:3896-3901，2006)。

[0532] 在某些制剂中，抗原结合蛋白的浓度为至少10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml或150mg/ml。一些制剂中包含缓冲液、蔗糖以及聚山梨醇酯。制剂的实例为包含50-100mg/ml抗原结合蛋白、5-20mM醋酸钠、5-
10% w/v蔗糖和0.002-0.008% w/v 聚山梨醇酯。某些制剂例如包含9-11mM醋酸钠缓冲液、
8-10% w/v蔗糖和0.005-0.006% w/v聚山梨醇酯中的65-75mg/ml抗原结合蛋白。某些此类
制剂的pH在4.5-6的范围内。其它制剂的pH为5.0-5.5(例如，pH为5.0、5.2或5.4)。

[0533] 一旦已配制药物组合物后，就可将其以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或脱水或冻干粉末形式储存于无菌小瓶中。此类制剂可以即用形式或施用前复原的形式(例如冻干形式)储存。还提供用于制造单剂量施用单元的试剂盒。某些试剂盒包含具有无水蛋白质的第一容器以及具有水性制剂的第二容器。在某些实施方案中，提供含有单室和多室预
填充注射器(例如，液体注射器和冻干制剂注射器(lyosyringe))的试剂盒。要采用的包含
人CGRP R抗原结合蛋白的药物组合物的治疗有效量取决于治疗情形和目的。本领域的技术
人员将理解，用于治疗的适当剂量水平将部分根据所递送的分子、使用的人CGRP R抗原结
合蛋白所针对的适应症、施用途径和患者的体格(体重、体表或器官尺寸)和/或状况(年龄
和总体健康状况)而变化。在某些实施方案中，临床医师可滴定剂量，并改变施用途径以获得最佳治疗效果。

[0534] 根据上述因素，典型的剂量范围为约1μg/kg至约30mg/kg或以上。在具体实施方案中，剂量范围可为10μg/kg至约30mg/kg，任选地为0.1mg/kg至约30mg/kg，或0.3mg/kg至约20mg/kg。在一些应用中，剂量为0.5mg/kg至20mg/kg。在某些情况下，将抗原结合蛋白以
0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg或20mg/kg给药。一些治疗方案中的给药方案为0.3mg/kg qW、0.5mg/kg qW、1mg/kg qW、3mg/kg qW、10mg/kg qW或20mg/kg qW的剂量。

[0535] 给药频率将取决于所用制剂中特定人CGRP R抗原结合蛋白的药代动力学参数。通常，临床医师施用所述组合物，直到实现所需效果的剂量。因此，可将组合物以单次剂量或者随时间以两次或两次以上的剂量形式(其可包含或可不含相同量的所需分子)或经由植
入装置或导管连续输注施用。可通过使用适当剂量反应数据来确定适当剂量。在某些实施
方案中，可在较长时间段内对患者施用抗原结合蛋白。长期施用抗原结合蛋白可使通常与
非完全人抗体的抗原结合蛋白相关的不利免疫或过敏反应减到最少，该非完全人抗体例如
在非人类动物中针对人抗原产生的抗体，例如非人类物种中产生的非完全人抗体或非人抗
体。

[0536] 药物组合物的施用途径与己知方法相符，例如，口服；通过静脉内、腹膜内、大脑内(脑实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门脉内或病灶内途径注射；通过持续释放系统或植入装置施用。在某些实施方案中，可通过弹丸式注射或连续输注或通过植入装置施用组合物。

[0537] 也可通过植入其上已吸收或包封所需分子的膜、海绵或另一适当材料来局部施用组合物。在某些实施方案中，当使用植入装置时，可将该装置植入任何合适的组织或器官
中，并可通过扩散、定时释放丸剂或连续施用来实现所需分子的递送。

[0538] 也可能需要在体外使用人CGRP R抗原结合蛋白药物组合物。在此类情况下，将从患者中移除的细胞、组织或器官暴露于人CGRP R抗原结合蛋白药物组合物，随后将所述细
胞、组织和/或器官植回患者体内。

[0539] 具体而言，人CGRP R抗原结合蛋白可通过植入某些细胞来递送，这些细胞己使用诸如本文所述的方法进行遗传工程改造以表达和分泌多肽。在某些实施方案中，此类细胞
可为动物细胞或人细胞，并且可为自体细胞、异源细胞或异种细胞。在某些实施方案中，可使细胞永生化。在其它实施方案中，为了降低免疫应答的可能性，可将细胞包封以避免侵入外围组织。在其它实施方案中，包封材料通常为生物相容性、半渗透聚合外壳或膜，其允许释放一种或多种蛋白质产物，但防止患者的免疫系统或来自周围组织的其它有害因子破坏
细胞。

[0540] 下列实施例(包括所进行的实验以及所得到的结果)仅出于说明的目的而提供，并且不应将其理解为限制所附权利要求书的范围。

[0541] 实施例1

[0542] 作为抗原的CGRP受体的产生

[0543] A.人CRLR和RAMP1的分子克隆

[0544] 将人CRLR cDNA(GenBank登录号U17473；SEQ ID NO:1)和RAMP1 cDNA(GenBank登录号AJ001014；SEQ ID NO:3)分别克隆到哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-Zeo和
pcDNA3.1-Hyg(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，以便按如下所述转染HEK 293EBNA细胞
(Invitrogen)。还将hCRLR cDNA和hRAMP1 cDNA克隆到pDSRα24 载体(Kim，H. Y.等，J. 
Inv. Derm. Symp. Proc.(2007) 12: 48-49)中，以转染AM-1 CHO细胞(美国专利第6,210,
924号)。

[0545] B.稳定转染的细胞系

[0546] 1.人CGRP R在293EBNA细胞中的稳定表达

[0547] 将HEK 293EBNA细胞(可得自ATCC或Invitrogen)以1.5×106个细胞/100mm盘的密度接种。24小时后，按照Invitrogen提供的说明书，使用FuGene6(Invitrogen，Carlsbad，CA)，以huRAMP1/pcDNA3.1-Hyg和huCRLR/pcDNA3.1-Zeo的6µg线性化DNA共转染这些细胞。
两天之后，使细胞受胰蛋白酶作用，并继代培养到包含400µg/ml潮霉素+250µg/ml博来霉素(zeocin)的培养基中。两周后，使所得抗药性集落受胰蛋白酶作用，并合并到集合体中。对这些集合体进行四轮FACS，从而分选出Alexa 647标记的CGRP8-37肽类似物(下述)。每轮收集最高5%表达的细胞。

[0548] 2.人CGRP R在AM-1 CHO细胞中的稳定表达

[0549] 以1.5×106个细胞/100mm盘接种AM-1 CHO细胞(Urlaub和Chasin，Proc. Natl. Acad. Sci. 77，4216(1980)中所述的CHO DHFR缺乏型细胞系的无血清生长培养基调适的
变体)。24小时后，按照Invitrogen提供的说明书，使用FuGene6(Invitrogen，Carlsbad，CA)，pDSRα24/huRAMP1和pDSRα24/huCRLR每一者的线性化4μg DNA共转染这些细胞。转染2天后，使转染的细胞受胰蛋白酶作用，并接种到包含10%透析FBS且无次黄嘌呤/胸腺嘧啶补充的CHO DHFR选择性生长培养基中。2周后，使所得转染的集落受胰蛋白酶作用并合并。对这些集合体进行FACS分选分析。

[0550] 3.人肾上腺髓质素(AM1)在HEK 293EBNA细胞中的稳定表达

[0551] 将293EBNA细胞于DMEM(高葡萄糖)+5% FBS+1% MEM非必需氨基酸+1%丙酮酸钠中以1.5×106个细胞/盘接种到100mm盘中。第二天，使用FuGENE 6转染试剂(Roche)，以
pcDNA3.1/博来霉素/huCRLR外加pcDNA3.1/潮霉素/huRAMP2共转染这些细胞。DNA构建体均
以FspI线性化。48小时后，将细胞于包含200µg/ml 博来霉素的生长培养基中以3种细胞密
度(8×105、3.2×105和8×104个细胞/盘)继代培养到100mm盘中。将培养基每周更换两次。
一周后，向板中加入包含200µg/ml潮霉素+200µg/ml 博来霉素的培养基。两周后，用克隆环分离96个集落。将剩余的集落收集到单个集合体培养物中。分析克隆和集合体对受体激动
剂或毛喉素刺激的反应。若干克隆的反应良好，并选择一种用于后续实验。

[0552] 4.食蟹猴（cyno）CGRP R在HEK 293EBNA细胞中的稳定表达

[0553] 将293EBNA细胞于DMEM(高葡萄糖)+5% FBS+1% MEM非必需氨基酸+1%丙酮酸钠中以1.5×106个细胞/盘接种到100mm盘中。第二天，使用FuGENE 6，以pcDNA3.1/博来霉素/食蟹猴（cyno）CRLR外加pcDNA3.1/潮霉素/食蟹猴（cyno）RAMP1共转染这些细胞。构建体均以FspI线性化。48小时后，将细胞继代培养到包含200µg/ml 博来霉素+400µg/ml潮霉素、稀释度为1:20、1:40、1:100和1:200的生长培养基中。将培养基每周更换两次。两周后，使用克隆环分离96个转染的集落。分析克隆对CGRP配体刺激的反应。若干克隆表现出类似的高水平
反应，并选择一种用于后续实验。

[0554] C.高表达CGRP受体细胞的分离

[0555] 合成具有以下序列的CGRP8-37肽类似物(Midwest Bio-Tech Inc. Fishers，IN)：

[0556] Ac-WVTHRLAGLLSRSGGVVRCNFVPTDVGPFAF-NH2(SEQ ID NO:9)

[0557] 按照制造商说明书(Molecular Probes，Inc. Cat A 2006)将肽用Alexa 647-NHS来标记。Alexa 647标记的CGRP8-37显示出对CGRP受体转染的细胞而非未转染的亲本细胞的特异性染色，并用作FACS试剂。

[0558] 使用具有Alexa 647标记的CGRP8-37肽的集合体对huCGRP受体-转染的293EBNA和AM-1 CHO细胞集合体(如上所产生)反复分选多达四次。每次分选时收集高表达细胞，使其
扩增并在最终分选后于小瓶中冷冻。按如下所述用AM-1 CHO/huCGRP R细胞进行免疫，并在免疫后使用293EBNA/huCGRP R细胞滴定小鼠血清并用于杂交瘤上清液的结合筛选中。

[0559] D.可溶性CGRP受体的产生

[0560] 如下所述，通过用包含相应cDNA(SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7)的载体瞬时共转染293 6E细胞(Durocher等，Nucleic Acids Res.30:E9(2002))来产生包含人CRLR(SEQ ID 
NO:6)和人RAMP1(SEQ ID NO:8)的N末端胞外域(ECD)的可溶性CGRP受体多肽。采用常用的
标签(多聚组氨酸、Flag、HA和/或Fc)来促进分泌和/或后续的纯化。

[0561] 使用适当的引物，通过PCR克隆到瞬时表达载体pTT5(Durocher等，见上文)中来制备与Fc融合的可溶性异源二聚CGRP R ECD。CRLR N末端ECD-Fc由与人IgG1 Fc融合的CRLR
(SEQ ID NO:6)的N末端胞外域组成。RAMP1 ECD-Fc包含与人IgG1 Fc融合的RAMP1(SEQ ID 
NO:8)的胞外域。在两种情况下，均存在由五个介于ECD域和Fc之间的连续甘氨酸组成的连
接子。

[0562] 按照下文，通过共转染两种构建体来表达可溶性异源二聚CGRP受体。在FreeStyle 293培养基(Invitrogen)中，使用3ml PEI/mg DNA，以0.5mg/L DNA(hCRLR N末端ECD-Fc/
pTT5和huRAMP1 ECD-Fc/pTT5)转染摇瓶中1×106细胞/毫升的293-6E细胞。使细胞在补充
有0.1% Pluronic F68和50μg/ml遗传霉素的FreeStyle 293表达培养基的悬浮液中生长7
天，并收集用于纯化。

[0563] 通过添加50mM Tris、400mM柠檬酸钠来缓冲条件培养基(“CM”)并将pH调节至8.5来进行从CM的纯化。然后使缓冲的CM通过在50mM Tris、400mM柠檬酸钠和调节至8.5的pH中平衡的蛋白质A亲和柱。用PBS洗涤蛋白质A柱，并用0.1N HOAc洗脱Fc融合蛋白。使用对CRLR或RAMP1具有特异性的各抗体通过Western印迹法测试时，洗脱峰包含CRLR和RAMP1组分。进一步的LC-MS和N末端序列测定证实CRLR:RAMP1异源二聚体和CRLR:CRLR同源二聚体均存
在，比率为大约(2:3)。此“可溶性CGRP受体”在FMAT分析中显示出可与CGRP受体表达重组细胞竞争结合Alexa647标记的CGRP8-37，但其不能结合CGRP配体，如用Biacore测试所测定。该物质用作实施例中所述的免疫原，尽管其尤其存在异质性并不结合CGRP配体。

[0564] E.由重组CGRP受体表达细胞产生膜提取物

[0565] 使用Bossé，R.等，(Journal of Biomolecular Screening，3(4): 285-292(1998))所述的方法由CGRP受体表达细胞制备膜提取物。简言之，在4℃下，将大约5克细胞糊在50ml PBS中以3,000rpm沉淀10分钟并重悬于30ml冷裂解缓冲液(25mM HEPES，pH 7.4，
3mM MgCl2外加一种Roche蛋白酶抑制剂混合物片剂/50mL)中。用Glas-Col(Teflon玻璃匀
化器)在5,000rpm下以约20次冲击来使裂解物均化，并在JA21转子中以20,000rpm在4℃下
旋转15分钟。再次重复此过程并将最终团块重悬于约1-5ml“最终团块”缓冲液(25mM 
HEPES，pH 7.4，3mM MgCl2，10%(w/v)蔗糖外加一种Roche蛋白酶抑制剂混合物片剂/50mL)中。通过使膜提取物通过16G和25G针2-3次来对其进行剪切。用微型板BCA蛋白测定
(Pierce)来测定总的膜蛋白浓度。

[0566] 实施例2

[0567] CGRP受体的抗体的产生

[0568] A.免疫

[0569] 使用如实施例1所述制备的以下形式的CGRP受体抗原进行免疫：

[0570] (i)在细胞表面表达全长人CRLR和RAMP1的AM-1 CHO转染子，其通过用编码具有序列SEQ ID NO:2的多肽的人全长CRLR cDNA(SEQ ID NO:1)与编码具有序列SEQ ID NO:4的
多肽的RAMP1 cDNA(SEQ ID NO:3)共转染CHO细胞来获得；

[0571] (ii)来自上文(i)所述的细胞的膜提取物；和

[0572] (iii)可溶性CGRP受体，其通过共表达和纯化CRLR(SEQ ID NO:6)的N末端ECD和RAMP1(SEQ ID NO:8)的胞外域(ECD)获得，如实施例1中所述。

[0573] 用纯化的可溶性CGRP受体蛋白和由稳定表达CGRP R的AM-1 CHO细胞所制备的纯化的CGRP R膜(分别使用10μg/小鼠和150μg/小鼠的剂量)，以相同方式使XENOMOUSE动物免疫。使用上述方法制备CGRP膜。

[0574] 随后施用10μg/小鼠的可溶性CGRP R或75μg纯化的CGRP R膜的剂量进行加强。还用CGRP受体表达细胞(使用3.4×106个CGRP R转染细胞/小鼠的剂量)使XENOMOUSE动物免
疫，并且随后使用1.7×106个CGRP R转染细胞/小鼠的剂量进行加强。所用的注射部位为皮
下尾根部(base-of-tail)与腹膜内的组合。根据2002年2月19日提交的美国专利第7,064,
244号中所公开的方法进行免疫，该专利的公开内容据此以引用的方式并入。根据制造商说明书制备佐剂TiterMax Gold(Sigma；目录号T2684)、Alum(E.M. Sergent Pulp和Chemical Co.，Clifton，NJ，目录号1452-250)，并将佐剂乳液与抗原溶液以1:1的比率混合。

[0575] 首次注射后4-6周收集血清，并通过重组CGRP受体表达的293EBNA细胞的FACs染色来测定特异性滴度。

[0576] 用表达全长CGRP R细胞或可溶性CGRP R胞外域的细胞/膜使小鼠免疫，其中在大约一个月至三个半月期间进行11-17次免疫。鉴别具有最高血清滴度的小鼠，并制备用于产生杂交瘤。在多个(通常十个)小鼠的组中进行免疫。通常从各组中采集腿弯部和腹股沟淋
巴结以及脾脏组织来产生融合物。

[0577] B.单克隆抗体的制备

[0578] 鉴别表现出合适滴度的动物，并从引流淋巴结获得淋巴细胞，并在必要时采集各组的淋巴细胞。在合适的培养基(例如，杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)；DMEM；得自Invitrogen，Carlsbad，CA)中，从淋巴组织解离淋巴细胞，以使细胞脱离组织并悬浮于DMEM中。使用合适的方法选择和/或扩增B细胞，并使其与合适的融
合配偶体(例如，非分泌性骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞)(美国典型培养物保藏所CRL 1580；
Kearney等，J. Immunol. 1231979，1548-1550)融合。

[0579] 将淋巴细胞与融合配偶体细胞以1:4的比率混合。通过在400×g下离心4分钟将细胞混合物轻微沉淀，倾析上清液，通过使用1ml移液管轻微混合细胞混合物。用PEG/DMSO(聚乙二醇/二甲基亚砜；得自Sigma-Aldrich，St. Louis MO；每百万淋巴细胞1ml)诱导融合。
在轻轻搅拌下，经一分钟缓慢添加PEG/DMSO，然后混合一分钟。然后在轻轻搅拌下，经2分钟添加IDMEM(不含谷氨酰胺的DMEM；每百万B细胞2ml)，随后经3分钟添加额外的IDMEM(每百
万B细胞8ml)。

[0580] 将融合细胞轻微沉淀(400×g，6分钟)并重悬于每百万B细胞20ml的选择培养基(例如，包含重氮丝氨酸和次黄嘌呤[HA]以及必要的其它补充材料)中。将细胞在37℃下孵
育20-30分钟，然后重悬于200ml选择培养基中，并在T175烧瓶中培养三至四天后接种于96
孔板中。

[0581] 使用标准技术将细胞分布于96孔板中，使得所得集落的克隆形成能力最大化。培养若干天后，收集杂交瘤上清液并按下文实施例中详述进行筛选测定，包括证实与人CGRP
受体的结合、通过配体结合竞争性测定鉴别封闭性抗体，以及评估与CGRP受体有关的其它
受体(例如，人肾上腺髓质素受体)的交叉反应性。进一步选择阳性细胞，并使其经受标准克隆和亚克隆技术。使克隆系在体外扩增，并获得所分泌的人抗体以供分析。

[0582] C.所选单克隆抗体的序列分析

[0583] 使用标准RT-PCR方法对所选亚克隆单克隆抗体进行测序。表2A示出本文所公开的示例性抗体的轻链氨基酸序列。表2B示出本文所公开的示例性抗体的重链氨基酸序列。

[0584] 将对应于已测序抗体的CDR区的氨基酸序列进行比对，并利用比对通过相似性对克隆进行分组。

[0585] 图3A和3B中示出来自具有κ轻链的克隆的轻链CDR和某些相应共有序列的序列比对。

[0586] 图4示出来自具有λ轻链的克隆的轻链CDR和某些相应的共有序列的序列比对。

[0587] 图5A、5B、5C、5D和5E中示出本文所公开的示例性抗体的重链CDR和某些相应的共有序列的序列比对。

[0588] 图5F中示出本文所公开的示例性重链CDR的某些共有序列。

[0589] 实施例3

[0590] CGRP受体特异性抗体的鉴别

[0591] A.通过FMAT选择CGRP受体特异性结合抗体

[0592] 培养14天后，通过荧光微体积测定技术(FMAT)(Applied Biosystems，Foster City，CA)，针对CGRP R特异性单克隆抗体筛选杂交瘤上清液。针对用人CGRP R转染的AM-1 CHO huCGRP R细胞或重组HEK 293细胞筛选上清液，并针对亲本HEK293细胞(如实施例1所
述制备)进行反向筛选。

[0593] 简言之，将Freestyle培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中的细胞以大约4000个细胞/孔的密度(对于稳定转染子)和大约16,000个细胞/孔的密度(对于亲本细胞和细胞)
接种于体积为50µL/孔的384孔FMAT板中，并在37℃下孵育过夜。然后添加10µL/孔上清液并将板在4℃下孵育大约一小时，然后以2.8μg/ml浓度(400ng/ml终浓度)添加10µL/孔的抗人IgG-Cy5二抗(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)。然后将板在4℃下孵育一小时，并用FMAT共聚焦式扫描仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)来读取荧光。

[0594] 对于反向筛选，以类似方式接种亲本AM-1 CHO细胞或HEK 293细胞，并针对这些细胞通过FMAT并行筛选上清液，以区分并消除结合细胞蛋白质而非结合CGRP受体的杂交瘤。

[0595] B.通过配体结合竞争性分析、经由FMAT鉴别封闭性抗体

[0596] 开发配体结合竞争法，以鉴别(杂交瘤上清液中)结合CGRP受体并阻断CGRP配体结合的抗体。制备每孔中具有5,000个AM-1 huCGRP R Pool 2细胞和20,000个未转染CHO-S细
胞的384孔板(Corning Costar，目录号3712)。将20µl抗CGRP R杂交瘤上清液添加到各孔
中，并将板在室温下孵育1小时。然后将10µl 2.8µg/ml Alexa647-CGRP8-37肽添加到各孔
中，并将板在室温下再孵育3小时。在FMAT 8200细胞检测系统(Applied Biosystems)上测
定与细胞结合的Alexa647-CGRP8-37的量。输出数据为信号强度的数显FL1值(较高FL1值表
明较高的信号强度)以及细胞图像。

[0597] 实验包括阴性对照杂交瘤细胞上清液。将这些阴性对照实验中观察到的平均FL1值用作测定的最大可能信号。将实验上清液与此最大信号相比较，并计算各孔的抑制百分
比(%抑制=(1-(抗CGRP R杂交瘤细胞上清液的FL1/最大FL1信号))。

[0598] 图6中示出数据概况。在此实验中，用受体配体测定测试1092抗CGRP R上清液。使用平均抑制百分比对数据排序。九十种上清液具有>25%平均抑制，其中31种>50%，7种>70%平均抑制。

[0599] 下表10示出简化数据集。ID No.1-5的样本示出抑制Alexa647-CGRP8-37肽与CGRP受体结合的抗CGRP R杂交瘤上清液的实施例，并且ID No 536-540的样本示出不抑制
Alexa647-CGRP8-37肽与CGRP受体结合的抗CGRP R杂交瘤上清液的实施例。

[0600] 表10–来自FMAT配体结合竞争性测定的示例性数据

[0601]

[0602] 根据结合竞争性测定，选择大约30种上清液以用于进一步表征。

[0603] 实施例4

[0604] CGRP受体特异性阻断单克隆抗体在cAMP功能测定中的活性

[0605] A. CGRP受体抗体活性。

[0606] 在体外CGRP受体介导的cAMP测定中筛选所选的CGRP受体抗体，以测定固有效价。体外cAMP测定采用得自ATCC(ATCC编号HTB-10；“HTB-10细胞”)、源于人成神经细胞瘤的细胞系(SK-N-MC；Spengler等，(1973)In Vitro 8: 410)。HTB-10细胞表达CRLR和RAMP1，从而形成CGRP受体(L. M. McLatchie等，1998)。如实施例1中所述产生表达重组食蟹猴CGRP R
的293EBNA细胞系，并且由ATCC获得表达大鼠CGRP受体的大鼠L6细胞系(CRL-1458)。

[0607] 在筛选中使用LANCE cAMP测定试剂盒(PerkinElmer，Boston，MA)。在60µL总体积的白色96孔板中进行测定。简言之，在测定当天，将冷冻的HTB-10细胞在37℃下解冻，将细胞用测定缓冲液洗涤一次，并将包含与Alexa标记的抗cAMP抗体混合的10000个细胞的12µL
细胞悬液添加到96孔半区域白色板中。添加12µL CGRP受体抗体后，将混合物在室温下孵育
30分钟。然后添加12µL CGRP受体激动剂人α-CGRP(1nM终浓度)，并在室温下进一步孵育15分钟。在人α-CGRP刺激后，添加24µL检测混合物并在室温下孵育60分钟，并在EnVision仪器(PerkinElmer，Boston，MA)上于Em665nM下读取板。通过Prizm(GraphPad Software Inc.)或ActivityBase(IDBS)处理和分析数据。

[0608] 图7A示出如上所述使用三种抗体3C8、13H2和1E11的hCGRP受体表达细胞系HTB-10获得的示例性数据。将数据根据相对于对照的百分比(“POC”)为抗体(3C8、13H2或1E11)浓度的函数作图，并且以标准非线性回归曲线拟合，以产生图底部所示的IC50值。

[0609] B.相关受体中缺乏抗体活性。

[0610] 使用表达相关受体AM1(表达hCRLR+hRAMP2的HEK 293细胞；D. R. Poyner等，Pharmacological review，54:233-246，2002)、AM2(表达hCRLR+hRAMP3的CHO细胞；D. R. Poyner等，Pharmacological review，54:233-246，2002)或人胰岛淀粉样肽AMY1受体(MCF-
7细胞hCTR+hRAMP1；Wen-Ji Chen等，Molecular pharmacology，52: 1164-1175，1997)的细胞测定所测试抗体的选择性。如上文实施例1中所述产生AM1表达HEK 293细胞系。AM2表达
CHO细胞系购自EuroScreen(现为PerkinElmer，Inc.)；并且人胰岛淀粉样肽AMY1受体表达
MCF-7细胞系(Zimmermann等，Journal of Endocrinology，423-431，1997)得自ATCC(HTB-
22)。如上所述的示例性结果示出于图7B(hAM1-HEK细胞)、7C(hAM2-CHO细胞)和7D(hAMY-
MCF-7细胞)中。注意所测试的抗体在所测范围内均无针对hAM1、hAM2或hAMY1受体的显著抑制活性。

[0611] 使用表达食蟹猴CGRP受体的重组HEK细胞和表达大鼠CGRP受体(ATCC)的大鼠L6细胞进行类似实验。来自这些研究的数据以及本实施例的A部分中所述获得的其它IC50数据
在下表11的“cAMP”栏中示出。注意到针对人和食蟹猴（cyno）CGRP受体的IC50值在纳摩尔范围内，而针对大鼠CGRP受体和人AM1、AM2和AMY1受体，以及表达降钙素的MCF7细胞(未示出数据)的活性均大于1微摩尔。人CGRP受体与人AM1、AM2、胰岛淀粉样肽和降钙素受体之间的IC50差异表明这些抗体对CGRP受体的选择性高于部分由相同受体组分所形成的相关受体。
使用人和食蟹猴CGRP受体得到的IC50类似，而所测试的抗体似乎不与大鼠CGRP受体发生交
叉反应。

[0612] 表11

[0613]

[0614]

[0615] 实施例5

[0616] 用于受体封闭性抗体的Ki测定的放射性配体CGRP结合测定

[0617] 在不同浓度的测试抗体存在下使用125I标记的CGRP(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)和HTB-10细胞的细胞膜(PerkinElmer Inc.，Waltham，Massachusetts)进行放射性配体结合实验，以测定相应的Ki值。在室温下于96孔板中准备CGRP结合测定，所述
96孔板包含：110μl结合缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.5，5.0mM MgSO4，0.2% BSA(Sigma)、1片CompleteTM/50ml缓冲剂(蛋白酶抑制剂))；20µL测试化合物(10×)；20µL 125I-hαCGRP
(Amersham Biosciences；10×)；以及50µL人成神经细胞瘤细胞(HTB-10)膜悬浮液(每孔10
μg，PerkinElmer)。将板在室温下孵育2小时，同时以60rpm摇振，然后经由0.5%聚乙烯亚胺(PEI)处理(至少一小时)的GF/C 96孔滤板过滤各孔的内容物。将GF/C滤板用50mM的冰冷
Tris(pH 7.5)洗涤六次，并在55℃的烘箱中干燥1小时。然后密封GF/C板的底部。将40µL 
MicroscintTM 20添加到各孔中，用TopSealTM-A(压上粘合型剂密封膜)密封GF/C板的顶部，并用TopCount NXT(Packard)对GF/C板进行计数。使用Prizm(GraphPad Software Inc.)分
析数据。

[0618] 图8示出使用抗体3C8，12H2和1E11获得的示例性数据和Ki值。

[0619] 上表11中最右栏列出放射性标记125I-CGRP竞争性结合测定中指定mAb对HTB-10细胞膜的Ki值。该数据表明CGRP受体抗体对CGRP结合具有高度竞争性(所有亚纳摩尔范围)。

[0620] 实施例6

[0621] 用于CGRP受体封闭性抗体的KD测定的FACS结合测定

[0622] 使用FACS方法测定抗CGRP R mAb对表达于细胞上的CGRP受体的亲和力。简言之，在包含10% FBS、NEAA、PS、L Glut、NaPyr和0.05%叠氮化钠的DMEM培养基中，将如上所述制备的AM-1 CHO huCGRP R表达细胞以每孔16,000或160,000个细胞的密度接种到96孔板中。
将CGRP受体抗体在50nM至1pM的相同培养基中滴定并与细胞一起孵育。在4℃下以120μl的
总体积在板摇动器上孵育过夜后，将细胞用PBS+2% FBS洗涤2次，每次离心并弃上清液。然后添加100μl/孔包含7AAD(5µl/孔)的G抗Hu Fc Cy5(5µg/mL；Jackson ImmunoResearch 
Laboratories Inc.，West Grove，PA，USA)，并在4℃下孵育40分钟。将细胞用PBS+2%FBS洗涤2次，每次离心并弃上清液。然后添加100µL PBS+2%FBS缓冲液，并通过FACS分析以测定结合几何平均值。使用KinExA软件，通过求取各抗体浓度下的负几何平均值来计算Kd作为游
离Ab的存在量，Rathanaswami等，Biochemical and  Biophysical  Research 
Communications334(2005) 1004-1013。如Rathanaswami等，Biochemical and 
Biophysical Research Communications334(2005) 1004-1013中所述，通过n曲线分析来
分析在两种不同细胞浓度下获得的数据，以测定Kd和95%置信区间。

[0623] 图10中示出抗体12G8.2的具有相应曲线拟合的示例性数据。表12中示出根据本公开所产生的八种封闭性抗体的数据。在两个不同天时分析抗体之一(3B6)。用16K细胞进行
的实验获得的0.9的比率表明，抗原浓度可按0.9倍Kd预测，因此由此实验获得的曲线为Kd
控制曲线。可理解，以此方式获得的Kd值在所有测试抗体的低个位数摩尔范围内。

[0624] 表12

[0625]

[0626] 实施例7

[0627] 通过BICORE结合竞争结合CGRP受体封闭性抗体

[0628] 按如下进行Biacore分析(Karlsson，R.等，Methods; A Companion to Methods in Enzymology，6: 99-110(1994))。根据制造商说明书，使用10mM HEPES、0.15M NaCl、
3.4mM EDTA、0.005% P-20(pH 7.4)(HBS-EP缓冲液)的连续流将抗CGRP受体抗体固定到CM5
感测芯片表面。通过注射60µL包含0.2M N-乙基-N’(二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和0.05M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合物来活化感测芯片表面上的羧基。通过注射180µL稀释于
10mM乙酸盐(pH 4.0)中的抗CGRP受体抗体(浓度为30μg/mL)来获得特异性表面。通过注射
60µL 1M乙醇胺使表面上过量的反应性基团失活。各个抗体的最终固定化水平如下：

[0629]

[0630] 还在感测芯片上制备空白的模拟耦合参考面。将浓度为100nM的可溶性huCGRP受体捕获到具有上述六种固定化抗体(11D11、3B6、4H6、12G8、9F5或34E3)之一的感测芯片上。
然后将20种测试抗CGRP R抗体的每一者注射到捕获的huCGRP受体上。如果注射的抗体识别
不同的表位(相对于固定化抗体所识别的表位)，则会观察到第二结合事件。如果抗体识别
相同或极类似的表位，则仅会观察到huCGRP受体的结合。

[0631] 图9A中示出使用涂覆有固定化抗体3B6的感测芯片获得的示例性数据。四条痕迹为在注射的溶液中使用抗体1E11、4E4、2E7和12G8获得的数据。实验期间的事件用字母表
示，其中“A”对应于注射huCGRP R-Fc，“B”对应于huCGRP R-Fc注射结束，“C”对应于注射第二mAb，并且“D”对应于第二mAb注射结束和缓冲液洗涤开始。注意到固定化抗体表面上无任何所注射抗体的任何结合信号的指示，这表明四种所注射的抗体似乎与固定化抗体识别相
同或极类似的表位。在五种固定化中和抗体表面的每一者上洗涤的所有测试封闭性抗体中
均观察到基本上相同的结果，这表明所有测试的抗huCGRP受体封闭性抗体识别相同或极类
似并且高度重叠的表位。

[0632] 相比之下，如图9B、9C和9D中部分所示，四种所测试的非封闭性CGRP受体特异性抗体32H8、33B5、33E4和34E3未能与11D11(未示出数据)、3B6(图9B)、12G8(图9C)和9F5(未示出数据)竞争，尽管34E3能够与4H6(图9D)竞争并与32H7(未示出数据)微弱竞争。32H8未能与3B6、4H6、12G8、9F5或非封闭性抗体34E3竞争，但33B5和33E4可与非封闭性抗体34E3竞争。所有封闭性和非封闭性抗体的数据汇总于下表13中。“NB”表示未结合；“+”表示显著结合；并且“弱”表示弱结合。

[0633] 表13

[0634]

[0635] 从数据可看出，所有测试的封闭性或中和抗体与五种固定化封闭性抗体的相同区结合；即，所有测试的中和抗体结合CGRP R分子的相同区。另一方面，非封闭性抗体通常不与固定化封闭性抗体竞争，这表明非封闭性抗体主要结合CGRP R的不同区。

[0636] 实施例8

[0637] WESTERN印记法中CGRP受体抗体与可溶性CGRP受体的结合

[0638] 使用Western印记法测试三种代表性CGRP受体封闭性抗体与可溶性CGRP受体-muFc融合蛋白的结合。

[0639] 在13.3%浓度的β-巯基乙醇(βME)存在(还原)或不存在(未还原)的情况下，将100ng纯化的CGRP R-muFc(如上针对CGRP R-huFc所述来产生和纯化的，除了使用小鼠Fc并
将RAMP1或将CRLR ECD与muFc之间的连接子变为 “GGGGGVDGGGGGV”(SEQ ID NO:213))稀释于具有PAGE样本缓冲液的PBS中。然后将包含βME的样本煮沸4分钟。将还原或未还原的样本装载到单独的4-20% Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen)上，该凝胶具有CGRP R-Fc蛋白质与分
子量标记(Invitrogen)的交替泳道。将凝胶在0.2µm硝化纤维素滤膜(Invitrogen)上进行
电转染。将印记用Tris缓冲盐溶液+1% Tween 20(TBST)洗涤，然后用TBST+5%干乳粉阻断30分钟。将印迹沿分子量标记泳道切成条带。将一条各具有还原和未还原CGRP R-muFc的条带与纯化的huCGRP R抗体4E4、9F5或3B6(在TBST+5%牛乳中以1:500稀释)、山羊抗huRAMP1 N-
20(1:500；Santa Cruz Biotechnology，Inc)、兔抗小鼠IgG-Fc-HRP(1:10,000)(Pierce)或山羊抗人IgG-Fc-HRP(1:10,000)(Pierce)一起孵育。将印迹与抗体一起孵育一小时，然后
用TBST+1%牛乳洗涤3×10分钟。将印迹用huCGRP R抗体处理，然后与山羊抗小鼠IgG-Fc-
HRP(TBST+1%牛乳中1:10,000)一起孵育，并将用抗huRAMP1(N-20抗RAMP1山羊多克隆抗体，Santa Cruz Biotech，CA)处理的印迹与兔抗山羊IgG-Fc-HRP(1:10,000)一起孵育20分钟。
将印迹用TBST洗涤3×15分钟。将huCGRP R和抗huRAMP1抗体印迹用Pierce Supersignal 
West Pico检测试剂处理，并将抗小鼠和抗人IgG-Fc-HRP印迹用Pierce标准检测试剂处理
(1分钟)。然后用Kodak Biomax MS X射线胶片使印迹曝光。

[0640] 所有三种CGRP受体抗体、4E4、9F5和3B6在非还原条件下能够(但在还原条件下未能)检测可溶性CGRP R-muFc(包含RAMP1-ECD和CRLR ECD)，这表明这些CGRP R抗体的结合
表位具有构象，并对二硫键(RAMP1-ECD中有三对，并且CRLR N-ter ECD中有三对)敏感。相比之下，市售抗RAMP1抗体N-20(Santa Cruz Biotech)在还原与非还原条件下均与RAMP1结
合，这表明N-20抗体的结合位点主要为线性的并对二硫键不敏感。

[0641] 实施例9

[0642] CGRP受体封闭性抗体与嵌合受体的结合

[0643] 天然RAMP1与嵌合CRLR，或天然CRLR与嵌合RAMP1形成的CGRP受体用于鉴别参与抗体结合的CGRP受体序列。鉴于所有测试的人CGRP受体封闭性抗体均不能表现出对大鼠CGRP
受体的功能活性，因此嵌合组分在人序列背景下包含大鼠序列的区。产生下列嵌合体以便
通过FACS进行结合分析：

[0644] RAMP1嵌合体#1(Q28至A34)；SEQ ID NO:217

[0645] 将人RAMP1中的氨基酸残基Q28至A34用大鼠RAMP1的相应序列置换。此段包括人与大鼠RAMP1之间不同的五个氨基酸残基。

[0646] RAMP1嵌合体#2(Q43至E53)；SEQ ID NO:218

[0647] 将人RAMP1中的氨基酸残基Q43至E53用大鼠RAMP1的相应序列置换。此段包括人与大鼠RAMP1之间不同的六个氨基酸残基。

[0648] RAMP1嵌合体#3(R67至E78)；SEQ ID NO:219

[0649] 将人RAMP1中的氨基酸残基R67至E78用大鼠RAMP1的相应序列置换。此段包括人与大鼠RAMP1之间不同的七个氨基酸残基。

[0650] CRLR嵌合体#1(L24至Q33)；SEQ ID NO:223

[0651] 将人CRLR中的氨基酸残基L24至Q33用大鼠CRLR的相应序列置换。此段包括人与大鼠CRLR之间不同的八个氨基酸残基。

[0652] 图11示出食蟹猴(SEQ ID NO:215)、人(SEQ ID NO:4)、大鼠(SEQ ID NO:214)和恒河猴(SEQ ID NO:216)的RAMP1氨基酸序列以及RAMP1嵌合体#1(SEQ ID NO:217)、嵌合体#2
(SEQ ID NO:218)和嵌合体#3(SEQ ID NO:219)的序列的比对。图12A和12B示出人(SEQ ID 
NO:2)、食蟹猴(SEQ ID NO:221)、恒河猴(SEQ ID NO:222)、大鼠(SEQ ID NO:220)的CRLR氨基酸序列以及CRLR嵌合体#1的氨基酸序列(SEQ ID NO:223)的比对。

[0653] 用CGRP R嵌合体DNA构建体(CRLR wt+RAMP1 Q28-A34；CRLR wt+RAMP1 Q43-E53；CRLR wt+RAMP1 R67-E78；CRLR L24-Q33+RAMP wt；CRLR wt+RAMP1 wt；pTT5载体对照)瞬时转染293-6E细胞。将细胞在72小时后收获，用PBS+0.5% BSA洗涤，并计数。将各转染的细胞系以5×105个细胞/100µl PBS/BSA的稀释度重悬。将细胞悬液以每孔100µl等分到96孔圆
底板(Falcon)中。将细胞以1200rpm沉淀5分钟。将上清液移除，并用包含0.5µg纯化的
huCGRP R抗体1H7、2E7、3B6、9F5、4H6、12G8、3C8、10E4、11D11、32H8或33B5的100µl悬液替换。将对照孔用抗DNP huIgG2(0.5µg)、Alexa647-CGRP肽(0.5µg)或单独的PBS/BSA处理。将细胞在冰上孵育一小时，然后用PBS/BSA洗涤两次。将细胞重悬于100µl/孔的包含抗hug-
Fc-FITC(0.5µg)(Alexa647-CGRP处理的细胞除外)的PBS/BSA中。在暗处，将细胞于冰上孵
育一小时，然后用PBS/BSA洗涤两次。将细胞重悬于200µl PBS/BSA中，并用FACS Calibur进行分析。

[0654] 对十种代表性封闭性抗体(3B6、9F5、4H6、12G8、3C8、10E4、32H7、4E4、11D11和1H7)和两种非封闭性抗体(32H8和33B5)进行测试。代表性数据(9F5抗体)在图13A、13B和13C中示出。图13A示出与野生型CGRP受体的结合；图13B示出与包含CRLR L24-Q33嵌合体的CGRP
受体的结合，并且图13C示出与包含RAMP1 Q28-A34嵌合体的CGRP受体的结合。FACS分析显
示所有12种抗体均结合野生型人CGRP受体对照，正如所预期。所有12种抗体显示与三种
RAMP1嵌合体RAMP1(Q28-A34)、(Q43-E53)和(R67-E78)中任一者的结合均显著降低。这可由下列因素造成：(1)嵌合体受体的表达水平低得多；(2)RAMP1嵌合体损害与人CRLR的折叠并改变受体复合物的构象；和/或(3) RAMP1上的这三个所选区直接参与这些抗体与CGRP受体
的结合。

[0655] 当开启FACS示踪以仅包括极小“表达”细胞群时，相比封闭性抗体，非封闭性抗体33B5和32H8似乎不能良好一致地结合RAMP1 Q43-E53嵌合体(较低几何平均值)，这表明结
合RAMP1 Q43-E53区对于非封闭性抗体而言可能更重要。另一方面，33B5和32H8比封闭性抗体更良好一致地结合RAMP1 R67-E78嵌合体，这表明RAMP1 R67-E78序列对于封闭性抗体而
言可能更重要。

[0656] 所有测试的CGRP受体抗体均适度良好地结合CRLR嵌合体(L24-Q33)，这表明此位点对于封闭性抗体的结合而言并非必需。

[0657] 概括地讲，数据显示RAMP1上的三个不连续区—(Q28-A34)、(Q43-E53)和(R67-E78)—可能参与CGRP受体抗体结合，其中(R67-E78)对于封闭性抗体而言更重要。如通过此方法所分析，CRLR的N末端序列(L24-Q33)似乎并未关键性地参与CGRP受体抗体的结合。此
方法不排除人与大鼠CGRP受体之间共享相同或相似序列的附加结合位点，这些结合位点未
在分析中被靶向。

[0658] 实施例10

[0659] 通过蛋白酶保护测定鉴别抗CGRP R中和抗体的人CGRP R表位

[0660] 成熟形式的CRLR-Fc融合分子(信号肽已移除；本文以SEQ ID NO:10公开)中的CRLR部分包含116个氨基酸(位于甘氨酸连接子之前)并具有通过形成三个二硫键而产生的
三个大环结构。CRLR中的三个二硫键为：序列位置26的Cys1(此段中列出的所有CRLR序列位置均是相对于SEQ ID NO:10表示的成熟序列而言)，其连接至序列位置52的Cys3(称为CRLR C1-C3)；序列位置43的Cys2，其连接至序列位置83的Cys5(称为CRLR C2-C5)；序列位置66的Cys4，其连接至序列位置105的Cys6(称为CRLR C4-C6)。成熟形式的RAMP1-Fc融合分子中
RAMP1部分包含位于甘氨酸连接子之前的91个氨基酸(SEQ ID NO:11)，其还形成三个分子
内二硫键。RAMP1中的三个二硫键为：序列位置1的Cys1(此段中列出的所有RAMP1序列位置
均相对于SEQ ID NO:11表示的成熟序列而言)，其连接至序列位置56的Cys5(称为RAMP1 
C1-C5)；序列位置14的Cys2，其连接至序列位置46的Cys4(称为RAMP1 C2-C4)；序列位置31的Cys3，其连接至序列位置78的Cys6(称为RAMP1 C3-C6)。

[0661] 抗CGRP中和单克隆抗体所结合的人CGRP受体蛋白的区通过以下方式来鉴别：用特异性蛋白酶将h CGRP R分割成肽，并测定所得hCGRP R肽(即，CRLR和RAMP1部分的包含二硫键和不含二硫键的肽片段)的序列。然后进行蛋白酶保护测定，以测定hCGRP R在存在结合
单克隆抗体的情况下的蛋白质水解消化。此测定的普遍原理为mAb与CGRP R的结合可保护
某些特异性蛋白酶切割位点，并且此信息可用于测定mAb所结合的CGRP R的区域或部分。

[0662] 简言之，对肽消化物进行HPLC肽作图；收集各个峰，并通过在线电喷射离子化LC-MS(ESI-LC-MS)分析和/或通过N末端测序来识别这些肽并作图。这些研究的所有HPLC分析
均使用窄孔反相C18柱(2.1mm内径×15cm长度；Zorbax  300SB，5μM；Agilent 
Technologies)(对于离线分析)和使用毛细管反相C18柱(0.5mm内径×25cm Vydac C18 
MS，5µm；The Separation Group)(对于LC-MS)来进行。用0.05%三氟乙酸(移动相A)至含有
90%乙腈的0.05%三氟乙酸的线性梯度来进行HPLC肽作图。对于离线或在线LC-MS分析的窄
孔HPLC，以0.25ml/min的流速将柱冲洗90分钟，并且对于在线LC-MS分析的毛细管HPLC，以
0.018ml/min的流速将柱冲洗90分钟。

[0663] 通过在37℃下将0.1M磷酸钠(pH 6.5)中的约100μg CGRP R(1.0mg/ml)与2μg AspN一起孵育20小时，用AspN(其在氨基端的天冬氨酸和一些谷氨酸残基之后裂解)消化成
熟形式的人CGRP R。

[0664] AspN消化物的HPLC色谱分析产生图14中所示的肽图谱(各样本注射30µg)(单独CGRP R(浓度1mg/ml)的色谱图标记为A)，而用相似量的CGRP R中和抗体克隆12G8的对照消
化显示，抗体基本上对AspN蛋白内切酶具有抗性(色谱图标记为B；CGRP R：抗体的重量比分别为100:2；100:7；100:20)。通过在线LC-MS/MS并通过Edman测序对从HPLC回收的肽峰进行序列分析。对肽消化物进行在线ESI LC-MS分析，以测定通过HPLC所分离的肽的精确质量和序列。从而测定AspN消化所得肽峰中存在的若干肽的特征(如图14中编号的峰所示)。下表
14示出这些肽序列在hCGRP R的相应组分(CRLR或RAMP1)中的位置。位于编号或X后的大写
字母C表示鉴别为CRLR肽的肽；位于编号或X后的大写字母R为RAMP1肽，并且“Fc”表示从
CRLR-Fc和RAMP1-Fc融合分子中释放的未消化的Fc片段。

[0665] 表14

[0666] 通过对CGRP R AspN消化进行肽作图来鉴别CRLR和RAMP1肽

[0667]

[0668] 图15示出使用单独CGRP R进行的AspN消化实验(各样本注射30µg)(色谱图标记为A)与在存在中和抗体12G8的情况下所进行的实验(色谱图标记为B)的比较。CGRP R:抗体的
重量比为1:1。色谱图B中的若干个峰(C5、C6和C7)显示峰高降低(相对于色谱图A)，而色谱图B中的两个其它峰(C-X和R-X)显示峰高增加(相对于色谱图A)。如果消化样本中存在相似
量的不同中和抗CGRP R抗体(10E4、3B6、3C8或4E4)(如标记为C的色谱图中所见)，则还观察到类似的肽图案。C6和C7均为二硫键连接的肽，其覆盖CRLR分子的大部分，而C5为驻留于分子N末端的不含CRLR二硫键的肽，并位于C7二硫键肽的倒数第二个位置。峰C-X包含三个
CRLR二硫键与多个序列，这表明至少两至三个肽通过二硫键连接在一起。在存在CGRP中和
抗体的情况下，CGRP R消化物中峰C-X的峰高增加表明，该抗体保护CGRP R免于在若干个与Glu25和Asp55有关的裂解位点处被AspN消化。由于肽C2和C4的峰强度根本未降低，因此抗
体似乎对Asp33和Asp72不具有显著的保护效应。因此，抗体似乎结合CRLR的区，其包括CRLR C1-C3和CRLR C4-C6二硫键区，以及Cys53和Cys66之间的环区。

[0669] 对hCGRP R的AspN作图还可鉴别RAMP1二硫键肽(R2)和RAMP1非二硫键肽(R1)(见表14和图14)。在任一上述中和抗体(12G8、10E4、4E4、3B6或3C8)存在的情况下，在峰强度显著高于从消化无抗体样本中所得的峰强度时回收肽R-X。质量和序列分析显示R-x包含对应
于Cys1和Arg86之间RAMP1序列的单一多肽链。这些实验表明CGRP R中和抗体可保护RAMP1
的重要区免于AspN蛋白质水解消化。

[0670] 为评估对CGRP R AspN蛋白质水解的保护效应对CGRP R中和(封闭性)抗体是否具有特异性(相比抗CGRP R非中和抗体)，在不中和CGRP R活性的无关对照单克隆抗体的存在
下进行CGRP R的AspN消化。结果在图15的色谱图D中示出。非中和抗体对CGRP R AspN蛋白
质水解并未显示出任何显著的阻断效应；实际上，肽图谱(色谱图D)在有关方面与消化单独CGRP R所得的图谱(色谱图A)几乎不可区分。

[0671] 蛋白质水解保护效应取决于添加至消化样本中的浓度。从图16可看出，对样本中具有可变量的抗CGRP R中和抗体4E4的固定量的CGRP R(100µg)(CGRP R:抗体重量比(微
克)分别为100:2；100:7；100:20)进行Aspen蛋白质水解。可对保护图谱进行观察，并且该保护是抗体浓度依赖性的。

[0672] 合在一起，这些数据表明本文所公开的封闭性或中和抗CGRP R抗体可阻断CGRP R(CRLR和RAMP1组分)的AspN蛋白质水解，这表明当这些抗体与CGRP受体结合时，这些封闭性抗体与CRLR和RAMP1都结合。此外，保护效应是抗体浓度依赖性的。这些结果还表明CGRP R中和抗体结合人CGRP R上接近Asp N切割位点的共同区。

[0673] 实施例11

[0674] cAMP功能分析中的市售抗RAMP1和抗CRLR抗体

[0675] 在CGRP受体介导的cAMP测定中，使用上文实施例4中所述的HTB-10细胞筛选针对人CGRP受体的一种或其它组分(RAMP1或CRLR)的市售抗体，以确定抗体是否具有生物活性。
数据在下表15中示出。在本文所公开的示例性抗体具有强生物活性的浓度范围内，抗体具
有不可检测(“ND”)、极弱(“VW”)或弱(“W”)生物活性。

[0676] 表15市售抗体活性

[0677]

[0678]

[0679] 实施例12

[0680] 表达不同受体组分的细胞的免疫组织化学染色

[0681] 每个胶塞(colla plug)(Integra LifeSciences Co.，Plainsboro，NJ)注射2×106-4×106个细胞。将胶塞嵌入OCT培养基(Sakura Finetek Inc.，Torrance，CA)，在-20℃下冷冻，并使用冷冻切片机将其切成20μm的切片。在室温(RT)下用4%低聚甲醛将切片固定1小时，随后在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤。将内源性过氧化物酶用3%H2O2/PBS封闭15分钟，并将切片在封闭溶液(具有3%正常山羊血清(Vector Labs，Burlingame，CA)和0.3%三硝基
甲苯X-100的PBS)中孵育1小时。随后，将切片在人抗CGRP受体一抗(32H7，0.03-0.1μg/ml)中于4℃下孵育过夜，在PBS中洗涤，并在1%正常山羊血清/PBS中的二抗(生物素化山羊抗人IgG Fc片段，1:800，Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)中于室温下孵育1小时。使用Vector Elite试剂盒，根据制造商说明书(Vector Labs，Burlingame，CA)增强免疫反应性，并使用3,3'-二氨基联苯胺-镍作为色原(Sigma-Aldrich，St. Louis，MO)来显色。将切片用二甲苯清洗，并用Permount(Fisher Chemicals，Fair Lawn，NJ)滑动盖片。使用Nikon E-800显微镜和相关软件(Nikon，Melville，NY)分析免疫反应性。

[0682] 使用上述抗体32H7由表达不同受体组分的细胞(如下文鉴别)获得的数据显示表达重组人CGRP受体的CHO细胞(CRLR+RAMP1；“CHO/CGRP R细胞”)显著染色，并且内源性表达CGRP受体的SK-N-MC细胞的染色较弱(由很低的受体密度所致)。下列细胞未观察到染色：亲本CHO细胞系、表达无关重组蛋白(TRPM8)的CHO细胞、用相应32H7抗原预吸附后的CHO/CGRP R细胞、表达重组人肾上腺髓质素受体2(CRLR+RAMP3)的CHO细胞、内源性表达胰岛淀粉样肽受体的MCF-7细胞、表达重组人肾上腺髓质素受体1(CRLR+RAMP2)的HEK细胞或亲本HEK细
胞。这些实验的数据汇总于下表16中。

[0683] 表16指定细胞的免疫组织化学染色强度

[0684]

[0685] 所标识的所有专利和其它公开案均以引用的方式明确地并入本文中，以用于描述和公开例如此类公开案中所述可结合本文所公开的主题使用的方法。此类公开案仅提供本
申请提交日之前的公开内容。就此而言，决不应解释为承认发明人因现有发明或任何其它
原因而无权将此公开案提前。所有关于日期的陈述或关于所述文献内容的说明均基于申请
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