一株降解T-2毒素的乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)CAMT22361

摘要

本发明属于毒素生物处理技术领域，具体公开了一株具有降解T‑2毒素的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）CAMT22361，所述乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT22361于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 2015295。所述乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT22361的发酵液与T‑2毒素反应72小时后对T‑2毒素降解率可以达到61％。将其应用在饲料中T‑2毒素的去除，降解率达到50%以上。本发明的乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT22361具有高效快速降解T‑2毒素的能力，在生物降解饲料等中T‑2毒素处理具有很好的应用前景。

权利要求

1.一株降解T-2毒素的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)CAMT22361，其特征在于，所述乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT22361于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2015295。

说明书

一株降解T-2毒素的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)

CAMT22361

技术领域

[0001] 本发明属于毒素生物处理技术领域，更具体地，涉及一株降解T-2毒素的乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT22361。

背景技术

[0002] T-2毒素即4，15-二乙酰氧基-8-(异戊酰氧基)-12，13-环氧单端孢霉-9- 烯-3醇，属倍半萜烯类化合物，为单端孢霉族毒素中的典型代表。主要由拟枝孢镰孢菌(Fusariumsporotricoides)、木贼镰孢菌(Fusariumequiseti)、梨孢镰孢菌(Fusarium pose)、串珠镰孢菌(Fusariumacuminatum)等真菌产生的毒性次级代谢产物。T-2毒素可以通过不同途径对人畜的各种组织和器官产生毒害作用，尤其对增殖活跃细胞如骨髓、肝脏、淋巴细胞和粘膜上皮细胞等危害严重，最终可致畸，甚至致癌等。1973年，联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO) 把T-2毒素划为自然界存在的最危险的食品污染源。T-2毒素不仅毒性强，而且污染率较高。随着国际贸易的发展和国际粮食运输日渐频繁，加速了产毒真菌在世界范围内的传播，导致人类食用粮与动物饲料被污染的机率加大。因此，预防产毒真菌的污染、T-2毒素的检测以及T-2毒素的有效降解等方面的研究引起广泛的关注。目前用于去除T-2毒素的物理法、化学法及生物法。

[0003] 用于去除T-2毒素的物理法，如利用蒙脱石、铝硅酸盐、硅藻土、环湖精和凹凸棒石等吸附剂，虽然对粮食或饲料中T-2毒素有较高的脱除效率，但仍达不到完全清除的效果，甚至有的吸附剂还能将一定量的营养物质吸附掉。加热法利用热降解机制破坏毒素，该类方法操作简单，但需要设备且需要消耗能源。紫外与γ射线光辐照照射可以破坏毒素的化学结构，使之降解，该技术具备高效、快速和避免二次污染的优点，但需要投入辐照设备，且辐照对操作人员健康有一定的影响。

[0004] 用于去除T-2毒素的化学法，如氢氧化钠、氨、次氯酸钠、臭氧、阿魏酸等，化学试剂可与毒素发生一定的化学反应，起到转化降解的作用，从而达到降低或去除的目的。总的来说，这类方法较物理法效果好，但化学试剂可能会有一定的残留，引起二次污染。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于根据现有技术中的不足，提供了一株降解T-2毒素的新菌株。

[0006] 本发明的目的通过以下技术方案实现：

[0007] 一株降解T-2毒素的乳酸乳球菌Lactococcuslactis CAMT 22361，所述乳酸乳球菌Lactococcuslactis CAMT22361于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2015295。

[0008] 所述乳酸乳球菌CAMT22361的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

[0009] 所述乳酸乳球菌Lactococcuslactis CAMT 22361在MRS平板上菌落呈圆形、不透明、菌落为白色突起、有光泽、边缘整齐，菌株革兰氏染色在显微镜下菌体形态为球形，革兰氏染色呈阳性。

[0010] 将所述乳酸乳球菌Lactococcuslactis CAMT 22361的发酵液对T-2毒素进行降解，在72小时后其降解率可达到61％，将其应用在饲料中T-2毒素的去除，降解率达到50％以上。显示了其较强的降解效果。

[0011] 与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

[0012] 本发明提供了一株降解T-2毒素的乳酸乳球菌CAMT22361，所述菌株能够显著降解T-2毒素，其发酵液与T-2毒素反应72小时后对T-2毒素降解率可以达到61％。将其应用在饲料中T-2毒素的去除，降解率达到50％以上。本发明的乳酸乳球菌CAMT22361具有高效快速降解T-2毒素的能力，在生物降解饲料等中T-2毒素具有很好的应用前景。

附图说明

[0013] 图1为乳酸乳球菌CAMT22361形态特征图，A为菌落图，B为显微图。

[0014] 图2为基于乳酸乳球菌CAMT22361的16S rRNA与相关菌种的系统发育树。

具体实施方式

[0015] 以下结合具体实施例和附图来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0016] 除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

[0017] 实施例1：菌株的分离与鉴定

[0018] 乳酸菌分离：用灭菌海水冲洗沙虫表面，晾干，称取25g肠道样品并剪碎。采用10倍稀释法进行稀释，并涂布于含有1.5％钙的MRS固体培养基上，在25℃下培养3～5d后观察，挑取有溶钙圈的菌落纯化，然后进行革兰氏染色及过氧化氢酶试验。将革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株确认为乳酸菌，并进行斜面保存。

[0019] 降解T-2毒素乳酸菌的筛选：将分离到的乳酸菌接种加到每毫升含有50ng T-2毒素的改良的MRS液体培养基中，(改良的MRS培养基配方g/L：蛋白胨 10g，牛肉膏10g，K2HPO4 2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温-80l mL，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 
0.25g，蒸馏水1000mL，pH 6.2～ 6.4)，使菌的浓度达到108CFU/mL，与不接菌的做对照。将其放在37℃下150 r/min摇床培养72h。再吸取发酵液2mL于一玻璃管中，并加入2mL乙酸乙酯，超声萃取10min，旋涡混合5min，4000r/min离心10min，取上层液于另一玻璃管中，反复提取3次，合并提取液。将提取液在60℃氮吹仪下吹干。吸取2mL 30％甲醇水溶解，旋涡
5min，用一次性无菌注射器吸取，并经过0.22uL滤膜过滤于样品瓶中，通过LC-MS/MS检测。
结果发现，接种菌株CAMT22361的与对照的(即没有接种CAMT22361)相比，其T-2毒素的降解率为61％。由此筛选到降解T-2毒素能力较强的菌株CAMT22361。

[0020] 乳酸乳球菌CAMT22361形态学和生化鉴定：在MRS平板上菌落凸起、圆形、边缘整齐、乳白色、不透明的光滑型菌落(见图1，A)；细胞为球形，革兰氏染色呈阳性(见图1，B)；其生长温度范围为10℃～45℃，最适生长温度是30℃；其生长pH范围为3～10，最适pH为6～7；不运动，能发酵麦芽糖、半乳糖、核糖、乳糖产酸，水解精氨酸，不发酵蜜二糖、棉籽糖和松三糖，不产生硫化氢，还原0.1％的美兰牛乳，可忍受4.5％的NaCl。

[0021] 乳酸乳球菌CAMT22361基因水平鉴定：通过16S rDNA特异性引物(27F 与1492R)进行PCR扩增，27F的序列见SEQ ID NO：2所示，1492R的序列见 SEQ ID NO：3所示，并经生工生物工程(上海)股份有限公司测序，并将所测基因序列与GenBank相关数据进行BLAST相似性分析，下载相似性高的相关菌株的模式菌株序列，利用MEGA5.0软件，采用邻接法(Neighbor-Joiningmethod) 进行聚类分析和系统进化树构建，乳酸乳球菌CAMT22361系统发育树见图2。

[0022] 乳酸乳球菌Lactococcuslactis CAMT22361于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为 CCTCC No.M2015295。

[0023] 实施例2：

[0024] 1、乳酸乳球菌CAMT22361活化

[0025] 在超洁净操作台中，挑取上述乳酸乳球菌CAMT22361接种在实施例1中改良的MRS液体培养基中(pH为6.2～6.4)，37℃摇床培养24h，得到活化菌液。

[0026] 2、接种发酵液

[0027] 在超洁净操作台中，取一定量活化菌液，10000r/min离心2min，弃上清，用无菌生理盐水洗两次沉淀后重悬到原来体积，以无菌水为空白对照，测OD600 nm，并用无菌生理盐水稀释至吸光值为0.3，制成菌悬液，并按1％的接种量将菌悬液接种在改良的MRS液体培养基中上，使肉汤培养基的初始菌数大约为108 CFU/mL。

[0028] 3、T-2毒素的添加

[0029] 添加T-2毒素到初始菌数大约为108CFU/mL的改良的MRS液体培养基中， T-2毒素初始浓度为50.0ng/mL。以含有50.0ng/mL的T-2毒素的无菌PBS作为对照。悬浮液于37℃摇床培养72h(150r/min)。

[0030] 4、T-2毒素提取与检测

[0031] 菌株的发酵液取三管，每管2mL，加入2mL乙酸乙酯，超声萃取10min，旋涡混合5min，4000r/min离心10min，取上层液于另一试管中，反复提取3 次，合并提取液。将提取液在60℃氮吹仪下吹干。吸取2mL 30％甲醇水溶解，旋涡5min，用一次性无菌注射器吸取，并经过0.22uL滤膜过滤于样品瓶中，通过LC-MS/MS检测，记录实验数据。

[0032] 其中，LC-MS/MS方法检测条件如下：

[0033] 液相色谱质谱联用仪：TSQ Quantum Access，美国THERMO Fisher；

[0034] 4.1色谱条件

[0035] 色谱柱：Hypersil Gold(100mm×2.1mm,5μL)；流动相：甲醇-5mmol/L乙酸铵溶液(含0.1％甲酸)。进样量：10μL；针头到瓶底距离：1.0mm；进样速度：10.0μL/s；淋洗体积：1500μL；淋洗速度：100.00μL/s；

[0036] 冲洗体积：1500μL；进样速度：250.0μL/min。梯度洗脱条件见表1。流动相：A：甲醇B：5mmol/L乙酸铵溶液(含0.1％甲酸)

[0037] 表1

[0038]时间(min) A(％) B(％)
0.00 30.0 70.0
3.00 90.0 10.0
5.00 90.0 10.0
5.10 30.0 70.0
8.00 30.0 70.0

[0039] 4.2质谱条件

[0040] 喷雾电压：4500V；鞘气压力：35au；辅助气压：15au；毛细管温度：270℃；碰撞压：1.5mTorr。离子化模式电喷雾电离正离子(ESI+)模式，选择二级质谱中响应值较高的两个子离子作为定性离子，响应值最高的作为定量离子进行选择离子扫描模式质谱条件优化，结果如表2所示。

[0041] 表2

[0042]毒素 母离子质荷比(m/z) 子离子质荷比(m/z) 碰撞能e
T-2 484.3 215/305 17/12

[0043] 5、数据处理

[0044] T-2毒素的去除率计算：

[0045] T-2去除率/％＝(1-样品中T-2含量/空白对照中T-2含量)×100

[0046] 计算得到本发明CAMT22361发酵72h后其发酵液T-2降解率为61％。(样品中添加毒素初始浓度为50ng/mL)。

[0047] 实施例3：乳酸乳球菌CAMT22361对南美白对虾饲料中T-2毒素的降解作用[0048] 1、乳酸乳球菌CAMT22361菌悬液制备

[0049] 在超洁净操作台中，挑取斜面保存的乳酸乳球菌CAMT22361接种于MRS 肉汤培养基中，37℃培养24～28h，使菌悬液终浓度达到108CFU/mL。

[0050] 2、T-2毒素毒液配制

[0051] 精确称取T-2毒素标准品(Enzo，USA，纯度≥98％)1mg溶解在乙腈，定容至1mL，配制成1mg/mL T-2毒素毒液。

[0052] 3、南美白对虾带毒饵料的制备

[0053] 将对虾基础饲料(进口鱼粉33％，乌贼粉4％，豆粕18％，花生粕8％，虾糠4％，矿物质预混料1％，高筋面粉22％，鱼油1％，大豆磷脂3％，预混料5.7％，复合维生素0.3％，粉碎至全部饲料通过40目筛。将2mLT-2毒素毒液均匀喷洒在1Kg粉碎后的对虾基础饲料中，即每Kg饲料中含2mg T-2毒素。

[0054] 4、接种发酵液降解T-2毒素

[0055] 将浓度为108CFU/mL菌悬液按8％的接种量以喷洒的方式均匀接种到含T-2 毒素的南美白对虾饵料中，同时仍以喷洒方式补加水份，使发酵混料的水分含量达45～50％，37℃静止发酵4天，取出晾干。

[0056] 5、南美白对虾中T-2毒素降解率检测

[0057] 称取接种发酵后对虾带毒饵料2.0g，加入15mL乙酸乙酯，10,000r/min 均质均匀，超声并振荡10min，4 000r/min，离心10min，取上清，残渣再加入 15mL乙酸乙酯，同样操作，重复2次，合并上清液。将上述上清提取液用氮吹仪浓缩吹干，用1mL 30％甲醇复溶，采用实施例2中LC-MS/MS方法检测条件检测T-2毒素含量。

[0058] 测定后，乳酸乳球菌CAMT22361发酵后的每Kg饲料含T-2毒素0.88mg，按T-2去除率/％＝(1-样品中T-2含量/空白对照中T-2含量)×100计算，T-2去除率为56％。

[0059] 实施例4：乳酸乳球菌CAMT22361对罗非鱼饲料中T-2毒素的降解作用[0060] 1、乳酸乳球菌CAMT22361菌悬液制备

[0061] 在超洁净操作台中，挑取斜面保存的乳酸乳球菌CAMT22361接种于MRS 肉汤培养基中，37℃培养24-28h，使菌悬液终浓度达到108CFU/mL。

[0062] 2、T-2毒素毒液配制

[0063] 精确称取T-2毒素标准品(Enzo，USA，纯度≥98％)1mg溶解在乙腈，定容至1mL，配制成1mg/mL T-2毒素毒液。

[0064] 3、罗非鱼带毒饵料的制备

[0065] 将罗非鱼基础饲料(麦皮10％，次粉20％，进口鱼粉12％，豆粕30％，米糠5％，Ca(H2PO4)2 1％，菜籽粕20％，预混料2％)混匀并粉碎，粉碎至全部饲料通过40目筛。将2mL T-2毒素毒液均匀喷洒在1Kg粉碎后的对虾基础饲料中，即每Kg饲料中含2mg T-2毒素。

[0066] 4、接种发酵液降解T-2毒素

[0067] 将浓度为108CFU/mL菌悬液按8％的接种量以喷洒的方式均匀接种到含T-2 毒素的罗非鱼饵料中，仍以喷洒方式补加水份，使发酵混料终水分含量达45～ 50％，37℃静止发酵4天，取出晾干。

[0068] 5、罗非鱼饲料中T-2毒素降解率检测

[0069] 称取接种发酵后罗非鱼饵料2.0g，加入15mL乙酸乙酯，10,000r/min均质均匀，超声并振荡10min，4 000r/min，离心10min，取上清，残渣再加入15mL 乙酸乙酯，同样操作，重复2次，合并上清液。将上述上清提取液用氮吹浓缩吹干，用1mL 30％甲醇复溶，采用实施例2中LC-MS/MS方法条件检测T-2毒素含量。

[0070] 测定后，乳酸乳球菌CAMT22361发酵后的每Kg饲料含T-2毒素0.94mg，按T-2去除率/％＝(1-样品中T-2含量/空白对照中T-2含量)×100计算，T-2去除率为53％。