一种高效近红外荧光材料及其生物应用

摘要

一种具有大斯托克斯(stoke)位移的高效近红外荧光染料及其在生物成像和荧光标记等领域的应用，属于有机荧光染料与应用技术领域。具体分子结构以富马酸腈为基本受体结构单元，通过双键在一侧或两侧共轭连接具有推电子能力的给体单元，其结构式如下所示，是通过Heck反应合成的一类新型的近红外荧光染料，其中R代表给体基团。研究发现这种染料在紫外光激发下会发出很亮的近红外荧光，且该材料具有很好的抗光漂白性和高固态量子效率。同时这些材料也有很大斯托克斯位移，因此其作为近红外荧光材料，可应用于生物成像和荧光标记等领域。

权利要求

1.一种基于富马酸腈的近红外荧光染料，其结构式如下所示：其中R为以下结构式之一所示的基团，

2.如权利要求1所述的一种基于富马酸腈的近红外荧光染料，其结构式如下：

3.权利要求1或2所述的一种基于富马酸腈的近红外荧光染料在荧光标记中的应用。

说明书

一种高效近红外荧光材料及其生物应用

技术领域

[0001] 本发明属于有机荧光染料与应用技术领域，具体涉及一种具有大斯托克斯(stoke)位移的高效近红外荧光染料及其在生物成像和荧光标记等领域的应用。

背景技术

[0002] 十六世纪光学显微镜改变了人们对生物学的认识，推动了生物医学的快速发展。本领域知悉，在光学显微镜下可以观察细胞的大小及形态、细胞器、染色体等。电子显微镜的发明开启了研究细胞超微结构的新纪元，如观察粗面内质网、滑面内质网、核糖体，同时配合生物化学技术还能对细胞分子进行分析等。随着人类社会的进步，近年来新的影像学设备及技术的不断涌现，分子影像学应运而生。分子影像学是一门涉及影像学与现代分子生物学及其他学科的新兴交叉学科。现代细胞生物学、分子生物学技术空前的进步和发展、高靶向性及灵敏度的分子探针、高时空分辨率小动物成像设备的发展等为分子影像学提供了条件。分子影像学是从分子或细胞水平上成像从而达到认识疾病、阐明病变组织生物过程变化、病变细胞基因表达、代谢活性高低、病变细胞是否存活以及细胞内生物活动的状态等目的的科学。分子影像学的发展为疾病早期诊断、治疗和机制研究提供了实时、动态信息。常用的分子影像学方法主要包括光学成像、超声成像(ultrasound)、计算机断层摄影(computedtomography，CT)、核磁共振(magneticresonanceimaging，MRI)、正电子衍射成像(positron-emissiontomography，PET)和单光子衍射(single-photon-
emissioncomputedtomography，SPECT)等。

[0003] 与其他成像手段相比，光学成像具有无创伤、无射线辐射危害、价格低、敏感性高、可实时成像等优点。荧光技术采用荧光报告基团(GFP、RFP、Cyt及dyes等)对靶向细胞或分子进行标记成像。光学成像仪器可以直接检测活体生物体内特定分子、细胞活动和基因表达行为。通过这些技术，可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、疾病的发生发展、基因的表达及反应等生物学过程。相对于其他活体成像技术：如超声、计算机断层摄影、核磁共振、正电子衍射成像、单光子衍射等，光学成像具有若干独特的优点，如操作简便、结果直观、测量快速、灵敏度高及费用低廉等。

[0004] 许多生物体及其组织在可见光的激发下自身会发射荧光，严重干扰生物样品的荧光检测和造影，如血浆中血清蛋白的荧光波长范围为325～350nm，还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酶(NADPH)和胆红素的荧光波长范围为430～470nm，故使得可见光区荧光分析的灵敏度和准确性受到了很大的影响。再加上光散射的影响往往会产生较为严重的背景干扰，严重限制了荧光分析法灵敏度的提高，而在近红外荧光(700～1200nm)光区，生物体内物质的自吸收和自发荧光较弱，可避免背景干扰而获得较高的分析灵敏度，同时还能够减少对生命体的损伤，有利于实现活体检测。并且由于散射光强度与波长的四次方成反比，随着波长增加，拉曼散射迅速减小，使散射干扰也大为减少。另外，小的斯托克斯位移会造成染料自淬灭，也称为染料的自吸收的问题。这是因为小斯托克斯位移的染料的吸收光谱与发射光谱有很大的交盖，这样染料有部分发射光能被其自身吸收，从而导致荧光强度下降。另一个问题是造成荧光分析技术的测量误差。这是因为小的斯托克斯位移使激发波长与荧光检测波长太过接近，激发波长易对荧光检测狭缝造成散射光干扰。因而开发具有大斯托克斯位移的荧光染料有着十分重要的意义。近年来，近红外荧光材料尤其受到关注，这主要是由于近红外光对生物组织不受背景荧光干扰的强穿透能力(Guo，Z.；Park，S.；Yoon，J.；
Shin，I.Chem.Soc.Rev.2014，43，16.Yuan，L.；Lin，W.；Zheng，K.；He，L.；Huang，W.Chem.Soc.Rev.2013，42，622.Achilefu，S.Angew.Chem.Int.Ed.2010，49，
9816.Escobedo，J.O.；Rusin，O.；Lim，S.；Strongin，R.M.Curr.Opin.Chem.Biol.2010，14，
64.Hilderbrand，S.A.；Weissleder，R.Curr.Opin.Chem.Biol.2010，14，71.Kiyose，K.；
Kojima，H.；Nagano，T.Chem.AsiaJ.2008，3，506.)。

[0005] 本发明为基于富马酸腈为受体单元，通过改变外围给体结构单元可以得到具有不同近红外发射的近红外荧光染料。以其为发光单元制备的荧光纳米粒子在细胞成像和生物标记领域中的应用具有广阔的前景。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种基于富马酸腈的近红外荧光染料及其在生物成像和荧光标记中的应用。

[0007] 本发明所述的近红外荧光染料，是以富马酸腈为基本结构单元，由双键在一侧或两侧共轭连接具有推电子能力的给体单元，其结构式如下所示：

[0008]

[0009] 其中R代表给体基团，为：

[0010]

[0011] 该类化合物适用于制备高效近红外荧光染料。本发明化合物的特点是具有高的固态荧光量子效率和抗光漂白能力，大的stoke位移和多光子吸收截面，且在紫外光激发下，任意一种上述化合物都会发出近红外荧光。而以此种化合物为基础制备的荧光标记物，如荧光纳米粒子，荧光探针等能够用于细胞成像和生物标记。

[0012] 富马酸腈近红外荧光染料合成步骤如下：

[0013]

[0014] 步骤1：在碘，甲醇钠催化下，俩分子的苯乙腈类原料反应生成富马酸腈中间体；

[0015] 步骤2：在碳酸银，醋酸钯催化条件下进行Heck反应制备得到终产物分子。

附图说明

[0016] 图1：为实施例1中制备的近红外荧光染料在THF溶液和固体状态下的紫外可见吸收发射谱，激发波长365nm；

[0017] 图2：为实施例2中制备的近红外荧光染料在THF溶液和固体状态下的紫外吸收发射谱，激发波长365nm；

[0018] 图3：为实施例17中制备的不同的近红外荧光染料负载量时的荧光发射谱；

[0019] 图4：为实施例18细胞成像图，纳米粒子培养浓度100μg/mL，激发波长408nm，捕获650～700nm荧光。

具体实施方式

[0020] 本发明给出了一类基于富马酸腈近红外荧光染料的合成方法及其在细胞成像和生物标记中的应用。

[0021] 前躯体的制备

[0022] 化合物1：

[0023] 对溴苯乙腈(5g，25.505mmol)和碘(6.5734g，25.505mmol)于250mL反应瓶中，冲氩气置换三次至瓶中无氧气和水为止，加入100mL干燥乙醚搅拌溶解。将甲醇钠(2.8933g，5.356mmol)溶于无水甲醇(8.680g，14.613ml)中，除氧和水，在-78摄氏度条件下缓慢滴入上述溶液中，整个滴加过程中需一直保持氩气氛围。滴加完后，缓慢升温至0摄氏度，继续搅拌反应3小时。反应完后，用质量分数5％的稀盐酸溶液淬灭反应，然后搅拌反应12小时。反应完全后，将溶液抽滤，滤饼用甲醇和水洗2次。所得固体在真空干燥箱中干燥。最终产品为
1
白色粉末化合物1(3.1143g，63％产率)。HNMR(CDCl3，500MHz):(ppm)7.67-7.72(m，8H，1-benzene)。

[0024] 化合物2：

[0025] 对溴苯乙腈(2.5g，12.753mmol)，苯乙腈(1.49g，12.753mmol)和碘(6.5734g，25.505mmol)于250mL反应瓶中，冲氩气置换三次至瓶中无氧气和水为止，加入100mL干燥乙醚搅拌溶解。将甲醇钠(2.8933g，5.356mmol)溶于无水甲醇(8.680g，14.613ml)中，除氧和水，在-78摄氏度条件下缓慢滴入上述溶液中，整个滴加过程中需一直保持氩气氛围。滴加完后，缓慢升温至0摄氏度，继续搅拌反应3小时。反应完后，用质量分数5％的稀盐酸溶液淬灭反应，然后搅拌反应12小时。反应完全后，将溶液抽滤，滤饼用甲醇和水洗2次。所得固体在真空干燥箱中干燥。最终产品为白色粉末化合物2(2.274g，57％产率)。1HNMR(CDCl3，
500MHz):(ppm)7.67-7.72(m，9H，1-benzene)。

[0026] 实施例1：

[0027] 分别取化合物2(159.6mg，0.52mM)，对二苯胺基苯乙烯(140mg，0.52mM)，Pd(OAc)2(6mg，0.026mM)，Ag2CO3(85mg，0.31mM)加入到50mL舒伦克管中，加入约10mL甲苯，100摄氏度下加热反应18小时。反应完后过滤反应液，滤液旋干溶剂，经硅胶柱提纯得深红色粉末产物化合物3，产率53.4％。1HNMR(500MHz，DMSO)δ7.82(ddd，J＝13.8，8.6，6.0Hz，9H)，7.55(d，J＝8.7Hz，2H)，7.43(s，1H)，7.39(s，1H)，7.33(dd，J＝8.3，7.5Hz，4H)，7.22(s，1H)，7.19(s，1H)，7.11–7.03(m，6H)，6.96(d，J＝8.6Hz，2H).Ms(m/e)：C36H25N3，calcd499.6；found499.6。
元素分析实验值(计算值)：C：86.6％(86.55％)；H：5.0％(5.04％)；N：8.4％(8.41％)。

[0028] 由图1可知，化合物3的四氢呋喃溶液最大吸收峰为455nm，在365nm激发光下的四氢呋喃溶液中的最大发射峰位于785nm的近红外发光区域，其斯托克斯位移达到了330nm，这对于生物成像来说是非常有利的。但是溶液亮度比较低，其量子效率只有1.03％,荧光寿命为0.25ns。化合物3的固体最大发射峰在690nm，相对于溶液来说产生了95nm的蓝移，这可能是其在固态时分子扭曲变大引起的，化合物3的固态荧光寿命为4.5ns，固体的荧光量子效率增大到了5.9％。

[0029]

[0030] 化合物3

[0031] 实施例2：

[0032] 分别取化合物1(200mg，0.52mM)，对二苯胺基苯乙烯(280mg，1.04mM)，Pd(OAc)2(12mg，0.052mM)，Ag2CO3(170mg，0.62mM)加入到50mL舒伦克管中，加入约10mL甲苯，100摄氏度下加热反应18小时。反应完后过滤反应液，滤液旋干溶剂，经硅胶柱提纯得深红色粉末产物化合物4，产率62.8％。1HNMR(500MHz，DMSO)δ7.87(d，J＝8.6Hz，4H)，7.82(d，J＝8.6Hz，4H)，7.58(d，J＝8.8Hz，4H)，7.43(d，J＝16.3Hz，4H)，7.38–7.33(m，8H)，7.23(d，J＝
16.5Hz，4H)，7.13–7.06(m，11H)，6.98(d，J＝8.7Hz，4H).Ms(m/e)：C56H40N4，calcd768.33；
found767.136.元素分析实验值(计算值)：C：87.5％(87.47％)；H：5.2％(5.24％)；N：7.3％(7.29％)。

[0033] 由图2可知，化合物4的最大吸收峰为472nm，在365nm激发光下的四氢呋喃溶液中的最大发射峰为770nm，同时我们还可以观察到化合物4溶液的斯托克斯位移达到了300nm。化合物4溶液量子效率为3.43％,荧光寿命为1.11ns，其固体最大发射峰在698nm，相对于溶液来说产生了72nm的蓝移，这可能是其在固态时分子扭曲变大引起的，而化合物4的固体最大发射峰比化合物3有微弱的红移，这可能是由于共轭体系的延长和分子构型更加扭曲引起的。化合物4的固态荧光寿命为3.77ns，固体的荧光量子效率增大到了19.1％。

[0034]

[0035] 化合物4

[0036] 实施例3：

[0037] 与化合物3合成类似，以对N，N-二甲基苯乙烯代替对二苯胺基苯乙烯，制备得化合物5。Ms(m/e):375.17，元素分析实验值(计算值)：C：83.2％(83.17％)；H：5.6％(5.64％)；N：11.2％(11.9％)。

[0038]

[0039] 化合物5

[0040] 实施例4：

[0041] 与化合物3合成类似，以对N，N-二乙基苯乙烯代替对二苯胺基苯乙烯得到化合物6。Ms(m/e):403.52，元素分析实验值(计算值)：C：83.3％(83.34％)；H：6.3％(6.24％)；N：
10.4％(10.41％)。

[0042]

[0043] 化合物6

[0044] 实施例5：

[0045] 与化合物3合成类似，以对N，N-二丙基苯乙烯代替对二苯胺基苯乙烯得到化合物7。Ms(m/e):431.57，元素分析实验值(计算值)：C：83.5％(83.49％)；H：6.8％(6.77％)；N：
9.7％(9.74％)。

[0046]

[0047] 化合物7

[0048] 实施例6：

[0049] 与化合物3合成类似，以对9-乙烯基久洛尼定代替对二苯胺基苯乙烯得到化合物8。Ms(m/e):427.2，元素分析实验值(计算值)：C：84.3％(84.28％)；H：5.9％(5.89％)；N：
9.8％(9.83％)。

[0050]

[0051] 化合物8

[0052] 实施例7：

[0053] 与化合物3合成类似，以对N-咔唑苯乙烯代替对二苯胺基苯乙烯得到化合物9。Ms(m/e):497.19，元素分析实验值(计算值)：C：86.9％(86.90％)；H：4.7％(4.66％)；N：8.4％(8.44％)。

[0054]

[0055] 化合物9

[0056] 实施例8：

[0057] 与化合物3合成类似，以9-三咔唑苯乙烯代替对二苯胺基苯乙烯得到化合物10。Ms(m/e):827.3，元素分析实验值(计算值)：C：87.0％(87.04％)；H：4.5％(4.50％)；N：8.5％(8.46％)。

[0058]

[0059] 化合物10

[0060] 实施例9：

[0061] 与化合物3合成类似，以三(三苯胺)基乙烯代替对二苯胺基苯乙烯得到化合物11。Ms(m/e):1037.45，元素分析实验值(计算值)：C：87.9％(87.92％)；H：5.3％(5.34％)；N：
6.8％(6.75％)。

[0062]

[0063] 化合物11

[0064] 实施例10：

[0065] 与化合物4合成类似，以对N，N-二甲基苯乙烯代替对二苯胺基苯乙烯，制备得化合物12。Ms(m/e):520.26，元素分析实验值(计算值)：C：83.0％(83.04％)；H：6.2％(6.19％)；N：10.8％(10.76％)。

[0066]

[0067] 化合物12

[0068] 实施例11：

[0069] 与化合物4合成类似，以对N，N-二乙基苯乙烯代替对二苯胺基苯乙烯，制备得化合物13。Ms(m/e):576.77，元素分析实验值(计算值)：C：83.3％(83.30％)；H：7.0％(6.99％)；N：9.7％(9.71％)。

[0070]

[0071] 化合物13

[0072] 实施例12：

[0073] 与化合物4合成类似，以对N，N-二丙基苯乙烯代替对二苯胺基苯乙烯得到化合物14。Ms(m/e):632.39，元素分析实验值(计算值)：C：83.5％(83.50％)；H：7.6％(7.64％)；N：
8.9％(8.85％)。

[0074]

[0075] 化合物14

[0076] 实施例13：

[0077] 与化合物4合成类似，以对9-乙烯基久洛尼定代替对二苯胺基苯乙烯得到化合物15。Ms(m/e):624.33，元素分析实验值(计算值)：C：84.6％(84.58％)；H：6.5％(6.45％)；N：
8.9％(8.97％)。

[0078]

[0079] 化合物15

[0080] 实施例14：

[0081] 与化合物4合成类似，以对N-咔唑苯乙烯代替对二苯胺基苯乙烯得到化合物16。Ms(m/e):764.29，元素分析实验值(计算值)：C：87.9％(87.93％)；H：4.8％(4.74％)；N：7.3％(7.32％)。

[0082]

[0083] 化合物16

[0084] 实施例15：

[0085] 与化合物4合成类似，以9-三咔唑苯乙烯代替对二苯胺基苯乙烯得到化合物17。Ms(m/e):1424.53，元素分析实验值(计算值)：C：87.6％(87.62％)；H：4.5％(4.52％)；N：7.9％(7.86％)。

[0086]

[0087] 化合物17

[0088] 实施例16：

[0089] 与化合物4合成类似，以三(三苯胺)基乙烯代替对二苯胺基苯乙烯得到化合物18。Ms(m/e):1844.81，元素分析实验值(计算值)：C：88.5％(88.47％)；H：5.5％(5.46％)；N：
6.0％(6.07％)。

[0090]

[0091] 化合物18

[0092] 实施例17

[0093] 将实施例2制备的近红外荧光染料化合物4按1mg/mL的浓度溶解在四氢呋喃中，并同时配置1mg/mL的两亲性聚合物聚(苯乙烯-co-马来酸酐)(PSMA)的四氢呋喃溶液。按图3中所示质量比例分别取化合物4的四氢呋喃溶液(40μL、36.4μL、33.3μL、32μL、30.76μL、28.6μL、26.7μL)于2mL的EP管中，再在其中分别加入PSMA溶液160μL，补加四氢呋喃定容至
1mL，超声使溶液混匀。将上述四氢呋喃溶液快速倒入含有5mL去离子水的玻璃瓶中，40度超声6分钟。在加热台设置温度70摄氏度下往瓶中吹氮气鼓泡(以气泡不会溢出瓶口为宜)去除四氢呋喃，吹至瓶中无四氢呋喃味道为止。用0.22微米滤头过滤溶液即可得红色纳米粒子溶液。上述纳米粒子溶液在365nm紫外光激发下可发出很亮的红光，其最大发射峰位在
670～700nm之间(附图3)，且其荧光量子效率会随着染料负载量的减少而逐渐增加，在负载比例为1:26时达到最大荧光量子效率34％。

[0094] 实施例18

[0095] 实施例17所述纳米粒子可以用于生物成像。A549细胞株被用作细胞成像，培养基均为DMEM培养基加10％胎牛血清、100U mL-1青霉素、100mg mL-1链霉素，培养条件为体积分数5％二氧化碳，37℃恒温培养。待细胞长至90mm培养皿铺满80％部分时，用胰蛋白酶37℃消化，转移至共聚焦培养皿内生长过夜，PBS溶液冲洗细胞，用含荧光纳米粒子100μg/mL的DMEM维持培养基(2％血清)换液，5小时后，弃培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，每次5分钟，在共聚焦显微镜下镜检照相，408nm激发，捕获650～700nm荧光检测荧光纳米粒子(如附图4)。可以看到，纳米粒子主要集中在细胞的细胞质区域且表现出了很高的荧光信号。