使用O‑甲基转移酶生物合成生成紫檀芪的方法

摘要

一种制备紫檀芪的生物合成方法，其包括在细胞系统中表达4‑香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)、在细胞系统中表达芪合酶(STS)、在细胞系统中表达白藜芦醇O‑甲基转移酶(ROMT)、向细胞系统供应对香豆酸、使细胞系统在培养基中生长、以及生成紫檀芪。

权利要求

1.一种制备紫檀芪的生物合成方法，其包括：在细胞系统中表达4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)；

在所述细胞系统中表达芪合酶(STS)；

在所述细胞系统中表达白藜芦醇O-甲基转移酶(ROMT)；

向所述细胞系统供应对香豆酸；

使所述细胞系统在培养基中生长；以及

生成紫檀芪。

2.如权利要求1所述的制备紫檀芪的生物合成方法，其中，所述4-香豆酸:辅酶A连接酶从由拟南芥(哥伦比亚生态型-0)克隆的4CL基因表达。

3.如权利要求2所述的制备紫檀芪的生物合成方法，其中，所述4-香豆酸:辅酶A连接酶从与由拟南芥(哥伦比亚生态型-0)克隆的4CL基因具有至少66％的序列同一性的基因表达。

4.如权利要求2所述的制备紫檀芪的生物合成方法，其中，所述4-香豆酸:辅酶A连接酶从与由拟南芥(哥伦比亚生态型-0)克隆的4CL基因具有至少90％的序列相似性的基因表达。

5.如权利要求1所述的制备紫檀芪的生物合成方法，其中，所述芪合酶从由葡萄(酿酒葡萄)克隆的STS基因表达。

6.如权利要求5所述的制备紫檀芪的生物合成方法，其中，所述芪合酶从与由葡萄(酿酒葡萄)克隆的STS基因具有至少66％的序列同一性的基因表达。

7.如权利要求5所述的制备紫檀芪的生物合成方法，其中，所述芪合酶从与由葡萄(酿酒葡萄)克隆的STS基因具有至少90％的序列相似性的基因表达。

8.如权利要求1所述的制备紫檀芪的生物合成方法，其中，所述白藜芦醇O-甲基转移酶从由葡萄(酿酒葡萄)克隆的基因表达。

9.如权利要求8所述的制备紫檀芪的生物合成方法，其中，所述白藜芦醇O-甲基转移酶从与由葡萄(酿酒葡萄)克隆的ROMT基因具有至少66％的序列同一性的基因表达。

10.如权利要求8所述的制备紫檀芪的生物合成方法，其中，所述白藜芦醇O-甲基转移酶从与由葡萄(酿酒葡萄)克隆的ROMT基因具有至少90％的序列相似性的基因表达。

11.如权利要求8所述的制备紫檀芪的生物合成方法，其中，表达的所述白藜芦醇O-甲基转移酶在选自由残基167、残基174、残基258、残基261及其组合组成的列表的残基中的一个或多个残基处被替代的氨基酸或经修饰的氨基酸修饰，并且其中，所修饰的白藜芦醇O-甲基转移酶相对于未修饰的白藜芦醇O-甲基转移酶具有增加的将白藜芦醇转化为紫檀芪的活性。

12.如权利要求1所述的制备紫檀芪的生物合成方法，其中，表达所述4-香豆酸:辅酶A连接酶和表达所述芪合酶包括转染4CL::STS融合基因。

13.如权利要求1所述的制备紫檀芪的生物合成方法，其中，表达所述4-香豆酸:辅酶A连接酶包括转染4CL基因。

14.如权利要求1所述的制备紫檀芪的生物合成方法，其中，表达所述芪合酶包括转染STS基因。

15.如权利要求1所述的制备紫檀芪的生物合成方法，其中，表达所述白藜芦醇O-甲基转移酶包括转染ROMT基因。

16.如权利要求1所述的制备紫檀芪的生物合成方法，其中，所述细胞系统选自至少包括以下的组：细菌、酵母、植物细胞、动物细胞及其组合。

17.如权利要求1所述的制备紫檀芪的生物合成方法，其中，所述细胞系统允许进行异位生物合成反应。

18.如权利要求1所述的制备紫檀芪的生物合成方法，其中，所述细胞系统包括体外翻译系统。

19.一种制备紫檀芪的生物合成方法，其包括：在细胞系统中表达白藜芦醇O-甲基转移酶(ROMT)；

向所述细胞系统供应白藜芦醇；

使所述细胞系统在培养基中生长；以及

生成紫檀芪。

20.一种制备白藜芦醇的生物合成方法，其包括：在细胞系统中表达4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)；

在所述细胞系统中表达芪合酶(STS)；

向所述细胞系统供应对香豆酸；

使所述细胞系统在培养基中生长；以及

生成白藜芦醇。

21.一种制备紫檀芪的生物合成方法，其包括：在第一细胞系统中表达4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)；

在所述第一细胞系统中表达芪合酶(STS)；

向所述第一细胞系统供应对香豆酸；

使所述第一细胞系统在培养基中生长；

生成白藜芦醇；

在第二细胞系统中表达白藜芦醇O-甲基转移酶(ROMT)；

向所述第二细胞系统供应白藜芦醇；

使所述第二细胞系统在培养基中生长；以及生成紫檀芪。

说明书

使用O-甲基转移酶生物合成生成紫檀芪的方法

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本公开是标题为Method of Using O-methyltransferase for Biosynthetic Production of Pterostilbene的PCT专利申请。本申请要求2013年11月1日提交的美国临时专利申请No.61/898899的优先权，该临时专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。

技术领域

[0003] 本公开适用于食品、医药和药理学行业。本公开总体涉及使用O-甲基转移酶(ROMT)生物合成生成紫檀芪(pterostilbene)的方法。

背景技术

[0004] 紫檀芪是一种与白藜芦醇(resveratrol)化学相关的芪类化合物，并存在于蓝莓和葡萄中。其属于一类植物抗毒素，即由植物产生的对抗感染的药剂。基于动物研究，认为紫檀芪具有抗癌、抗高胆固醇血症、抗高甘油三酯血症的性质以及竭力避免和逆转认知衰退的能力。据信所述化合物还具有抗糖尿病的性质，但是目前对于该问题几乎没有研究。

[0005] Schmidlin等已报道白藜芦醇O-甲基转移酶(ROMT)可催化白藜芦醇直接转化为紫檀芪(Schmidli等，2008)(登记号：FM178870)。紫檀芪通过4-香豆酸-CoA连接酶(4-香豆酸-辅酶A连接酶，4CL)、芪合酶(STS)和白藜芦醇O-甲基转移酶(ROMT)的作用而产生(图1)。

[0006] 在本发明中，申请人证明ROMT可连同4CL和STS在细胞系统中表达以将白藜芦醇转化为紫檀芪。

发明内容

[0007] 本公开解决了在诸如酵母或细菌的细胞系统中生成紫檀芪的技术问题。申请人已独特地分离了4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)、芪合酶(STS)和白藜芦醇O-甲基转移酶(ROMT)的基因，并在促进紫檀芪生成的细胞系统中表达。本公开提供了白藜芦醇和紫檀芪的工业生产。

[0008] 本公开是制备紫檀芪的生物合成方法，其包括在细胞系统中表达4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)、在细胞系统中表达芪合酶(STS)、在细胞系统中表达白藜芦醇O-甲基转移酶(ROMT)、向细胞系统供应对香豆酸、使细胞系统在培养基中生长、以及从而生成紫檀芪。

[0009] 另一个实施方式是制备紫檀芪的生物合成方法，其包括在细胞系统中表达白藜芦醇O-甲基转移酶(ROMT)、向细胞系统供应白藜芦醇、使细胞系统在培养基中生长、以及生成紫檀芪。

[0010] 另一个实施方式是制备白藜芦醇的生物合成方法，其包括在细胞系统中表达4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)、在细胞系统中表达芪合酶(STS)、向细胞系统供应对香豆酸、使细胞系统在培养基中生长、以及生成白藜芦醇。

[0011] 另一个实施方式是制备紫檀芪的生物合成方法，其包括在第一细胞系统中表达4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)、在第一细胞系统中表达芪合酶(STS)、向第一细胞系统供应对香豆酸、使第一细胞系统在培养基中生长、生成白藜芦醇、在第二细胞系统中表达白藜芦醇O-甲基转移酶(ROMT)、向第二细胞系统供应所生成的白藜芦醇、使第二细胞系统在培养基中生长、以及生成紫檀芪。

附图说明

[0012] 为了更好地理解本公开，可参考附图，其中：

[0013] 图1示出了紫檀芪的生物合成途径。

[0014] 图2示出了三种标准物(对香豆酸、白藜芦醇和紫檀芪)的HPLC图。

[0015] 图3示出了表达4CL::STS融合基因的大肠杆菌(E.coli)细胞的提取物的HPLC图。

[0016] 图4示出了表达ROMT基因的大肠杆菌细胞的提取物的HPLC图。

[0017] 图5示出了共表达4CL::STS和ROMT基因的大肠杆菌细胞的提取物的HPLC图。

[0018] 图6示出了表达4CL::STS融合基因的酵母细胞的提取物的HPLC图。

[0019] 图7示出了表达ROMT基因的酵母细胞的提取物的HPLC图。

[0020] 图8示出了共表达4CL::STS和ROMT基因的酵母细胞的提取物的HPLC图。

[0021] 图9示出了由条带表示的ROMT的模型。底物由深灰色的棍模型表示。底物结合残基由黑色的棍模型表示。F167A、D174A、W258A、H261A(H261是关键的氨基酸)是做出的改变。它们均是关键的活性氨基酸，其中H261是最重要的。

[0022] 图10示出了表达野生型ROMT和ROMT-突变体的大肠杆菌细胞的提取物的HPLC图。

[0023] 尽管本公开易受各种修改和可替代形式的影响，其特定实施方式通过在附图中以例举的方式显示并将在本文中详细描述。然而，应理解本文提出的附图和详述不意在限制本公开为公开的特定实施方式，但相反意图覆盖落入由随附的权利要求限定的本公开的精神和范围内的所有修改、等效物和替代物。

具体实施方式

[0024] 定义

[0025] 细胞系统

[0026] 细胞系统是提供异位蛋白表达的任何细胞。其包括细菌、酵母、植物细胞和动物细胞。其包括原核细胞和真核细胞两者。其还包括基于细胞组分(诸如核糖体)的蛋白质的体外表达。

[0027] 使细胞系统生长

[0028] 生长包括提供使细胞繁殖和分裂的培养基。其还包括提供资源，使得细胞或细胞组分可翻译和制备重组蛋白。

[0029] 转染

[0030] 转染是一种有意将核酸引入至细胞中的方法。该术语通常用于真核细胞中的非病毒方法。还可涉及其它方法和细胞类型，尽管其它术语是优选的：“转化”通常用于描述细菌、非动物真核细胞，包括植物细胞中的非病毒DNA转移。在动物细胞中，转染是优选的术语，因为转化还用于指代这些细胞中的癌性状态(致癌作用)的进展。转导通常用于描述病毒介导的DNA转移。转化、转导和病毒感染包含在本申请的转染的定义下。

[0031] 经修饰的氨基酸

[0032] 经修饰的氨基酸是一种经化学修饰的氨基酸，并且其可作为多肽序列一部分掺入。氨基酸可以以翻译后方式被修饰，或在翻译期间掺入多肽序列之前被修饰。

[0033] 4CL

[0034] 4-香豆酸:辅酶A连接酶从由拟南芥(Arabidopsis thaliana)(哥伦比亚生态型-0)克隆的4CL基因表达。在另一个实施方式中，4-香豆酸:辅酶A连接酶从与由拟南芥(哥伦比亚生态型-0)克隆的4CL基因具有至少66％的序列同一性的基因表达。在另一个实施方式中，4-香豆酸:辅酶A连接酶从与由拟南芥(哥伦比亚生态型-0)克隆的4CL基因具有至少
90％的序列相似性的基因表达。

[0035] STS

[0036] 芪合酶从由葡萄(酿酒葡萄(Vitis vinifera))克隆的STS基因表达。在另一个实施方式中，芪合酶从与由葡萄(酿酒葡萄)克隆的STS基因具有至少66％的序列同一性的基因表达。在另一个实施方式中，芪合酶从与由葡萄(酿酒葡萄)克隆的STS基因具有至少90％的序列相似性的基因表达。

[0037] ROMT

[0038] 白藜芦醇O-甲基转移酶从由葡萄(酿酒葡萄)克隆的基因表达。在另一个实施方式中，白藜芦醇O-甲基转移酶从与由葡萄(酿酒葡萄)克隆的ROMT基因具有至少66％的序列同一性的基因表达。在另一个实施方式中，白藜芦醇O-甲基转移酶从与由葡萄(酿酒葡萄)克隆的ROMT基因具有至少90％的序列相似性的基因表达。

[0039] 本公开的一个实施方式是制备紫檀芪的生物合成方法，其包括在细胞系统中表达4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)、在细胞系统中表达芪合酶(STS)、在细胞系统中表达白藜芦醇O-甲基转移酶(ROMT)、向细胞系统供应对香豆酸、使细胞系统在培养基中生长、以及生成紫檀芪。

[0040] 在一个实施方式中，表达4-香豆酸:辅酶A连接酶和表达芪合酶包括转染4CL::STS融合基因。在另一个实施方案中，表达4-香豆酸:辅酶A连接酶包括转染4CL基因，并且表达芪合酶包括转染单独的STS基因。表达白藜芦醇O-甲基转移酶包括转染ROMT基因。

[0041] 所述细胞系统选自至少包括以下的组：细菌、酵母及其组合。在另一个实施方式中，所述细胞系统允许进行异位生物合成反应。

[0042] 另一个实施方式是制备紫檀芪的生物合成方法，其包括在细胞系统中表达白藜芦醇O-甲基转移酶(ROMT)、向细胞系统供应白藜芦醇、使细胞系统在培养基中生长、以及生成紫檀芪。

[0043] 另一个实施方式是制备白藜芦醇的生物合成方法，其包括在细胞系统中表达4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)、在细胞系统中表达芪合酶(STS)、向细胞系统供应对香豆酸、使细胞系统在培养基中生长、以及生成白藜芦醇。

[0044] 另一个实施方式是制备紫檀芪的生物合成方法，其包括在第一细胞系统中表达4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)、在第一细胞系统中表达芪合酶(STS)、向第一细胞系统供应对香豆酸、使第一细胞系统在培养基中生长、生成白藜芦醇、在第二细胞系统中表达白藜芦醇O-甲基转移酶(ROMT)、向第二细胞系统供应白藜芦醇、使第二细胞系统在培养基中生长、以及生成紫檀芪。

[0045] 材料和方法

[0046] 菌株、质粒和培养条件

[0047] HI-Control 10G和DH5α用于质粒克隆，并且BL21(DE3)(Invitrogen)用于大肠杆菌中的重组蛋白表达。Wat11菌株用于酵母中的蛋白表达。对香豆酸、白藜芦醇和紫檀芪标准物均从Sigma购得。pETite N-His SUMO Kan载体从Lucigen(Middleton，WI)购得。质粒pETDuet-1从Novagen购得，用作重组蛋白表达的目的。

[0048] DNA操作

[0049] 所有DNA操作根据标准程序进行。限制性酶和T4 DNA连接酶从New England Biolabs购得。所有PCR扩增和克隆反应使用 高保真DNA聚合酶(New England Biolabs)来进行。

[0050] RNA提取和cDNA合成

[0051] ROMT(白藜芦醇O-甲基转移酶)、4CL(4-香豆酸:辅酶A连接酶)和STS(芪合酶)从各种植物物种克隆。使用Trizol Plus RNA纯化试剂盒(Invitrogen公司)，植物总RNA从葡萄(酿酒葡萄)提取以用于克隆ROMT和STS，和从拟南芥(哥伦比亚生态型-0)提取以用于克隆4CL。cDNA的合成使用Promega公司的Im Prom-IITM逆转录系统按照制造商手册来进行。所述基因从合成的cDNA用具有表1中列出的引物的来自New England Biolabs的Phusion PCR试剂盒来扩增。

[0052] 实施例1

[0053] 细菌表达载体的构建

[0054] 根据制造商手册将ROMT的PCR产物克隆到pETite N-His SUMO Kan载体(Lucigen公司)中。所得到的具有右插入序列的质粒通过测序得以确认，即Sumo-ROMT，并且被转化到BL21(DE3)中以用于异源基因表达。

[0055] 为了构建4CL::STS融合基因，At4CL和VvSTS使用PCR扩增策略融合。移除4CL的终止密码子，并将三个氨基酸连接子(Gly-Ser-Gly)引入至4CL的开放阅读框与STS之间。这种构建产生编码4CL、三肽连接子和STS的2.87kb融合基因构建体。将使用pCR8/GW/TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆至Gateway入门载体中的融合基因4CL::STS转化至一次使用的大肠杆菌细胞中，然后测序。扩增4CL::STS融合基因，并经由BamHI/HindIII将其克隆到pETDuet-1载体的多克隆位点中，被称为pETDuet-4CLSTS。用于所有克隆反应的引物可在表1中获得。

[0056] 实施例2

[0057] 酵母表达载体的构建

[0058] 将4CL::STS基因引入至酿酒酵母(S.cerevisiae)Advanced Gateway目的载体pAG304GPD-ccdB(Addgene，Boston，MA)中，并且由LR克隆酶II酶混合物试剂盒(Invitrogen)将ROMT基因交换到另一种Gateway目的载体pAG305GPD-ccdB(Addgene)中。所得的质粒被称为pAG304GPD-4CLSTS和pAG304GPD-ROMT。所述载体含有整合重组侧和在组成型启动子(GPD)的控制下的表达盒。将这些载体转化到WAT11中以用于发酵测定。

[0059] 酵母转化

[0060] 将构建体pAG304GPD-4CLSTS和pAG304GPD-ROMT连同作为对照的pAG304GPD-ccdB与pAG305GPD-ccdB载体用Frozen-EZ酵母转化II试剂盒(Zymo Research，Orange，CA)转化到WAT11细胞中。将载体pAG304GPD-4CLSTS和pAG304GPD-ROMT共转化至酵母WAT11细胞中。

[0061] 用于预测ROMT的底物结合残基的同源建模和对接

[0062] 就申请人所知，没有可用于分析底物结合位点的ROMT的三级结构。为了分析底物结合位点，申请人用计算机程序I-TASSER构建了ROMT模型(图9)(Ambrish等，2010)。申请人申请了一种用于增强的ROMT的实验室进化和开发的分子生物学和结构生物学的组合方法。底物结合位点通过用使用计算机程序SWISDOCK构建的ROMT模型对接白藜芦醇来预测(Grosdidier等，2011)。

[0063] 在大肠杆菌和酿酒酵母中用4CL::STS融合蛋白的蛋白质将对香豆酸生物转化为白藜芦醇

[0064] 使大肠杆菌菌株的单个菌落在具有100μg/mL氨苄西林的3mL LB培养基中在37℃下生长过夜，然后将种子培养物转移至具有100μg/mL氨苄西林的50mL改良M9培养基中。使含有pETDuet-4CLSTS载体的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃下在改良M9培养基中保持以200rpm振荡直至OD600达到0.6，然后添加1mM IPTG，在用IPTG诱导2小时后，将溶解于100％乙醇中的对香豆酸添加至培养物至0.5g/L。将培养物在相同的培养条件下保持振荡，并间隔取出样品用于HPLC分析。

[0065] 使含有pAG304GPD-4CLSTS质粒的Wat11细胞在30℃下在SD缺陷型培养基中生长，直至OD600达到0.2，然后添加对香豆酸(0.5g/L)。将培养物在相同的培养条件下保持振荡4天，并间隔取出样品用于HPLC分析。

[0066] 在大肠杆菌和酿酒酵母中用ROMT的蛋白质将白藜芦醇生物转化为紫檀芪[0067] 使含有SUMO-RMOT载体的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃下在改良M9培养基中生长，直至OD600达到0.6，然后添加1mM IPTG，在用IPTG诱导2小时后，将溶解于DMSO中的白藜芦醇添加至培养物至0.228g/L。M9培养基通过添加酵母提取物(1.25g/L)和甘油(0.5％v/v)至标准M9培养基中而改良。将培养物在相同的培养条件下保持振荡，并间隔取出样品用于HPLC分析。

[0068] 使含有pAG305GPD-RMOT质粒的Wat11细胞在标准酵母缺陷型培养基中在30℃下生长，直至OD600达到0.2，然后添加白藜芦醇酸(0.228g/L)。将培养物在相同的培养条件下保持振荡，并间隔取出样品用于HPLC分析。

[0069] 在大肠杆菌和酿酒酵母中用ROMT和4CL::STS融合蛋白的蛋白质将对香豆酸生物转化为紫檀芪

[0070] 使含有pETDuet-4CLSTS和SUMO-ROMT载体的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃下在改良M9培养基中生长，直至OD600达到0.6，然后添加1mM IPTG，在用IPTG诱导2小时后，将溶解于100％乙醇中的对香豆酸添加至培养物至0.5g/L。将培养物在相同的培养条件下保持振荡，并间隔取出样品用于HPLC分析。

[0071] 使含有pAG304GPD-4CLSTS和pAG305GPD-ROMT质粒的Wat11细胞在30℃下在SD缺陷型培养基中生长，直至OD600达到0.2，然后添加对香豆酸(0.5g/L)。将培养物在相同的培养条件下保持振荡，并间隔取出样品用于HPLC分析。

[0072] 产物的提取

[0073] 将培养物的等分试样(400μl)用800ul乙酸乙酯提取。将提取物用Eppendorf Vacufuge(Eppendorf Scientific Westbury，NY)在室温下蒸发至干，并再溶解于200μl的80％(v/v)甲醇中。

[0074] HPLC分析

[0075] 白藜芦醇和紫檀芪的HPLC分析用Dionex Ultimate 3000系统进行。中间物通过反向色谱法在phenomenex Kinetex C18柱(粒径2.6μm；150x 4.6mm)上利用0.1％(vol/vol)甲酸(溶液A)和100％乙腈(溶液B)进行分离。将样品稀释至80％甲醇中，并使用以下的梯度程序：10％的溶液B，2分钟；10％至70％的溶液B的线性梯度，18分钟；70％至30％的溶液B，1分钟；30％至10％的溶液B，2分钟；10％的溶液B，5分钟，在0.8ml/min的流速下。为了定量，所有中间物用外标校准。化合物通过其保留时间及对应的光谱来鉴定，其用系统中的二极管阵列检测器来鉴定。

[0076] 结果

[0077] 用4CL和STS的融合蛋白将对香豆酸生物转化为白藜芦醇

[0078] 使三种标准物进行HPLC，HPLC显示它们良好分离(图2)。使用PCR扩增策略，4CL和STS用4CL与STS之间的Gly-Ser-Gly连接子融合。申请人测试了在烧瓶内的改良M9培养基中用含有pETDuet-4CLSTS质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株将对香豆酸转化为白藜芦醇。如图3所示，可在改良M9培养基中将对香豆酸转化为白藜芦醇。

[0079] 为了体内酵母测定，使含有pAG304GPD-4CLSTS的新鲜酵母菌落在30℃下在含有0.5g/L对香豆酸的3ml酵母缺陷型培养基中生长4天。通过HPLC分析提取物。如图6所示，几乎所有的对香豆酸在4天内被转化为白藜芦醇。与大肠杆菌相比，酵母中的转化效率好得多。

[0080] 用ROMT的蛋白质将白藜芦醇生物转化为紫檀芪

[0081] 如图4所示，将供应至具有ROMT表达的大肠杆菌培养物中的白藜芦醇在烧瓶中转化为紫檀芪。HPLC分析表明白藜芦醇可在烧瓶中被转化为紫檀芪。然而，存在另一个未知峰，其很可能是添加到白藜芦醇上的甲基基团的峰。类似的结果还从酵母中获得(图7)。

[0082] 用4CL::STS和ROMT的共表达将对香豆酸生物转化为紫檀芪

[0083] 将对香豆酸供应到具有4CL::STS和ROMT共表达的大肠杆菌和酿酒酵母的培养物中，如图5和图8所示，通过在大肠杆菌和酿酒酵母中24小时，借由HPLC，对香豆酸在烧瓶中被转化为白藜芦醇和紫檀芪。在该条件下在96小时内获得HPLC图。

[0084] ROMT的常规诱变和饱和诱变

[0085] 在仔细分析底物结合位点后，选择氨基酸残基167、174、258和261用于饱和诱变以提高ROMT的活性。申请人已经进行了常规诱变以构建ROMT的F167A、D174A、W258A和H261A突变体以了解它们对酶活性的影响。除了D174A之外，它们中没有一个具有活性，D174A显示出极低的活性(图10)。这一结果表明167、174、258和261位处的氨基酸残基对于底物结合和催化活性很重要。因此，下一步申请人将进行定点饱和诱变以改善ROMT的酶促活性。饱和诱变使得能够将一个氨基酸改变为其它替代的19种氨基酸残基。申请人将根据改良的QuickChange定点诱变策略(Stratagene，CA)使用NNK简并引物(N代表A、T、G、C的混合物，且K代表G/T)，在ROMT的167、174、258和261位进行饱和诱变。密码子NNK具有32倍简并性并且在没有罕见密码子的情况下编码所有20种氨基酸。PCR混合物(25μl)由含有60ng Sumo-ROMT DNA模板的Phusion HF缓冲液、200μΜ dNTP、0.5μΜ正向引物、0.5μΜ反向引物、5％DMSO和0.3μl聚合酶组成。PCR通过以下步骤进行：在98℃下变性20秒，在58℃下退火30秒，然后在72℃下延伸2分30秒，进行25个循环。QuikChange PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳来检测，然后15μl的PCR产物用1μl DpnI(New England Biolabs)在37℃下消化4小时以去除模板质粒。将(2μl)消化产物的等分试样添加至50μl BL21(DE3)感受态细胞(Stratagene，CA)，在冰上保持30分钟。之后，在42℃下进行20秒热激，在冰上保持2分钟，然后添加500μl SOC培养基，并使细胞在37℃下生长1小时。以5000rpm离心细胞几分钟，弃掉450μl上清液，并将细胞用剩下的SOC培养基悬浮且接种在含有卡那霉素(50μg/ml)的Luria-Bertani(LB)琼脂板上。我们将分离质粒和DNA测序以确认突变体。我们将通过DNA测序确认文库的质量。

[0086] 表1.本研究中所用的引物

[0087]

[0088] 同一性和相似性

[0089] 同一性是在比对序列(其可仅使用序列信息或结构信息或一些其它信息进行，但通常其仅基于序列信息)后在一对序列之间相同的氨基酸的分数，而相似性是基于使用一些相似性矩阵的比对指定的评分。相似性指数可为以下BLOSUM62、PAM250或GONNET中的任一者，或者本领域技术人员进行蛋白质序列比对所用的任何矩阵。

[0090] 同一性是两条子序列之间一致性的程度(序列之间没有空位)。25％或更高的同一性意指功能的相似性，而18％至25％意指结构或功能的相似性。记住两条完全不相关或随机序列(其为多于100个残基)可具有高于20％的同一性。相似性是当比较两条序列时，这两条序列之间相似的程度。这取决于它们的同一性。

[0091] 如从前文描述显而易见，本公开的某些方面不限于本文说明的实施例的特定细节，并且因而考虑到本领域技术人员将进行其它改变和应用或其等效形式。因此权利要求应意欲覆盖所有不偏离本公开的精神和范围的此类改变和应用。

[0092] 此外，除非另外限定，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管在实践或测试本公开中可使用与本文描述的那些方法和材料相似或相等的任何方法和材料，但是上文描述了优选的方法和材料。

[0093] 本公开的其它方面、目标和优势可通过研究附图、公开内容和随附的权利要求获得。

[0094] 参考文献

[0095] Schmidlin L,Poutaraud A,Claudel P,Mestre P,Prado E,Santos-Rosa M,Wiedemann-Merdinoglu S,Karst F,Merdinoglu D,Hugueney P(2008)A stress-inducible resveratrol O-methyltransferase involved in the biosynthesis of pterostilbene in grapevine.Plant Physiol.l48(3):1630-1639.

[0096] Ambrish R,Alper K,Yang Z(2010)I-TASSER:a unified platform for automated protein structure and function prediction.Nature Protocols,5:725-738.

[0097] Grosdidier A,Zoete V,Michielin O.(2011)SwissDock,a protein-small molecule docking web service based on EADock DSS._Nucleic Acids Res.39:W270-277.