谷胱甘肽检测用生物传感器、其制备方法及其检测方法

摘要

本发明涉及一种谷胱甘肽检测用生物传感器、其制备方法及其检测方法。该传感器是在金电极的表面修饰有DNA双链探针，该双链探针中的第一探针是5’端修饰有巯基的Probe DNA1通过金金巯键固定在金电极表面，第二探针是3’端修饰亚甲基蓝信号分子的Probe DNA 2，所述的第二探针与第一探针部分杂交互补配对，从而形成DNA双链探针；所述的第一探针的碱基序列为：5’‑SH‑CCCCCTCTATACCGTACCTTTTTT‑3’；所述的第二探针的碱基序列为：5’‑GGTACGGTATAGAG‑MB‑3’。本发明的传感器可以灵敏地检测到谷胱甘肽的线性范围为0.5 nM至50μM，检测限为0.14 nM，且特异性强，可以有效地区分靶标与其他对照氨基酸和蛋白，也可在缓冲液和血清样本中高特异性的区分靶标分子，而且我们将体系运用到细胞中谷胱甘肽的检测。

权利要求

1.一种谷胱甘肽检测用生物传感器，其特征在于该传感器是在金电极的表面修饰有DNA双链探针，该双链探针中的第一探针是5’端修饰有巯基的Probe DNA1通过金巯键固定在金电极表面，第二探针是3’端修饰亚甲基蓝信号分子的Probe DNA 2，所述的第二探针与第一探针部分杂交互补配对，从而形成DNA双链探针；所述的第一探针的碱基序列为：5’-SH-CCCCCTCTATACCGTACCTTTTTT-3’；所述的第二探针的碱基序列为：5’-GGTACGGTATAGAG-MB-3’。

2.一种制备根据权利要求1所述的谷胱甘肽检测用生物传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：将预处理过的金电极浸没在修饰电极的反应液中，常温修饰反应16h-

24h；每100ml所述的修饰电极的反应液由5μL、10μM的Probe DNA1和5μL、10μM的Probe DNA2和5μL、100mM的TCEP，用85μL的固定缓冲液混成均匀的溶液稀释到终体积为100μL的体系构成，再经95℃的恒温加热5min，自然冷却至室温；所述的固定缓冲液为：10mM Tris-HCl、1mM EDTA、0.1M NaCl，其pH＝7.4。

3.根据权利要求2所述的一种制备谷胱甘肽检测用生物传感器的方法，其特征在于所述的金电极的预处理方法为：将金电极用砂纸和含有颗粒大小为1.0μm、0.3μm和0.5μm的铝粉的麂皮上打磨和抛光之后，将电极分别在无水乙醇和超纯水中超声3min，然后用50μL的水虎鱼，即浓硫酸︰过氧化氢＝3︰1的体积比的混合液，净化金电极，除去残留的杂质；再经过0.5M的H2SO4活化。

4.一种谷胱甘肽的检测方法，采用三电极检测系统，其中饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝作为辅助电极，工作电极金电极采用根据权利要求1所述的谷胱甘肽检测用生物传感器，其特征在于该方法的具体步骤为：a.配制反应体系，每100ml反应体系中含有10μL 100μM的Hg2+和5μL、10μM的helper DNA；将谷胱甘肽加入到该反应体系中，使反应体系中谷胱甘肽的浓度为：0.5nM～50μM，37℃恒温下，温育30min；所述的helper DNA的序列为：5’-TTTTTTGGTACGGTATAGAG-3’；

b.将金电极浸没在步骤a所得的反应体系中1～1.5h以在电极表面发生链置换反应；

c.在厌氧环境下，再通过三电极检测体系，运用差分脉冲伏安法的电化学方法表征亚甲基蓝分子的电化学信号，从而检测谷胱甘肽的浓度。

说明书

谷胱甘肽检测用生物传感器、其制备方法及其检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种DNA生物传感器，特别是一种谷胱甘肽检测用生物传感器、其制备方法及其检测方法。

背景技术

[0002] 谷胱甘肽，化学名为N-L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰，即由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸三部分组成，存在于所有的细胞中，是机体内的重要活性物质。谷胱甘肽（GSH）是一种同时具有谷氨酰基和巯基生物活性的三肽化合物，也是人体内和真核细胞内含量最大的一种非蛋白巯基物质。谷胱甘肽具有很多的生物学功能，它在氨基酸的吸收和转运，促进钙质吸收、提高机体免疫力，维持 DNA 的合成和细胞正常生长，参与高铁蛋白合成，清除自由基、以及体内解毒过程等方面有不可替代的作用；在药理上，GSH 具有抗惊厥，抑制癫痫发作和镇痛的作用； 此外，研究发现，GSH 的含量还涉及到癌症和心脏病等重大疾病的发生发展过程。正是由于 GSH 对人的身体健康有着如此大的影响，对 GSH的检测研究已经引起了人们愈来愈广泛的关注。

[0003] 目前存在的谷胱甘肽检测方法主要有高效液相色谱法、电化学发光法、酶循环法以及差热分析法等，但是这些方法或操作较为复杂，或检测灵敏度不高，且很难应用于原位分析和实时检测。于此，电化学成为检测谷胱甘肽的一门流行技术。如今，DNA分子是一个有利的元件用来构建有效的生物传感器，为分子识别、信号标记以及信号放大等提供很多选择。其中，DNA碱基与金属离子的选择性结合在DNA分析中引起了越来越多的关注。例如，Hg2+ 能够与T-T（胸腺嘧啶）高亲和性匹配,而C-C(胞嘧啶)可以专门捕捉Ag+。因为DNA碱基与金属离子间有高特异性的结合力，已经广泛用于离子检测、逻辑门的构建，甚至引发DNA扩增反应。最近，选择性形成T-Hg2+-T已经证明可以作为调节因子介导DNA链置换反应，从而成为了一个具有潜在意义的分子工具。

发明内容

[0004] 本发明的目的之一在于提供一种谷胱甘肽检测用生物传感器。

[0005] 本发明的目的之二提供该传感器制备的制备方法

[0006] 本发明的目的之三在于提供采用该传感器检测谷胱甘肽的方法。

[0007] 本发明是采用电化学技术对谷胱甘肽特异性和灵敏性的检测。为实现以上目的，本发明所采用的机理如下：

[0008] Probe DNA1的 5’ 端修饰有巯基可以自组装在金电极的表面，3’ 端修饰亚甲基蓝信号分子的Probe DNA 2与Probe DNA1部分杂交互补配对，从而形成DNA双链探针。这样，亚甲基蓝信号分子靠近金电极后响应出较强的电化学信号。在汞离子存在的情况下，helper DNA的5’端有6个T（胸腺嘧啶）的短序列作为“立足点”区，可以和Probe DNA1的 3’ 2+
端的6个T序列通过汞离子高特异性识别T -T，然后形成T-Hg -T结构。此时，helper DNA将原与Probe DNA1部分杂交互补配对的Probe DNA 2替代，发生链置换反应。同时，亚甲基蓝信号分子远离金电极后响应出较弱的电化学信号。然而，由于谷胱甘肽与Hg2+ 之间的络合力相比T-T与Hg2+ 之间的作用力更强，因此，谷胱甘肽螯合Hg2 +可以抑制发生T- Hg2 +- T复合物介导的链置换反应。在这种情况下，谷胱甘肽可以维护DNA双链探针在金电极的表面。
不同浓度的谷胱甘肽可以通过跟踪亚甲基蓝信号探针响应不同的电化学信号，从而实现定量检测谷胱甘肽的目的。

[0009] 因此，通过电化学信号的灵敏变化就能够检测到很低浓度的谷胱甘肽，参加图1。

[0010] 本发明构建了基于二价汞离子介导的链置换反应对谷胱甘肽进行检测。GSH分子中有3个可解离质子和10个可参与配位的原子，而巯基(-SH)是GSH分子结构中一个重要的官能团，是研究生物分子与金属离子作用较理想的模型。金属元素尤其是重金属元素具有强烈的亲S元素的特性，可以和GSH分子中的巯基结合，从而直接作用细胞内金属离子的螯合剂, 进一步用于GSH与金属离子的电化学行为研究。GSH对金属元素的结合能力与金属离子本身的软硬性有关。因此，相对软性的汞离子具有较强的络合能力，所起作用也较为明显。

[0011] 根据上述机理，本发明采用如下技术方案：

[0012] 一种谷胱甘肽检测用生物传感器，其特征在于该传感器是在金电极的表面修饰有DNA双链探针，该双链探针中的第一探针是5’ 端修饰有巯基的Probe DNA1通过金巯键固定在金电极表面，第二探针是3’ 端修饰亚甲基蓝信号分子的Probe DNA 2，所述的第二探针与第一探针部分杂交互补配对，从而形成DNA双链探针；所述的第一探针的碱基序列为：5’-SH-CCCCCTCTATACCGTACCTTTTTT-3’；所述的第二探针的的碱基序列为：5’-GGTACGGTATAGAG- MB-3’。

[0013] 一种制备上述的谷胱甘肽检测用生物传感器的方法，其特征在于该方法的的具体步骤为：将预处理过的金电极浸没在修饰电极的反应液中，常温修饰反应16h～24h；每100ml所述的修饰电极的反应液由5 μL、10 μM的Probe DNA 1，5 μL、10 μM的Probe DNA 2和5 μL、100 mM 的TCEP，用85 μL的固定缓冲液混成均匀的溶液稀释到终体积为100 μL的体系构成，再经95 ℃的恒温加热5 min，自然冷却至室温；所述的固定缓冲液为：10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、0.1 M NaCl，其pH= 7.4。

[0014] 上述的金电极的预处理方法为：将金电极用砂纸和含有颗粒大小为1.0μm、0.3μm和05μm的铝粉的麂皮上打磨和抛光之后，将电极分别在无水乙醇和超纯水中超声3min，然后用50 μL的水虎鱼，即浓硫酸︰过氧化氢=3︰1的体积比的混合液，净化金电极，除去残留的杂质；再经过0.5 M的H2SO4活化。

[0015] 一种谷胱甘肽的检测方法，采用三电极检测系统，其中饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝作为辅助电极，工作电极金电极采用上述的谷胱甘肽检测用生物传感器，其特征在于该方法的具体步骤为：

[0016] a.配制反应体系，每100ml反应体系中含有10 μL 100 μM的 Hg2+ 和5 μL、10 μM的[0017] helper DNA；将谷胱甘肽加入到该反应体系中，使反应体系中谷胱甘肽的浓度为：0.5 nM～50 μM，37  ℃恒温下，温育30min；所述的helper  DNA的序列为：5’-TTTTTTGGTACGGTATAGAG-3’；

[0018] b.将金电极浸没在步骤a所得的反应体系中1～1.5h以在电极表面发生链置换反应；

[0019] 在厌氧环境下，再通过三电极检测体系，运用差分脉冲伏安法的电化学方法表征亚甲基蓝分子的电化学信号，从而检测谷胱甘肽的浓度。。

[0020] 本发明构建了一种检测谷胱甘肽的生物传感器，基于汞离子介导的链置换反应实现了对谷胱甘肽的灵敏检测。该方法还可以为谷胱甘肽的临床监测提供技术支持，具有广泛的应用前景。

附图说明

[0021] 图1为本发明的方法原理图。

[0022] 图2为在三种情况下的电化学信号的方波伏安图。

[0023] 图3为不同浓度的谷胱甘肽存在情况下得到的电化学信号变化图，内嵌图为谷胱甘肽浓度在0.5 nM到5μM范围内与电化学信号变化值之间的线性关系图。

[0024] 图4为不同种类的氨基酸和蛋白质存在条件下获得的电化学信号响应柱状图。

[0025] 图5为 海拉细胞提取物和血清中谷胱甘肽的检测。

[0026] 图6为 血清检测统计表。

具体实施方式

[0027] 实施例一：汞离子介导的链置换反应

[0028] 首先，金电极用1 μm, 0.3 μm and 0.05 μm 的铝粉抛光。然后，金电极在乙醇和双蒸水中各超声5分钟。在用水虎鱼（H2SO4︰H2O2=3︰1）净化5分钟，双蒸水冲去后用0.5 M H2SO4的电化学净化以去除任何剩余的杂质。在氮气吹干后，金电极备用DNA 的固定。DNA杂交体系中有500 nM 的探针DNA1和探针DNA2，在使用前首先在95oC下加热5分钟冷却至室温自然杂交。然后，DNA 混合液倒扣在处理好的金电极上在室温下放置16小时后用1 mM的MCH处理1小时，以便在电极表面上获得很好的双链DNA探针单层膜。DNA双链探针修饰的金电极在37oC条件下浸没在含有10 μM Hg2+和300 nM helper DNA的反应液中1个小时以发生链置换反应。

[0029] 实施例二：亚甲基蓝信号分子响应电化学信号实现检测谷胱甘肽的研究[0030] 上述溶液中的helper DNA将原与Probe DNA1部分杂交互补配对的Probe DNA 2替代，发生链置换反应。同时，亚甲基蓝信号分子远离金电极后响应出较弱的电化学信号。为了检测谷胱甘肽，在电极浸没之前在上述包含汞离子和辅助DNA的溶液中加上不同浓度的谷胱甘肽。然而，由于谷胱甘肽与Hg2+ 之间的络合力相比T-T与Hg2+ 之间的作用力更强，因此，谷胱甘肽螯合Hg2 +可以抑制发生T- Hg2 +- T复合物介导的链置换反应。在这种情况下，谷胱甘肽可以维护DNA双链探针在金电极的表面，亚甲基蓝信号分子依然靠近金电极后表面响应出较强的电化学信号。因此不同浓度的谷胱甘肽可以通过采用电化学分析仪660c的方波伏安技术测定分析亚甲基蓝信号分子响应不同的电化学信号。一个传统的三电极系统用于电化学测试中，金电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝作为辅助电极。在测试之前所有的电解液都通过高纯氮在溶液中形成气泡至少20分钟使得彻底缺氧，保证所有实验的厌氧环境。

[0031] 为了验证本实验体系首先在发生汞离子介导的链置换反应的情况下才能进行，我们设计了三组实验。如图2 所示，我们已经应用了方波伏安法这种灵敏的电化学技术证明了我们检测的原理。在-0.25V处获得修饰在电极上的双链DNA探针的最高信号峰(curve a)，表明了亚甲基蓝信号分子与电极表面之间有效的电子传递。在加入汞离子之后，获得了电极表面的一个相当低的电化学响应电流，归因于汞离子介导的链置换反应使得修饰有亚甲基蓝信号分子的探针DNA2 远离电极表面的探针DNA1(curve b)。当谷胱甘肽存在时，谷胱甘肽可以螯合汞离子抑制汞离子介导的链置换反应，因此获得一个类似于修饰在电极上的双链DNA探针响应的电化学信号(curve c)。方波伏安法研究证明了我们检测原理的可行性。

[0032] 实施例三：不同浓度谷胱甘肽的检测

[0033] 将不同浓度的谷胱甘肽加到体系中（0.5 nM,1 nM,5 nM,10 nM,50 nM, 100 nM,500 nM,1 μM,5 μM,10 μM,25μM,50 μM），结果如图3所示。谷胱甘肽可以有效地抑制通过T-Hg2+-T复合物形成的立足点介导的链置换反应，因此增多了在电极表面的修饰在探针DNA 2上的亚甲基蓝信号分子的数量来响应电化学信号，峰电流值随着谷胱甘肽浓度的增加而增加。 图3 的内嵌图进一步表明了谷胱甘肽浓度在0.5 nM 到5 μM间与峰电流的线性关系。
线性方程为I (μA)=0.76467+0.19055×lgC (μM), R2=0.998。 在三倍噪声比下得到的检测限为0.14 nM。

[0034] 实施例四：生物传感器特异性研究

[0035] 对照实验表明了我们检测方法的特异性。如图4所示，在谷胱甘肽存在时获得较高的峰电流，当在对照分子无论是其他氨基酸还是蛋白(谷氨酸,苯丙氨酸, 凝血酶或牛血清白蛋白)存在时，仅获得很低的电流值。此外，对照组还有含有活性巯基的半胱氨酸同样也可以用我们的方法区别，它所响应的峰电流也低于谷胱甘肽。 谷胱甘肽和重金属离子间的螯合作用依赖于两个或者更多的结合位点，例如巯基和羰基，这比仅有一个官能团结合位点的氨基酸(例如半胱氨酸)要结合的稳定。因此对照实验证明了我们的方法具有符合要求的特异性。

[0036] 实施例五：血清和细胞实验模拟人体内环境的检测

[0037] 胎牛血清作为一个有干扰因素的实例和海拉细胞作为一个实际样本中研究了我们方法的适用性。如图5 所示，在用稀释血清中的谷胱甘肽或从海拉细胞中提取的谷胱甘肽样品时可以获得较高的峰电流值。乙酰基马来酰亚胺作为有效的谷胱甘肽巯基阻塞剂被引入谷胱甘肽样品中，发现电化学信号明显的减小。在血清样本和细胞提取实验中获得的电化学响应比较清楚地表明本实验设计被归功于为谷胱甘肽的存在。此外，给定浓度的血清样本的回收率证明在96.1%和107%之间，表现出此方法良好的选择性。参见图6。因此，在复杂生物样本中的实验不仅再次确认了我们方法的高选择性，也表明了我们的方法在临床应用中具有巨大潜力。

[0038] 以上实验结果表明，本发明方法实现了谷胱甘肽的灵敏检测，并可有效地区分其他对照氨基酸和蛋白分子。这种简单、便捷、灵敏和高选择性的检测手段，为今后的立足点介导的链置换反应在DNA分析中的应用提供了一个新的思路，也有望在将来应用到临床检测中以满足不同的检测需求。