用于诊断和治疗炎症性肠病的方法转让专利
申请号 : CN201580016240.3
文献号 : CN106102767A
文献日 : 2016-11-09
发明人 : J·A·哈克尼 , M·凯伊尔 , G·W·特乌
申请人 : 豪夫迈·罗氏有限公司
摘要 :
本发明提供预测对整联蛋白β7拮抗剂(包括抗β7整联蛋白亚基抗体)的反应性的生物标志及使用这类生物标志的方法。此外，提供治疗胃肠炎性障碍(如炎症性肠病，包括溃疡性结肠炎和克隆病)的方法。本发明还提供将这类预测生物标志用于治疗炎症性肠病(包括溃疡性结肠炎和克隆病)的方法。
权利要求 :
1.预测患有胃肠炎性障碍的患者对包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗的反应的方法，该方法包括：从患者获得生物样品；
测量样品中选自GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个高表达预测基因(“HEPG”)的mRNA表达水平；
将在样品中检测到的mRNA表达水平与所测量的各HEPG的参考水平相比较；和在将所测量的各HEPG的mRNA表达水平测量为与所测量的各HEPG各自的参考水平相比提高时，预测患者将响应治疗。
2.预测胃肠炎性障碍患者对整联蛋白β7拮抗剂治疗的反应性的方法，方法包括测量来自患者的生物样品中选自GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4L1.2、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG的mRNA表达水平，其中与所测量的各HEPG的参考水平相比，所测量的各HEPG的提高的mRNA表达水平将患者鉴定为可能响应整联蛋白β7拮抗剂治疗的患者。
3.将患有胃肠炎性障碍的患者鉴定为可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗的方法，方法包括：(a)测量来自患者的生物样品中选自GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG的mRNA表达水平；
(b)将(a)中测量的各HEPG的mRNA表达水平与所测量的各HEPG的参考水平相比较；和(c)在(a)中测量的各HEPG的mRNA表达水平高于所测量的各HEPG各自的参考水平时，将患者鉴定为更有可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗。
4.治疗患有胃肠炎性障碍的患者的方法，方法包括：
(a)测量来自患者的生物样品中选自GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG的mRNA表达水平；
(b)将(a)中测量的各HEPG的mRNA表达水平与所测量的各HEPG的参考水平相比较；
(c)在(a)中测量的各HEPG的mRNA表达水平高于所测量的各HEPG各自的参考水平时，将患者鉴定为更有可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗；和
(d)在(a)中测量的各HEPG的mRNA表达水平高于所测量的各HEPG各自的参考水平时，施用治疗，从而治疗胃肠炎性障碍。
5.预测患有胃肠炎性障碍的患者对包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗的反应的方法，方法包括：从患者获得生物样品；
测量样品中选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3的至少一个、至少两个或至少三个低表达预测基因(“LEPG”)的mRNA表达水平；
将在样品中测量的各LEPG的mRNA表达水平与所测量的各LEPG的参考水平相比较；和在将所测量的各LEPG的mRNA表达水平测量为与所测量的各LEPG各自的参考水平相比降低时，预测患者将响应治疗。
6.预测胃肠炎性障碍患者对整联蛋白β7拮抗剂治疗的反应性的方法，方法包括测量来自患者的生物样品中选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3的至少一个、至少两个或至少三个LEPG的mRNA表达水平，其中与所测量的各LEPG的参考水平相比，所测量的各LEPG的降低的mRNA表达水平将患者鉴定为可能响应整联蛋白β7拮抗剂治疗的患者。
7.将患有胃肠炎性障碍的患者鉴定为可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗的方法，方法包括：(a)测量来自患者的生物样品中选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3的至少一个、至少两个或至少三个LEPG的mRNA表达水平；
(b)将(a)中测量的各LEPG的mRNA表达水平与所测量的各LEPG的参考水平相比较；和(c)在(a)中测量的各LEPG的mRNA表达水平低于所测量的各LEPG各自的参考水平时，将患者鉴定为更有可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗。
8.治疗患有胃肠炎性障碍的患者的方法，方法包括：
(a)测量来自患者的生物样品中选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3的至少一个、至少两个或至少三个LEPG的mRNA表达水平；
(b)将(a)中测量的各LEPG的mRNA表达水平与所测量的各LEPG的参考水平相比较；
(c)在(a)中测量的各LEPG的mRNA表达水平低于所测量的各LEPG各自的参考水平时，将患者鉴定为更有可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗；和
(d)在(a)中测量的各LEPG的mRNA表达水平低于所测量的各LEPG各自的参考水平时，施用治疗，从而治疗胃肠炎性障碍。
9.预测患有胃肠炎性障碍的患者对包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗的反应的方法，方法包括：(a)从患者获得生物样品；
(b)测量样品中选自GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG的mRNA表达水平，并将在样品中检测到的mRNA表达水平与所测量的各HEPG的参考水平(“HEPG参考水平”)相比较；且进一步包括：(c)测量样品中选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3的至少一个、至少两个或至少三个LEPG的mRNA表达水平，并将在样品中检测到的mRNA表达水平与所测量的各LEPG的参考水平(“LEPG参考水平”)相比较；和(d)在将(b)中测量的各HEPG的mRNA表达水平测量为与HEPG参考水平相比提高时，及在将(c)中测量的各LEPG的mRNA表达水平测量为与LEPG参考水平相比降低时，预测患者将响应治疗。
10.预测胃肠炎性障碍患者对整联蛋白β7拮抗剂治疗的反应性的方法，方法包括：(a)测量来自患者的生物样品中选自GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG的mRNA表达水平；
且进一步包括：
(b)测量来自患者的生物样品中选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3的至少一个、至少两个或至少三个LEPG的mRNA表达水平；
其中与所测量的各HEPG的参考水平相比，(a)中测量的各HEPG的提高的mRNA表达水平，及其中与所测量的各LEPG的参考水平相比，(b)中测量的各LEPG的降低的mRNA表达水平，将患者鉴定为可能响应整联蛋白β7拮抗剂治疗的患者。
11.将患有胃肠炎性障碍的患者鉴定为可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗的方法，方法包括：
(a)测量来自患者的生物样品中选自GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG的mRNA表达水平；
(b)将(a)中测量的各HEPG的mRNA表达水平与所测量的各HEPG的参考水平(“HEPG参考水平”)相比较；且进一步包括：
(c)测量来自患者的生物样品中选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3的至少一个、至少两个或至少三个LEPG的mRNA表达水平；
(d)将(c)中测量的各LEPG的mRNA表达水平与所测量的各LEPG的参考水平(“LEPG参考水平”)相比较；和
(e)在(a)中测量的各HEPG的mRNA表达水平高于HEPG参考水平和(c)中测量的各LEPG的mRNA表达水平低于LEPG参考水平时，将患者鉴定为更有可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗。
12.治疗患有胃肠炎性障碍的患者的方法，方法包括：
(a)测量来自患者的生物样品中选自GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG的mRNA表达水平；
(b)将(a)中测量的各HEPG的mRNA表达水平与所测量的各HEPG的参考水平(“HEPG参考水平”)相比较；且进一步包括：
(c)测量来自患者的生物样品中选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3的至少一个、至少两个或至少三个LEPG的mRNA表达水平；
(d)将(c)中测量的各LEPG的mRNA表达水平与所测量的各LEPG的参考水平(“LEPG参考水平”)相比较；和
(e)在(a)中测量的各HEPG的mRNA表达水平高于HEPG参考水平和(c)中测量的各LEPG的mRNA表达水平低于LEPG参考水平时，将患者鉴定为更有可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗；和(f)在(a)中测量的各HEPG的mRNA表达水平高于HEPG参考水平和(c)中测量的各LEPG的mRNA表达水平低于LEPG参考水平时，施用治疗，从而治疗胃肠炎性障碍。
13.权利要求9-12中任一项的方法，其进一步包括测量附加的HEPG的mRNA表达水平，其中附加的HEPG是ITGAE。
14.权利要求1-4中任一项的方法，其中至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG选自GZMA、KLRB1、FOXM1、SLC8A3和ECH1。
15.权利要求1-4或14中任一项的方法，其进一步包括测量附加的HEPG的mRNA表达水平，其中附加的HEPG是ITGAE。
16.权利要求5-8中任一项的方法，其中至少一个、至少两个或至少三个LEPG选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2和CCL2。
17.权利要求16的方法，其中至少一个、至少两个或至少三个LEPG选自SLC8A3、VNN2和TNFSF15。
18.权利要求9-12中任一项的方法，其中至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG选自GZMA、KLRB1、FOXM1、SLC8A3和ECH1，且其中至少一个、至少两个或至少三个LEPG选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、VNN2和CCL2。
19.权利要求18的方法，其进一步包括测量附加的HEPG的mRNA表达水平，其中附加的HEPG是ITGAE。
20.权利要求19的方法，其中至少一个、至少两个或至少三个LEPG选自SLC8A3、VNN2和TNFSF15。
21.权利要求4、8或12中任一项的方法，其中每四周一次皮下施用105mg整联蛋白β7拮抗剂。
22.权利要求4、8或12中任一项的方法，其中皮下施用210mg整联蛋白β7拮抗剂的起始剂量，然后在起始剂量后2周皮下施用210mg整联蛋白β7拮抗剂的第一后续剂量，在起始剂量后4周皮下施用210mg整联蛋白β7拮抗剂的第二后续剂量，在起始剂量后8周皮下施用
210mg整联蛋白β7拮抗剂的第三后续剂量，并在起始剂量后12周皮下施用210mg整联蛋白β7拮抗剂的第四后续剂量。
23.权利要求1-22中任一项的方法，其中胃肠炎性障碍是炎症性肠病。
24.权利要求23的方法，其中炎症性肠病是溃疡性结肠炎或克隆病。
25.权利要求24的方法，其中炎症性肠病是溃疡性结肠炎，且反应选自临床反应、黏膜愈合和缓解。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其中生物样品选自肠组织和外周全血。
27.权利要求26的方法，其中通过RNA测序法、微阵列或PCR法来测量mRNA表达水平。
28.权利要求27的方法，其中PCR法包括qPCR。
29.权利要求28的方法，其中测量包括扩增GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2、SLC8A3mRNA中的一个或多个，可选地进一步包括扩增ITGAE mRNA，并检测所扩增的mRNA，从而测量所扩增的mRNA的水平。
30.权利要求28的方法，其中测量包括扩增SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2、VNN3mRNA中的一个或多个，并检测所扩增的mRNA，从而测量所扩增的mRNA的水平。
31.权利要求1-8中任一项的方法，其中各参考水平是中值。
32.权利要求9-12中任一项的方法，其中HEPG参考水平是中值，且LEPG参考水平是中值。
33.前述权利要求中任一项的方法，其中患者之前未用抗TNF治疗剂治疗过。
34.权利要求25的方法，其中整联蛋白β7拮抗剂的施用导致以下的一项或多项：(1)MCS减少3分和从基线降低30％，且直肠出血小分减少≥1分或绝对直肠出血得分为0或1；(2)内窥镜检查小分为0或1；(3)MCS≤2，没有单个小分>1。
35.用于测定获自患有胃肠炎性障碍的患者的生物样品中选自GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4L1.2、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个标志的mRNA水平的试剂盒的用途，用于将患者分层为整联蛋白β7拮抗剂治疗的可能的响应者和非响应者。
36.权利要求35的用途，其中试剂盒用于测定选自GZMA、KLRB1、FOXM1、SLC8A3和ECH1的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个标志的mRNA水平。
37.权利要求35或权利要求36的用途，其中试剂盒用于进一步测定ITGAE的mRNA水平。
38.用于测定获自患有胃肠炎性障碍的患者的生物样品中选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3的至少一个、至少两个或至少三个标志的mRNA水平的试剂盒的用途，用于将患者分层为整联蛋白β
7拮抗剂治疗的可能的响应者和非响应者。
39.权利要求38的用途，其中试剂盒用于测定选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2和CCL2的至少一个、至少两个或至少三个标志的mRNA水平。
40.权利要求38或权利要求39的用途，其中试剂盒用于进一步测定ITGAE的mRNA水平。
41.用于分层患有胃肠炎性障碍的患者的试剂盒，其中试剂盒包含：
(a)用于测量获自患者的生物样品中选自GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4L1.2、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个标志的mRNA水平的试剂；和(b)关于以下的说明：(i)测量至少一个、至少两个、至少三个或至少四个标志的mRNA水平；(ii)将至少一个、至少两个、至少三个或至少四个标志的水平与参考水平相比较；和(iii)根据比较来将患者分层为整联蛋白β7拮抗剂响应者或整联蛋白β7拮抗剂非响应者的类别。
42.权利要求41的试剂盒，其中试剂盒包含用于测量获自患者的样品中选自GZMA、KLRB1、FOXM1、SLC8A3和ECH1的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个标志的mRNA水平的试剂。
43.权利要求41或权利要求42的试剂盒，其中试剂盒进一步包含用于测量获自患者的样品中ITGAE的mRNA水平的试剂。
44.用于分层患有胃肠炎性障碍的患者的试剂盒，其中试剂盒包含：
(a)用于测量获自患者的生物样品中选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/
3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3的至少一个、至少两个或至少三个标志的mRNA水平的试剂；和(b)关于以下的说明：(i)测量至少一个、至少两个或至少三个标志的mRNA水平；(ii)将至少一个、至少两个或至少三个标志的水平与参考水平相比较；和(iii)根据比较来将患者分层为整联蛋白β7拮抗剂响应者或整联蛋白β7拮抗剂非响应者的类别。
45.权利要求44的试剂盒，其中试剂盒包含用于测量获自患者的样品中选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2和CCL2的至少一个、至少两个或至少三个标志的mRNA水平的试剂。
46.权利要求44或权利要求45的试剂盒，其中试剂盒进一步包含用于测量获自患者的样品中ITGAE的mRNA水平的试剂。
47.权利要求1-34中任一项的方法，或权利要求35-40中任一项的用途，或权利要求41-
46中任一项的试剂盒，其中整联蛋白β7拮抗剂是单克隆抗β7抗体。
48.权利要求47的方法，其中抗β7抗体选自嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。
49.权利要求48的方法，其中抗β7抗体是抗体片段。
50.权利要求48的方法，其中抗β7抗体包含六个高变区(HVR)，其中：(i)HVR-L1包含氨基酸序列A1-A11，其中A1-A11是RASESVDTYLH(SEQ ID NO:1)；
RASESVDSLLH(SEQ ID NO:7)；RASESVDTLLH(SEQ ID NO:8)；或RASESVDDLLH(SEQ ID NO:9)；
或SEQ ID NO:1、7、8或9的变体(SEQ ID NO:26)，其中氨基酸A2选自A、G、S、T和V，和/或氨基酸A3选自S、G、I、K、N、P、Q、R和T，和/或A4选自E、V、Q、A、D、G、H、I、K、L、N和R，和/或氨基酸A5选自S、Y、A、D、G、H、I、K、N、P、R、T和V，和/或氨基酸A6选自V、R、I、A、G、K、L、M和Q，和/或氨基酸A7选自D、V、S、A、E、G、H、I、K、L、N、P、S和T，和/或氨基酸A8选自D、G、N、E、T、P和S，和/或氨基酸A9选自L、Y、I和M，和/或氨基酸A10选自L、A、I、M和V，和/或氨基酸A11选自H、Y、F和S；
(ii)HVR-L2包含氨基酸序列B1-B8，其中B1-B8是KYASQSIS(SEQ ID NO:2)；RYASQSIS(SEQ ID NO:20)；或XaaYASQSIS(SEQ ID NO:21，其中Xaa代表任意氨基酸)；或SEQ ID NO:
2、20或21的变体(SEQ ID NO:27)，其中氨基酸B1选自K、R、N、V、A、F、Q、H、P、I、L、Y和Xaa(其中Xaa代表任意氨基酸)，和/或氨基酸B4选自S和D，和/或氨基酸B5选自Q和S，和/或氨基酸B6选自S、D、L和R，和/或氨基酸B7选自I、V、E和K；
(iii)HVR-L3包含氨基酸序列C1-C9，其中C1-C9是QQGNSLPNT(SEQ ID NO:3)；或SEQ ID NO:3的变体(SEQ ID NO:28)，其中氨基酸C8选自N、V、W、Y、R、S、T、A、F、H、I L和M；
(iv)HVR-H1包含氨基酸序列D1-D10，其中D1-D10是GFFITNNYWG(SEQ ID NO:4)；
(v)HVR-H2包含氨基酸序列E1-E17，其中E1-E17是GYISYSGSTSYNPSLKS(SEQ ID NO:5)；
或SEQ ID NO:5的变体(SEQ ID NO:29)，其中氨基酸E2选自Y、F、V和D，和/或氨基酸E6选自S和G，和/或氨基酸E10选自S和Y，和/或氨基酸E12选自N、T、A和D，和/或氨基酸13选自P、H、D和A，和/或氨基酸E15选自L和V，和/或氨基酸E17选自S和G；和(vi)HVR-H3包含氨基酸序列F2-F11，其中F2-F11是MTGSSGYFDF(SEQ ID NO:6)或RTGSSGYFDF(SEQ ID NO:19)；或包含氨基酸序列F1-F11，其中F1-F11是AMTGSSGYFDF(SEQ ID NO:16)；ARTGSSGYFDF(SEQ ID NO:17)；或AQTGSSGYFDF(SEQ ID NO:18)；或SEQ ID NO:
6、16、17、18、or 19的变体(SEQ ID NO:30)，其中氨基酸F2是R、M、A、E、G、Q、S，和/或氨基酸F11选自F和Y。
51.权利要求50的方法，其中抗-β7抗体包含三个重链高变区(HVR-H1-H3)序列和三个轻链高变区(HVR-L1-L3)序列，其中：
(i)HVR-L1包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9；
(ii)HVR-L2包含SEQ ID NO:2；
(iii)HVR-L3包含SEQ ID NO:3；
(iv)HVR-H1包含SEQ ID NO:4；
(v)HVR-H2包含SEQ ID NO:5；和
(vi)HVR-H3包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19。
52.权利要求51的方法，其中抗β7抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:31的可变轻链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:32的可变重链。
53.权利要求52的方法，其中抗β7抗体是etrolizumab。
说明书 :
用于诊断和治疗炎症性肠病的方法
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2014年3月27日提交的美国临时申请号61/971,379的优先权，该临时申请在此完整引入作为参考。
[0003] 序列表
[0004] 本申请包含序列表，该序列表已通过EFS-Web提交，在此完整引入作为参考。2015年3月5日创建的该ASCII拷贝命名为P5817R1-WO_SL.txt，大小为20,156字节。
技术领域
[0005] 提供预测对整联蛋白β7拮抗剂(包括抗β7整联蛋白亚基抗体)的反应性的生物标志及使用这类生物标志的方法。此外，提供治疗胃肠炎性障碍(如炎症性肠病，包括溃疡性结肠炎和克隆病)的方法。还提供将这类预测生物标志用于治疗炎症性肠病(包括溃疡性结肠炎和克隆病)的方法。
背景技术
[0006] 炎症性肠病(IBD)是胃肠(GI)道的慢性炎性自身免疫病症，其在临床上表现为溃疡性结肠炎(UC)或克隆病(CD)。CD是具有影响整个胃肠道的任意部分的潜能的慢性透壁性炎性疾病，而UC是结肠的黏膜炎症。两种病症在临床上都表征为频繁肠运动、营养不良和脱水，伴随日常生活活动的破坏。CD常并发吸收不良、狭窄和瘘的发展，可以需要反复手术。较少见的UC可以并发严重的血性腹泻和中毒性巨结肠，也需要手术。两种IBD病症都与提高的胃肠道恶性肿瘤风险相关。IBD的病因复杂，发病机制的许多方面仍不清楚。
[0007] 中度至严重IBD的治疗向治疗医生提出了巨大的挑战，因为使用皮质类固醇的常规疗法和免疫调节剂疗法(例如硫唑嘌呤(azathioprine)、6巯基嘌呤和氨甲蝶呤)与副作用和不耐受相关，且未在维持疗法(类固醇)中显示经证明的益处。靶向肿瘤坏死因子α(TNF-α)的单克隆抗体(如英夫单抗(Infliximab)(嵌合抗体)和阿达木单抗(adalimumab)(全人抗体))目前用于CD的治疗。英夫单抗还已显示对UC的有效性，并被批准用于UC。但是，约10％-20％的CD患者对抗TNF疗法是初级无响应者，另外～20％-30％的CD患者随时间推移而失去响应(Schnitzler等,Gut 58:492-500(2009))。与抗TNF相关的其他不良事件(AE)包括细菌感染(包括结核病)及更罕见的淋巴瘤和脱髓鞘的比例提高(Chang等,Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatology 3:220(2006)；Hoentjen等,World J.Gastroenterol.15(17):2067(2009))。目前没有可用的疗法在超过20％-30％患有慢性疾病的IBD患者中达到持续缓解(Hanauer等,Lancet 359:1541-49(2002)；Sandborn等,N Engl J Med 353:1912-25(2005))。此外，大多数患者未达到持续的无类固醇缓解和黏膜愈合(与真实的疾病改变相关的临床结果)。因此，存在发展针对长期使用优化的靶向性更强的IBD疗法的需要：改善的具有持续缓解(尤其是无类固醇缓解)的安全性特征及在更大比例的患者(包括从未响应抗TNF治疗剂或随时间推移失去响应的那些患者(TNF响应不足患者或TNR-IR患者))中预防长期并发症。
[0008] 整联蛋白是在包括白细胞黏附、信号发放、增殖和迁移的许多细胞过程中，以及在基因调节中发挥作用的α/β异二聚体细胞表面糖蛋白受体(Hynes,R.O.,Cell,1992,69:11-25；和Hemler,M.E.,Annu.Rev.Immunol.,1990,8:365-368)。它们由特异性结合内皮、上皮上的不同细胞黏附分子(CAM)和胞外基质蛋白的两个异二聚、非共价相互作用的α和β跨膜亚基组成。在这种方式中，整联蛋白可以作为组织特异性细胞黏附受体发挥作用，该受体辅助以高度调节的方式从血液招募白细胞进入几乎所有组织部位，在白细胞向正常组织和炎症部位归巢中发挥作用(von Andrian等,N Engl J Med 343:1020-34(2000))。在免疫系统中，整联蛋白在炎症过程中涉及白细胞运输、黏附和浸润(Nakajima,H.等,J.Exp.Med.,
1994,179:1145-1154)。整联蛋白的差异表达调节细胞的黏附特性，不同整联蛋白涉及不同的炎症反应。(Butcher,E.C.等,Science,1996,272:60-66)。含有β7的整联蛋白(即α4β7和αEβ7)主要在单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和巨噬细胞上表达，而不在嗜中性粒细胞上表达(Elices,M.J.等,Cell,1990,60:577-584)。
1994,179:1145-1154)。整联蛋白的差异表达调节细胞的黏附特性，不同整联蛋白涉及不同的炎症反应。(Butcher,E.C.等,Science,1996,272:60-66)。含有β7的整联蛋白(即α4β7和αEβ7)主要在单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和巨噬细胞上表达，而不在嗜中性粒细胞上表达(Elices,M.J.等,Cell,1990,60:577-584)。
[0009] α4β7整联蛋白是在细胞向肠黏膜及相关淋巴组织(如小肠中的淋巴集结、大肠中的淋巴小结和肠系膜淋巴结)迁移中重要的白细胞归巢受体。在肠中，白细胞翻滚并紧紧黏附于黏膜内皮由来自趋化因子的信号起始，并由黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM)-1相关唾液酰Lewis X介导。趋化因子信号发放诱导α4β7整联蛋白经历从低MAdCAM-1结合亲和力至高MAdCAM-1结合亲和力的变化。然后白细胞停滞，并开始通过血管内皮外渗至下层组织的过程。认为此外渗过程在正常免疫细胞再循环状态中及在炎性病症中都发生(von Andrian等,上文)。浸润物中α4β7+细胞的数目及配体MAdCAM-1的表达在诸如UC或CD患者的肠道的慢性炎症部位处更高(Briskin等,Am J Pathol 151:97–110(1997)；Souza等,
Gut45:856-63(1999))。α4β7优先结合表达MAdCAM-1和血管细胞黏附分子(VCAM)-1的高内皮小静脉，以及胞外基质分子纤连蛋白片段CS-1(Chan等,J Biol Chem 267:8366–70
(1992)；Ruegg等,J Cell Biol 17:179–89(1992)；Berlin等,Cell 74:185–95(1993))。α4β
7整联蛋白与肠黏膜脉管中组成性表达的MAdCAM-1一起在白细胞肠向性中发挥选择性作用，但似乎不促成白细胞向外周组织或CNS归巢。相反，外周淋巴运输与α4β1与VCAM-1的相互作用相关(Yednock等,Nature 356:63-6(1992)；Rice等,Neurology 64:1336–42
(2005))。
Gut45:856-63(1999))。α4β7优先结合表达MAdCAM-1和血管细胞黏附分子(VCAM)-1的高内皮小静脉，以及胞外基质分子纤连蛋白片段CS-1(Chan等,J Biol Chem 267:8366–70
(1992)；Ruegg等,J Cell Biol 17:179–89(1992)；Berlin等,Cell 74:185–95(1993))。α4β
7整联蛋白与肠黏膜脉管中组成性表达的MAdCAM-1一起在白细胞肠向性中发挥选择性作用，但似乎不促成白细胞向外周组织或CNS归巢。相反，外周淋巴运输与α4β1与VCAM-1的相互作用相关(Yednock等,Nature 356:63-6(1992)；Rice等,Neurology 64:1336–42
(2005))。
[0010] 仅在T淋巴细胞上表达且与黏膜组织相关的β7整联蛋白家族的另一成员是αEβ7整联蛋白，或称为CD103。αEβ7整联蛋白选择性结合上皮细胞上的E钙黏着蛋白，已提出其在黏膜组织中的T细胞在上皮内淋巴细胞区室中的停留中发挥作用(Cepek等,J Immunol 150:3459-70(1993)；Karecla等Eur J Immunol 25:852–6(1995))。已报道固有层中的αEβ7+细胞对应激或感染的上皮细胞显示细胞毒性(Hadley等,J Immunol159:3748–56(1997)；Buri等,J Pathol 206:178–85(2005))。CD中αEβ7的表达提高(Elewaut等,Acta Gastroenterol Belg 61:288–94(1998)；Oshitani等,Int J Mol Med 12:715–9(2003))，已报道抗αEβ7抗体治疗在小鼠中减弱实验性结肠炎，暗示αEβ7+淋巴细胞在IBD的实验模型中的作用
(Ludviksson等,J Immunol 162:4975–82(1999))。
(Ludviksson等,J Immunol 162:4975–82(1999))。
[0011] 据报道，施用抗αEβ7的单克隆抗体在IL-2-/-小鼠中预防和改善免疫诱发的结肠炎，表明炎症性肠病的发病和保持依赖于表达αEβ7的固有层CD4+淋巴细胞的结肠定位(Ludviksson等,J Immunol.1999,162(8):4975-82)。据报道，抗α4抗体(那他珠单抗(natalizumab))在CD患者的治疗中具有有效性(Sandborn等,N Engl J Med 2005；353:
1912-25)，据报道，抗α4β7抗体(MLN-02，MLN0002，vedolizumab)在UC患者中有效(Feagan等,N Engl J Med 2005；352:2499-507)。第二种抗α4β7抗体(AMG181)也处于开发中，且临床试验最近已开始(clinicaltrials(dot)gov识别号NCT01164904，2012年9月)。这些研究和发现将α4β7确认为治疗靶点，并支持α4β7和MAdCAM-1之间的相互作用介导IBD的发病机制的观点。因此，β7整联蛋白的拮抗剂具有在治疗IBD中作为治疗剂的巨大潜能。
1912-25)，据报道，抗α4β7抗体(MLN-02，MLN0002，vedolizumab)在UC患者中有效(Feagan等,N Engl J Med 2005；352:2499-507)。第二种抗α4β7抗体(AMG181)也处于开发中，且临床试验最近已开始(clinicaltrials(dot)gov识别号NCT01164904，2012年9月)。这些研究和发现将α4β7确认为治疗靶点，并支持α4β7和MAdCAM-1之间的相互作用介导IBD的发病机制的观点。因此，β7整联蛋白的拮抗剂具有在治疗IBD中作为治疗剂的巨大潜能。
[0012] 之前已描述了靶向β7整联蛋白亚基的人源化单克隆抗体。参见例如国际专利公开号WO2006/026759。一个这种抗体rhuMAbβ7(etrolizumab)衍生自抗大鼠小鼠/人单克隆抗体FIB504(Andrew等1994)。将它改造为包含人IgG1重链和κ1轻链构架。国际专利公开号WO2006/026759。之前已描述了按照某些给药方案对人患者施用etrolizumab。参见例如国际专利公开号WO/2012/135589。
[0013] RhuMAbβ7(etrolizumab)结合在肠黏膜中分别调节淋巴细胞亚群的运输和停留的α4β7(Holzmann等,Cell 56:37-46(1989)；Hu等,Proc Natl Acad Sci USA 89:8254-8(1992))和αEβ7(Cepek等,J Immunol150:3459-70(1993))。临床研究已证明抗α4抗体(那他珠单抗)对CD的治疗的有效性(Sandborn等,N Engl J Med 353:1912-25(2005))，在UC(Feagan等,N Engl J Med 352:2499-507(2005),Feagan等,N Engl J Med 369(8):699-
710(2013))以及CD(Sandborn等,N Engl J Med369(8):711-721(2013))的治疗中已针对抗α4β7抗体(LDP02/MLN02/MLN0002/vedolizumab)报道了振奋人心的结果。这些发现有助于将α4β7确认为潜在的治疗靶点，并支持α4β7和黏膜地址素细胞黏附分子1(MAdCAM 1)之间的相互作用促成炎症性肠病(IBD)的发病机制的假说。
710(2013))以及CD(Sandborn等,N Engl J Med369(8):711-721(2013))的治疗中已针对抗α4β7抗体(LDP02/MLN02/MLN0002/vedolizumab)报道了振奋人心的结果。这些发现有助于将α4β7确认为潜在的治疗靶点，并支持α4β7和黏膜地址素细胞黏附分子1(MAdCAM 1)之间的相互作用促成炎症性肠病(IBD)的发病机制的假说。
[0014] 与结合α4并因此结合α4β1和α4β7二者的那他珠单抗不同，rhuMAbβ7特异性结合α4β7和αEβ7的β7亚基，而不结合α4或β1整联蛋白单个亚基。这通过该抗体在高达100nM的浓度下也不能抑制α4β1+α4β7–Ramos细胞与血管细胞黏附分子1(VCAM 1)的黏附得到了证明。重要的是，rhuMAbβ7的此特征表明选择性：表达α4β1但不表达β7的T细胞亚群应不直接受rhuMAbβ7影响。
[0015] rhuMAbβ7对淋巴细胞归巢的肠特异性作用的支持来自几项体内非临床研究。在用CD45RBhighCD4+T细胞重建的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠(结肠炎的动物模型)中，rhuMAbβ7阻断放射性标记的淋巴细胞向发炎的结肠归巢，但不阻断向外周淋巴器官脾归巢。参见例如国际专利公开号WO2006/026759。此外，大鼠-小鼠嵌合抗鼠β7(抗β7，muFIB504)不能在患有实验性自身免疫性脑炎(EAE)的髓鞘碱性蛋白T细胞受体(MBP-TCR)转基因小鼠(多发性硬化的动物模型)中降低中枢神经系统(CNS)炎症的组织学程度或改善疾病存活。Id.此外，在食蟹猕猴(cynomolgus monkey)中的两项安全性研究中，rhuMAbβ7诱导外周血淋巴细high胞数目的中度提高，其主要由CD45RA-β7 外周血T细胞(在表型上类似于人类中的肠归巢记忆/效应T细胞的亚群)的显著(约3至6倍)提高引起。参见例如国际专利公开号WO2009/
140684；Stefanich等,Br.J.Pharmacol.162:1855-1870(2011)。相反，rhuMAbβ7对CD45RA+β
7外周血T细胞(在表型上类似于人类中的幼稚T细胞的亚群)的数目具有最小的影响或无影low
响，且对CD45RA-β7 外周血T细胞(在表型上类似于人类中的外周归巢记忆/效应T细胞的亚群)的数目无影响，确认了rhuMAbβ7对肠归巢淋巴细胞亚群的特异性。国际专利公开号WO2009/140684；Stefanich等,Br.J.Pharmacol.162:1855-1870(2011)。
140684；Stefanich等,Br.J.Pharmacol.162:1855-1870(2011)。相反，rhuMAbβ7对CD45RA+β
7外周血T细胞(在表型上类似于人类中的幼稚T细胞的亚群)的数目具有最小的影响或无影low
响，且对CD45RA-β7 外周血T细胞(在表型上类似于人类中的外周归巢记忆/效应T细胞的亚群)的数目无影响，确认了rhuMAbβ7对肠归巢淋巴细胞亚群的特异性。国际专利公开号WO2009/140684；Stefanich等,Br.J.Pharmacol.162:1855-1870(2011)。
[0016] 虽然临床研究已证明抗α4抗体(那他珠单抗)对CD的治疗的有效性(Sandborn等,N Engl J Med 353:1912-25(2005))，在UC的治疗中已针对抗α4β7抗体(LDP02/MLN02/MLN0002/vedolizumab)报道了振奋人心的结果，但在这些障碍的治疗中仍然存在对进一步改善的需要。例如，那他珠单抗治疗与接受那他珠单抗和免疫抑制剂的并行治疗的克隆病(分开地，多发性硬化)患者中确诊的进行性多灶性白质脑病(PML)病例相关。PML是与脑中多瘤病毒(JC病毒)的再活化及活性病毒复制相联系的可能致死的神经病症。没有已知的干预可以可靠地预防PML或在它发生时充分治疗PML。vedolizumab治疗的一个局限是它为静脉内施用，其可以对患者不便，且还可以与不希望或不良的事件(例如输注部位反应)相关。
因此，存在对改进的治疗诸如IBD(例如溃疡性结肠炎和克隆病)的胃肠炎性障碍的治疗方法以及更可取的给药方案的需要。
因此，存在对改进的治疗诸如IBD(例如溃疡性结肠炎和克隆病)的胃肠炎性障碍的治疗方法以及更可取的给药方案的需要。
[0017] 治疗之前通常不知道患者是否将响应具体的治疗剂或治疗剂种类。因此，在IBD患者，尤其是UC和CD患者寻求治疗时，在寻找对具体患者有效的治疗剂中涉及相当的试验和错误。为了找到最有效的疗法，这种试验和错误对患者而言常涉及相当的风险和不适。因此，存在对用于测定哪些患者将响应哪种治疗，并将这类测定并入更有效的IBD患者治疗方案的更有效的手段的需要。
[0018] 因此，具有可用于客观地鉴定最有可能响应多种IBD治疗剂(包括抗β7整联蛋白亚基抗体)治疗的患者的附加诊断方法(包括预测性诊断方法)将高度有利。因此，存在对鉴定与溃疡性结肠炎、克隆病以及其他炎性肠障碍相关，并预测对抗β7整联蛋白亚基抗体治疗的反应的新生物标志的持续需要。此外，在鉴定预期从抗β7整联蛋白亚基抗体治疗显著受益的UC或CD患者的具体亚群(如TNF-IR患者)的努力中，可以用关于这类相关的统计学上和生物学上显著和可重现的信息作为有机组成成分，例如，在治疗剂在临床研究中显示在这种具体的UC或CD患者亚群中具有治疗益处时。
[0019] 本文所述的发明满足某些上述需要，并提供其他益处。
[0020] 本文引用的所有参考文献(包括专利申请和公开)为了任何目的，完整引入作为参考。
[0021] 发明概述
[0022] 本发明的方法至少部分基于这样的发现，从患者获得的生物样品(例如肠活检组织或血液)中某些基因的mRNA表达水平是患有胃肠炎性障碍的患者对整联蛋白β7拮抗剂治疗的反应性的预测。
[0023] 因此，在一方面，提供预测患有胃肠炎性障碍的患者对包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗的反应或预测胃肠炎性障碍患者对包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗的反应性的方法。在某些实施方案中，从该患者获得生物样品，并测量mRNA表达水平。在一些实施方案中，测量样品中选自GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个高表达预测基因(“HEPG”)的表达。在一些实施方案中，该至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG选自GZMA、KLRB1、FOXM1、SLC8A3和ECH1。在一些实施方案中，测量除上文列出的那些之外的另一HEPG，该HEPG是ITGAE。在一个实施方案中，该生物样品是组织活检样品。在一个实施方案中，该活检组织获自肠组织。在某些这类包含组织活检样品或肠组织的实施方案中，该HEPG不包括SLC8A3。在一个实施方案中，该生物样品是外周全血。在某些这类包含外周血的实施方案中，该HEPG包括SLC8A3。在一个实施方案中，该外周全血收集在PAXgene管中。在某些实施方案中，通过RNA测序法、微整列或PCR法来测量该mRNA表达水平。在一个实施方案中，该PCR法是qPCR。在某些实施方案中，该测量包括扩增GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4L1.2、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3mRNA中的一个或多个，可选地进一步包括扩增ITGAE mRNA，并检测所扩增的mRNA，从而测量所扩增的mRNA的水平。在某些实施方案中，将该mRNA表达水平与参考水平相比较。在一些实施方案中，将该mRNA表达水平与所测量的各HEPG的参考水平相比较。在某些实施方案中，各参考水平是中值。在一些实施方案中，与所测量的各HEPG的参考值(其在某些实施方案中是各参考值的中值)相比，样品中选自GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG的mRNA表达水平提高时，预测该患者响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗。在一个实施方案中，该反应是临床缓解。在一个实施方案中，该反应是黏膜愈合。在一个实施方案中，该反应是临床反应。在某些实施方案中，在绝对Mayo临床评分≤2且没有单个小分>1时，确定在该患者中诱导缓解，其也称为临床缓解。在某些实施方案中，在确定患者具有通过可屈性乙状结肠镜检查评估的0或1的内窥镜检查小分时，确定已发生黏膜愈合。在某些这类实施方案中，确定出现黏膜愈合的患者具有0的内窥镜检查小分。在某些实施方案中，在患者出现MCS减少3分和从基线降低30％及直肠出血小分减少≥1分或绝对直肠出血得分为0或1时，确定发生了临床反应。
[0024] 在另一方面，提供将患有胃肠炎性障碍的患者鉴定为可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗的方法。在某些实施方案中，该方法包括：(a)测量来自该患者的生物样品中选自GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG的mRNA表达水平；(b)将(a)中测量的mRNA表达水平与所测量的各HEPG的参考水平相比较；和(c)在(a)中测量的各HEPG的mRNA表达水平高于所测量的各HEPG的参考水平时，将该患者鉴定为更有可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗。在一些实施方案中，该至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG选自GZMA、KLRB1、FOXM1、SLC8A3和ECH1。在一些实施方案中，测量除上文列出的那些之外的另一HEPG，该另一HEPG是ITGAE。在一个实施方案中，该患者是人。在一个实施方案中，该患者之前未用抗TNF治疗剂治疗过。在一个实施方案中，该胃肠炎性障碍是炎症性肠病。在一个实施方案中，该炎症性肠病是溃疡性结肠炎或克隆病。在一个实施方案中，该炎症性肠病是溃疡性结肠炎，该反应选自临床反应、黏膜愈合和缓解。在某些实施方案中，在绝对Mayo临床评分≤2且没有单个小分>1时，确定在该患者中诱导缓解，其也称为临床缓解。在某些实施方案中，在确定患者具有通过可屈性乙状结肠镜检查评估的0或1的内窥镜检查小分时，确定已发生黏膜愈合。在某些这类实施方案中，确定出现黏膜愈合的患者具有0的内窥镜检查小分。在某些实施方案中，在患者出现MCS减少3分和从基线降低30％及直肠出血小分减少≥1分或绝对直肠出血得分为0或1时，确定发生了临床反应。
[0025] 在另一方面，提供治疗患有胃肠炎性障碍的患者的方法。在某些实施方案中，该方法包括：(a)测量来自该患者的生物样品中选自GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG的mRNA表达水平；(b)将(a)中测量的各HEPG的mRNA表达水平与所测量的各HEPG的参考水平相比较；(c)在(a)中测量的各HEPG的mRNA表达水平高于所测量的各HEPG各自的参考水平时，将该患者鉴定为更有可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗；和(d)在(a)中测量的各HEPG的mRNA表达水平高于所测量的各HEPG各自的参考水平时，施用该治疗，从而治疗该胃肠炎性障碍。在一些实施方案中，该至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG选自GZMA、KLRB1、FOXM1、SLC8A3和ECH1。在一些实施方案中，测量除上文列出的那些之外的另一HEPG，该另一HEPG是ITGAE。在一个实施方案中，每四周一次皮下施用105mg整联蛋白β7拮抗剂。在一个实施方案中，皮下施用210mg整联蛋白β7拮抗剂起始剂量，然后施用后续剂量，每个210mg整联蛋白β7拮抗剂后续剂量皮下施用，在起始剂量后第2、4、8和12周中的每个时间点施用。在一个实施方案中，该患者是人。在一个实施方案中，该患者之前未用抗TNF治疗剂治疗过。在一个实施方案中，该胃肠炎性障碍是炎症性肠病。在一个实施方案中，该炎症性肠病是溃疡性结肠炎或克隆病。在一个实施方案中，该炎症性肠病是溃疡性结肠炎，该反应选自临床反应、黏膜愈合和缓解。在某些实施方案中，在绝对Mayo临床评分≤2且没有单个小分>1时，确定在该患者中诱导缓解，其也称为临床缓解。在某些实施方案中，在确定患者具有通过可屈性乙状结肠镜检查评估的0或1的内窥镜检查小分时，确定已发生黏膜愈合。在某些这类实施方案中，确定出现黏膜愈合的患者具有0的内窥镜检查小分。在某些实施方案中，在患者出现MCS减少3分和从基线降低30％及直肠出血小分减少≥1分或绝对直肠出血得分为0或1时，确定发生了临床反应。
[0026] 还在另一方面，提供预测患有胃肠炎性障碍的患者对包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗的反应或预测胃肠炎性障碍患者对包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗的反应性的方法，其中测量样品中选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3的至少一个、至少两个或至少三个低表达预测基因(“LEPG”)的表达。在一些实施方案中，该至少一个、至少两个或至少三个LEPG选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、VNN2和CCL2。在一些实施方案中，至少一个、至少两个或至少三个LEPG选自SLC8A3、VNN2和TNFSF15。在一个实施方案中，该生物样品是组织活检样品。在一个实施方案中，该活检组织获自肠组织。在某些这类包含组织活检样品或肠组织的实施方案中，该LEPG包括SLC8A3。在一个实施方案中，该生物样品是外周全血。在某些这类包含外周血的实施方案中，该LEPG不包括SLC8A3。在一个实施方案中，该外周全血收集在PAXgene管中。在某些实施方案中，通过RNA测序法、微整列或PCR法来测量该mRNA表达水平。在一个实施方案中，该PCR法是qPCR。在某些实施方案中，该测量包括扩增SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2、VNN3mRNA中的一个或多个，并检测所扩增的mRNA，从而测量所扩增的mRNA的水平。在某些实施方案中，将该mRNA表达水平与参考水平相比较。在一些实施方案中，将该mRNA表达水平与所测量的各LEPG的参考水平相比较。在某些实施方案中，各LEPG的参考水平是中值。在一些实施方案中，与所测量的各LEPG的参考值(其在某些实施方案中是各参考值的中值)相比，样品中选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3的至少一个、至少两个或至少三个LEPG的mRNA表达水平降低时，预测该患者响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗。在一个实施方案中，该反应是临床缓解。在一个实施方案中，该反应是黏膜愈合。在一个实施方案中，该反应是临床反应。在某些实施方案中，在绝对Mayo临床评分≤2且没有单个小分>1时，确定在该患者中诱导缓解，其也称为临床缓解。在某些实施方案中，在确定患者具有通过可屈性乙状结肠镜检查评估的0或1的内窥镜检查小分时，确定已发生黏膜愈合。在某些这类实施方案中，确定出现黏膜愈合的患者具有0的内窥镜检查小分。在某些实施方案中，在患者出现MCS减少3分和从基线降低30％及直肠出血小分减少≥1分或绝对直肠出血得分为0或1时，确定发生了临床反应。
[0027] 还在另一方面，提供将患有胃肠炎性障碍的患者鉴定为可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗的方法。在某些实施方案中，该方法包括：(a)测量来自该患者的生物样品中选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3的至少一个、至少两个或至少三个LEPG的mRNA表达水平；(b)将(a)中测量的mRNA表达水平与所测量的各LEPG的参考水平相比较；和(c)在(a)中测量的各LEPG的mRNA表达水平低于所测量的各LEPG的参考水平时，将该患者鉴定为更有可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗。在一些实施方案中，该至少一个、至少两个或至少三个LEPG选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、VNN2和CCL2。在一些实施方案中，至少一个、至少两个或至少三个LEPG选自SLC8A3、VNN2和TNFSF15。在一个实施方案中，该患者是人。在一个实施方案中，该患者之前未用抗TNF治疗剂治疗过。在一个实施方案中，该胃肠炎性障碍是炎症性肠病。在一个实施方案中，该炎症性肠病是溃疡性结肠炎或克隆病。在一个实施方案中，该炎症性肠病是溃疡性结肠炎，该反应选自临床反应、黏膜愈合和缓解。在某些实施方案中，在绝对Mayo临床评分≤2且没有单个小分>1时，确定在该患者中诱导缓解，其也称为临床缓解。在某些实施方案中，在确定患者具有通过可屈性乙状结肠镜检查评估的0或1的内窥镜检查小分时，确定已发生黏膜愈合。在某些这类实施方案中，确定出现黏膜愈合的患者具有0的内窥镜检查小分。在某些实施方案中，在患者出现MCS减少3分和从基线降低30％及直肠出血小分减少≥1分或绝对直肠出血得分为0或1时，确定发生了临床反应。
[0028] 在另一方面，提供治疗患有胃肠炎性障碍的患者的方法。在某些实施方案中，该方法包括：(a)测量来自该患者的生物样品中选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3的至少一个、至少两个或至少三个LEPG的mRNA表达水平；(b)将(a)中测量的各LEPG的mRNA表达水平与所测量的各LEPG的参考水平相比较；(c)在(a)中测量的各LEPG的mRNA表达水平低于所测量的各LEPG各自的参考水平时，将该患者鉴定为更有可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗；和(d)在(a)中测量的各LEPG的mRNA表达水平低于所测量的各LEPG各自的参考水平时，施用该治疗，从而治疗该胃肠炎性障碍。在一些实施方案中，该至少一个、至少两个或至少三个LEPG选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、VNN2和CCL2。在一些实施方案中，至少一个、至少两个或至少三个LEPG选自SLC8A3、VNN2和TNFSF15。在一个实施方案中，每四周一次皮下施用105mg整联蛋白β7拮抗剂。在一个实施方案中，皮下施用210mg整联蛋白β7拮抗剂起始剂量，然后施用后续剂量，每个210mg整联蛋白β7拮抗剂后续剂量皮下施用，在起始剂量后第2、4、8和12周中的每个时间点施用。在一个实施方案中，该患者是人。在一个实施方案中，该患者之前未用抗TNF治疗剂治疗过。在一个实施方案中，该胃肠炎性障碍是炎症性肠病。在一个实施方案中，该炎症性肠病是溃疡性结肠炎或克隆病。在一个实施方案中，该炎症性肠病是溃疡性结肠炎，该反应选自临床反应、黏膜愈合和缓解。在某些实施方案中，在绝对Mayo临床评分≤2且没有单个小分>1时，确定在该患者中诱导缓解，其也称为临床缓解。在某些实施方案中，在确定患者具有通过可屈性乙状结肠镜检查评估的0或1的内窥镜检查小分时，确定已发生黏膜愈合。在某些这类实施方案中，确定出现黏膜愈合的患者具有0的内窥镜检查小分。在某些实施方案中，在患者出现MCS减少3分和从基线降低30％及直肠出血小分减少≥1分或绝对直肠出血得分为0或1时，确定发生了临床反应。
[0029] 还在另一方面，提供预测患有胃肠炎性障碍的患者对包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗的反应或预测胃肠炎性障碍患者对包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗的反应性的方法，其中测量生物样品中选自GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG的表达，且其中测量样品中选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3的至少一个、至少两个或至少三个LEPG的表达。在一些实施方案中，该至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG选自GZMA、KLRB1、FOXM1、SLC8A3和ECH1，且该至少一个、至少两个或至少三个LEPG选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、VNN2和CCL2。在一些实施方案中，至少一个、至少两个或至少三个LEPG选自SLC8A3、VNN2和TNFSF15。在一些实施方案中，将各HEPG的mRNA表达水平与所测量的各HEPG的参考水平相比较，并将各LEPG的mRNA表达水平与所测量的各LEPG的参考水平相比较。在一些实施方案中，在所测量的各HEPG的mRNA表达水平与所测量的各HEPG各自的参考水平相比提高时，及在所测量的各LEPG的mRNA表达水平与所测量的各LEPG各自的参考水平相比降低时，预测该患者响应该治疗。在一个实施方案中，该生物样品是组织活检样品。在一个实施方案中，该活检组织获自肠组织。在某些这类包含组织活检样品或肠组织的实施方案中，该HEPG不包括SLC8A3，而该LEPG包括SLC8A3。在一个实施方案中，该生物样品是外周全血。在某些这类包含外周血的实施方案中，该HEPG包括SLC8A3，而该LEPG不包括SLC8A3。在一个实施方案中，该外周全血收集在PAXgene管中。在某些实施方案中，通过RNA测序法、微整列或PCR法来测量该mRNA表达水平。在一个实施方案中，该PCR法是qPCR。在某些实施方案中，该测量包括扩增GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4L1.2、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3mRNA中的一个或多个，可选地进一步包括扩增ITGAE mRNA，且包括扩增SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2、VNN3mRNA中的一个或多个，并检测所扩增的mRNA，从而测量所扩增的mRNA的水平。在某些实施方案中，将所测量的各基因的mRNA表达水平与所测量的基因的参考水平(其在一些实施方案中是中位数水平)相比较。在一个实施方案中，该反应是临床缓解。在一个实施方案中，该反应是黏膜愈合。在一个实施方案中，该反应是临床反应。在某些实施方案中，在绝对Mayo临床评分≤2且没有单个小分>1时，确定在该患者中诱导缓解，其也称为临床缓解。在某些实施方案中，在确定患者具有通过可屈性乙状结肠镜检查评估的0或1的内窥镜检查小分时，确定已发生黏膜愈合。在某些这类实施方案中，确定出现黏膜愈合的患者具有0的内窥镜检查小分。在某些实施方案中，在患者出现MCS减少3分和从基线降低30％及直肠出血小分减少≥1分或绝对直肠出血得分为0或1时，确定发生了临床反应。
[0030] 在另一方面，提供将患有胃肠炎性障碍的患者鉴定为可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗的方法，其包括：(a)测量来自该患者的生物样品中选自GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG的mRNA表达水平；(b)将(a)中测量的mRNA表达水平与所测量的各HEPG的参考水平相比较；该方法进一步包括：(c)测量来自该患者的生物样品中选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3的至少一个、至少两个或至少三个LEPG的mRNA表达水平；(d)将(c)中测量的mRNA表达水平与所测量的各LEPG的参考水平相比较；和(e)在(a)中测量的各HEPG的mRNA表达水平高于所测量的各HEPG各自的参考水平时，及在(c)中测量的各LEPG的mRNA表达水平低于所测量的各LEPG各自的参考水平时，将该患者鉴定为更有可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗。在一些实施方案中，该至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG选自GZMA、KLRB1、FOXM1、SLC8A3和ECH1，且该至少一个、至少两个或至少三个LEPG选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、VNN2和CCL2。在一些实施方案中，至少一个、至少两个或至少三个LEPG选自SLC8A3、VNN2和TNFSF15。在一些实施方案中，测量除上文列出的那些之外的另一HEPG，该HEPG是ITGAE。在一个实施方案中，该患者是人。在一个实施方案中，该患者之前未用抗TNF治疗剂治疗过。在一个实施方案中，该胃肠炎性障碍是炎症性肠病。在一个实施方案中，该炎症性肠病是溃疡性结肠炎或克隆病。在一个实施方案中，该炎症性肠病是溃疡性结肠炎，该反应选自临床反应、黏膜愈合和缓解。在某些实施方案中，在绝对Mayo临床评分≤2且没有单个小分>1时，确定在该患者中诱导缓解，其也称为临床缓解。在某些实施方案中，在确定患者具有通过可屈性乙状结肠镜检查评估的0或1的内窥镜检查小分时，确定已发生黏膜愈合。在某些这类实施方案中，确定出现黏膜愈合的患者具有0的内窥镜检查小分。在某些实施方案中，在患者出现MCS减少3分和从基线降低30％及直肠出血小分减少≥1分或绝对直肠出血得分为0或1时，确定发生了临床反应。
[0031] 还在另一方面，提供治疗患有胃肠炎性障碍的患者的方法，其中该方法包括：(a)测量来自该患者的生物样品中选自GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG的mRNA表达水平；(b)将(a)中测量的各HEPG的mRNA表达水平与所测量的各HEPG的参考水平(“HEPG参考水平”)相比较；该方法进一步包括：(c)测量来自该患者的生物样品中选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3的至少一个、至少两个或至少三个LEPG的mRNA表达水平；(d)将(c)中测量的各LEPG的mRNA表达水平与所测量的各LEPG的参考水平(“LEPG参考水平”)相比较；(e)在(a)中测量的各HEPG的mRNA表达水平高于HEPG参考水平，而(c)中测量的各LEPG的mRNA表达水平低于LEPG参考水平时，将该患者鉴定为更有可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗；和(f)在(a)中测量的各HEPG的mRNA表达水平高于HEPG参考水平，而(c)中测量的各LEPG的mRNA表达水平低于LEPG参考水平时，施用该治疗，从而治疗该胃肠炎性障碍。在一些实施方案中，该至少一个、至少两个、至少三个或至少四个HEPG选自GZMA、KLRB1、FOXM1、SLC8A3和ECH1，且该至少一个、至少两个或至少三个LEPG选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、VNN2和CCL2。在一些实施方案中，至少一个、至少两个或至少三个LEPG选自SLC8A3、VNN2和TNFSF15。在一些实施方案中，测量除上文列出的那些之外的另一HEPG，该HEPG是ITGAE。在一个实施方案中，每四周一次皮下施用105mg整联蛋白β7拮抗剂。在一个实施方案中，皮下施用210mg整联蛋白β7拮抗剂起始剂量，然后施用后续剂量，每个210mg整联蛋白β7拮抗剂后续剂量皮下施用，在起始剂量后第2、4、8和12周中的每个时间点施用。在一个实施方案中，该患者是人。在一个实施方案中，该患者之前未用抗TNF治疗剂治疗过。在一个实施方案中，该胃肠炎性障碍是炎症性肠病。在一个实施方案中，该炎症性肠病是溃疡性结肠炎或克隆病。在一个实施方案中，该炎症性肠病是溃疡性结肠炎，该反应选自临床反应、黏膜愈合和缓解。在某些实施方案中，在绝对Mayo临床评分≤2且没有单个小分>1时，确定在该患者中诱导缓解，其也称为临床缓解。在某些实施方案中，在确定患者具有通过可屈性乙状结肠镜检查评估的0或1的内窥镜检查小分时，确定已发生黏膜愈合。在某些这类实施方案中，确定出现黏膜愈合的患者具有0的内窥镜检查小分。在某些实施方案中，在患者出现MCS减少3分和从基线降低30％及直肠出血小分减少≥1分或绝对直肠出血得分为0或1时，确定发生了临床反应。
[0032] 还在另一方面，提供用于治疗患有胃肠炎性障碍的患者的整联蛋白β7拮抗剂。在某些实施方案中，在选自GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4L1.2、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3的至少一个基因的mRNA表达水平高于参考水平时，治疗该患者或选择该患者进行治疗。在一个实施方案中，测量除上文列出的那些之外的另一基因，该另一基因是ITGAE。在某些实施方案中，在选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3的至少一个基因的mRNA表达水平低于参考水平时，治疗该患者或选择该患者进行治疗。在一个实施方案中，所测量的各基因的参考水平是中值。在一个实施方案中，该整联蛋白β7拮抗剂用于治疗该患者，其中每四周一次皮下施用105mg。在一个实施方案中，皮下施用210mg整联蛋白β7拮抗剂起始剂量，然后施用后续剂量，每个210mg整联蛋白β7拮抗剂后续剂量皮下施用，在起始剂量后第2、4、8和12周中的每个时间点施用。
[0033] 在另一方面，提供特异性结合选自GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4L1.2、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3的生物标志的至少一种物质的体外用途。在一个实施方案中，测量结合除上文列出的那些之外的另一生物标志的物质，该另一生物标志是ITGAE。在某些实施方案中，该至少一种物质用于鉴定或选择患有胃肠炎性障碍的患者为可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗，其中高于参考水平的mRNA表达水平鉴定或选择该患者更有可能响应该治疗。在一个实施方案中，该参考水平是中值。在某些实施方案中，该体外用途包括试剂盒。
[0034] 在另一方面，提供特异性结合选自SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3的生物标志的至少一种物质的体外用途。在某些实施方案中，该至少一种物质用于鉴定或选择患有胃肠炎性障碍的患者为可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的治疗，其中低于参考水平的mRNA表达水平鉴定或选择该患者更有可能响应该治疗。在一个实施方案中，该参考水平是中值。在某些实施方案中，该体外用途包括试剂盒。
[0035] 还在另一方面，提供治疗患者中的胃肠炎性障碍的方法。在某些实施方案中，在测定出获自患者的生物样品表达某些基因中的一个或多个的提高的mRNA表达水平时，对该患者施用治疗有效量的整联蛋白β7拮抗剂。在一些实施方案中，与中值相比，测定出该样品表达提高的GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4L1.2、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2或SLC8A3。在一些实施方案中，与相同mRNA的中位数水平相比，测定出该样品表达GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4L1.2、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3中的两个或三个或四个的提高的mRNA水平。在一些实施方案中，测定出该样品表达除上文列出的那些之外的另一基因的提高的mRNA水平，该另一基因是ITGAE。在某些实施方案中，根据生物样品中某些基因与相同的一个或多个基因的中值相比提高的mRNA表达水平选择患者进行治疗。在一个实施方案中，该生物样品是组织活检样品。在某些这类包含活检组织的实施方案中，未测定SLC8A3的表达。在一个实施方案中，该生物样品是外周全血。在某些这类包含外周血的实施方案中，测定SLC8A3的提高的表达。在一个实施方案中，该外周全血收集在PAXgene管中。在某些实施方案中，通过RNA测序法、微整列或PCR法来测量该mRNA表达水平。在一个实施方案中，该PCR法是qPCR。在某些实施方案中，该测量包括扩增GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4L1.2、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2和SLC8A3mRNA中的一个或多个，可选地进一步包括扩增ITGAE mRNA，并检测所扩增的mRNA，从而测量所扩增的mRNA的水平。在某些实施方案中，整联蛋白β7拮抗剂的施用导致以下的一项或多项：(1)MCS减少
3分和从基线降低30％，且直肠出血小分减少≥1分或绝对直肠出血得分为0或1；(2)内窥镜检查小分为0或1；(3)MCS≤2，没有单个小分>1。在一个实施方案中，每四周一次皮下施用
105mg整联蛋白β7拮抗剂。在一个实施方案中，皮下施用210mg整联蛋白β7拮抗剂起始剂量，然后施用后续剂量，每个210mg整联蛋白β7拮抗剂后续剂量皮下施用，在起始剂量后第2、4、
8和12周中的每个时间点施用。
3分和从基线降低30％，且直肠出血小分减少≥1分或绝对直肠出血得分为0或1；(2)内窥镜检查小分为0或1；(3)MCS≤2，没有单个小分>1。在一个实施方案中，每四周一次皮下施用
105mg整联蛋白β7拮抗剂。在一个实施方案中，皮下施用210mg整联蛋白β7拮抗剂起始剂量，然后施用后续剂量，每个210mg整联蛋白β7拮抗剂后续剂量皮下施用，在起始剂量后第2、4、
8和12周中的每个时间点施用。
[0036] 还在另一方面，提供治疗患者中的胃肠炎性障碍的方法。在某些实施方案中，在测定出获自患者的生物样品表达某些基因中的一个或多个的降低的mRNA表达水平时，对该患者施用治疗有效量的整联蛋白β7拮抗剂。在一些实施方案中，与中值相比，测定出该样品表达降低的SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2或VNN3。在一些实施方案中，与相同mRNA的中位数水平相比，测定出该样品表达SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3中的两个或三个的降低的mRNA水平。在某些实施方案中，根据生物样品中某些基因与一个或多个相同基因的中值相比降低的mRNA表达水平选择患者进行治疗。在一些实施方案中，与中值相比，根据降低的SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2或VNN3表达选择患者进行治疗。在一些实施方案中，与相同mRNA的中值相比，根据SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3中的两个或三个的降低的mRNA表达选择患者进行治疗。在一个实施方案中，该生物样品是组织活检样品。在某些这类包含组织活检样品的实施方案中，该方法包括与参考值或中值相比降低的SLC8A3表达。在一个实施方案中，该生物样品是外周全血。在某些这类包含外周血的实施方案中，与参考值或中值相比，SLC8A3表达未降低。在一个实施方案中，该外周全血收集在PAXgene管中。在某些实施方案中，通过RNA测序法、微整列或PCR法来测量该mRNA表达水平。在一个实施方案中，该PCR法是qPCR。在某些实施方案中，该测量包括扩增SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2和VNN3mRNA中的一个或多个，并检测所扩增的mRNA，从而测量所扩增的mRNA的水平。在某些实施方案中，整联蛋白β7拮抗剂的施用导致以下的一项或多项：(1)MCS减少3分和从基线降低30％，且直肠出血小分减少≥1分或绝对直肠出血得分为0或1；(2)内窥镜检查小分为0或1；(3)MCS≤2，没有单个小分>1。在一个实施方案中，每四周一次皮下施用105mg整联蛋白β7拮抗剂。在一个实施方案中，皮下施用210mg整联蛋白β7拮抗剂起始剂量，然后施用后续剂量，每个210mg整联蛋白β7拮抗剂后续剂量皮下施用，在起始剂量后第2、4、8和12周中的每个时间点施用。
[0037] 在某些以上实施方案中，该胃肠炎性障碍是炎症性肠病，在某些这类实施方案中，该炎症性肠病是溃疡性结肠炎(UC)或克隆病(CD)，在某些这类实施方案中，该整联蛋白β7拮抗剂是单克隆抗β7抗体。在某些这类实施方案中，该抗β7抗体选自嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。在某些实施方案中，该抗β7抗体是抗体片段。在某些实施方案中，该抗β7抗体包含六个高变区(HVR)，其中：
[0038] (i)HVR-L1包含氨基酸序列A1-A11，其中A1-A11是RASESVDTYLH(SEQ ID NO:1)；RASESVDSLLH(SEQ ID NO:7)；RASESVDTLLH(SEQ ID NO:8)；或RASESVDDLLH(SEQ ID NO:9)；
或SEQ ID NO:1、7、8或9的变体(SEQ ID NO:26)，其中氨基酸A2选自A、G、S、T和V，和/或氨基酸A3选自S、G、I、K、N、P、Q、R和T，和/或A4选自E、V、Q、A、D、G、H、I、K、L、N和R，和/或氨基酸A5选自S、Y、A、D、G、H、I、K、N、P、R、T和V，和/或氨基酸A6选自V、R、I、A、G、K、L、M和Q，和/或氨基酸A7选自D、V、S、A、E、G、H、I、K、L、N、P、S和T，和/或氨基酸A8选自D、G、N、E、T、P和S，和/或氨基酸A9选自L、Y、I和M，和/或氨基酸A10选自L、A、I、M和V，和/或氨基酸A11选自H、Y、F和S；
或SEQ ID NO:1、7、8或9的变体(SEQ ID NO:26)，其中氨基酸A2选自A、G、S、T和V，和/或氨基酸A3选自S、G、I、K、N、P、Q、R和T，和/或A4选自E、V、Q、A、D、G、H、I、K、L、N和R，和/或氨基酸A5选自S、Y、A、D、G、H、I、K、N、P、R、T和V，和/或氨基酸A6选自V、R、I、A、G、K、L、M和Q，和/或氨基酸A7选自D、V、S、A、E、G、H、I、K、L、N、P、S和T，和/或氨基酸A8选自D、G、N、E、T、P和S，和/或氨基酸A9选自L、Y、I和M，和/或氨基酸A10选自L、A、I、M和V，和/或氨基酸A11选自H、Y、F和S；
[0039] (ii)HVR-L2包含氨基酸序列B1-B8，其中B1-B8是KYASQSIS(SEQ ID NO:2)；RYASQSIS(SEQ ID NO:20)；或XaaYASQSIS(SEQ ID NO:21，其中Xaa代表任意氨基酸)；或SEQ ID NO:2、20或21的变体(SEQ ID NO:27)，其中氨基酸B1选自K、R、N、V、A、F、Q、H、P、I、L、Y和Xaa(其中Xaa代表任意氨基酸)，和/或氨基酸B4选自S和D，和/或氨基酸B5选自Q和S，和/或氨基酸B6选自S、D、L和R，和/或氨基酸B7选自I、V、E和K；
[0040] (iii)HVR-L3包含氨基酸序列C1-C9，其中C1-C9是QQGNSLPNT(SEQ ID NO:3)；或SEQ ID NO:3的变体(SEQ ID NO:28)，其中氨基酸C8选自N、V、W、Y、R、S、T、A、F、H、I L和M；
[0041] (iv)HVR-H1包含氨基酸序列D1-D10，其中D1-D10是GFFITNNYWG(SEQ ID NO:4)；
[0042] (v)HVR-H2包含氨基酸序列E1-E17，其中E1-E17是GYISYSGSTSYNPSLKS(SEQ ID NO:5)；或SEQ ID NO:5的变体(SEQ ID NO:29)，其中氨基酸E2选自Y、F、V和D，和/或氨基酸E6选自S和G，和/或氨基酸E10选自S和Y，和/或氨基酸E12选自N、T、A和D，和/或氨基酸13选自P、H、D和A，和/或氨基酸E15选自L和V，和/或氨基酸E17选自S和G；和
[0043] (vi)HVR-H3包含氨基酸序列F2-F11，其中F2-F11是MTGSSGYFDF(SEQ ID NO:6)或RTGSSGYFDF(SEQ ID NO:19)；或包含氨基酸序列F1-F11，其中F1-F11是AMTGSSGYFDF(SEQ ID NO:16)；ARTGSSGYFDF(SEQ ID NO:17)；或AQTGSSGYFDF(SEQ ID NO:18)；或SEQ ID NO:6、16、17、18、or 19的变体(SEQ ID NO:30)，其中氨基酸F2是R、M、A、E、G、Q、S，和/或氨基酸F11选自F和Y。
[0044] 在某些实施方案中，该抗-β7抗体包含三个重链高变区(HVR-H1-H3)序列和三个轻链高变区(HVR-L1-L3)序列，其中：
[0045] (i)HVR-L1包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9；
[0046] (ii)HVR-L2包含SEQ ID NO:2；
[0047] (iii)HVR-L3包含SEQ ID NO:3；
[0048] (iv)HVR-H1包含SEQ ID NO:4；
[0049] (v)HVR-H2包含SEQ ID NO:5；和
[0050] (vi)HVR-H3包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19。
[0051] 在某些实施方案中，该抗-β7抗体包含三个重链高变区(HVR-H1-H3)序列和三个轻链高变区(HVR-L1-L3)序列，其中：
[0052] (i)HVR-L1包含SEQ ID NO:9；
[0053] (ii)HVR-L2包含SEQ ID NO:2；
[0054] (iii)HVR-L3包含SEQ ID NO:3；
[0055] (iv)HVR-H1包含SEQ ID NO:4；
[0056] (v)HVR-H2包含SEQ ID NO:5；和
[0057] (vi)HVR-H3包含SEQ ID NO:19。在某些实施方案中，该抗β7抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:31的可变轻链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:32的可变重链。
[0058] 在某些实施方案中，该抗β7抗体是etrolizumab，也称为rhuMAbβ7。
[0059] 附图简述
[0060] 图1A和1B针对以下共有序列和抗β7亚基抗体序列显示可变轻链和重链的序列的比对：轻链人亚型κI共有序列(图1A，SEQ ID NO:12)；重链人亚型III共有序列(图1B，SEQ ID NO:13)；大鼠抗小鼠β7抗体(Fib504)可变轻链(图1A，SEQ ID NO:10)；大鼠抗小鼠β7抗体(Fib504)可变重链(图1B，SEQ ID NO:11)；及人源化抗体变体：人源化hu504K移植可变轻链(图1A，SEQ ID NO:14)，人源化hu504K移植可变重链(图1B，SEQ ID NO:15)，变体hu504-5、hu504-16和hu504-32(对于变体hu504-5、hu504-16和hu504-32，来自人源化hu504K移植的氨基酸变异显示在图1A(轻链)(按出现的顺序分别为SEQ ID NO:22-24)和图1B(重链)(SEQ ID NO:25)中)。
[0061] 图2显示etrolizumab的可变轻链区(图2A)(SEQ ID NO:31)和可变重链区(图2B)(SEQ ID NO:32)。
[0062] 图3显示用于实施例1中所述II期临床研究的研究计划。
[0063] 图4显示用于实施例1中所述II期开放标签扩展临床研究的研究计划。
[0064] 图5显示实施例2中所述所有患者中针对基于并行药物和之前的抗TNF暴露的疗效差异估计调整的所示通过qPCR测量的差异表达基因的优势比。所显示的是富集缓解的基因的差异表达。
[0065] 图6显示实施例2中所述未接受过抗TNF的患者中针对基于并行药物和之前的抗TNF暴露的疗效差异估计调整的所示通过qPCR测量的差异表达基因的优势比。所显示的是富集缓解的基因的差异表达。
[0066] 图7是显示实施例2中所述的所选择的基因的双向聚类(图7A)和相关(图7B)的热图。
[0067] 图8显示实施例2中所述的按肠活检组织中基线基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，并用安慰剂(黑色棒)、100mg/剂量etrolizumab(斑点棒)或300mg/剂量etrolizumab+负荷剂量(LD)(条纹棒)治疗的患者比例(百分比)。(图8A)按粒酶A(GZMA)基因表达分层的患者的比例；(图8B)按KLRB1基因表达分层的患者的比例；(图8C)按FOXM1基因表达分层的患者的比例；(图8D)按整联蛋白αE(ITGAE)基因表达分层的患者的比例。图左侧，所有患者；图右侧，之前未用任何肿瘤坏死因子(TNF)活性拮抗剂治疗过的患者(未接受过抗TNF)。
[0068] 图9显示实施例2中所述高于中位数水平的基线粒酶A(GZMA)表达富集对etrolizumab治疗的反应性。(图9A)按肠活检组织中基线GZMA基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，并用安慰剂(黑色棒)、100mg/剂量etrolizumab(斑点棒)或300mg/剂量etrolizumab(条纹棒)治疗的未接受过TNF拮抗剂的患者，在第10周处于缓解、在第10周显示黏膜愈合或在第10周显示临床反应的比例(百分比)。(图9B)按肠活检组织中基线GZMA基因表达(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，来自开放标签扩展研究的之前TNF活性拮抗剂治疗失败或响应不足(TNF-IR)的患者，在继续用
etrolizumab治疗后4-6周处于临床缓解(左侧)或显示临床反应(右侧)的百分比。(图9C)从II期etrolizumab试验中招募并鉴定为未接受过TNF拮抗剂(未接受过抗TNF)或TNF-IR(抗TNF失败)的患者获得的基线活检组织中，相对于GAPDH表达的GZMA基因表达，黑色实心圆：
第10周时的非缓解者；空心圆：第10周时的缓解者，虚线表示中位数。(图9D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第71天显示GZMA变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
etrolizumab治疗后4-6周处于临床缓解(左侧)或显示临床反应(右侧)的百分比。(图9C)从II期etrolizumab试验中招募并鉴定为未接受过TNF拮抗剂(未接受过抗TNF)或TNF-IR(抗TNF失败)的患者获得的基线活检组织中，相对于GAPDH表达的GZMA基因表达，黑色实心圆：
第10周时的非缓解者；空心圆：第10周时的缓解者，虚线表示中位数。(图9D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第71天显示GZMA变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
[0069] 图10显示实施例2中所述高于中位数水平的基线KLRB1表达富集对etrolizumab治疗的反应性。(图10A)按肠活检组织中基线KLRB1基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，并用安慰剂(黑色棒)、100mg/剂量etrolizumab(斑点棒)或300mg/剂量etrolizumab(条纹棒)治疗的未接受过TNF拮抗剂的患者，在第10周处于缓解、在第10周显示黏膜愈合或在第10周显示临床反应的比例(百分比)。(图10B)按肠活检组织中基线KLRB1基因表达(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层的来自开放标签扩展研究的TNF-IR患者，在继续用etrolizumab治疗后4-6周处于临床缓解(左侧)或显示临床反应(右侧)的百分比。(图10C)从II期etrolizumab试验中招募并鉴定为未接受过TNF拮抗剂(未接受过抗TNF)或TNF-IR(抗TNF失败)的患者获得的基线活检组织中，相对于GAPDH表达的KLRB1基因表达，黑色实心圆：第10周时的非缓解者；空心圆：第10周时的缓解者，虚线表示中位数。(图10D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第71天显示KLRB1变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
[0070] 图11显示实施例2中所述高于中位数水平的基线FOXM1表达富集对etrolizumab治疗的反应性。(图11A)按肠活检组织中基线FOXM1基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，并用安慰剂(黑色棒)、100mg/剂量etrolizumab(斑点棒)或300mg/剂量etrolizumab(条纹棒)治疗的未接受过TNF拮抗剂的患者，在第10周处于缓解、在第10周显示黏膜愈合或在第10周显示临床反应的比例(百分比)。(图11B)按肠活检组织中基线FOXM1基因表达(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层的来自开放标签扩展研究的TNF-IR患者，在继续用etrolizumab治疗后4-6周处于临床缓解(左侧)或显示临床反应(右侧)的百分比。(图11C)从II期etrolizumab试验中招募并鉴定为未接受过TNF拮抗剂(未接受过抗TNF)或TNF-IR(抗TNF失败)的患者获得的基线活检组织中，相对于GAPDH表达的FOXM1基因表达，黑色实心圆：第10周时的非缓解者；空心圆：第10周时的缓解者，虚线表示中位数。(图11D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第71天显示FOXM1变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
[0071] 图12显示实施例2中所述高于中位数水平的基线ITGAE表达富集对etrolizumab治疗的反应性。(图12A)按肠活检组织中基线ITGAE基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，并用安慰剂(黑色棒)、100mg/剂量etrolizumab(斑点棒)或300mg/剂量etrolizumab(条纹棒)治疗的未接受过TNF拮抗剂的患者，在第10周处于缓解、在第10周显示黏膜愈合或在第10周显示临床反应的比例(百分比)。(图12B)按肠活检组织中基线ITGAE基因表达(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层的来自开放标签扩展研究的TNF-IR患者，在继续用etrolizumab治疗后4-6周处于临床缓解(左侧)或显示临床反应(右侧)的百分比。(图12C)从II期etrolizumab试验中招募并鉴定为未接受过TNF拮抗剂(未接受过抗TNF)或TNF-IR(抗TNF失败)的患者获得的基线活检组织中，相对于GAPDH表达的ITGAE基因表达，黑色实心圆：第10周时的非缓解者；空心圆：第10周时的缓解者，虚线表示中位数。(图12D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第71天显示ITGAE变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
[0072] 图13显示实施例2中所述按肠活检组织中基线基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，并用安慰剂(黑色棒)、100mg/剂量etrolizumab(斑点棒)或300mg/剂量etrolizumab+LD(条纹棒)治疗的患者的比例(百分比)。(图13A)按SLC8A3基因表达分层的患者的比例；(图13B)按TNFSF15基因表达分层的患者的比例；(图13C)按CCL2基因表达分层的患者的比例；(图13D)按BEST2基因表达分层的患者的比例。
[0073] 图14显示实施例2中所述筛查活检组织中低于中位数水平的基线SLC8A3表达富集对etrolizumab治疗的反应性。(图14A)按肠活检组织中基线SLC8A3基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，并用安慰剂(黑色棒)、100mg/剂量etrolizumab(斑点棒)或300mg/剂量etrolizumab(条纹棒)治疗的未接受过TNF拮抗剂的患者，在第10周处于缓解、在第10周显示黏膜愈合或在第10周显示临床反应的比例(百分比)。(图14B)按肠活检组织中基线SLC8A3基因表达(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层的来自开放标签扩展研究的TNF-IR患者，在继续用etrolizumab治疗后4-6周处于临床缓解(左侧)或显示临床反应(右侧)的百分比。(图14C)从II期etrolizumab试验中招募并鉴定为未接受过TNF拮抗剂(未接受过抗TNF)或TNF-IR(抗TNF失败)的患者获得的基线活检组织中，相对于GAPDH表达的SLC8A3基因表达，黑色实心圆：第10周时的非缓解者；空心圆：第10周时的缓解者，虚线表示中位数。(图14D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第71天显示SLC8A3变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
[0074] 图15显示实施例2中所述低于中位数水平的基线TNFSF15表达富集对etrolizumab治疗的反应性。(图15A)按肠活检组织中基线TNFSF15基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，并用安慰剂(黑色棒)、100mg/剂量etrolizumab(斑点棒)或300mg/剂量etrolizumab(条纹棒)治疗的未接受过TNF拮抗剂的患者，在第10周处于缓解、在第10周显示黏膜愈合或在第10周显示临床反应的比例(百分比)。(图15B)按肠活检组织中基线TNFSF15基因表达(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层的来自开放标签扩展研究的TNF-IR患者，在继续用etrolizumab治疗后4-6周处于临床缓解(左侧)或显示临床反应(右侧)的百分比。(图15C)从II期etrolizumab试验中招募并鉴定为未接受过TNF拮抗剂(未接受过抗TNF)或TNF-IR(抗TNF失败)的患者获得的基线活检组织中，相对于GAPDH表达的TNFSF15基因表达，黑色实心圆：第10周时的非缓解者；空心圆：第10周时的缓解者，虚线表示中位数。(图15D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第71天显示TNFSF15变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
[0075] 图16显示实施例2中所述低于中位数水平的基线CCL2表达富集对etrolizumab治疗的反应性。(图16A)按肠活检组织中基线CCL2基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，并用安慰剂(黑色棒)、100mg/剂量etrolizumab(斑点棒)或300mg/剂量etrolizumab(条纹棒)治疗的未接受过TNF拮抗剂的患者，在第10周处于缓解、在第10周显示黏膜愈合或在第10周显示临床反应的比例(百分比)。(图16B)按肠活检组织中基线CCL2基因表达(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层的来自开放标签扩展研究的TNF-IR患者，在继续用etrolizumab治疗后4-6周处于临床缓解(左侧)或显示临床反应(右侧)的百分比。(图16C)从II期etrolizumab试验中招募并鉴定为未接受过TNF拮抗剂(未接受过抗TNF)或TNF-IR(抗TNF失败)的患者获得的基线活检组织中，相对于GAPDH表达的CCL2基因表达，黑色实心圆：第10周时的非缓解者；空心圆：第10周时的缓解者，虚线表示中位数。(图16D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第71天显示CCL2变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
[0076] 图17显示实施例2中所述低于中位数水平的基线BEST2表达富集对etrolizumab治疗的反应性。(图17A)按肠活检组织中基线BEST2基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，并用安慰剂(黑色棒)、100mg/剂量etrolizumab(斑点棒)或300mg/剂量etrolizumab(条纹棒)治疗的未接受过TNF拮抗剂的患者，在第10周处于缓解、在第10周显示黏膜愈合或在第10周显示临床反应的比例(百分比)。(图17B)按肠活检组织中基线BEST2基因表达(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层的来自开放标签扩展研究的TNF-IR患者，在继续用etrolizumab治疗后4-6周处于临床缓解(左侧)或显示临床反应(右侧)的百分比。(图17C)从II期etrolizumab试验中招募并鉴定为未接受过TNF拮抗剂(未接受过抗TNF)或TNF-IR(抗TNF失败)的患者获得的基线活检组织中，相对于GAPDH表达的BEST2基因表达，黑色实心圆：第10周时的非缓解者；空心圆：第10周时的缓解者，虚线表示中位数。(图17D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第71天显示BEST2变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
[0077] 图18显示(图18A)实施例2中所述按肠活检组织中基线ECH1基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，并用安慰剂(黑色棒)、100mg/剂量etrolizumab(斑点棒)或300mg/剂量etrolizumab(条纹棒)治疗的未接受过TNF拮抗剂的患者，在第10周处于缓解、在第10周显示黏膜愈合或在第10周显示临床反应的比例(百分比)。(图18B)按肠活检组织中基线ECH1基因表达(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层的来自开放标签扩展研究的TNF-IR患者，在继续用etrolizumab治疗后4-6周处于临床缓解(左侧)或显示临床反应(右侧)的百分比。(图18C)从II期etrolizumab试验中招募并鉴定为未接受过TNF拮抗剂(未接受过抗TNF)或TNF-IR(抗TNF失败)的患者获得的基线活检组织中，相对于GAPDH表达的ECH1基因表达，黑色实心圆：第10周时的非缓解者；空心圆：第10周时的缓解者，虚线表示中位数。(图18D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第71天显示ECH1变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
[0078] 图19显示(图19A)实施例2中所述按肠活检组织中基线VNN2基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，并用安慰剂(黑色棒)、100mg/剂量etrolizumab(斑点棒)或300mg/剂量etrolizumab(条纹棒)治疗的未接受过TNF拮抗剂的患者，在第10周处于缓解、在第10周显示黏膜愈合或在第10周显示临床反应的比例(百分比)。(图19B)按肠活检组织中基线VNN2基因表达(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层的来自开放标签扩展研究的TNF-IR患者，在继续用etrolizumab治疗后4-6周处于临床缓解(左侧)或显示临床反应(右侧)的百分比。(图19C)从II期etrolizumab试验中招募并鉴定为未接受过TNF拮抗剂(未接受过抗TNF)或TNF-IR(抗TNF失败)的患者获得的基线活检组织中，相对于GAPDH表达的VNN2基因表达，黑色实心圆：第10周时的非缓解者；空心圆：第10周时的缓解者，虚线表示中位数。(图19D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第71天显示VNN2变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
[0079] 图20显示实施例2中所述高于中位数水平的基线外周血ITGAE基因表达(此背景中的基线指筛查时的值和第1天的值的平均值)富集对etrolizumab治疗的反应性。(图20A)按基线外周血ITGAE基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，并用安慰剂(黑色棒)、100mg/剂量etrolizumab(斑点棒)或300mg/剂量etrolizumab(条纹棒)治疗的未接受过TNF拮抗剂的患者，在第10周处于缓解、在第10周显示黏膜愈合或在第10周显示临床反应的比例(百分比)。(图20B)按基线外周血ITGAE基因表达(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层的来自开放标签扩展研究的TNF-IR患者，在继续用etrolizumab治疗后4-6周处于临床缓解(左侧)或显示临床反应(右侧)的百分比。(图20C)来自II期etrolizumab试验中招募并鉴定为未接受过TNF拮抗剂(未接受过抗TNF)或TNF-IR(抗TNF失败)的患者的外周血中，相对于GAPDH表达的ITGAE基因表达，黑色实心圆：第10周时的非缓解者；空心圆：第10周时的缓解者，虚线表示中位数。(图20D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第71天显示ITGAE基因表达变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
[0080] 图21显示实施例2中所述高于中位数水平的基线外周血ECH1基因表达富集对etrolizumab治疗的反应性。(图21A)按基线外周血ECH1基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，并用安慰剂(黑色棒)、100mg/剂量etrolizumab(斑点棒)或
300mg/剂量etrolizumab(条纹棒)治疗的未接受过TNF拮抗剂的患者，在第10周处于缓解、在第10周显示黏膜愈合或在第10周显示临床反应的比例(百分比)。(图21B)按基线ECH1外周血基因表达(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层的来自开放标签扩展研究的TNF-IR患者，在继续用etrolizumab治疗后4-6周处于临床缓解(左侧)或显示临床反应(右侧)的百分比。(图21C)从II期etrolizumab试验中招募并鉴定为未接受过TNF拮抗剂(未接受过抗TNF)或TNF-IR(抗TNF失败)的患者获得的基线活检组织中，相对于GAPDH表达的ECH1基因表达，黑色实心圆：第10周时的非缓解者；空心圆：第10周时的缓解者，虚线表示中位数。(图21D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第71天显示外周血中ECH1基因表达变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
300mg/剂量etrolizumab(条纹棒)治疗的未接受过TNF拮抗剂的患者，在第10周处于缓解、在第10周显示黏膜愈合或在第10周显示临床反应的比例(百分比)。(图21B)按基线ECH1外周血基因表达(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层的来自开放标签扩展研究的TNF-IR患者，在继续用etrolizumab治疗后4-6周处于临床缓解(左侧)或显示临床反应(右侧)的百分比。(图21C)从II期etrolizumab试验中招募并鉴定为未接受过TNF拮抗剂(未接受过抗TNF)或TNF-IR(抗TNF失败)的患者获得的基线活检组织中，相对于GAPDH表达的ECH1基因表达，黑色实心圆：第10周时的非缓解者；空心圆：第10周时的缓解者，虚线表示中位数。(图21D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第71天显示外周血中ECH1基因表达变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
[0081] 图22显示(图22A)实施例2中所述按基线外周血FOXM1基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，并用安慰剂(黑色棒)、100mg/剂量etrolizumab(斑点棒)或300mg/剂量etrolizumab(条纹棒)治疗的未接受过TNF拮抗剂的患者，在第10周处于缓解、在第10周显示黏膜愈合或在第10周显示临床反应的比例(百分比)。(图22B)按外周血中的基线FOXM1基因表达(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层的来自开放标签扩展研究的TNF-IR患者，在继续用etrolizumab治疗后4-6周处于临床缓解(左侧)或显示临床反应(右侧)的百分比。(图22C)从II期etrolizumab试验中招募并鉴定为未接受过TNF拮抗剂(未接受过抗TNF)或TNF-IR(抗TNF失败)的患者获得的基线外周血中，相对于GAPDH表达的FOXM1基因表达，黑色实心圆：第10周时的非缓解者；空心圆：第10周时的缓解者，虚线表示中位数。(图22D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第71天显示外周血中FOXM1基因表达变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
[0082] 图23显示(图23A)实施例2中所述按基线外周血GZMA基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，并用安慰剂(黑色棒)、100mg/剂量etrolizumab(斑点棒)或300mg/剂量etrolizumab(条纹棒)治疗的未接受过TNF拮抗剂的患者，在第10周处于缓解、在第10周显示黏膜愈合或在第10周显示临床反应的比例(百分比)。(图23B)按外周血中的基线GZMA基因表达(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层的来自开放标签扩展研究的TNF-IR患者，在继续用etrolizumab治疗后4-6周处于临床缓解(左侧)或显示临床反应(右侧)的百分比。(图23C)从II期etrolizumab试验中招募并鉴定为未接受过TNF拮抗剂(未接受过抗TNF)或TNF-IR(抗TNF失败)的患者获得的基线外周血样品中，相对于GAPDH表达的GZMA基因表达，黑色实心圆：第10周时的非缓解者；空心圆：第10周时的缓解者，虚线表示中位数。(图23D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第71天显示外周血中GZMA基因表达变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
[0083] 图24显示(图24A)实施例2中所述按基线外周血KLRB1基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，并用安慰剂(黑色棒)、100mg/剂量etrolizumab(斑点棒)或300mg/剂量etrolizumab(条纹棒)治疗的未接受过TNF拮抗剂的患者，在第10周处于缓解、在第10周显示黏膜愈合或在第10周显示临床反应的比例(百分比)。(图24B)按外周血样品中的基线KLRB1基因表达(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层的来自开放标签扩展研究的TNF-IR患者，在继续用etrolizumab治疗后4-6周处于临床缓解(左侧)或显示临床反应(右侧)的百分比。(图24C)从II期etrolizumab试验中招募并鉴定为未接受过TNF拮抗剂(未接受过抗TNF)或TNF-IR(抗TNF失败)的患者获得的基线外周血样品中，相对于GAPDH表达的KLRB1基因表达，黑色实心圆：第10周时的非缓解者；空心圆：第10周时的缓解者，虚线表示中位数。(图24D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第71天显示外周血中KLRB1基因表达变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
[0084] 图25显示实施例2中所述高于中位数水平的外周血SLC8A3基因表达富集对etrolizumab治疗的反应性。(图25A)按外周血中的基线SLC8A3基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，并用安慰剂(黑色棒)、100mg/剂量etrolizumab(斑点棒)或300mg/剂量etrolizumab(条纹棒)治疗的未接受过TNF拮抗剂的患者，在第10周处于缓解、在第10周显示黏膜愈合或在第10周显示临床反应的比例(百分比)。(图25B)按外周血中的基线SLC8A3基因表达(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层的来自开放标签扩展研究的TNF-IR患者，在继续用etrolizumab治疗后4-6周处于临床缓解(左侧)或显示临床反应(右侧)的百分比。(图25C)II期etrolizumab试验中招募并鉴定为未接受过TNF拮抗剂(未接受过抗TNF)或TNF-IR(抗TNF失败)的患者中，相对于GAPDH表达的SLC8A3外周血基因表达，黑色实心圆：第10周时的非缓解者；空心圆：第10周时的缓解者，虚线表示中位数。(图25D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第71天显示外周血中SLC8A3基因表达变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
[0085] 图26显示实施例2中所述低于中位数水平的基线外周血TNFSF15表达富集对etrolizumab治疗的反应性。(图26A)按外周血中的基线TNFSF15基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，并用安慰剂(黑色棒)、100mg/剂量etrolizumab(斑点棒)或300mg/剂量etrolizumab(条纹棒)治疗的未接受过TNF拮抗剂的患者，在第10周处于缓解、在第10周显示黏膜愈合或在第10周显示临床反应的比例(百分比)。(图26B)按基线外周血TNFSF15基因表达(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层的来自开放标签扩展研究的TNF-IR患者，在继续用etrolizumab治疗后4-6周处于临床缓解(左侧)或显示临床反应(右侧)的百分比。(图26C)II期etrolizumab试验中招募并鉴定为未接受过TNF拮抗剂(未接受过抗TNF)或TNF-IR(抗TNF失败)的患者中，相对于GAPDH表达的TNFSF15外周血基因表达，黑色实心圆：第10周时的非缓解者；空心圆：第10周时的缓解者，虚线表示中位数。
(图26D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第71天显示外周血中TNFSF15基因表达变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
(图26D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第71天显示外周血中TNFSF15基因表达变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
[0086] 图27显示实施例2中所述低于中位数水平的基线外周血VNN2基因表达富集对etrolizumab治疗的反应性。(图27A)按外周血中的基线VNN2基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层，并用安慰剂(黑色棒)、100mg/剂量etrolizumab(斑点棒)或300mg/剂量etrolizumab(条纹棒)治疗的未接受过TNF拮抗剂的患者，在第10周处于缓解、在第10周显示黏膜愈合或在第10周显示临床反应的比例(百分比)。(图27B)按基线外周血VNN2基因表达(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层的来自开放标签扩展研究的TNF-IR患者，在继续用etrolizumab治疗后4-6周处于临床缓解(左侧)或显示临床反应(右侧)的百分比。(图27C)II期etrolizumab试验中招募并鉴定为未接受过TNF拮抗剂(未接受过抗TNF)或TNF-IR(抗TNF失败)的患者中，相对于GAPDH表达的外周血VNN2基因表达，黑色实心圆：第10周时的非缓解者；空心圆：第10周时的缓解者，虚线表示中位数。(图27D)安慰剂组中的未接受过TNF拮抗剂的患者(左图)和TNF-IR患者(右图)在基线、第43天和第
71天显示外周血中VNN2基因表达变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
71天显示外周血中VNN2基因表达变异性。每条线代表所测试的各时间点的单个患者。
[0087] 图28显示实施例2中所述来自未治疗的患者样本(群组1，由健康对照(HC)组成(n＝14))、溃疡性结肠炎患者(UC)(n＝30)和克隆病患者(CD)(n＝60)的组织活检样品中的基因表达水平。在此观察群组中，从健康对照和UC患者的乙状结肠、从健康对照和CD患者的升或降结肠和回肠采集未发炎的组织活检样品。在具有活性病灶性疾病和邻近未发炎区域的UC和CD患者中，采集成对的发炎和未发炎的活检组织。显示相对于GAPDH的ITGAE(图28A)、GZMA(图28B)、VNN2(图28C)、ECH1(图28D)、KLRB1(图28E)、SLC8A3(图28F)、TNFSF15(图28G)和FOXM1(图28H)基因表达。统计学差异未显示在这些图上。
[0088] 图29显示实施例2中所述来自未治疗的患者样本(群组2，由健康对照组成(n＝10))和进行了溃疡性结肠炎(UC)(n＝32)或克隆病(CD)(n＝32)切除术的患者的外周血中的基因表达水平。显示相对于GAPDH测量的ITGAE(图29A)、GZMA(图29B)、VNN2(图29C)、ECH1(图29D)、KLRB1(图29E)、SLC8A3(图29F)、TNFSF15(图29G)和FOXM1(图29H)基因表达。使用Mann Whitney检验，*＝p<0.05，**＝p<0.01，****＝p<0.0001。
[0089] 图30显示实施例2中所述etrolizumab II期研究中按生物标志分层的etrolizumab对肠隐窝上皮中整联蛋白αE阳性(αE+)细胞的影响。在招募入etrolizumab II期研究的患者中用etrolizumab或安慰剂治疗之前和之后计数与肠隐窝上皮结合的αE+细胞。用基线结肠活检组织qPCR中值作为临界值来将患者分类为粒酶Ahigh(GZMA)或αEhigh(在每种情况下，high是指处于或高于中位数)或粒酶Alow(GZMA)或αElow(在每种情况下，low是指低于中位数)。按基线结肠活检组织粒酶A(图30A)和αE(图30B)基因表达状态(分层)的肠隐窝上皮中αE+细胞的基线分布。按基线活检组织粒酶A(图30C)和αE基因(图30D)表达水平分层的etrolizumab(空心圆)或安慰剂(黑色实心三角)治疗之前和之后肠隐窝上皮中αE+细胞的变化。**p<0.01。Scr＝筛查。
[0090] 图31显示实施例2中所述UC患者中αE+T细胞中提高的粒酶A(GZMA)基因表达。(图31A)从来自未治疗的患者样本(群组3)的结肠活检组织分离T细胞，并通过CD4、CD8和整联蛋白αE的表面表达分选纯化。与分选纯化的来自UC患者的CD4+αE-T细胞和来自非IBD对照个体的CD4+αE+T细胞相比，来自UC患者的CD4+αE+T细胞具有提高的粒酶A基因表达。(图
31B)在来自UC患者的分选纯化的CD4+αE+T细胞但不是分选纯化的CD8+αE+T细胞中，粒酶A和整联蛋白αE的基因表达显著相关。(图31C)在etrolizumab II期研究中，粒酶A和αE的基线结肠组织基因表达显著相关。虚线表示qPCR中位数临界值。(图31D)在来自etrolizumab II期研究的基线结肠活检组织中，粒酶A的基因表达与上皮和固有层中αE+细胞的数目显著相关。(图31E)显示粒酶A和αE在来自未治疗的患者样本(群组3)中的UC患者的结肠组织活检样品中的共免疫荧光染色的代表性图像。*P<0.05，****P<0.0001。
31B)在来自UC患者的分选纯化的CD4+αE+T细胞但不是分选纯化的CD8+αE+T细胞中，粒酶A和整联蛋白αE的基因表达显著相关。(图31C)在etrolizumab II期研究中，粒酶A和αE的基线结肠组织基因表达显著相关。虚线表示qPCR中位数临界值。(图31D)在来自etrolizumab II期研究的基线结肠活检组织中，粒酶A的基因表达与上皮和固有层中αE+细胞的数目显著相关。(图31E)显示粒酶A和αE在来自未治疗的患者样本(群组3)中的UC患者的结肠组织活检样品中的共免疫荧光染色的代表性图像。*P<0.05，****P<0.0001。
[0091] 发明详述
[0092] 除非另有说明，本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。Singleton等,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第2版,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)和March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure第4版,John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)为本领域技术人员提供了本申请中所用的许多术语的一般指导。
[0093] 定义
[0094] 为了解释本说明书的目的，将适用以下定义，无论何时适当时，以单数形式使用的术语还将包括复数形式，反之亦然。在下文所示的任意定义与本文引入作为参考的任意文件冲突时，将以下文所示的定义为准。
[0095] 除非文中清楚地另有说明，本说明书和所附权利要求中所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。因此，例如提到“一个蛋白质”包括多个蛋白质；提到“一个细胞”包括细胞的混合物等。
[0096] 本说明书和所附权利要求中提供的范围包括两个终点及终点之间的所有点。因此，例如，2.0至3.0的范围包括2.0、3.0及2.0和3.0之间的所有点。
[0097] “治疗”及其语法变化形式指改变所治疗的个体或细胞的天然过程的尝试中的临床干预，且可以为了预防而进行或在临床病理的过程中进行。希望得到的疗效包括预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任意直接或间接的病理结果、降低疾病进展的速率、改善或缓和疾病状态及缓解或改善预后。
[0098] “治疗方案”指剂量、施用的频率、或治疗的持续时间、加入或不加入第二药物的组合。
[0099] “有效治疗方案”指将向接受该治疗的患者提供有益反应的治疗方案。
[0100] “改变治疗”指改变治疗方案，包括改变剂量、施用的频率、或治疗的持续时间、和/或加入第二药物。
[0101] 可以用显示对患者的益处的任意终点来评估“患者反应”或“患者反应性”，其非限制性地包括：(1)以某种程度抑制疾病进展，包括减慢和完全阻断；(2)疾病发作和/或症状的数目的减少；(3)损伤大小的减小；(4)抑制(即减少、减慢或完全阻止)疾病细胞浸润入邻近的外周器官和/或组织；(5)抑制(即减少、减慢或完全阻止)疾病传播；(6)自身免疫、免疫或炎症反应的减少，其可以但并非必须导致疾病损伤的消退或消融；(7)以某种程度减轻与该障碍相关的一种或多种症状；(8)治疗后无疾病呈现的长度增加；和/或(9)治疗后给点时间点的死亡率降低。术语“反应性”指可测量的反应，包括完全反应(CR)和部分反应(PR)。
[0102] “完全反应”或“CR”指炎症的所有病征响应治疗而消失或缓解。这并非总是指该疾病已治愈。
[0103] “部分反应”或“PR”指炎症的严重度响应治疗而降低至少50％。
[0104] 患者对整联蛋白β7拮抗剂治疗的“有益反应”和类似的用词指来自诸如抗整联蛋白β7抗体的拮抗剂治疗或由于诸如抗整联蛋白β7抗体的拮抗剂治疗而赋予处于胃肠炎性障碍风险或患有胃肠炎性障碍的患者的临床或治疗益处。这种益处包括来自或由于拮抗剂治疗的患者的细胞或生物学反应、完全反应、部分反应、稳定疾病(无进展或复发)或具有较晚的复发的反应。
[0105] 治疗过程中患者的反应性不随时间降低时，“患者保持对治疗的反应性”。
[0106] 本文所用的“无反应”或“缺乏反应”或类似用词指缺乏对抗整联蛋白β7拮抗剂治疗的完全反应、部分反应或有益反应。
[0107] 本文所用的术语“样品”或“测试样品”指获自或衍生自目的个体的组合物，其包含有待例如基于物理、生物化学、化学和/或生理学特征表征和/或鉴定的细胞实体和/或其他分子实体。例如，短语“疾病样品”及其变化形式指获自的目的个体的任意样品，预期或已知其包含待表征的细胞实体和/或分子实体。样品可以获自目的个体的组织或获自该个体的外周血。例如，该样品可以获自血液和生物来源的其他流体样品及组织样品，如活检组织样品或从其衍生的组织培养物或细胞。组织样品的来源可以是实体组织，如来自新鲜、冷冻和/或保藏的器官或组织样品、活检组织或吸出物；血液或任意血液组分；体液；来自个体妊娠或发育的任何时间的细胞；或血浆。术语“样品”或“测试样品”包括在其获得后以任意方式操作过的生物样品，如通过试剂处理、稳定化、或针对某些成分(如蛋白质或多核苷酸)富集、或包埋在用于切片目的的半固体或固体基质中。为了本文的目的，组织样品的“切片”意指组织样品的单个部分或片，例如，从组织样品切割的组织或细胞的薄片。样品包括但不限于全血、血液来源的细胞、血清、血浆、淋巴液、滑膜液、细胞提取物及其组合。
[0108] 本文所用的“参考样品”指用于比较目的的任意样品、标准或水平。在一个实施方案中，参考样品获自同一个体或患者的身体的健康和/或未患病的部分(例如，组织或细胞)。在另一实施方案中，参考样品获自同一个体或患者的身体的未处理的组织和/或细胞。还在另一实施方案中，参考样品获自不是该个体或患者的个体的身体的健康和/或未患病的部分(例如，组织或细胞)。甚至在另一实施方案中，参考样品获自不是该个体或患者的个体的未处理的组织和/或细胞部分。
[0109] “β7整联蛋白拮抗剂”或“β7拮抗剂”指抑制β7整联蛋白的一种或多种生物学活性或阻断β7整联蛋白与它的一种或多种结合分子的结合的任意分子。本发明的拮抗剂可以用来调节β7结合作用的一个或多个方面，包括但不限于与α4整联蛋白亚基的结合，与αE整联蛋白亚基的结合，α4β7整联蛋白与MAdCAM、VCAM-1或纤连蛋白的结合，及αEβ7整联蛋白与E-钙黏着蛋白的结合。这些作用可以通过任意生物学上相关的机制来调节，包括破坏配体与β7亚基或与α4β7或αEβ7二聚体整联蛋白的结合，和/或通过破坏α和β整联蛋白亚基之间的结合，使得二聚体整联蛋白的形成被抑制。在本发明的一个实施方案中，该β7拮抗剂是抗β7整联蛋白抗体(或抗β7抗体)。在一个实施方案中，该抗β7整联蛋白抗体是人源化抗β7整联蛋白抗体，更具体而言，重组人源化单克隆抗β7抗体，例如rhuMAbβ7，也称为etrolizumab。在一些实施方案中，本发明的抗β7抗体是抗整联蛋白β7拮抗抗体，其抑制或阻断β7亚基与α4整联蛋白亚基的结合，与αE整联蛋白亚基的结合，α4β7整联蛋白与MAdCAM、VCAM-1或纤连蛋白的结合，及αEβ7整联蛋白与E-钙黏着蛋白的结合。
[0110] “beta7亚基”或“β7亚基”意指人β7整联蛋白亚基(Erle等,(1991)J.Biol.Chem.266:11009-11016)。β7亚基与α4整联蛋白亚基(如人α4亚基)结合(Kilger和Holzmann(1995)J.Mol.Biol.73:347-354)。据报道，α4β7整联蛋白在大多数成熟淋巴细胞以及一小群胸腺细胞、骨髓细胞和肥大细胞上表达(Kilshaw和Murant(1991)
Eur.J.Immunol.21:2591-2597；Gurish等,(1992)149:1964-1972；及Shaw,S.K.和Brenner,M.B.(1995)Semin.Immunol.7:335)。β7亚基还与αE亚基(如人αE整联蛋白亚基)结合(Cepek,K.L等(1993)J.Immunol.150:3459)。αEβ7整联蛋白在肠内上皮淋巴细胞(iIEL)上表达(Cepek,K.L.(1993)上文)。
Eur.J.Immunol.21:2591-2597；Gurish等,(1992)149:1964-1972；及Shaw,S.K.和Brenner,M.B.(1995)Semin.Immunol.7:335)。β7亚基还与αE亚基(如人αE整联蛋白亚基)结合(Cepek,K.L等(1993)J.Immunol.150:3459)。αEβ7整联蛋白在肠内上皮淋巴细胞(iIEL)上表达(Cepek,K.L.(1993)上文)。
[0111] “alphaE亚基”或“alphaE整联蛋白亚基”或“αE亚基”或“αE整联蛋白亚基”或“CD103”意指与上皮内淋巴细胞上的β7整联蛋白结合的整联蛋白亚基，该αEβ7整联蛋白介导iEL与表达E-钙黏着蛋白的肠上皮的结合(Cepek,K.L.等(1993)J.Immunol.150:3459；Shaw,S.K.和Brenner,M.B.(1995)Semin.Immunol.7:335)。
[0112] “MAdCAM”或“MAdCAM-1”在本发明的背景中可互换使用，指蛋白质黏膜地址素细胞黏附分子-1，其是包含短的胞质尾、跨膜区和由三个免疫球蛋白样结构域组成的胞外序列的单链多肽。已克隆了鼠、人和食蟹猕猴MAdCAM-1的cDNA(Briskin等,(1993)Nature,363:461-464；Shyjan等,(1996)J.Immunol.156:2851-2857)。
[0113] “VCAM-1”或“血管细胞黏附分子-1”或“CD106”指表达在活化的内皮上且在内皮-淋巴细胞相互作用(如炎症过程中淋巴细胞的结合和变移)中重要的α4β7和α4β1的配体。
[0114] “CD45”指蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的蛋白质。已知PTP是调节包括细胞生长、分化、有丝分裂周期和致癌性转化的多种细胞过程的信号发放分子。此PTP包含胞外结构域、单跨膜区段和两个串联的胞质内催化结构域，因此隶属于受体型PTP。此基因在造血细胞中专一性表达。已显示此PTP是T细胞和B细胞抗原受体信号发放的必需调节物。它通过与抗原受体复合物的成分的直接相互作用或通过活化抗原受体信号发放所需的多种Src家族激酶来发挥作用。此PTP还抑制JAK激酶，因此作为细胞因子受体信号发放的调节物发挥作用。已报道了此基因的编码不同同种型的四种选择性剪接转录物变体(Tchilian EZ,Beverley PC(2002)."CD45in memory and disease."Arch.Immunol.Ther.Exp.(Warsz.)50(2):85-93；Ishikawa H,Tsuyama N,Abroun S等(2004)."Interleukin-6,CD45and the src-kinases in myeloma cell proliferation."Leuk.Lymphoma 44(9):1477-81)。
[0115] 存在多种同种型的CD45：CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RAB、CD45RAC、CD45RBC、CD45RO、CD45R(ABC)。CD45还高度糖基化。CD45R是最长的蛋白质，在从T细胞分离时按200kDa迁移。B细胞也表达具有更重的糖基化的CD45R，使分子量达到220kDa，因此称为B220；220kDa的B细胞同种型。B220表达不限于B细胞，还可以表达在活化的T细胞、一个亚群的树突细胞及其他抗原呈递细胞上。Stanton T,Boxall S,Bennett A等(2004)."
CD45variant alleles:possibly increased frequency of a novel exon
4CD45polymorphism in HIV seropositive Ugandans."Immunogenetics 56(2):107-10。
CD45variant alleles:possibly increased frequency of a novel exon
4CD45polymorphism in HIV seropositive Ugandans."Immunogenetics 56(2):107-10。
[0116] “肠归巢淋巴细胞”指具有选择性地向肠淋巴结和组织归巢但不向外周淋巴结和组织归巢的特征的淋巴细胞亚群。此亚群的淋巴细胞表征为多种细胞表面分子的组合的独特表达模式，该组合包括但不限于CD4、CD45RA和β7的组合。通常，可以根据标记CD45RA和β7进一步划分至少两个亚群的外周血CD4+淋巴细胞，CD45RA-β7high和CD45RA-β7low CD4+细胞。CD45RA-β7high CD4+细胞优先向肠淋巴结和组织归巢，而CD45RA-β7low CD4+细胞优先向外周淋巴结和组织归巢(Rott等1996；Rott等1997；Williams等1998；Rosé等1998；Williams和Butcher1997；Butcher等1999)。因此，肠归巢淋巴细胞是在流式细胞术测定中鉴定为CD45RA-β7high CD4+的不同亚群的淋巴细胞。鉴定此组淋巴细胞的方法为本领域已知。
[0117] 本文关于细胞表面标志所用的符号“+”表示细胞表面标志的阳性表达。例如，CD4+淋巴细胞是在其细胞表面表达CD4的一组淋巴细胞。
[0118] 本文关于细胞表面标志所用的符号“-”表示细胞表面标志的阴性表达。例如，CD45RA-淋巴细胞是未在其细胞表面表达CD45RA的一组淋巴细胞。
[0119] 生物标志的“量”或“水平”可以用本领域已知和本文中公开的方法(如流式细胞术分析或qPCR)测定。
[0120] “生物标志的量或水平的变化”是与该生物标志的参考/比较量相比。在某些实施方案中，作为参考或比较量的值的函数，该改变大于约10％、或大于约30％、或大于约50％、或大于约100％、或大于约300％。例如，参考或比较量可以是治疗之前生物标志的量，更具体而言，可以是基线或给药前的量。
[0121] 本文所用的短语“与…基本相同”表示改变程度不显著，使得本领域技术人员不会认为该改变具有统计显著性或在通过该值(例如，饱和药物靶受体所需的药物血清水平)测量的生物学特征的背景内是具有生物学意义的改变。例如，认为饱和受体所需的相互差异小于约2倍、或相互差异小于约3倍、或相互差异小于约4倍的血清药物浓度基本相同。
[0122] “胃肠炎性障碍”是引起黏膜中的炎症和/或溃疡的一组慢性障碍。这些障碍包括例如炎症性肠病(例如克隆病、溃疡性结肠炎、不确定性结肠炎和感染性结肠炎)、黏膜炎(例如口腔黏膜炎、胃肠黏膜炎、鼻黏膜炎和直肠炎)、坏死性小肠结肠炎和食管炎。
[0123] “炎症性肠病”或“IBD”在本文中可互换使用，指引起炎症和/或溃疡的肠病，且非限制性地包括克隆病和溃疡性结肠炎。
[0124] “克隆病(CD)”和“溃疡性结肠炎(UC)”是未知病因的慢性炎症性肠病。与溃疡性结肠炎不同，克隆病可以影响肠的任意部分。克隆病最突出的特征是肠壁的颗粒状、红紫色水肿增厚。随着炎症的发展，这些肉芽瘤常失去它们的限制边界，并与周围组织结为一体。腹泻和肠梗阻是主要的临床特征。与溃疡性结肠炎一样，克隆病的过程可以连续的或复发的，轻微的或严重的，但与溃疡性结肠炎不同，克隆病不可通过切除所累及的肠区段治愈。大多数克隆病患者需要在某个点手术，但随后的复发很常见，通常需要连续的医疗处理。
[0125] 虽然克隆病可以累及从口至肛门的消化道的任意部分，但它通常出现在回肠结肠、小肠或结肠-肛门直肠区域。在组织病理学上，该疾病表征为不连续的granulomatomas、隐窝脓肿、龟裂和口疮性溃疡。炎症性浸润物是混合的，由淋巴细胞(T和B细胞二者)、浆细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞组成。分泌IgM和IgG的浆细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞有不成比例的增加。
[0126] 抗炎药物柳氮磺吡啶和5-氨基水杨酸(5-ASA)用于治疗轻度活性的结肠克隆病，并常在维持疾病的缓解的尝试中使用。Metroidazole和环丙沙星的功效与柳氮磺吡啶相似，且尤其用于治疗肛周疾病。在更严重的病例中，用皮质类固醇可有效治疗活性恶化，且有时可以维持缓解。硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤也已用于需要长期施用皮质类固醇的患者。已提出这些药物可以在长期预防中发挥作用。不幸的是，在一些患者中发挥作用前，存在非常长的延迟(长达6个月)。抗腹泻药物也可以在一些患者中提供症状减轻。营养疗法或要素膳食可以改善患者的营养状态，并诱导急性疾病的症状改善，但是它不诱导持续的临床缓解。抗生素用于治疗继发性小肠细菌过度生长及治疗化脓性并发症。
[0127] “溃疡性结肠炎(UC)”伤害大肠。该疾病的过程可以是持续的或复发的，轻微的或严重的。最早的损伤是炎性浸润，在肠腺基部形成脓肿。这些膨胀和破裂的隐窝的合并倾向于将覆盖的黏膜与其血液供应分开，导致溃疡形成。该疾病的症状包括腹部绞痛、下腹痛、直肠出血及频繁的稀排泄物，其主要由具有极少的粪便颗粒的血液、脓和黏液组成。急性、严重或慢性的持续性溃疡性结肠炎可以需要全结肠切除术。
[0128] UC的临床特征高度可变，且发病可以是潜伏的或突然的，且可以包括腹泻、里急后重和复发性直肠出血。可能发生整个结肠的爆发性累及、中毒性巨结肠、危及生命的紧急状况。肠外表现包括关节炎、pyoderma gangrenoum、葡萄膜炎和结节性红斑。
[0129] UC的治疗包括用于轻微病例的柳氮磺吡啶和相关的含水杨酸的药物，用于严重病例的皮质类固醇药物。水杨酸类或者皮质类固醇的局部施用有时是有效的，尤其至在疾病局限于末端肠时，且与全身性使用相比与降低的副作用相关。有时指出需要支持性措施，如施用铁和抗腹泻剂。硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤和氨甲蝶呤有时也被建议用于顽固性皮质类固醇依赖性病例。
[0130] “有效剂量”指对在必要的剂量和时间内达到希望的治疗或预防结果的有效的量。
[0131] 本文所用的术语“患者”指希望得到治疗的任意单个个体。在某些实施方案中，本文中的患者是人。
[0132] 本文中的“个体”通常是人。在某些实施方案中，个体是非人哺乳动物。示例性非人哺乳动物包括实验动物、驯养动物、宠物动物、运动动物和家畜动物，例如小鼠、猫、狗、马和牛。通常，该个体符合治疗的条件，例如胃肠炎性障碍的治疗。
[0133] 术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广泛的含义可互换地使用，且包括单克隆抗体(例如，全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们显示希望的生物学活性)，且也可以包括某些抗体片段(如本文更详细地描述)。抗体可以是人、人源化和/或亲和力成熟的抗体。
[0134] “抗体片段”仅包含完整抗体的部分，其中该部分优选保留与该部分存在于完整抗体中时通常相关的功能的至少一种，优选多数或全部。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合部位，从而保持结合抗原的能力。在另一实施方案中，抗体片段(例如包含Fc区的抗体片段)保留通常与该Fc区存在于完整抗体中时相关的生物学功能的至少一种，如FcRn结合、抗体半寿期调节、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是单价抗体，其具有基本上类似于完整抗体的体内半衰期。例如，这种抗体片段可以包含与能够赋予该片段体内稳定性的Fc序列连接的抗原结合臂。
[0135] 本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即除了可以少量存在的可能的天然存在的突变外，包含该群体的单种抗体是相同的。单克隆抗体高度特异，针对单一抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。
[0136] 本文的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或隶属于特定抗体种类或亚类的抗体中对应的序列相同或同源，一条或多条链的其余部分与衍生自另一物种或隶属于另一抗体种类或亚类的抗体中对应的序列相同或同源，以及这类抗体的片段，只要它们显示希望的生物学活性(美国专利号4,816,567；及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
[0137] 非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有来自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中用来自非人物种(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)的具有希望的特异性、亲和力和能力的高变区(供体抗体)的残基取代来自受体的高变区的残基。在一些情况下，用对应的非人残基取代人免疫球蛋白的构架区(FR)残基。此外，人源化抗体可以包含不见于受体抗体或供体抗体中的残基。进行这些修饰来进一步改良抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，且全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还将可选地包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。进一步的细节参见Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见以下综述文章及其中引用的参考文献：Vaswani和Hamilton,
Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions
23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)。
Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions
23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)。
[0138] “人抗体”是包含对应于人产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列和/或用本文公开的制备人抗体的技术中的任一种制备的抗体。这类技术包括筛选人衍生的组合文库，如噬菌体展示文库(参见例如Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)及Hoogenboom等,Nucl.Acids Res.,19:4133-4137(1991))；用人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系来产生人单克隆抗体(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,55-93页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987；及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))；及在能够在缺乏内源免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的所有组成成分的转基因动物(例如小鼠)中产生单克隆抗体(参见例如Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,90:2551(1993)；Jakobovits等,
Nature,362:255(1993)；Bruggermann等,Year in Immunol.,7:33(1993))。人抗体的此定义特别排除包含来自非人动物的抗原结合残基的人源化抗体。
Nature,362:255(1993)；Bruggermann等,Year in Immunol.,7:33(1993))。人抗体的此定义特别排除包含来自非人动物的抗原结合残基的人源化抗体。
[0139] “分离的”抗体是已鉴定并从其天然环境的成分分离和/或回收的抗体。它的天然环境的污染成分是将干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，且可以包括酶、激素和其他蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方案中，将该抗体纯化至：(1)通过Lowry法测定抗体大于95wt％，且常超过99wt％；(2)足以通过使用旋杯式测序仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)考马斯蓝染色或银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE显示同质。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为将不存在该抗体的天然环境的至少一种成分。但是，通常将通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体。
[0140] 在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”指抗体可变结构域的在序列上高变和/或形成结构上确定的环的区域。通常，抗体包含六个高变区；三个在VH(H1、H2、H3)中，三个在VL(L1、L2、L3)中。许多高变区描述在用并为本文所涵盖。Kabat互补决定区(CDR)基于序列变异性是最常用(Kaba等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。而Chothia涉及结构环的定位(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM高变区代表Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并为Oxford Molecular的AbM抗体建模软件所使用。“接触”高变区基于可用的复杂晶体结构的分析。来自这些HVR的每一个的残基在下文指出。
[0141]
[0142]
[0143] 高变区可以包含如下的“延伸的高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或49-56或50-56或52-56(L2)和89-97(L3)及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-
102或95-102(H3)。对于这些定义的每一个，按Kabat等,上文编号可变结构域残基。
102或95-102(H3)。对于这些定义的每一个，按Kabat等,上文编号可变结构域残基。
[0144] “构架”或“FR”残基是除本文定义的高变区残基外的那些可变结构域残基。
[0145] “人共有构架”是代表人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选择中最常存在的氨基酸残基的构架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚型。通常，该序列亚型是如Kabat等中的亚型。在一个实施方案中，对于VL，该亚型是如Kabat等中的亚型κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚型是如Kabat等中的亚型III。
[0146] “亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个CDR中具有一个或多个改变的抗体，与不具有那些改变的亲本抗体相比，该改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。在某些实施方案中，亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。通过本领域已知的方法产生亲和力成熟的抗体。Marks等Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组进行亲和力成熟。Barbas等Proc Nat.Acad.Sci,USA91:3809-3813(1994)；Schier等Gene 169:147-155(1996)；Yelton等J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；和Hawkins等J.Mol.Biol.226:889-896(1992)描述了CDR和/或构架残基的随机诱变。
[0147] 本文所用的短语“基本上相似”或“基本上相同”表示两个数值(通常一个与本发明的抗体相关，另一个与参考/比较抗体相关)之间的相似性程度足够高，使得本领域技术人员将认为，在通过该值度量的生物学特征的背景中，这两个值之间的差异有很小的或者没有生物学和/或统计学显著性。
[0148] “结合亲和力”一般指分子(例如抗体)的单个结合部位与其结合配偶体(例如抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，本文所用的“结合亲和力”指内在的结合亲和力，其反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可通过解离常数(Kd)来代表。亲和力可以通过本领域公知的方法来测量，包括本文中描述的那些。低亲和力抗体一般缓慢地结合抗原并倾向于容易解离，而高亲和力抗体一般更快地结合抗原并倾向于保持更长久的结合。多种测量结合亲和力的方法为本领域已知，其中的任一种都可以用于本发明的目的。
[0149] 与抗体或免疫球蛋白相关的术语“可变的”指这样的事实，在抗体之间，可变结构域的某些部分的序列差别很大，且用于每种具体抗体对其具体抗原的结合和特异性。但是，可变性并非均勻分布在抗体的整个可变结构域中。它集中在轻链和重链可变结构域中称为高变区的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR，四个FR主要采用β-折叠构型，通过三个高变区连接，该高变区形成连接β-折叠结构的环，且在一些情况下形成β-折叠结构的部分。各条链中的高变区通过FR近距离保持在一起，并与来自其他链的高变区一起促成抗体的抗原结合部位的形成(参见Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但显示多种效应子功能，如抗体在抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)中的参与。
[0150] 抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单个抗原结合部位和残留的“Fc”片段，其名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合部位且仍然能够交联抗原。
[0151] “Fv”是包含完整的抗原识别和抗原结合部位的最小抗体片段。此区域由紧密非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。各可变结构域的三个高变区正是在此构型中相互作用来定义VH-VL二聚体表面上的抗原结合部位。六个高变区共同赋予抗体抗原结合特异性。但是，甚至单个可变结构域(或Fv的一半，其仅包含三个对抗原特异的高变区)也具有识别和结合抗原的能力，虽然亲和力低于整个结合部位。
[0152] Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同在于，在重链CH1结构域的羧基端加入了几个残基，其包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab’-SH是本文对其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基具有至少一个自由巯基的Fab’的命名。F(ab’)2抗体片段最初作为其间具有铰合部半胱氨酸的Fab’片段对产生。还已知抗体片段的其他化学偶联。
[0153] 根据其恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任意脊椎动物物种的抗体的“轻链”分配至称为κ和λ的两个明显不同的类型之一。
[0154] 取决于其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体(免疫球蛋白)分配至不同种类。存在五个主要种类的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几个可以进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型众所周知，且通常描述于例如Abbas等Cellular and Mol.Immunology,第4版(W.B.Saunders,Co.,2000)中。抗体可以是通过该抗体与一种或多种其他蛋白质或多肽的共价或非共价结合形成的更大的融合分子的一部分。
[0155] 术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指处于其基本上完整的形式的抗体，不是下文定义的抗体片段。这些术语尤其指具有含Fc区的重链的抗体。
[0156] 为了本文的目的，“裸抗体”是不与细胞毒性部分或放射性标记缀合的抗体。
[0157] 本文所的术语“Fc区”用来定义免疫球蛋白重链的C-端区域，包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可变，但是人IgG重链Fc区通常定义为从Cys226或从Pro230位的氨基酸残基延伸至其羧基端。Fc区的C-端赖氨酸(EU编号系统的残基447)可以例如在抗体的产生或纯化期间去除，或者通过重组改造编码抗体的重链的核酸来去除。因此，完整抗体的组合物可以包含去除了所有K447残基的抗体群体、没有去除K447残基的抗体群体及具有含和不含K447残基的抗体的混合物的抗体群体。
[0158] 除非另有说明，在本文中，免疫球蛋白重链中的残基的编号是Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中的EU指数的编号，其在此明确引入作为参考。“Kabat中的EU指数”指人IgGl EU抗体的残基编号。
[0159] “功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括C1q结合、依赖补体的细胞毒性、Fc受体结合、依赖抗体的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。此类效应子功能一般需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合，且可以例如用本文中公开的多种测定来评估。
[0160] “天然序列Fc区”包含与见于自然界中的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；天然序列人IgG4Fc区；及其天然存在的变体。
[0161] “变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列的氨基酸序列。在某些实施方案中，与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸取代，例如从约一个至约十个氨基酸取代，且在某些实施方案中从约一个至约五个氨基酸取代。在某些实施方案中，本文的变体Fc区将与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性，或与之具有至少约90％同源性，或与之具有至少约95％同源性。
[0162] 取决于其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将完整抗体分配至不同“种类”。存在五个主要种类的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几个可以进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同种类的抗体的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型众所周知。
[0163] “依赖抗体的细胞毒性”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞的裂解。用于介导ADCC的主要细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的464页上的表3中。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，如描述于美国专利号5,500,362或5,821,337中的体外ADCC测定。用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或此外，可以在体内，例如在诸如公开于Clynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)中的动物模型的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。
[0164] “人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。在某些实施方案中，该细胞至少表达FcγRIII，并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和中性粒细胞。可以从其天然来源，例如从本文所述的血液或PBMC分离效应细胞。
[0165] 术语“Fc受体”或“FcR”用来描述与抗体的Fc区结合的受体。在某些实施方案中，FcR是天然序列人FcR。此外，FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有相似的氨基酸序列，主要在其胞质结构域中不同。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见 Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)中的综述)。FcR综述于
Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等,Immunomethods 4:25-34(1994)；及de Haas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中。本文的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括有待将来鉴定的那些。该术语还包括负责将母体IgG转移至胎儿FcRn(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))并调节免疫球蛋白的稳态的新生儿受体。WO00/42072(Presta,L.)和US2005/0014934A1(Hinton等)中描述了对新生儿Fc受体(FcRn)具有改进的结合和延长的半衰期的抗体。这些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，该取代改善了Fc区与FcRn的结合。例如，Fc区可以在位置238、250、256、265、
272、286、303、305、307、311、312、314、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、
428或434(残基的Eu编号)的一个或多个上具有取代。在某些实施方案中，具有改善的FcRn结合的包含Fc区的抗体变体在其Fc区的位置307、380和434(残基的Eu编号)的一个、两个或三个上包含氨基酸取代。
Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等,Immunomethods 4:25-34(1994)；及de Haas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中。本文的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括有待将来鉴定的那些。该术语还包括负责将母体IgG转移至胎儿FcRn(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))并调节免疫球蛋白的稳态的新生儿受体。WO00/42072(Presta,L.)和US2005/0014934A1(Hinton等)中描述了对新生儿Fc受体(FcRn)具有改进的结合和延长的半衰期的抗体。这些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，该取代改善了Fc区与FcRn的结合。例如，Fc区可以在位置238、250、256、265、
272、286、303、305、307、311、312、314、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、
428或434(残基的Eu编号)的一个或多个上具有取代。在某些实施方案中，具有改善的FcRn结合的包含Fc区的抗体变体在其Fc区的位置307、380和434(残基的Eu编号)的一个、两个或三个上包含氨基酸取代。
[0166] “单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。在某些实施方案中，Fv多肽进一步在VH和VL结构域之间包含多肽接头，该多肽接头使得scFv能够形成希望的结构用于抗原结合。scFv的综述参见Plückthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,纽约,269-315页(1994)。HER2抗体scFv片段公开于WO93/16185、美国专利号5,571,
894和美国专利号5,587,458中。
894和美国专利号5,587,458中。
[0167] 术语“双抗体”指具有两个抗原结合部位的小的抗体片段，该片段包含在同一条多肽链中与可变轻链结构域(VL)连接的可变重链结构域(VH)(VH-VL)。通过使用太短而不允许同一条链上的两个结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一条链上的互补结构域配对，并产生两个抗原结合部位。双抗体更充分地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中。
[0168] “亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个高变区中具有一个或多个改变的抗体，与不具有那些改变的亲本抗体相比，该改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。在某些实施方案中，亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。通过本领域已知的方法产生亲和力成熟的抗体。Marks等Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组进行亲和力成熟。Barbas等Proc Nat.Acad.Sci,USA91:3809-3813(1994)；Schier等Gene 169:147-155(1995)；Yelton等J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；和Hawkins等,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)描述了CDR和/或构架残基的随机诱变。
[0169] 本文的“氨基酸序列变体”抗体是具有不同于主要种类抗体的氨基酸序列的抗体。在某些实施方案中，氨基酸序列变体将与主要种类抗体具有至少约70％同源性，或者它们将与主要种类抗体具有至少约80％或至少约90％同源性。氨基酸序列变体在主要种类抗体的氨基酸序列内部或相邻的某些位置上具有取代、缺失和/或添加。本文的氨基酸序列变体的实例包括酸性变体(如脱酰胺化的抗体变体)、碱性变体、在其一条或两条轻链上具有氨基端前导序列延伸(例如VHS-)的抗体、在其一条或两条重链上具有C-端赖氨酸残基的抗体等，且包括重链和/或轻链的氨基酸序列的变异的组合。本文的尤其重要的抗体变体是这样的抗体，相对于主要种类抗体，其在其一条或两条轻链上包含氨基端前导序列延伸，可选地进一步包含其他氨基酸序列和/或糖基化差异。
[0170] 本文的“糖基化变体”抗体是具有附着于该抗体的一个或多个糖类部分的抗体，该糖类部分不同于附着于主要种类抗体的一个或多个糖类部分。本文的糖基化变体的实例包括具有附着于其Fc区的Gl或G2寡糖结构而不是G0寡糖结构的抗体、具有附着于其一条或两条轻链的一个或两个糖类部分的抗体、没有附着于该抗体的一条或两条重链的糖类的抗体等，以及糖基化改变的组合。在抗体具有Fc区时，寡糖结构可以例如在残基299(298，残基的Eu编号)处附着于该抗体的一条或两条重链。
[0171] 本文所用的术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞的功能和/或导致细胞的破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂和毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体。
[0172] 术语“细胞因子”是由一个细胞群体释放的作为胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通用术语。这类细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘促乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；缪勒氏管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；及其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。本文所用的术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等同物。
[0173] 本文针对辅助疗法所用的术语“免疫抑制剂”指发挥作用来抑制或掩蔽本文所治疗的受试者的免疫系统的物质。这将包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自身抗原表达或掩蔽MHC抗原的物质。这类物质的实例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(参见美国专利号4,665,077)；非类固醇抗炎药(NSAID)；更昔洛韦；他克莫司；糖皮质激素，如皮质醇或醛固酮；抗炎剂，如环加氧酶抑制剂；5-脂加氧酶抑制剂；或白三烯受体拮抗剂；嘌呤拮抗剂，如硫唑嘌呤或麦考酚酸酯(MMF)；烷化剂，如环磷酰胺；溴隐亭；达那唑；氨苯砜；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如美国专利号4,120,649中所述)；MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素；6-巯基嘌呤；类固醇，如皮质类固醇或糖皮质激素或糖皮质激素类似物，例如泼尼松、甲泼尼龙，包括S0LU-MEDR0L.RTM、琥珀酸钠甲基强的松龙和地塞米松；二氢叶酸还原酶抑制剂，如氨甲蝶呤(口服或皮下)；抗疟疾剂，如氯喹和羟氯喹；柳氮磺吡啶；来氟米特；细胞因子或细胞因子受体抗体或拮抗剂，包括抗干扰素-α、-β或-γ抗体，抗肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体(英夫单抗(REMICADE.RTM.)或阿达木单抗)，抗TNF-α免疫黏附素(依那西普)、抗TNF-β抗体、抗白介素-2(IL-2)抗体和抗IL-2受体抗体，及抗白介素-6(IL-6)受体抗体和拮抗剂；
抗LFA-1抗体，包括抗CDlla和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；泛-T抗体，抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合结构域的可溶性肽(W0 90/08187，1990年7月26日公开)；链激酶；转化生长因子-β(TGF-β)；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；
苯丁酸氮芥；脱氧精胍菌素；雷帕霉素；T-细胞受体(Cohen等，美国专利号5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等,Science,251:430-432(1991)；WO 90/11294；Ianeway,Nature,341:
482(1989)；和WO 91/01133)；BAFF拮抗剂，如BAFF或BR3抗体或免疫粘附素和zTNF4拮抗剂(综述参见Mackay和Mackay,Trends Immunol.,23:113-5(2002)，也参见下文的定义)；干扰T细胞辅助信号的生物制剂，如抗CD40受体或抗CD40配体(CD154)，包括CD40-CD40配体的封闭抗体(例如Durie等,Science,261:1328-30(1993)；Mohan等,J.Immunol.,154:1470-80(1995))和CTLA4-Ig(Finck等,Science,265:1225-7(1994))；及T-细胞受体抗体(EP 340,
109)，如T10B9。
抗LFA-1抗体，包括抗CDlla和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；泛-T抗体，抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合结构域的可溶性肽(W0 90/08187，1990年7月26日公开)；链激酶；转化生长因子-β(TGF-β)；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；
苯丁酸氮芥；脱氧精胍菌素；雷帕霉素；T-细胞受体(Cohen等，美国专利号5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等,Science,251:430-432(1991)；WO 90/11294；Ianeway,Nature,341:
482(1989)；和WO 91/01133)；BAFF拮抗剂，如BAFF或BR3抗体或免疫粘附素和zTNF4拮抗剂(综述参见Mackay和Mackay,Trends Immunol.,23:113-5(2002)，也参见下文的定义)；干扰T细胞辅助信号的生物制剂，如抗CD40受体或抗CD40配体(CD154)，包括CD40-CD40配体的封闭抗体(例如Durie等,Science,261:1328-30(1993)；Mohan等,J.Immunol.,154:1470-80(1995))和CTLA4-Ig(Finck等,Science,265:1225-7(1994))；及T-细胞受体抗体(EP 340,
109)，如T10B9。
[0174] 本文所用的术语“改善”指病症、疾病、障碍或表型(包括异常或症状)的减少、降低或消除。
[0175] 疾病或障碍(例如炎症性肠病，例如溃疡性结肠炎或克隆病)的“症状”是个体经历并指示疾病的任意病态现象或结构、功能或感觉偏离正常。
[0176] 表述“治疗有效量”指对预防、改善或治疗疾病或障碍(例如炎症性肠病，例如溃疡性结肠炎或克隆病)有效的量。例如，抗体的“治疗有效量”指对预防、改善或治疗指定的疾病或障碍有效的抗体的量。类似地，抗体和第二化合物的组合的“治疗有效量”指组合起来对预防、改善或治疗指定的疾病或障碍有效的抗体的量和第二化合物的量。
[0177] 应理解，术语两种化合物的“组合”不意味着该化合物必须在相互的混合物中施用。因此，这种组合的治疗或用途涵盖化合物的混合物或化合物的分开施用，且包括在同一天或不同天施用。因此，术语“组合”意指将两种或多种化合物单独或在相互的混合物中用于治疗。在例如对个体组合施用抗体和第二化合物时，无论该抗体和第二化合物是单独对个体施用还是在混合物中对个体施用，在该第二化合物存在于该个体中时，该抗体也存在于该个体中。在某些实施方案中，在该抗体之后施用抗体以外的化合物。
[0178] 为了本文的目的，“肿瘤坏死因子-α(TNF-α)”指包含Pennica等,Nature,312:721(1984)或Aggarwal等,JBC,260:2345(1985)中所述的氨基酸序列的人TNF-α分子。
[0179] 术语“TNF-α抑制剂”在本文中可与“抗TNF-α治疗剂”互换使用，指一般通过与TNF-α结合并中和其活性来以某种程度抑制TNF-α的生物学功能的物质。本文特别考虑的TNF抑制剂的实例是依那西普 英夫单抗 阿达木单抗戈利木单抗(SIMPONITM)和赛妥珠单抗
[0180] “皮质类固醇”指模拟或扩大天然存在的皮质类固醇的作用的具有类固醇的一般化学结构的几种合成或天然存在的物质中的任意一种。合成的皮质类固醇的实例包括强的松、强的松龙(包括甲基强的松龙)、地塞米松、曲安西龙和倍他米松。
[0181] “拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、废止、降低或干扰具体的或指定的蛋白质的活性(包括其在配体的情况下与一种或多种受体的结合，或在受体的情况下与一种或多种配体的结合)的分子。拮抗剂包括抗体及其抗原结合片段、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、拟肽、药物制剂及其代谢物、转录和翻译控制序列等。拮抗剂还包括蛋白质的小分子抑制剂、融合蛋白质、与蛋白质特异性结合从而螯合其与它的靶标的结合的受体分子和衍生物、蛋白质的拮抗变体、针对蛋白质的反义分子、RNA适体和抗蛋白质的核酶。
[0182] “自注射器械”指用于例如由患者或家庭护理人员自我施用治疗剂的医疗器械。自注射器械包括自动注射器械及设计用于自我施用的其他器械。
[0183] 文所用的“寡核苷酸”指短的单链多核苷酸，其长度为至少约7个核苷酸，且长度小于约250个核苷酸。寡核苷酸可以是合成的。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并非相互排斥。上文针对多核苷酸的描述同等地和完全地适用于寡核苷酸。
[0184] 术语“引物”指单链多核苷酸，其能够与核酸杂交，且通常通过提供游离3’-OH基团来允许聚合互补核酸。
[0185] 术语“扩增”指产生参考核酸序列或其互补序列的一个或多个拷贝的方法。扩增可以是线性的或指数的(例如PCR)。“拷贝”并非必然指相对于模板序列完美的序列互补性或同一性。例如，拷贝可以包含核苷酸类似物(如脱氧肌苷)、内部序列改变(如通过包含可杂交至模板但并非完全互补的序列的引物引入的序列改变)和/或扩增过程中出现的序列错误。
[0186] 术语“检测”包括任意检测手段，包括直接检测和间接检测。
[0187] “提高的表达”或“提高的水平”是指，相对于对照或参考水平(如不患有自身免疫病(例如IBD)的个体)，或相对于预先确定的阈值或截止值，或相对于患者和/或个体的群体的中位数，患者中mRNA或蛋白质的表达增加。
[0188] “低表达”或“低表达水平”或“降低的表达”是指，相对于对照或参考水平(如不患有自身免疫病(例如IBD)的个体)，或相对于预先确定的阈值或截止值，或相对于患者和/或个体的群体的中位数，患者中mRNA或蛋白质的表达减少。
[0189] 术语“多重PCR”指为了在单个反应中扩增两种或多种DNA序列的目的而用一个以上引物组对获自单个来源(例如患者)的核酸进行的单个PCR反应。
[0190] 本文所用的术语“生物标志”指患者表型(例如病理学状态或对治疗剂的可能的反应性)的指示物，其可以在该患者的生物样品中检测到。生物标志包括但不限于DNA、RNA、蛋白质、糖类或基于糖脂的分子标志。
[0191] 本文用术语“诊断”来指分子或病理学状态、疾病或病症的鉴定或分类。例如，“诊断”可以指，通过所累及的组织/器官(例如，炎症性肠病)，或通过其他特征(例如，表征为对治疗(如整联蛋白β7拮抗剂治疗)的反应性的患者亚群)，或通过分子特征(例如，表征为特定基因或该基因所编码的蛋白质之一或其组合的表达的亚型)，鉴定胃肠炎性障碍的具体类型，或分类胃肠炎性障碍的具体亚型。
[0192] 本文用术语“辅助诊断”来指辅助就症状或病症的具体类型的存在或性质作出临床决定的方法。例如，辅助诊断IBD的方法可以包括测量某些基因在来自个体的生物样品中的表达。
[0193] 本文用术语“预后”来指胃肠炎性障碍的疾病症状(包括例如复发、发作和药物抗性)的可能性的预测。
[0194] 本文用术语“预测”来指患者有利地或不利地响应药物(治疗剂)或药物组或治疗方案的可能性。在一个实施方案中，预测涉及那些响应的程度。在一个实施方案中，预测涉及患者在治疗(例如具体治疗剂治疗)后存活或改善与否和/或存活或改善的概率，或在某个时期内无疾病复发。本发明的预测方法可以通过为任何具体患者选择最适当的治疗方式来在临床上用于作出治疗决定。在预测患者是否可能有利地响应治疗方案(如给定的治疗方案，包括例如施用给定的治疗剂或组合、手术干预、类固醇治疗等)或患者是否可能在治疗方案后长期存活或缓解或持续缓解中，本发明的预测方法是有价值的工具。
[0195] “对照个体”指尚未诊断为患有具体疾病(例如IBD)且未受与该疾病相关的任意病征或症状折磨的健康个体。
[0196] “相关”或“相关的”意指以任意方式将第一分析或流程的表现和/或结果与第二分析或流程的表现和/或结果相比较。例如，可以用第一分析或流程的结果来进行第二流程，和/或可以用第一分析或流程的结果来确定是否应进行第二分析或流程。就基因表达分析或流程的实施方案而言，可以用基因表达分析或流程的结果来确定是否应进行特定治疗方案。
[0197] 本文所用的术语“比较”指将来自个体或患者的样品中生物标志的水平与本描述中其他地方指定的生物标志的参考水平相比较。应理解，本文所用的比较通常指相应参数或值的比较，例如，将绝对量与绝对参考量相比较，而将浓度与参考浓度相比较，或将从样品中的生物标志获得的强度信号与从参考样品获得的相同类型的强度信号相比较。该比较可以手动进行或计算机辅助进行。因此，该比较可以通过计算装置(例如，本文公开的系统的计算装置)进行。在来自个体或患者的样品中测量到或检测到的生物标志水平和参考水平的值可以例如相互比较，且该比较可以由执行比较算法的计算机程序自动进行。进行该评价的计算机程序将以适宜的输出格式提供希望得到的评估。对于计算机辅助比较，可以通过计算机程序将测定量的值与存储在数据库中的对应于适宜的参考的值相比较。计算机程序可以进一步评价比较的结果，即以适宜的输出格式自动提供希望得到的评估。对于计算机辅助比较，可以通过计算机程序将测定量的值与存储在数据库中的对应于适宜的参考的值相比较。计算机程序可以进一步评价比较的结果，即以适宜的输出格式自动提供希望得到的评估。
[0198] 本文所用的短语“推荐治疗”是指，使用所产生的涉及GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4L1.2、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2、SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2、VNN3mRNA中的一种或多种在患者样品中的水平或存在，并可选地进一步涉及ITGAE mRNA的水平或存在的信息或数据，鉴定适于用该疗法治疗或不适于用该疗法治疗的患者。在一些实施方案中，该疗法包括整联蛋白β7拮抗剂，包括抗整联蛋白β7抗体，如etrolizumab。在一些实施方案中，短语“推荐治疗/疗法”包括鉴定需要适应所施用的有效量的整联蛋白β7拮抗剂的患者。在一些实施方案中，推荐治疗包括推荐适应所施用的整联蛋白β7拮抗剂的量。本文所用的短语“推荐治疗”还可以指，用所产生的信息或数据来为鉴定或选择为或多或少有可能响应包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法的患者提出或选择包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法。所使用或产生的信息或数据可以是任意形式，书面、口头或电子形式。在一些实施方案中，使用所产生的信息或数据包括沟通、展示、报告、存储、发送、转移、提供、传递、分配或其组合。在一些实施方案中，通过计算装置、分析仪单元或其组合来进行沟通、展示、报告、存储、发送、转移、提供、传递、分配或其组合。在一些其他实施方案中，由实验室或医学专业人员进行沟通、展示、报告、存储、发送、转移、提供、传递、分配或其组合。在一些实施方案中，该信息或数据包括将GZMA、KLRB1、FOXM1、CCDC90A、CCL4L1.2、CPA2、CXCR6、DDO、ECH1、FAM125B、FASLG、FGF9、GPR15、GZMB、KCNMA1、PHF14、TIFAB、TMEM200A、TMIGD2、SLC8A3、TNFSF15、BEST2、CCL2、CCL3、CCL3L1/3、CPA3、FGF7、HAMP、IL1A、IL18RAP、INHBA、LIF、LMO4、LRRC4、MLK7.AS1、MT1M、MUCL1、MX1、PMCH、REM2、SSTR2、TM4SF4、TMEM154、UROS、VNN2、VNN3mRNA中的一种或多种及可选地进一步包括ITGAE mRNA的水平与参考水平相比较。在一些实施方案中，该信息或数据包括指示所鉴定的mRNA中的一种或多种以提高或降低的水平存在于样品中。在一些实施方案中，该信息或数据包括指示该患者适于用该疗法治疗或不适于用该疗法治疗，该疗法包含整联蛋白β7拮抗剂，包括抗整联蛋白β7抗体，如etrolizumab。
[0199] “包装说明书”指通常包含在治疗性产品或药物的商业包装中的说明书，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症、待与所包装的产品组合的其他治疗性产品的信息，和/或有关这类治疗性产品或药物的用途的警告等。
[0200] “试剂盒”是包含至少一种用于治疗IBD(例如UC或克隆病)的试剂(例如药物)或用于特异性检测本发明的生物标志基因或蛋白质的探针的制成品(例如，包装或容器)。在某些实施方案中，该制成品作为用于进行本发明的方法的单位推销、分销或销售。
[0201] “目标受众”是通过销售或广告，尤其是针对具体用途、治疗或适应症，向其推销或旨在向其推销具体药物的人群或机构，如个体患者，患者群体，报纸、医学文献和杂志读者，电视或互联网观众，广播或互联网听众，医生，药物公司等。
[0202] 术语“血清样品”指从个体获得的任何血清样品。用于从哺乳动物获得血清的方法为本领域公知。
[0203] 术语“全血”指从个体获得的任何全血样品。通常，全血包含所有血液成分，例如细胞成分和血浆。用于从哺乳动物获得全血的方法为本领域公知。
[0204] 在涉及个体或患者对之前对他们施用的一种或多种药物(治疗剂)的反应时，表述“对…无反应”、“无反应”及其语法变形描述这样的个体或患者，在施用这种(类)药物时，他们未显示所治疗的障碍的任何或充分的治疗迹象，或者他们对该一种或多种药物显示临床上不可接受的高毒性程度，或者他们在首次施用这种(类)药物后未保持治疗迹象，此背景中所用的词语治疗如本文中所定义。短语“无反应”包括对之前施用的一种或多种药物耐药和/或之前施用的一种或多种药物难治的那些个体的描述，且包括其中个体或患者在接受对他或她施用的一种或多种药物的同时发生进展，及其中个体或患者在完成涉及他或她不再响应的一种或多种药物的方案后12个月内(例如，6个月内)发生进展的情况。对一种或多种药物无反应性因此包括在之前或目前用该一种或多种药物治疗后仍具有活性疾病的个体。例如，患者可以在用他们对其无反应的一种或多种药物治疗约1至3个月、或3至6个月、或6至12个月后具有活性疾病活动。这种反应性可以由熟练治疗所讨论的障碍的临床医生评估。
[0205] 为了对一种或多种药物无反应的目的，从之前或目前的一种或多种药物治疗出现“临床上不可接受的高毒性水平”的个体出现一种或多种与之相关的、有经验的临床医生认为显著的负面副作用或不良事件，例如，严重感染，充血性心力衰竭，脱髓鞘(导致多发性硬化)，显著超敏反应，神经病理学事件，高度自身免疫，癌症，如子宫内膜癌、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌或黑素瘤，结核病(TB)等。
[0206] 与对患有某些疾病或障碍的患者的提高的临床益处或对具体治疗剂或治疗方案的反应的预测相关的生物标志的“量”或“水平”是生物样品中可检测到的水平。这些可以通过本领域技术人员已知以及本文中公开的方法来测量。所评估的生物标志的表达水平或量可以用于确定对治疗或治疗剂的反应或预测的反应。
[0207] 术语“表达的水平”或“表达水平”一般可互换使用，通常指生物样品中多核苷酸或氨基酸产物或蛋白质的量。“表达”通常指基因编码的信息转化为在细胞中存在和运转的结构的过程。因此，本文所用的基因的“表达”指转录为多核苷酸、翻译为蛋白质、或甚至蛋白质的翻译后修饰。转录的多核苷酸、翻译的蛋白质或翻译后修饰的蛋白质的片段也视为表达的，无论它们是源自通过选择性剪接产生的转录物或降解的转录物，还是源自蛋白质的翻译后加工(例如，通过蛋白水解)。“表达的基因”包括转录为多核苷酸(如mRNA)然后翻译为蛋白质的那些，以及转录为RNA但不翻译为蛋白质的那些(例如，转运RNA和核糖体RNA)。
[0208] 本文定义或以其他方式表征多种其他术语。
[0209] 组合物和方法
[0210] A.β7整联蛋白拮抗剂
[0211] 提供通过施用β7整联蛋白拮抗剂来在个体(例如人)中治疗胃肠炎性障碍的方法。潜在的拮抗剂的实例包括结合免疫球蛋白与β7整联蛋白的融合物的寡核苷酸，尤其是抗体，其非限制性地包括多克隆和单克隆抗体和抗体片段、单链抗体、抗独特型抗体和这类抗体或片段的嵌合或人源化形式，以及人抗体和抗体片段。备选地，潜在的拮抗剂可以是密切相关的蛋白质，例如，β7整联蛋白的突变形式，其识别该配体但不赋予效应，从而竞争性抑制β7整联蛋白的作用。
[0212] 另一潜在的β7整联蛋白拮抗剂是用反义技术制备的反义RNA或DNA构建体，其中例如反义RNA或DNA分子通过与所靶向的mRNA杂交而发挥作用来直接阻断mRNA的翻译，并阻止蛋白质翻译。反义技术可以用于通过三螺旋形成或反义DNA或RNA来控制基因表达，这两种方法都基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，编码本文的β7整联蛋白的多核苷酸序列的5’编码部分用于设计长度为约10到40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸设计为与涉及转录的基因的区域互补(三螺旋——参见Lee等,Nucl.Acids Res.,6:3073(1979)；
Cooney等,Science,241:456(1988)；Dervan等,Science,251:1360(1991))，从而阻止转录和β7整联蛋白的产生。反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交并阻断mRNA分子翻译为β7整联蛋白蛋白质(反义——Okano,Neurochem.,56:560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(CRC Press:Boca Raton,Fla.,1988))。上述寡核苷酸也可以递送至细胞，使得可以在体内表达反义RNA或DNA来抑制PRO多肽的产生。在使用反义DNA时，衍生自翻译起始位点，例如靶基因核苷酸序列的约-10和+10位置之间的寡脱氧核糖核苷酸是典型的。
Cooney等,Science,241:456(1988)；Dervan等,Science,251:1360(1991))，从而阻止转录和β7整联蛋白的产生。反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交并阻断mRNA分子翻译为β7整联蛋白蛋白质(反义——Okano,Neurochem.,56:560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(CRC Press:Boca Raton,Fla.,1988))。上述寡核苷酸也可以递送至细胞，使得可以在体内表达反义RNA或DNA来抑制PRO多肽的产生。在使用反义DNA时，衍生自翻译起始位点，例如靶基因核苷酸序列的约-10和+10位置之间的寡脱氧核糖核苷酸是典型的。
[0213] 其他潜在的拮抗剂包括结合活性位点、配体或结合分子结合位点，从而阻断β7整联蛋白的正常生物学活性的小分子。小分子的实例包括但不限于小肽或肽样分子，通常为可溶性肽，及合成的非肽酰有机或无机化合物。
[0214] 核酶是能够催化RNA的特异性切割的酶促RNA分子。核酶通过与互补靶RNA序列特异性杂交，接着进行内切核苷酸水解切割而发挥作用。可以通过已知的技术来鉴定潜在的RNA靶标内特定的核酶切割位点。进一步的细节参见例如Rossi,Current Biology,4:469-471(1994)和PCT公开号WO 97/33551(1997年9月18日公开)。
[0215] 用于抑制转录的三螺旋形成中的核酸分子应是单链，且由脱氧核苷酸组成。这样设计这些寡核苷酸的碱基组成，使得它通过Hoogsteen碱基配对规则促进三螺旋形成，其一般需要在双螺旋的一条链上相当大的嘌呤或嘧啶序列。进一步的细节参见例如PCT公开号WO 97/33551。这些小分子可以通过上文讨论的筛选测定中的任意一种或多种和/或通过本领域技术人员公知的任意其他筛选技术来鉴定。
[0216] 设计拮抗剂的筛选测定来鉴定与本文鉴定的基因编码的β7整联蛋白结合或复合，或者干扰所编码的多肽与其他细胞蛋白质的相互作用的化合物。这类筛选测定将包括能进行化学文库的高通量筛选，使得它们尤其适合用于鉴定小分子药物候选物的测定。
[0217] 测定可以以多种形式进行，包括本领域中充分表征的蛋白质-蛋白质结合测定、生物化学筛选测定、免疫测定及基于细胞的测定。
[0218] B.抗β7整联蛋白抗体
[0219] 在一个实施方案中，该β7整联蛋白拮抗剂是抗β7抗体。示例性抗体包括下文所述的多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、双特异性抗体和异缀合物抗体等。
[0220] 1.多克隆抗体
[0221] 可以通过多次皮下(SC)或腹膜内(IP)注射相关抗原和佐剂来在动物中制备多克隆抗体。用双功能剂或衍生剂(例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2或其中R和R1是不同烷基的R1N＝C＝NR)将相关抗原与在待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质(例如匙孔槭血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合可以是有用的。
[0222] 通过将例如100μg或5μg的蛋白质或缀合物(分别对于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂组合，并在多个部位皮内注射该溶液来针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫动物。一个月后，通过在多个部位皮下注射来用弗氏完全佐剂中的初始量的1/5至1/10的肽或缀合物加强免疫动物。7至14天后，对动物进行采血，并测定血清的抗体效价。加强免疫动物，直至效价平台期。在某些实施方案中，用同一抗原的缀合物加强免疫动物，但该抗原与不同的蛋白质缀合和/或通过不同的交联剂缀合。缀合物还可以作为蛋白质融合物在重组细胞培养物中制备。另外，适宜地用诸如明矾的聚集剂来增强免疫反应。
[0223] 2.单克隆抗体
[0224] 单克隆抗体可以用最先由Kohler等,Nature,256(1975)495描述的杂交瘤法制备，或者可以通过重组DNA法制备(参见例如美国专利号4,816,567)。
[0225] 在杂交瘤法中，按上文所述免疫小鼠或其他适宜的宿主动物(如仓鼠)来引出淋巴细胞，该淋巴细胞产生或能够产生将特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体。备选地，可以体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞，然后用适宜的融合剂(如聚乙二醇)与骨髓瘤细胞系融合形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,59-103页(Academic Press,1986))。
[0226] 将这样制备的杂交瘤细胞接种和培养在适宜的培养基中，该培养基可以包含一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(也称为融合配偶体)生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的选择性培养基通常将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止缺乏HGPRT的细胞的生长。
[0227] 在某些实施方案中，融合配偶体骨髓瘤细胞是高效融合、通过所选择的产抗体细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对针对未融合的亲本细胞选择的选择性培养基敏感的那些。在某些实施方案中，骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，如可从Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.USA获得的衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，及可从American Type Culture Collection,Rockville,Md.USA获得的SP-2和衍生物，如X63-Ag8-653细胞。还针对人单克隆抗体的产生描述了人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；和Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
[0228] 针对抗该抗原的单克隆抗体的产生测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基。在某些实施方案中，通过免疫沉淀或通过诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)的体外结合测定来测定杂交瘤产生的单克隆抗体的结合特异性。
[0229] 可以例如通过描述于Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)中的Scatchard分析来测定单克隆抗体的结合亲和力。一旦鉴定出产生具有希望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，即可以通过有限稀释法亚克隆该克隆，并通过标准方法培养(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,59-103页(Academic
Press,1986))。适合用于此目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可以例如通过将细胞腹膜内注射入小鼠，在动物中作为腹水肿瘤体内培养杂交瘤细胞。通过常规抗体纯化方法(例如亲和层析(例如使用A蛋白或G蛋白Sepharose)或离子交换层析、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析等)从培养基、腹水或血清适宜地分离由亚克隆分泌的单克隆抗体。
Press,1986))。适合用于此目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可以例如通过将细胞腹膜内注射入小鼠，在动物中作为腹水肿瘤体内培养杂交瘤细胞。通过常规抗体纯化方法(例如亲和层析(例如使用A蛋白或G蛋白Sepharose)或离子交换层析、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析等)从培养基、腹水或血清适宜地分离由亚克隆分泌的单克隆抗体。
[0230] 编码该单克隆抗体的DNA易于用常规方法分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞可作为这种DNA的来源。一旦分离，即可以将该DNA放入表达载体中，然后将该表达载体转染入诸如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不以其他方式产生免疫球蛋白蛋白质的骨髓瘤细胞的宿主细胞中，以获得单克隆抗体在该重组宿主细胞中的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述文章包括Skerra等,Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)和Pluckthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
[0231] 在另一实施方案中，可以从用例如描述于McCafferty等,Nature,348:552-554(1990)中的技术产生的抗体噬菌体文库分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等,Nature,
352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)分别描述了用噬菌体文库分离鼠抗体和人抗体。随后的公开描述了通过链改组产生高亲和力(nM范围)人抗体
(Marks等,Bio/Technology,10:779-783(1992))，以及作为构建非常大的噬菌体文库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouse等,Nuc.Acids.Res.21:2265-2266(1993))。因此，这些技术是除传统单克隆抗体杂交瘤技术之外用于分离单克隆抗体的可行选择。
352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)分别描述了用噬菌体文库分离鼠抗体和人抗体。随后的公开描述了通过链改组产生高亲和力(nM范围)人抗体
(Marks等,Bio/Technology,10:779-783(1992))，以及作为构建非常大的噬菌体文库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouse等,Nuc.Acids.Res.21:2265-2266(1993))。因此，这些技术是除传统单克隆抗体杂交瘤技术之外用于分离单克隆抗体的可行选择。
[0232] 可以修饰编码抗体的DNA来产生嵌合或融合抗体多肽，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域(CH和CL)序列取代同源鼠序列(美国专利号4,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的编码序列的全部或部分融合。非免疫球蛋白多肽序列可以取代抗体的恒定结构域，或者它们可以取代抗体的一个抗原结合部位的可变结构域以产生嵌合二价抗体，该嵌合二价抗体包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合部位和对不同抗原具有特异性的另一抗原结合部位。
[0233] 示例性抗β7抗体是Fib504、Fib 21、22、27、30(Tidswell,M.J Immunol.1997年8月1日；159(3):1497-505)或其人源化衍生物。Fib504的人源化抗体详细公开于美国专利公开号20060093601(作为美国专利号7,528,236授权)中，其内容以其整体引入作为参考(还见下文的讨论)。
[0234] 3.人和人源化抗体
[0235] 本发明的抗β7整联蛋白抗体可以进一步包含人源化抗体或人抗体。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中用来自非人物种(如小鼠、大鼠或兔)的具有希望的特异性、亲和力和能力的CDR(供体抗体)的残基取代来自受体的互补决定区(CDR)的残基。在一些情况下，用对应的非人残基取代人免疫球蛋白的构架残基。人源化抗体还可以包含不见于受体抗体中或输入的CDR或构架序列中的残基。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，且全部或基本上全部FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还将可选地包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区[Jones等,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,
2:593-596(1992)]。
2:593-596(1992)]。
[0236] 用于人源化非人抗体的方法为本领域公知。通常，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。基本上可以按照Winter及其同事的方法[Jones等,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等,Science,239:1534-1536(1988)]，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代对应的人抗体序列来进行人源化。因此，这类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中用对应的来自非人物种的序列取代了基本上少于完整的人可变结构域。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中用来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代了一些CDR残基，且可能取代一些FR残基。在抗体预期用于人治疗用途时，用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链二者)的选择对降低抗原性和HAMA反应(人抗小鼠抗体)非常重要。按照所谓的“最佳适合”法，针对已知人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。然后鉴定出最接近于啮齿动物的V结构域序列的人V结构域序列，并接受其内的人构架区(FR)用于人源化抗体(Sims等,J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia等,J.Mol.Biol.,196:901(1987))。另一种方法使用衍生自特定亚型的轻链或重链的所有人抗体的共有序列的特定构架区。同一构架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等,J.Immunol.151:2623(1993))。保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性来人源化抗体也很重要。为了达到此目的，根据某些实施方案，通过用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和多种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常可得，并为本领域技术人员所熟悉。说明和显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序也可得。这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中可能的作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列选择和组合FR残基，使得达到希望的抗体特征，如提高的对一种或多种靶抗原的亲和力。通常，高变区残基直接且最实质性地涉及影响抗原结合。
[0237] 考虑多种形式的人源化抗β7抗体。例如，人源化抗体可以是抗体片段，如Fab，其可选地与一种或多种细胞毒剂缀合，以便产生免疫缀合物。备选地，人源化抗体可以是完整抗体，如完整的IgGl抗体。
[0238] 示例性人源化抗β7抗体包括但不限于rhuMAbβ7，其是抗整联蛋白亚基β7的人源化单克隆抗体，且衍生自大鼠抗小鼠/人单克隆抗体FIB504(Andrew等,1994J Immunol 1994；153:3847-61)。已将它改造为包括人免疫球蛋白IgG1重链和κ1轻链构架，并通过中国仓鼠卵巢细胞来产生。此抗体结合两种整联蛋白α4β7(Holzmann等1989Cell,1989；56:37-46；Hu等,1992,Proc Natl Acad Sci USA 1992；89:8254-8)和αEβ7(Cepek等,1993J Immunol
1993；150:3459-70)，这两种整联蛋白调节胃肠道中的淋巴细胞亚群的运输和保留，且涉及炎症性肠病(IBD)，如溃疡性结肠炎(UC)和克隆病(CD)。rhuMAbβ7是α4β7和其配体(粘膜地址素细胞黏附分子-l[MAdCAM]-l、血管细胞黏附分子[VCAM]-1和纤连蛋白)之间的细胞相互作用以及αEβ7和其配体(E-钙黏着蛋白)之间的相互作用的有效体外阻断剂。rhuMAbβ7以相似的高亲和力可逆地结合来自兔、食蟹猕猴和人类的淋巴细胞上的β7。它还以高亲和力结合小鼠β7。rhuMAbβ7及其变体的氨基酸序列及制备和使用详细公开于美国专利申请公开号20060093601(作为美国专利号7,528,236授权)中，该申请的内容以其整体引入。
1993；150:3459-70)，这两种整联蛋白调节胃肠道中的淋巴细胞亚群的运输和保留，且涉及炎症性肠病(IBD)，如溃疡性结肠炎(UC)和克隆病(CD)。rhuMAbβ7是α4β7和其配体(粘膜地址素细胞黏附分子-l[MAdCAM]-l、血管细胞黏附分子[VCAM]-1和纤连蛋白)之间的细胞相互作用以及αEβ7和其配体(E-钙黏着蛋白)之间的相互作用的有效体外阻断剂。rhuMAbβ7以相似的高亲和力可逆地结合来自兔、食蟹猕猴和人类的淋巴细胞上的β7。它还以高亲和力结合小鼠β7。rhuMAbβ7及其变体的氨基酸序列及制备和使用详细公开于美国专利申请公开号20060093601(作为美国专利号7,528,236授权)中，该申请的内容以其整体引入。
[0239] 图1A和1B针对以下显示可变轻链和重链的序列的比对：轻链人亚型κI共有序列(图1A，SEQ ID NO:12)；重链人亚型III共有序列(图1B，SEQ ID NO:13)；大鼠抗小鼠β7抗体(Fib504)可变轻链(图1A，SEQ ID NO:10)；大鼠抗小鼠β7抗体(Fib504)可变重链(图1B，SEQ ID NO:11)；及人源化抗体变体：人源化hu504K移植可变轻链(图1A，SEQ ID NO:14)，人源化hu504K移植可变重链(图1B，SEQ ID NO:15)，变体hu504-5、hu504-16和hu504-32(对于变体hu504-5、hu504-16和hu504-32，相对于人源化hu504K移植的氨基酸变异显示在图1A(轻链)(按出现的顺序分别为SEQ ID NO:22-24)和图1B(重链)(SEQ ID NO:25)中)。
[0240] 4.人抗体
[0241] 作为人源化之外的选择，可以产生人抗体。例如，现在可能产生转基因动物(例如小鼠)，其在免疫时能够在缺乏内源免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的所有组成成分。例如，已描述了嵌合和种系突变体小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转入这类种系突变体小鼠将导致在抗原攻击时产生人抗体。参见例如Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；
Jakobovits等,Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann等,Year in Immuno.7:33(1993)；
美国专利号5,545,806、5,569,825、5,591,669(全都属于GenPharm)；美国专利号5,545,
807；和WO 97/17852。
Jakobovits等,Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann等,Year in Immuno.7:33(1993)；
美国专利号5,545,806、5,569,825、5,591,669(全都属于GenPharm)；美国专利号5,545,
807；和WO 97/17852。
[0242] 备选地，可以用噬菌体展示技术(McCafferty等,Nature 348:552-553[1990])来在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库产生人抗体和抗体片段。根据此技术，将抗体V结构域基因符合读框地克隆入丝状噬菌体(如M13或fd)的主要或次要外被蛋白质基因中，并作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面上。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体功能特性的选择还导致编码显示那些特性的抗体的基因的选择。因此，噬菌体模拟了B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以综述于例如Johnson,Kevin S.和Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3:564-571(1993)中的多种形式进行。可以将V基因区段的几个来源用于噬菌体展示。
Clackson等,Nature,352:624-628(1991)从衍生自免疫小鼠的脾的V基因的小的随机组合文库分离了一系列多样化的抗恶唑酮抗体。可以构建来自未免疫的人供体的V基因库，且可以基本上按照Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等,EMBO J.12:725-
734(1993)所述的技术分离抗一系列多样化抗原(包括自身抗原)的抗体。还参见美国专利号5,565,332和5,573,905。
Clackson等,Nature,352:624-628(1991)从衍生自免疫小鼠的脾的V基因的小的随机组合文库分离了一系列多样化的抗恶唑酮抗体。可以构建来自未免疫的人供体的V基因库，且可以基本上按照Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等,EMBO J.12:725-
734(1993)所述的技术分离抗一系列多样化抗原(包括自身抗原)的抗体。还参见美国专利号5,565,332和5,573,905。
[0243] 如上文所讨论，还可以通过体外活化B细胞来产生人抗体(参见美国专利号5,567,610和5,229,275)。
[0244] 5.抗体片段
[0245] 在某些情况下，使用抗体片段而不是完整抗体是有利的。片段的较小尺寸允许快速清除，且可以导致更易接近实体瘤。
[0246] 已发展了多种技术来产生抗体片段。通常，通过完整抗体的蛋白水解消化来衍生这些片段(参见例如Morimoto等,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)和Brennan等,Science,229:81(1985))。但是，现在可以通过重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，可以从上文讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。备选地，可以从大肠杆菌直接回收Fab’-SH片段，并化学偶联来形成F(ab’)2片段(Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物直接分离F(ab’)2片段。用于产生抗体片段的其他技术对熟练的从业者而言显而易见。在其他实施方案中，所选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利号5,571,894；及美国专利号5,587,458。抗体片段还可以是描述于例如美国专利号5,641,870中的“线性抗体”。这类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
[0247] 6.双特异性抗体
[0248] 双特异性抗体是对至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可以结合本文所述的β7整联蛋白的两个不同表位。其他这类抗体可以将TAT结合部位与用于另一蛋白质的结合部位组合。备选地，抗β7整联蛋白臂可以与结合白细胞上的触发分子(如T细胞受体分子(例如CD3)，或IgG的Fc受体(FcγR)，如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16))的臂组合，以将细胞防御机制集中和定位在表达TAT的细胞。双特异性抗体还可以用来将细胞毒剂定位至表达TAT的细胞。这些抗体具有TAT结合臂和结合细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)制备。
[0249] 用于制备双特异性抗体的方法为本领域已知。全长双特异性抗体的传统产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Millstein等,Nature 305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤
(quadromas)产生10种不同抗体分子的可能的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤进行)非常麻烦，且产物产率低。WO 93/
08829和Traunecker等,EMBO J.10:3655-3659(1991)中公开了类似的方法。
(quadromas)产生10种不同抗体分子的可能的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤进行)非常麻烦，且产物产率低。WO 93/
08829和Traunecker等,EMBO J.10:3655-3659(1991)中公开了类似的方法。
[0250] 根据不同的方法，将具有希望的结合特异性(抗体-抗原结合部位)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。在某些实施方案中，该融合是与包含至少部分铰链区、CH2区和CH3区的Ig重链恒定结构域融合。在某些实施方案中，包含轻链结合所必需的部位的第一重链恒定区(CH1)存在于该融合的至少一个中。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果希望)免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染入适宜的宿主生物。在用于构建的不等比例的三条多肽链提供希望的双特异性抗体的最佳产率时，这为在实施方案中调整三个多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。但是，在表达等比例的至少两种多肽链导致高产率时，或在该比例对希望的链组合的产率无显著影响时，可能将两种或全部三种多肽链的编码序列插入单个表达载体中。
[0251] 在某些实施方案中，该双特异性抗体由一条臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现此不对称结构便于从不想要的免疫球蛋白链组合分离希望的双特异性化合物，因为免疫球蛋白轻链仅存在于该双特异性分子的一半中提供了容易的分离方式。此方法公开于WO 94/04690中。产生双特异性抗体的进一步细节参见例如Suresh等,Methods in
Enzymology121:210(1986)
Enzymology121:210(1986)
[0252] 根据美国专利号5,731,168中所述的另一种方法，可以改造抗体分子对间的界面来最大化从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比。在某些实施方案中，该界面至少包含部分CH3结构域。在此方法中，用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一抗体分子的界面的一个或多个小的氨基酸侧链。通过用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大的氨基酸侧链来在第二抗体分子的界面上产生与一个或多个大的侧链相同或相似大小的补偿“空洞”。这提供了增加异二聚体的产率超过其他不想要的终产物(如同二聚体)的机制。
[0253] 双特异性抗体包括交联抗体或“异缀合物”抗体。例如，异缀合物中的抗体之一可以与抗生物素蛋白偶联，另一种与生物素偶联。例如，已提出这类抗体将免疫系统细胞靶向至不需要的细胞(美国专利号4,676,980)，并用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可以用任意方便的交联方法产生异缀合物抗体。适宜的交联剂为本领域公知，并连同许多交联技术一起公开于美国专利号4,676,980中。
[0254] 还已在文献中描述了用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，可以用化学连接制备双特异性抗体。Brennan等,Science 229:81(1985)描述了蛋白酶解切割完整抗体来产生F(ab')2片段的方法。在二巯基络合剂亚砷酸钠的存在下还原这些片段，以稳定邻位二巯基并防止分子间二硫化物形成。然后将产生的Fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸盐(TNB)衍生物：然后通过用巯基乙胺还原来将Fab’-TNB衍生物之一再转化为Fab’-巯基，并与等摩尔量的其他Fab’-TNB衍生物混合来形成双特异性抗体。可以将产生的双特异性抗体用作用于选择性固定酶的物质。
[0255] 最近的进展已便于从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段，该片段可以化学偶联来形成双特异性抗体。Shalaby等,J.Exp.Med.175:217-225(1992)描述了充分人源化的双特异性抗体F(ab')2分子的产生。每个Fab'片段分别从大肠杆菌分泌，并在体外进行定向化学偶联来形成双特异性抗体。这样形成的双特异性抗体能够结合过量表达ErbB2受体的细胞和正常的人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞对人乳腺肿瘤靶标的裂解活性。还已描述了用于直接从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体。Kostelny等,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白质的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab’部分连接。在铰链区还原抗体同二聚体形成单体，然后再氧化形成抗体异二聚体。还可以利用此方法来产生抗体同二聚体。Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)所述的“双抗体”技术提供了用于制备双特异性抗体片段的备选机制。片段包含通过接头与VL连接的VH，该接头太短而不允许同一条链上的两个结构域间配对。因此，迫使一个片段的VH和VL结构域与另一片段的互补的VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合部位。还已报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体片段的另一策略。参见Gruber等,J.Immunol.152:5368(1994)。
[0256] 考虑超过二价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)。
[0257] 7.异缀合物抗体
[0258] 异缀合物抗体也在本发明的范围之内。异缀合物抗体由两个共价结合的抗体组成。例如，已提出这类抗体将免疫系统细胞靶向至不需要的细胞[美国专利号4,676,980]，并用于治疗HIV感染[WO 91/00360；WO92/200373；EP 03089]。考虑用合成蛋白质化学中已知的方法(包括涉及交联剂的那些)在体外制备该抗体。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适合用于此目的的试剂的实例包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-巯基butyrimidate和例如美国专利号4，676，980中公开的那些。
[0259] 8.多价抗体
[0260] 多价抗体可以比二价抗体更快地被表达该抗体所结合的抗原的细胞内化(和/或分解代谢)。本发明的抗体可以是(除IgM种类外的)具有三个或多个抗原结合部位的多价抗体(例如四价抗体)，其可以容易地通过重组表达编码该抗体的多肽链的核酸来制备。该多价抗体可以包含二聚化结构域和三个或多个抗原结合部位。在某些实施方案中，该二聚化结构域包含Fc区或铰链区(或由Fc区或铰链区组成)。在这种情况下，该抗体将包含Fc区及Fc区氨基端的三个或多个抗原结合部位。在某些实施方案中，本文的多价抗体包含三个至约八个，但通常四个抗原结合部位(或由三个至约八个，但通常四个抗原结合部位组成)。该多价抗体包含至少一条多肽链(且通常两条多肽链)，其中该一条或多条多肽链包含两个或多个可变结构域。例如，该一条或多条多肽链可以包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的一条多肽连，X1和X2代表氨基酸或多肽，n是0或1。例如，该一条或多条多肽链可以包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体可以进一步包含至少两条(且通常四条)轻链可变结构域多肽。例如，本文的多价抗体可以包含约两条至约八条轻链可变结构域多肽。此处考虑的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，且可选地进一步包含CL结构域。
[0261] 9.效应子功能改造
[0262] 可以希望就效应子功能修饰本发明的抗体，例如，以增强该抗体的依赖抗体的细胞毒性(ADCC)和/或依赖补体的细胞毒性(CDC)。这可以通过在该抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来达到。备选地或此外，可以在Fc区中引入一个或多个半胱氨酸残基，从而允许在此区域中形成链间二硫键。这样产生的同二聚体抗体可以具有改善的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。参见Caron等,J.Exp Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.J.,Immunol.148:2918-2922(1992)。还可以用
Wolff等,Cancer Research 53:2560-2565(1993)中所述的异双功能交联剂来制备具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体。备选地，可以改造抗体，使其具有双Fc区，从而可以具有增强的补体裂解和ADCC能力。参见Stevenson等,Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989)。为了增加抗体的血清半衰期，可以按例如美国专利号5,739,277中所述在抗体(尤其是抗体片段)中掺入挽救受体结合表位。本文所用的术语“挽救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位，其负责增加IgG分子的体内血清半衰期。
Wolff等,Cancer Research 53:2560-2565(1993)中所述的异双功能交联剂来制备具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体。备选地，可以改造抗体，使其具有双Fc区，从而可以具有增强的补体裂解和ADCC能力。参见Stevenson等,Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989)。为了增加抗体的血清半衰期，可以按例如美国专利号5,739,277中所述在抗体(尤其是抗体片段)中掺入挽救受体结合表位。本文所用的术语“挽救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位，其负责增加IgG分子的体内血清半衰期。
[0263] 10.免疫缀合物
[0264] 用于本文的方法的拮抗剂或抗体可选地缀合至另一物质，如细胞毒剂或细胞因子。
[0265] 缀合通常将通过共价连接实现，其确切的性质将由靶向分子和整联蛋白β7拮抗剂或抗体多肽上的连接位点决定。通常，通过加入接头来修饰非肽试剂，该接头允许通过抗β7整联蛋白抗体的氨基酸侧链、碳水化合物链或者通过化学修饰引入抗体上的反应基而缀合到该抗体。例如，药物可以通过赖氨酸残基的ε氨基、通过自由α氨基、通过与半胱氨酸残基的二硫键交换、或者通过用高碘酸氧化碳水化合物链中的1,2-二醇以允许通过希夫碱连接附着含有多种亲核试剂的药物来进行附着。参见例如美国专利号4,256,833。蛋白质修饰剂包括胺反应性试剂(例如，反应性酯、异硫氰酸酯、醛和磺酰卤)、硫醇反应性试剂(例如，卤代乙酰基衍生物和马来酰亚胺)及羧酸和醛反应性试剂。整联蛋白β7拮抗剂或抗体多肽可以通过使用双功能交联剂来共价连接到肽试剂。异双功能试剂更常用，且允许通过使用两种不同的反应性部分(例如胺反应性加上硫醇、碘乙酰胺或马来酰亚胺)来控制两种不同蛋白质的偶联。这类连接试剂的用途为本领域公知。参见例如Brinkley,上文和美国专利号4,671,958。也可以使用肽接头。在备选方案中，抗β7整联蛋白抗体多肽可以通过融合多肽的制备连接到肽部分。
[0266] 其他双功能蛋白质偶联剂的实例包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(Ν-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚胺酯的双功能衍生物(如二甲基己二酸HCL)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、二-叠氮基化合物(如二(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、二-重氮衍生物(如二-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
[0267] 11.免疫脂质体
[0268] 本文公开的抗β7整联蛋白抗体也可以配制为免疫脂质体。“脂质体”是由多种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊，其用于将药物递送至哺乳动物。脂质体的成分通常以双层形式排列，类似于生物膜的脂质排列。通过本领域已知的方法来制备含有抗体的脂质体，如Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985)；Hwang等,Proc.Natl Acad.Sci.USA77:4030(1980)；美国专利号4,485,045和4,544,545；及1997年10月23日公开的WO97/38731中所述。美国专利号5,013,556中公开了具有增强的循环时间的脂质体。
[0269] 可以用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物，通过反相蒸发法来产生尤其有用的脂质体。将脂质体通过确定孔径的滤器挤出以产生具有所希望直径的脂质体。
[0270] 可以按Martin等,J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所述通过二硫键交换反应来将本发明抗体的Fab'片段缀合至脂质体。化疗剂可选地包含在脂质体内。参见Gabizon等,J.National Cancer Inst.81(19):1484(1989)。
[0271] 12.用于抗体产生的载体、宿主细胞和重组方法
[0272] 还提供分离的编码本文所述抗β7抗体或多肽试剂的核酸、包含该核酸的载体和宿主细胞及用于产生该抗体的重组技术。
[0273] 为了重组产生抗体，可以分离编码它的核酸，并插入可复制载体用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。在另一实施方案中，可以通过例如美国专利号5,204,244(在此明确引入作为参考)中所述的同源重组来产生抗体。编码单克隆抗体的DNA易于用常规方法分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。许多载体可用。载体成分一般包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，例如，如1996年7月9日授权的美国专利号5,534,615中所述，其在此明确引入作为参考。
[0274] 适合用于克隆或表达本文的载体中的DNA的宿主细胞是上文所述的原核生物、酵母或高级真核生物细胞。适合用于此目的的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形杆菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)，例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)，例如Serratia marcescans，志贺氏菌属
(Shigella)，以及芽抱杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.Iicheniformis)(例如，1989年4月12日公开的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，和链霉菌属
(Streptomyces)。一个大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，虽然诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)的其他菌株也适宜。这些实例是说明性的而非限制性的。
(Shigella)，以及芽抱杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.Iicheniformis)(例如，1989年4月12日公开的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，和链霉菌属
(Streptomyces)。一个大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，虽然诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)的其他菌株也适宜。这些实例是说明性的而非限制性的。
[0275] 除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是适合用于编码抗β7整联蛋白抗体的载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见的面包酵母是低级真核宿主微生物中最常用的。但是，许多其他属、种和菌株是通常可得到的，并在本文中使用，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，例如乳酸克鲁维酵母(K.Iactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、瓦尔提克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母
(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma
reesia)(EP 244,234)；粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，例如脉孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma
reesia)(EP 244,234)；粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，例如脉孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
[0276] 适合用于表达糖基化的抗β7抗体的宿主细胞衍生自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已鉴定了来自诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)的宿主的许多杆状病毒株和变体及对应的受纳昆虫宿主细胞。多种用于转染的病毒株是公开可得的，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5病毒株，且可以将这类病毒用作本发明的病毒，尤其是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、西红柿和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。
[0277] 但是，在脊椎动物细胞中的兴趣最大，且在培养物(组织培养物)中繁殖脊椎动物细胞已成为常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293或为在悬浮培养物中生长而亚克隆的293细胞，Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CVl ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。
[0278] 用上述用于抗β7整联蛋白抗体产生的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在根据诱导启动子、选择转化体或扩增编码希望的序列的基因的需要修改的常规营养培养基中培养。
[0279] 可以在多种培养基中培养用于产生本发明的抗β7整联蛋白抗体的宿主细胞。诸如Ham's F10(Sigma)、Minimal Essential Medium(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM，Sigma)的市售培养基适合用于培养宿主细胞。此外，可以将Ham等,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes等,Anal.Biochem.102:255(1980)；
美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO
87/00195；或美国专利再版30,985中所述的培养基中的任一种用作宿主细胞的培养基。可以根据需要向任意这些培养基中补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等同的能量来源。还可以按本领域技术人员已知的适当浓度包含任意其他必需的补充物。诸如温度、pH等的培养条件是之前用于所选择的表达宿主细胞的那些，且对普通技术人员而言显而易见。
美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO
87/00195；或美国专利再版30,985中所述的培养基中的任一种用作宿主细胞的培养基。可以根据需要向任意这些培养基中补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等同的能量来源。还可以按本领域技术人员已知的适当浓度包含任意其他必需的补充物。诸如温度、pH等的培养条件是之前用于所选择的表达宿主细胞的那些，且对普通技术人员而言显而易见。
[0280] 在使用重组技术时，抗体可以在胞内产生，产生在周质空间中，或者直接分泌进入培养基。如果抗体在胞内产生，作为第一步骤，例如通过离心或超滤去除颗粒碎片(宿主细胞或裂解片段)。Carter等,Bio/Technology10:163-167(1992)描述了用于分离分泌至大肠杆菌的周质空间的抗体的方法。简言之，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下融化细胞糊约30分钟。通过离心去除细胞碎片。在抗体分泌进入培养基时，通常首先用市售蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自这类表达系统的上清。可以在任意前述步骤中包含蛋白酶抑制剂(如PMSF)来抑制蛋白水解，且可以包含抗生素来防止外来污染物的生长。
[0281] 可以用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析纯化从细胞制备的抗体组合物，亲和层析是典型的纯化技术。A蛋白作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任意免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。可以用A蛋白来纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。建议G蛋白用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等,EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体所附着的基质最常是琼脂糖，但其他基质也可用。与用琼脂糖可以达到的流速和处理时间相比，机械稳定的基质(如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯)允许更快的流速和更短的处理时间。在抗体包含CH3结构域时，用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)进行纯化。取决于待回收的抗体，用于蛋白质纯化的其他技术(如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀)也可用。任意一个或多个初步纯化步骤后，可以对包含目的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水作用层析，该层析使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，通常在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下进行。
[0282] C.药物制剂
[0283] 通过将具有希望的纯度的抗体与可选的生理可用载体、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编辑(1980))混合，以水溶液、冻干或其他干燥制剂的形式制备包含本发明的治疗剂、拮抗剂或抗体的治疗制剂用于保存。
可用载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对受体无毒性，且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEEN.TM.、PLURONICS.TM.或聚乙二醇(PEG)。
可用载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对受体无毒性，且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEEN.TM.、PLURONICS.TM.或聚乙二醇(PEG)。
[0284] 本文的制剂还可以包含所治疗的具体适应症必需的一种以上活性化合物，通常是相互无不利影响的具有互补活性的那些。这类分子适宜地以对预期目的有效的量组合存在。
[0285] 活性成分还可以包载在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊(例如，分别为羟甲基纤维素微囊或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米囊(nanocapsule))中或粗滴乳状液中。这类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)中。
[0286] 待用于体内施用的制剂必须无菌。这易于通过滤过无菌滤膜来实现。
[0287] 可以制备缓释制剂。缓释制剂的适宜的实例包括含有本发明的免疫球蛋白的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成形物品的形式，例如膜或微囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOT.TM.(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物使得能够释放分子超过100天，而某些水凝胶释放蛋白质较短时期。包封的免疫球蛋白长时间存留在体内时，它们可由于在37℃暴露于湿度而变性或聚集，导致生物学活性的丧失和可能的免疫原性改变。取决于所涉及的机制，可以设计合理的策略来稳定。例如，如果发现聚集机制是通过硫代二硫化物(thio-disulfide)交换形成分子间S-S键，那么可以通过修饰硫氢残基、从酸性溶液冻干、控制含水量、使用适当的添加剂和发展特异性聚合物基质组合物来达到稳定。
[0288] D.施用
[0289] 实施治疗的医生将能够针对基于体重的剂量或针对统一剂量确定单个个体的适当剂量，将遵循标签上的说明。与整联蛋白β7拮抗剂组合施用的市售第二治疗剂和其他化合物的制备和施用方案可以按厂家的说明使用或由熟练的从业人员按经验确定。
[0290] 对于疾病的预防或治疗，整联蛋白β7拮抗剂及与非排除抗体组合施用的任意第二治疗剂或其他化合物的适当剂量将取决于待治疗的胃肠炎性障碍的类型(例如IBD、UC、CD)、疾病的严重度和病程、为了预防还是治疗的目的而施用该整联蛋白β7拮抗剂或组合、之前的治疗、患者的临床病史和对整联蛋白β7拮抗剂或组合的反应及主治医生的判断。在某些实施方案中，每周一次、或每两周一次、或每四周一次、或每六周一次、或每八周一次施用整联蛋白β7拮抗剂，施用一个月(4周)、或两个月、三个月、或六个月、或12个月、或18个月、或24个月、或在患者一生中长期施用。在某些实施方案中，治疗由患者自己施用。
[0291] 取决于疾病的类型和严重度，约0.5mg/kg至4.0mg/kg抗β7抗体是对患者施用的初始候选剂量，例如，通过一次或多次分开施用，或通过连续输注。对于在几天或更长时间内反复施用，取决于病症，治疗持续至出现希望的疾病症状的抑制。但是，可以使用其他剂量方案。
[0292] 例如，在某些实施方案中，对患者施用统一剂量的抗β7抗体。统一剂量是不考虑体重而对每名患者施用的抗β7抗体的具体量。取决于疾病的类型和严重度，对患者施用约50mg和450mg之间的抗β7抗体的统一剂量，其可以是一次或多次分开的注射或输注或施用。
这种统一剂量可以静脉内或皮下或通过本文所述的其他途径施用。在某些实施方案中，该统一剂量是50mg、或100mg、或105mg、或150mg、或200mg、或210mg、或300mg、或315mg、或
400mg、或420mg、或450mg。
这种统一剂量可以静脉内或皮下或通过本文所述的其他途径施用。在某些实施方案中，该统一剂量是50mg、或100mg、或105mg、或150mg、或200mg、或210mg、或300mg、或315mg、或
400mg、或420mg、或450mg。
[0293] 在某些实施方案中，抗β7抗体的起始统一负荷剂量后跟随抗β7抗体的一个或多个维持剂量。该负荷剂量是比维持剂量更大量的抗β7抗体。在某些实施方案中，该负荷剂量在400mg和450mg之间，该维持剂量在50mg和350mg之间。在某些实施方案中，该负荷剂量是
400mg、或420mg、或430mg、或450mg。
400mg、或420mg、或430mg、或450mg。
[0294] 通常，临床医生将施用本发明的抗体(单独或与第二化合物组合)，直至达到提供所需生物学作用的一个或多个剂量。容易地通过常规技术和测定来监测本发明的疗法的进展。
[0295] 可以通过任意适宜的手段来施用整联蛋白β7拮抗剂，包括胃肠外、局部、静脉内、皮下、腹膜内、肺内、鼻内和/或病灶内施用。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、富农内、或皮下施用。还考虑鞘内施用(参见例如Grillo-Lopez的美国专利公开号2002/0009444)。此外，可以通过例如用剂量逐渐降低的抗体脉冲输注来适宜地施用整联蛋白β7拮抗剂。在某些实施方案中，静脉内或皮下给药。可以用相同或不同的施用手段来提供每个暴露。在一个实施方案中，通过皮下施用来提供抗β7抗体的每个暴露。在一个实施方案中，通过静脉内施用来提供抗β7抗体的第一暴露(例如负荷剂量)，通过皮下施用来提供每个后续暴露。
[0296] 在某些实施方案中，用例如自注射器械、自动注射器械或设计用于自我施用的其他器械来施用抗β7抗体。包括自动注射器械的多种自注射器械为本领域已知，且可购得。示例性器械包括但不限于预装注射器(如来自Becton Dickinson的BD HYPAK READYFILLTM和STERIFILL SCFTM；来自Baxter的CLEARSHOTTM共聚物预装注射器；及可从West Pharmaceutical Service获得的Daikyo Seiko CRYSTAL 预装注射器)；
一次性笔注射器械，如来自Becton Dickinson的BD Pen；超锋利(ultra-sharp)和微针器械(如来自Becton Dickinson的INJECT-EASETM和微输注器；可从Valeritas获得的H-
PATCHTM)；以及无针注射器械(如可从Bioject获得的 和 可
从Medtronic获得的 和patch devices)。在某些实施方案中，rhuMAbβ7
是包含含有2ML(150mg)rhuMAbβ7的预装注射器的制成品。在某些实施方案中，rhuMAbβ7是包含含有1ML(180mg)rhuMAbβ7的预装注射器的制成品。
一次性笔注射器械，如来自Becton Dickinson的BD Pen；超锋利(ultra-sharp)和微针器械(如来自Becton Dickinson的INJECT-EASETM和微输注器；可从Valeritas获得的H-
PATCHTM)；以及无针注射器械(如可从Bioject获得的 和 可
从Medtronic获得的 和patch devices)。在某些实施方案中，rhuMAbβ7
是包含含有2ML(150mg)rhuMAbβ7的预装注射器的制成品。在某些实施方案中，rhuMAbβ7是包含含有1ML(180mg)rhuMAbβ7的预装注射器的制成品。
[0297] 如所指出，整联蛋白β7拮抗剂可以单独施用或与至少第二治疗化合物组合施用。这些第二治疗化合物通常以之前所用的剂量和给药途径相同的剂量和给药途径使用，或之前所用剂量的约1％至99％。如果使用这类第二化合物，则它们在某些实施方案中以低于不存在整联蛋白β7拮抗剂时的量使用，以消除或降低因此引起的副作用。
[0298] 同样如所指出(例如，参见下文)，多种适合用于治疗IBD(例如溃疡性结肠炎和克隆病)的第二治疗化合物为本领域已知，同样描述了这类第二治疗化合物的剂量和施用方法。
[0299] 整联蛋白β7拮抗剂和任意第二治疗化合物的施用可以同时进行，例如作为单种组合物或作为使用相同或不同给药途径的两种或多种不同组合物。备选地，或此外，施用可以以任意顺序顺次进行。在某些实施方案中，两种或多种组合物的施用之间可以存在从几分钟至几天、几周至几个月的间隔。例如，可以先施用整联蛋白β7拮抗剂，然后施用第二治疗化合物。但是，也考虑同时施用或在整联蛋白β7拮抗剂之前施用第二治疗化合物。
[0300] 活性中度至严重活性UC个体的治疗标准涉及用以下的标准剂量治疗：氨基唾液酸、口服皮质类固醇、6-巯基嘌呤(6-MP)和/或硫唑嘌呤。整联蛋白β7拮抗剂(如本文公开的抗β7整联蛋白抗体)治疗将导致疾病缓解的改善(疾病的快速控制和/或延长的缓解)，和/或优于用这类个体的治疗标准达到的临床反应的临床反应。
[0301] 在一个实施方案中，本发明的患有IBD的人个体中的炎症性肠病(IBD)治疗包括对该个体施用有效量的治疗剂，如抗β7整联蛋白抗体，且进一步包括对该个体施用有效量的第二药物，该药物是免疫抑制剂、疼痛控制剂、抗腹泻剂、抗生素或其组合。
[0302] 在示例性实施方案中，该第二药物选自氨基唾液酸、口服皮质类固醇、6-巯基嘌呤(6-MP)和硫唑嘌呤。在另一示例性实施方案中，该第二药物是另一整联蛋白β7拮抗剂，如另一抗β7整联蛋白抗体或抗细胞因子的抗体。
[0303] 所有这些第二药物可以分别相互组合或它们自身与第一药物组合使用，使得本文所用的表述“第二药物”并非意味着它是除第一药物外唯一的药物。因此，第二药物无需是一种药物，但可以组成或包含一种以上这种药物。
[0304] 本文的组合施用包括用分开的制剂或单种药物制剂共同施用，及以任一顺序连续施用，其中通常存在两种(或所有)活性剂同时发挥其生物学活性的时期。
[0305] 第二药物的组合施用包括用分开的制剂或单种药物制剂共同施用(同时施用)，及以任一顺序连续施用，其中通常存在两种(或所有)活性剂(药物)同时发挥其生物学活性的时期。
[0306] E.设计治疗方案
[0307] 药物开发是复杂并且昂贵的过程。估计新药上市的费用在8亿到10亿美元之间。I期临床试验中不到10％的药物进入批准期。药物在后期失败的两个关键原因是缺乏对剂量-浓度反应和非预期的安全性事件之间的关系的理解。考虑到此情况，关键是有工具帮助预测药物在体内表现如何及协助临床治疗候选者的成功(Lakshmi Kamath,Drug Discovery and Development；Modeling Success in PK/PD Testing Drug Discovery&Development(2006))。
[0308] 药物动力学(PK)表征药物的吸收、分布、代谢和清除特性。药效学(PD)定义对所施用的药物的生理学和生物学反应。PK/PD建模建立了这两种方法之间的数学和理论联系，并帮助更好地预测药物作用。通过模拟进行的集成PK/PD建模和计算机辅助试验设计正被整合到许多药物开发项目中，并具有不断增长的影响(Lakshmi Kamath,Drug Discovery and Development；Modeling Success in PK/PD Testing Drug Discovery&Development(2006))。
[0309] PK/PD测试通常在药物开发过程的每个阶段进行。因为开发正变得越来越复杂、费时和昂贵，许多公司正寻求更好地利用PK/PD数据，以在开始时消除有缺陷的候选物，并鉴定临床成功机会最高的那些候选物(Lakshmi Kamath，上文)。
[0310] PK/PD建模方法在确定生物标志应答、药物水平和给药方案之间的关系中被证明是有用的。候选药物的PK/PD谱和预测患者对它的应答的能力对于临床试验的成功是很关键。分子生物学技术中的最近进展和多种疾病靶标的更好理解已将生物标志验证为药物治疗功效的良好临床指标。生物标志测定(包括本文所述的那些)和这类生物标志测定的使用帮助鉴定对候选药物的生物应答。一旦在临床上验证了生物标志，就可以对试验模拟有效建模。生物标志具有达到替代品状态的潜力，其可以在某天代替药物开发中的临床结果(Lakshmi Kamath，上文)。
[0311] 外周血中生物标志(如本文所述的那些)的量可用于鉴定对整联蛋白β7拮抗剂治疗的生物学反应，并因此可以作为候选物治疗的治疗功效的良好临床指标发挥功能。
[0312] 药物开发中的传统PK/PD建模定义诸如药物剂量浓度、药物暴露作用、药物半衰期、药物浓度对时间及药物作用对时间的参数。在更宽泛地使用时，诸如药物建模、疾病建模、实验建模和市场建模的定量技术可以支持整个开发过程，其通过风险的明确考虑和知识的更好利用导致更好的决策。对药物开发研究员而言，多种PK/PD建模工具可用，例如由Pharsight,Inc.Mountain View,California开发的WinNonlin and the Knowledgebase Server(PKS)。
[0313] 一般生物标志技术
[0314] 除非另有说明，本发明的实施将利用本领域技术范围之内的常规分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术。这类技术充分阐述于文献中，如"Molecular Cloning:A Laboratory Manual",第2版(Sambrook等,1989)；"Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait编辑,1984)；"Animal Cell Culture"
(R.I.Freshney编辑,1987)；"Methods in Enzymology"(Academic Press,Inc.)；"Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel等编辑,1987,及定期更新)；"PCR:The Polymerase Chain Reaction",(Mullis等编辑,1994).
(R.I.Freshney编辑,1987)；"Methods in Enzymology"(Academic Press,Inc.)；"Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel等编辑,1987,及定期更新)；"PCR:The Polymerase Chain Reaction",(Mullis等编辑,1994).
[0315] 本发明中所利用的引物、寡核苷酸和多核苷酸可以用本领域已知的标注技术产生。
[0316] 本文提供与预测IBD患者(包括患有UC或克隆病的患者)对某些治疗剂的反应性相关的基因表达生物标志。由该基因编码的mRNA或单个蛋白质的这些表达水平构成用于预测对IBD治疗剂、UC治疗剂和/或克隆病治疗剂的反应性的生物标志。因此，本文所公开的发明用于多种环境，例如用于涉及炎症性肠病的诊断和治疗的方法和组合物。
[0317] 基因表达水平的检测
[0318] 本文所述任意方法的核酸可以是从基因组DNA转录的RNA或从RNA或mRNA产生的cDNA。核酸可以源自脊椎动物，例如哺乳动物。如果核酸直接从特定来源获得，或者如果核酸是见于该来源的核酸的拷贝，则称它“源自”该来源。
[0319] 核酸包括核酸的拷贝，例如产生自扩增的拷贝。在某些情况下可以希望进行扩增，例如，以获得所希望的量的材料用于检测变异。然后可以对扩增子进行变异检测方法(如下文所述的那些)，以测定某些基因的表达。
[0320] mRNA的水平可以通过本领域技术人员公知的多种方法(包括市售试剂盒和试剂的使用)来测量和定量。一个这种方法是聚合酶链反应(PCR)。另一种用于定量用途的方法是实时定量PCR或qPCR。参见例如“PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,”(M.A.Innis等编辑,Academic Press,Inc.,1990)；"Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel等编辑,1987,及定期更新)；及"PCR:The
Polymerase Chain Reaction",(Mullis等编辑,1994)。
Polymerase Chain Reaction",(Mullis等编辑,1994)。
[0321] 微阵列是通常用成千上万个核酸探针的阵列系列来在高严格性条件下与例如cDNA或cRNA样品杂交的多重技术。通常通过检测荧光团、银或化学发光标记的靶标来检测和定量探针-靶标杂交，以测定靶标中核酸序列的相对丰度。在典型的微阵列中，通过与化学基质的共价键(经环氧-硅烷、氨基-硅烷、赖氨酸、聚丙烯酰胺或其他)将探针附着至固体表面。固体表面是例如玻璃、硅芯片或微球。多种微阵列可购得，包括例如由Affymetrix,Inc.和Illumina,Inc.制造的那些。
[0322] 生物样品可以用本领域技术人员已知的某些方法获得。生物样品可以获自脊椎动物，尤其是哺乳动物。在某些情况下，生物样品是滑膜组织、血清或外周血单核细胞(PBMC)。通过筛查这类身体样品，可以针对诸如溃疡性结肠炎和克隆病的疾病达到简单的早期诊断。此外，通过针对靶核酸(或所编码的多肽)表达水平的变异测试这类身体样品，可以更容易地监测治疗过程。
[0323] 确定个体或组织或细胞样品包含本文公开的基因表达特征或某些生物标志的相对水平后，考虑可以对该个体施用有效量的适当治疗剂，以该个体中的具体疾病，例如UC或克隆病。熟练的从业人员可以在哺乳动物中进行本文所述多种病理学病症的临床诊断。临床诊断技术为本领域可得，其允许例如诊断或检测哺乳动物中的炎症性肠病，例如溃疡性结肠炎和克隆病。
[0324] 试剂盒
[0325] 还提供用于本文所述或所提出的应用的试剂盒或制成品。这类试剂盒可以包含区室化来紧密限制地容纳一个或多个容器手段(如小瓶、管等)的载体手段，每个容器手段包含将要在方法中使用的分开的组成部分之一。例如，容器手段之一可以包含进行可检测标记或可以进行可检测标记的探针。这种探针可以是对包含基因表达特征的一个或多个基因的多核苷酸特异的多核苷酸。在试剂盒利用核酸杂交来检测靶核酸时，试剂盒还可以具有包含用于扩增靶核酸序列的一种或多种核酸的容器和/或包含报道手段的容器，如生物素结合蛋白，如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，结合于报道分子，如酶、荧光或放射性同位素标记。
[0326] 试剂盒通常将包含上述容器和一个或多个其他容器，该其他容器包含商业和用户角度希望的物质，包括缓冲液、稀释液、滤器、针头、注射器和含有使用说明的包装说明书。容器上可以存在标签来指示该组合物用于具体的治疗或非治疗性应用，且还可以指示体内或体外使用的方向，如上文所述的那些。试剂盒中的其他可选成分包括一种或多种缓冲液(例如封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物缓冲液等)、其他试剂(如通过酶标记发生化学改变的底物(例如色原))、表位修复溶液、对照样品(阳性和/或阴性对照)、对照切片等。
[0327] 销售方法
[0328] 本发明还涵盖用于销售治疗剂或其可药用组合物的方法，其包括向目标受众推销、讲解和/或详述该治疗剂或其药物组合物在治疗患有具体疾病(例如UC或克隆病)的患者或患者群体中的用途，已从该患者获得样品并显示本文公开的基因表达特征或血清生物标志的相对水平。
[0329] 销售通常是通过非个人媒介的付费报道，其中标明赞助人并控制信息。为了本文目的的销售包括宣传、公共关系、产品放置、赞助、承销和促销。此术语还包括出现在任意印刷媒介中的赞助信息公告，其设计用于吸引广大受众来说服、告知、促进、激发或以其他方式改变针对采购、支持或认可本发明的有利模式的行为。
[0330] 本文的诊断方法的销售可以通过任意手段达到。用来传递这些信息的销售媒介的实例包括电视、广播、电影、杂质、报纸、互联网和广告牌，包括广告，其是出现在广播媒介中的信息。
[0331] 所使用的销售类型将取决于许多因素，例如要影响的目标受众的性质，例如医院、保险公司、诊所、医生、护士和患者，以及成本考虑及管理药物和诊断剂的销售的相关管辖法律和法规。销售可以根据通过服务互动和/或其他数据(如使用者人口统计和地理位置)确定的使用者特征来个体化或个性化。
[0332] 认为前述书面说明和以下实施例足以使本领域技术人员能够实施本发明。除本文所显示和描述的那些之外，对本领域技术人员而言，本发明的多种修改将从前述描述和以下实施例变得显而易见，并落在所附权利要求的范围之内。
[0333] 应理解，在本文所含教导的指引下，本发明的教导在具体问题或情况中的应用将在本领域普通技术人员的能力范围之内。
[0334] 通过以下非限制性实施例来说明本发明的其他细节。说明书中所有引文的公开内容在此明确引入作为参考。实施例
[0335] 实施例1
[0336] 在患有中度至严重溃疡性结肠炎的患者中评价rhuMAbβ7(etrolizumab)的有效性和安全性的II期、随机化、双盲、安慰剂对照研究及开放标签扩展研究
[0337] 临床研究描述
[0338] rhuMAbβ7(etrolizumab)描述
[0339] rhuMAbβ7(etrolizumab)是人源化单克隆抗体，其基于人IgG1亚型III VH、κ亚型-I VL共有序列，且特异性抗整联蛋白异二聚体的β7亚基。参见图1A和B。已显示它以高亲和力结合α4β7(约116pM的Kd)和αEβ7(约1800pM的Kd)。
[0340] 此重组抗体具有通过IgG1抗体典型的链间和链内二硫键共价连接的两条重链(446个残基)和两条轻链(214个残基)。对于本文所述的研究，它是在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生的。完整的非糖基化rhuMAbβ7分子的分子量约为144kDa。rhuMAbβ7的每条重链在Asn297处具有一个保守的N连接糖基化位点。存在于此位点上的寡糖是在CHO细胞中表达的重组抗体中观察到的典型的那些，主要的糖型是无唾液酸的双分枝G0和G1聚糖。包含两个G0聚糖且无C端赖氨酸残基的最普遍的rhuMAbβ7形式的质量约为147kDa。
[0341] rhuMAbβ7(etrolizumab)药物产品和安慰剂由Genentech制备。它们是澄清至微乳白、无色至微黄色的水溶液。两种溶液都是预期用于IV和SC施用的无菌和无防腐剂的液体。
[0342] 研究设计
[0343] 研究描述
[0344] 此II期研究是在中度至严重UC患者中与安慰剂比较评价两个rhuMAbβ7剂量水平的有效性和安全性的随机化、双盲、安慰剂对照、多中心研究。在第10周(施用最后一个剂量的研究药物后2周)评价了主要有效性终点，在第6周评价了次要有效性终点。
[0345] 患者按1:1:1的比例在第0、4和8周rhuMAbβ7 100mg SC(平剂量)，第0周420mg SC(平负荷剂量)后第2、4和8周300mg SC或匹配的安慰剂SC的剂量范围上随机化。图2中显示研究方案。研究划分为0-35天的筛查期、10周的双盲治疗期、18周的安全性随访期和17个月的进行性多灶性白质脑病(PML)随访期(随机化后2年)。
[0346] 前一段落中提供的剂量值为标称剂量。II期剂量施用使用小瓶和注射器，小瓶浓度为150mg/ml。为了能够进行一致的准确剂量施用，选择0.7ml作为每次皮下(SC)注射的体积。因此，标称100mg剂量臂的实际药物量为105mg(1x 0.7ml SC注射)，标称300mg剂量的实际药物量为315mg(3x 0.7ml SC注射)。420mg的实际负荷剂量为420mg(4x 0.7ml SC注射)。所有SC注射都施用入腹部。因此，“100mg”的剂量和“105mg”的剂量在本文中可互换使用。此外，“300mg”的剂量和“315mg”的剂量在本文中可互换使用。最后，在本文的某些情况下，作为速记及为了方便，将其中患者接受“300mg+负荷剂量(LD)”的试验臂称为“300mg剂量”。因此，除非文中清楚地另有说明，“300mg+负荷剂量”等同于“300mg剂量”。
[0347] 为了符合条件，患者必须具有最少12周按照美国胃肠病学会(ACG)实践指南诊断为UC的持续时间；即，由组织病理学报告证实的临床证据和内窥镜检查证据，在某些情况下由MCS≥5或在某些情况下由MCS≥6证实的中度至严重疾病的证据，包括内窥镜检查小分≥2，直肠出血小分≥1(参见表1)，及距肛外缘最少25cm的疾病活动的内窥镜检查证据。用于此研究的其他纳入和排除标准在国际专利申请公开号WO/2012/135589中提供。
[0348] 表1.用于评估溃疡性结肠炎活性的Mayo临床评分系统
[0349]
[0350] a每名患者作为他或她自己的对照来建立大便频率异常的程度。
[0351] b每日出血评分代表该日最严重的出血。
[0352] c医生的总体评估认可三个其他标准，患者每天的腹部不适的记忆和一般健康感，及其他观察结果，如体检发现和患者的体力状态。
[0353] 在随机化之前，患者必须已处于稳定剂量的用于UC的并行药物。在第1天的随机化之前，口服5-氨基水杨酸(5-ASA)和免疫抑制剂(硫唑嘌呤[AZA]、6-巯基嘌呤[6-MP]或氨甲蝶呤)剂量必须已保持稳定至少4周。在第1天的随机化之前，接受局部5-ASA或糖皮质激素的患者必须已停药2周。在第1天的随机化之前，口服糖皮质激素剂量必须已保持稳定2周。在第1天的随机化之前，接受高剂量类固醇的患者必须已降低剂量至≤20mg/天2周。对于在研究治疗期期间接受口服糖皮质激素的患者，类固醇的逐渐减少必须已在第10周开始，按每周5mg强的松或强的松当量的速率进行2周，然后按每周2.5mg强的松或强的松当量的速率进行至停药。对于接受口服免疫抑制剂(口服糖皮质激素以外)的患者，免疫抑制剂的逐渐减少必须已在第8周开始，患者必须在第10周时完全停用免疫抑制剂。在第1天随机化来接受研究药物之前，此前接受抗TNF治疗的患者必须以中断治疗最少8周。如果患者在研究期间的任意时间出现持续的或增加的疾病活动，则可以根据研究人员的临床判断增加或启动增加类固醇和/或免疫抑制剂剂量的形式的补救治疗。允许需要补救治疗的患者留在研究中但中断研究治疗，并在数据分析期间分类为已出现治疗失败。
[0354] 评估患者以确定它们是否未能响应常规治疗(包括至少一种抗TNF剂)。如本文所使用，对抗TNF剂和免疫抑制剂的反应丧失和/或耐受指以下。对于抗TNF剂，反应丧失和/或耐受指尽管之前已用以下一种或多种治疗，但活动性疾病的症状仍持续：(a)英夫单抗：5mg/kg IV，6周内3个剂量，第8周评估；(b)阿达木单抗：第0周一个160mg SC剂量，然后第2周一个80mg剂量，然后第4和6周40mg，第8周评估；或之前的反应后定期安排的维持剂量期间的复发性活动性症状(有过反应且未丧失反应的患者的选择性治疗中断不合格)；或耐受至少一种抗TNF抗体的历史(包括但不排除或限于输注相关反应或注射部位反应、感染、充血性心力衰竭、脱髓鞘)。对于免疫抑制剂，反应丧失和/或耐受指尽管之前已每周用一种或多种硫唑嘌呤(≥1.5mg/kg)或等同剂量的6-巯基嘌呤mg/kg(≥0.75mg/kg)或氨甲蝶呤
25mg SC/肌内(或如所示)治疗了至少8周，但活动性疾病的症状仍持续；或至少一种免疫抑制剂的耐受历史(包括但不排除胰腺炎、药物热、皮疹、恶心/呕吐、肝功能试验上升、硫嘌呤S-甲基转移酶遗传突变、感染)。
25mg SC/肌内(或如所示)治疗了至少8周，但活动性疾病的症状仍持续；或至少一种免疫抑制剂的耐受历史(包括但不排除胰腺炎、药物热、皮疹、恶心/呕吐、肝功能试验上升、硫嘌呤S-甲基转移酶遗传突变、感染)。
[0355] 研究治疗的随机化按糖皮质激素并行治疗(是/否)、免疫抑制剂并行治疗(是/否)、之前的抗TNF暴露(是/否)(除在美国随机化的患者外)和研究地点分层。
[0356] 在筛查时(认为这是基线MCS)、第6周(第4周给药后2周)和第10周(最后一剂研究药物后2周)用MCS评估UC疾病活动。在这些相同时间点进行的可屈性乙状结肠镜检查期间获得结肠的活检组织。还在整个研究期间收集部分MCS。还通过使用简短炎症性肠病问卷(SIBDQ)来评估患者报告结果(PRO)，该问卷将由患者在第1天及第6和10周完成。此外，在患者日记中收集疾病活动、每日症状和UC影响，该日记将由患者从筛查(第1天之前约7天直至第1天)和第6和10周研究就诊之前至少7天直至第6和10周研究就诊每天完成。还获得血清和粪便样品用于生物标志分析。在筛查时及第6、10和28周获得大便用于测量生物标志。考虑测量的示例性生物标志包括但不限于脂笼蛋白、钙防卫蛋白和乳铁蛋白(lactorferrin)。在筛查时、第1天及第4、6、10、16和28周获得血清和血浆用于测量探索性生物标志。
[0357] 此研究的主要有效性终点是到第10周时达到临床缓解(定义为MCS绝对降低至≤2，没有单个小分超过1分)的患者的比例。其他次要终点在下文所述的研究结果测量中列出。
[0358] 结果测量
[0359] 主要有效性结果测量
[0360] 主要有效性结果测量是第10周临床缓解。临床缓解定义为MCS≤2，没有单个小分超过1分(参见表1)。
[0361] 次要有效性结果测量
[0362] 用于此研究的次要有效性结果测量是：(1)第6周和第10周的临床反应，其中临床反应定义为MCS减少至少3分和从基线降低30％，直肠出血小分减少≥1分或绝对直肠出血得分为0或1；(2)第6周临床缓解(上文所定义)；和(3)第6周和第10周内窥镜检查得分和直肠出血得分为0的指针。
[0363] 探索性结果测量
[0364] 用于此研究的探索性结果测量是达到反应或缓解的患者中UC发作的时间。对于此结果测量，发作定义为部分MCS减少2分伴随3天连续直肠出血和可屈性乙状结肠镜检查上的内窥镜检查得分为2。
[0365] 安全性结果测量
[0366] 用以下测量评估rhuMAbβ7的安全性和耐受性：(1)按照4.0版美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准(NCI CTCAE，第4版)分级的不良事件和严重不良事件的发生率；(2)生命体征和安全性实验室测量中临床显著的变化；(3)由于不良事件而停药；(4)注射部位反应和超敏反应的发生率和性质；(5)感染性并发症的发生率；和(6)通过ATA的发生率测量的免疫原性。
[0367] 药代动力学结果测量
[0368] 药物动力学结果测量包括以下：(1)第一个和最后一个剂量后的Cmax；(2)第一个和最后一个剂量后达到最大浓度的时间(Tmax)；(3)最后一个剂量后的剂量间隔内的血清浓度-时间曲线下面积(AUC)；(4)从时间0至最后可检测的观察的时间(AUClast)或至无穷(AUCinf)的AUC；(5)表观清除(CL/F)；(6)表观分布体积(V/F)；和(7)清除半衰期(t1/2)。
[0369] 实施例2-预测生物标志研究和分析
[0370] 选择用于富集etrolizumab治疗的患者中的有效性的预测生物标志的实验设计
[0371] 为了鉴定预测对etrolizumab治疗的反应的新的生物标志，我们首先用RNA测序法来建立来自所有etrolizumab治疗的患者的结肠活检组织的基线基因表达概况。用来自etrolizumab治疗的未接受过TNF拮抗剂的患者的基线活检组织来鉴定经历缓解的etrolizumab治疗患者和未经历缓解的etrolizumab治疗患者之间的差异基因表达概况。差异表达的基因进一步根据信号强度、生物学相关性和其他IBD数据集中的表达来选择，然后用来自etrolizuamb治疗患者和安慰剂治疗患者的结肠活检组织中的定量聚合酶链反应进一步评估，进行亚组分析。
[0372] 肠活检组织的采集和处理
[0373] 在筛查就诊(治疗前至多4周)及开始etrolizumab治疗后第6和10周的可屈性乙状结肠镜检查/全结肠镜检查期间，从研究参与者采集肠活检组织。从肛外缘10-40cm内发炎最严重的结肠区域采集活检组织。避免溃疡黏膜的坏死区内或之前进行结肠切除的患者中的缝合部位处的活检组织。将活检组织放入组织RNA稳定缓冲液(RNAlater,Qiagen,目录号76104)，冷冻运输，或将它们放入福尔马林保存并在随后处理。
[0374] RNA分离和测序
[0375] 收到后，融化活检组织样品，用TissueLyzer(Qiagen,目录号69989)用3mm钢珠匀浆，并按照厂家说明书用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,目录号74106)分离RNA。使用Agilent RNA 6000 Pico试剂盒(Agilent Technologies,目录号5067-1513)，用Agilent 2100 Bioanalyzer评估RNA完整性。将具有低RNA质量(RIN≤5)的样品从分析中排除。用Quant-TM
iT RNA Assay试剂盒(Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA,USA)定量RNA。
iT RNA Assay试剂盒(Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA,USA)定量RNA。
[0376] 高质量总RNA(250ng)输入Illumina TruSeq RNA样品制备试剂盒v2流程，并结合Beckman Coulter Life Sciences的Biomek液体处理平台运行。用Agilent 2200TapeStation High Sensitivity D1K Tape和qPCR with the KAPA Library
Quantification Kit for Illumina Sequencing评价RNA文库。上样2nM(每个泳道12个样品)文库进行簇生成，并按2x 50bp读长加指数阅读在Illumina HiSeq2000测序系统上测序。测定passing filter reads，并通过Illumina CASAVA v1.8产生fastq文件。
Quantification Kit for Illumina Sequencing评价RNA文库。上样2nM(每个泳道12个样品)文库进行簇生成，并按2x 50bp读长加指数阅读在Illumina HiSeq2000测序系统上测序。测定passing filter reads，并通过Illumina CASAVA v1.8产生fastq文件。
[0377] 差异表达基因的鉴定
[0378] 用R编程语言(http://www.r-project.org)连同来自Bioconductor project(http://bioconductor.org)的软件包进行RNA测序数据的处理和分析。用HTSeqGenie Bioconductor软件包处理原始RNA测序读出结果。简言之，用GSNAP算法(Wu,T.D.等,
Bioinformatics(Oxford,英格兰)26,873-881(2010))将读出结果与参考人基因组序列
(NCBI build 37)比对。计数落在外显子内的独特比对的读出结果对，以提供单个基因表达水平的估计。
Bioinformatics(Oxford,英格兰)26,873-881(2010))将读出结果与参考人基因组序列
(NCBI build 37)比对。计数落在外显子内的独特比对的读出结果对，以提供单个基因表达水平的估计。
[0379] 为了计算差异表达，我们使用了DESeq2Bioconductor软件包(Anders等,Genome Biology(2010)，11(10)卷，R106页)，该软件包拟合负二项广义线性模型，以确定log倍数变化和组间差异的p值。我们用来自此软件包的默认文库大小估计法来解释个体间测序深度的差异。我们最后的分析仅包括来自未接受过TNF的患者的样品。最终的广义模型包括患者是否在第10周处于缓解，测序反应的技术方面的协变量(测序板和泳道)，及Mayo临床评分的内窥镜检查小分。对于我们的统计学分析，我们用标称(非多重检验校正)p值来排序与缓解相关的候选基因。
[0380] 通过定量聚合酶链反应的基因表达分析
[0381] 用High-Capacity cDNA Reverse Transcription试剂盒(Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA,USA)将分离自上文所述 活检组织的RNA反转录为
互补的脱氧核糖核酸。通过实时聚合酶链反应(也称为定量聚合酶链反应)评估基因表达水平。按照厂家说明书使用各基因的Taqman基因表达测定(均来自Life Technologies
Corporation,Carlsbad,CA,USA)，用TaqMan PreAmp Master Mix(Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA,USA)和试剂(Fluidigm)在BioMarkTM HD System(Fluidigm Corporation,South San Francisco,CA,USA)上运行实时聚合酶链反应。用ΔCt法针对GAPDH表达归一化靶基因表达。
互补的脱氧核糖核酸。通过实时聚合酶链反应(也称为定量聚合酶链反应)评估基因表达水平。按照厂家说明书使用各基因的Taqman基因表达测定(均来自Life Technologies
Corporation,Carlsbad,CA,USA)，用TaqMan PreAmp Master Mix(Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA,USA)和试剂(Fluidigm)在BioMarkTM HD System(Fluidigm Corporation,South San Francisco,CA,USA)上运行实时聚合酶链反应。用ΔCt法针对GAPDH表达归一化靶基因表达。
[0382] 统计学分析
[0383] 根据需要用Wilcoxon秩和检验或Fisher精确检验进行统计学分析。未进行多重比较的校正。对所选择的基因进行了使用样本中位数临界值的亚组分析。在接受安慰剂的患者中评价了基因表达的纵向稳定性，其中从在基线、第6周和第10周从同一患者测量的样品测定了生物标志低或生物标志高分类的一致率。还通过计算在基线、第6周和第10周来自同一患者的样品的标准差来评估了患者内变异性。
[0384] 结果
[0385] 按照上文所述的方法和分析，用RNA序列读出结果来鉴定在etrolizumab治疗后经历缓解的患者和在etrolizumab治疗后未经历缓解的患者之间差异表达的基因。结果总结在以下表2和3中。表2显示与etrolizumab治疗后无缓解相关的具有高基线表达的差异表达基因。表3显示与在etrolizumab治疗后缓解相关的具有高基线表达的差异表达基因。如上文所述，在获自未接受过TNF拮抗剂的患者的基线结肠活检组织中鉴定差异表达的基因。用解释人种/种族、性别、技术批和基线内窥镜检查得分的广义模型来控制其他基线变量。
[0386] 表2.与etrolizumab治疗后无缓解相关的高基线基因表达
[0387]
[0388]
[0389] 表3.与etrolizumab治疗后缓解相关的高基线基因表达
[0390]
[0391]
[0392]
[0393] 通过RNA测序分析鉴定出差异表达的候选基因后，我们根据信号强度、生物学相关性和在其他数据集中的表达模式选择了这些基因(n＝46)的亚组进行进一步分析。对于这些基因，通过定量聚合酶链反应(qPCR)定量来自所有患者(n＝106)的基线活检组织中的基因表达，并用中位数临界值法评价了富集。将实施例1中所述的两个不同etrolizumab剂量组合并进行这些分析。图5显示所示基因就缓解而言在所有来者中的疗效差异的优势比。在图5中，优势比1(无疗效)显示为框中央的虚线；正疗效在中位数右侧显示，负疗效在中位数左侧显示。因此，例如，高于中位数水平的粒酶A(GZMA)和FoxM1表达及低于中位数水平的TNFSF15和SLC8A3组织表达与etrolizumab治疗后的缓解相关。图5及其他地方的定性结果总结在以下表4和表5中。
[0394] 表4.所有来者中高于中位数的基因表达水平与etrolizumab反应性相关(“高表达预测基因”或“HEPG”)。
[0395]
[0396]
[0397] 表5.所有来者中低于中位数的基因表达水平与etrolizumab反应性相关(“低表达预测基因”或“LEPG”)。
[0398]基因符号 临床终点：缓解
TNFSF15 X
SLC8A3(组织) X
MLK7.AS1 X
CCL3 X
VNN3 X
INHBA X
VNN2 X
IL18RAP X
REM2 X
TMEM154 X
CCL2 X
IL1A X
LRRC4 X
HAMP X
LMO4 X
MUCL1 X
LIF X
TM4SF4 X
FGF7 X
BEST2 X
CCL3L3 X
MX1 X
UROS X
SSTR2 X
CPA3 X
MT1M X
TNFSF15 X
SLC8A3(组织) X
MLK7.AS1 X
CCL3 X
VNN3 X
INHBA X
VNN2 X
IL18RAP X
REM2 X
TMEM154 X
CCL2 X
IL1A X
LRRC4 X
HAMP X
LMO4 X
MUCL1 X
LIF X
TM4SF4 X
FGF7 X
BEST2 X
CCL3L3 X
MX1 X
UROS X
SSTR2 X
CPA3 X
MT1M X
[0399] 图6显示所示基因就缓解而言在未接受过抗TNF的患者中的疗效差异的优势比。在图6中，优势比1(无疗效)显示为框中央的虚线；正疗效在中位数右侧显示，负疗效在中位数左侧显示。因此，例如，高于中位数水平的粒酶A(GZMA)表达和低于中位数水平的SLC8A3表达与etrolizumab治疗后的缓解相关。图6及其他地方的定性结果总结在以下表6和表7中。
[0400] 表6.未接受过TNF的患者中高于中位数的基因表达水平与etrolizumab反应性相关(“高表达预测基因”或“HEPG”)。
[0401]基因符号 临床终点：缓解
FASLG X
CCL4 X
GZMA X
FOXM1 X
ECH1 X
KLRB1 X
TMIGD2 X
ITGAE X
KCNMA1 X
GZMB X
PHF14 X
CPA2 X
DDO X
TMEM200A X
FAM125B X
CXCR6 X
SLC8A3(blood) X
FASLG X
CCL4 X
GZMA X
FOXM1 X
ECH1 X
KLRB1 X
TMIGD2 X
ITGAE X
KCNMA1 X
GZMB X
PHF14 X
CPA2 X
DDO X
TMEM200A X
FAM125B X
CXCR6 X
SLC8A3(blood) X
[0402] 表7.未接受过TNF的患者中低于中位数的基因表达水平与etrolizumab反应性相关(“低表达预测基因”或“LEPG”)。
[0403]基因符号 临床终点：缓解
PMCH X
TNFSF15 X
SLC8A3(组织) X
MLK7.AS1 X
CCL3 X
VNN3 X
INHBA X
VNN2 X
IL18RAP X
REM2 X
TMEM154 X
CCL2 X
IL1A X
LRRC4 X
HAMP X
LMO4 X
MUCL1 X
LIF X
TM4SF4 X
FGF7 X
BEST2 X
CCL3L1/3 X
UROS X
SSTR2 X
CPA3 X
MT1M X
PMCH X
TNFSF15 X
SLC8A3(组织) X
MLK7.AS1 X
CCL3 X
VNN3 X
INHBA X
VNN2 X
IL18RAP X
REM2 X
TMEM154 X
CCL2 X
IL1A X
LRRC4 X
HAMP X
LMO4 X
MUCL1 X
LIF X
TM4SF4 X
FGF7 X
BEST2 X
CCL3L1/3 X
UROS X
SSTR2 X
CPA3 X
MT1M X
[0404] 使用所选择的富集基因的基线基因表达的双向聚类允许我们鉴定出两个不同的患者聚类。如图7A中所示，T细胞相关基因(整联蛋白αE、KLRB1、FOXM1、GZMA、TMEM200A)高表达和骨髓/嗜中性粒细胞基因(IL1A、VNN2、VNN3)低表达的患者更有可能经历缓解。此外，图7B显示，缓解者中基线较高的基因趋于相关，而非缓解者中基线较高的基因趋于相关。
[0405] 随后，我们针对某些所选择的基因分析了达到缓解、黏膜愈合和反应的患者的百分比。图8显示，在所有患者(各图的左半部分)中及在未接受过抗TNF的患者(图的右半部分)中，所示基因高于中位数水平的基因表达富集用etrolizumab治疗的患者中的缓解。图8中所示的其高表达富集缓解的基因是(A)粒酶A、(B)KLRB1、(C)FOXM1和(D)整联蛋白αE。对于图8中所示的结果，我们还通过测量在筛查、第43天和第71天从个体患者获得的活检组织中粒酶A、KLRB1、FOXM1和αE中每一个的基因表达水平，定性评估(即基因表达高于中位数、处于中位数、或低于中位数)了来自研究的安慰剂臂的样品中基因表达水平的纵向稳定性。这些样品配对进行一致性比较，并计算平均一致性。安慰剂样品中的平均一致性对于粒酶A为67％，对于KLRB1，平均一致性为71％，对于FOXM1，平均一致性为70％，对于αE，平均一致性为57％。不受限于理论，认为具有较高平均一致性的基因比具有较低平均一致性的基因反映潜在生物学的更稳定方面，因此这类一致的基因最终可证明用作富集抗整联蛋白β7拮抗剂反应性的生物标志更稳健。
[0406] 粒酶A、KLRB1、FOXM1和αE中每一个的其他结果分别显示在图9-12中。如图9-12的每一个中所示，与上述结果一致，所鉴定的基因中每一个的高基线表达富集通过缓解评估的etrolizumab反应性。此外，图9-12中的数据显示，GZMA、KLRB1、FOXM1和ITGAE中每一个的高基线表达富集通过黏膜愈合和临床反应评估的etrolizumab反应性，但富集程度较不显著。图18A-D中显示在筛查活检组织中检查基线表达，并通过缓解、黏膜愈合和临床反应评估etrolizumab反应性的另一基因ECH1的数据。
[0407] 我们还观察到，某些基因在筛查活检组织中低于中位数水平的基线基因表达富集患者对etrolizumab治疗的反应性。如图13中所示，所示基因在所有患者中(各图的左半部分)及在未接受过抗TNF的患者中(图的右半部分)低于中位数水平的基因表达富集用etrolizumab治疗的患者中的缓解。图13中所示的其低表达富集缓解的基因是SLC8A3(图
13A)、TNFSF15(图13B)、CCL2(图13C)和BEST2(图13D)。对于图13中所示的结果，我们还通过测量在筛查、第43天和第71天从个体患者获得的活检组织中SLC8A3、TNFSF15、CCL2和BEST2中每一个的基因表达水平，定性(即基因表达高于中位数、处于中位数或低于中位数)评估了来自研究的安慰剂臂的样品中基因表达水平的纵向稳定性。这些样品配对进行一致性比较，并计算平均一致性。安慰剂样品中的平均一致性对于SLC8A3为66％，对于TNFSF15，平均一致性为75％，对于CCL2，平均一致性为70％，对于BEST2，平均一致性为63％。如上文所讨论，不受限于理论，认为具有较高平均一致性的基因比具有较低平均一致性的基因反映潜在生物学的更稳定方面，因此这类一致的基因最终可证明对用作富集抗整联蛋白β7拮抗剂反应性的生物标志更稳健。
13A)、TNFSF15(图13B)、CCL2(图13C)和BEST2(图13D)。对于图13中所示的结果，我们还通过测量在筛查、第43天和第71天从个体患者获得的活检组织中SLC8A3、TNFSF15、CCL2和BEST2中每一个的基因表达水平，定性(即基因表达高于中位数、处于中位数或低于中位数)评估了来自研究的安慰剂臂的样品中基因表达水平的纵向稳定性。这些样品配对进行一致性比较，并计算平均一致性。安慰剂样品中的平均一致性对于SLC8A3为66％，对于TNFSF15，平均一致性为75％，对于CCL2，平均一致性为70％，对于BEST2，平均一致性为63％。如上文所讨论，不受限于理论，认为具有较高平均一致性的基因比具有较低平均一致性的基因反映潜在生物学的更稳定方面，因此这类一致的基因最终可证明对用作富集抗整联蛋白β7拮抗剂反应性的生物标志更稳健。
[0408] SLC8A3、TNFSF15、CCL2和BEST2中每一个的其他结果分别显示在图14-17中。如图14-17的每一个中所示，与上述结果一致，所鉴定的基因中每一个的低基线表达富集通过缓解评估的etrolizumab反应性。此外，图14-17中的数据显示，SLC8A3、TNFSF15、CCL2和BEST2中每一个的低基线表达富集通过黏膜愈合和临床反应评估的etrolizumab反应性，但富集程度较不显著。图19A-D中显示在筛查活检组织中检查基线表达，并通过缓解、黏膜愈合和临床反应评估etrolizumab反应性的另一基因VNN2的数据。
[0409] 概括起来，我们显示，通过考察未响应药物(通过缓解、黏膜愈合或临床反应的临床终点评估)的etrolizumab治疗患者和响应药物(使用相同的临床终点)的etrolizumab治疗患者之间的差异基因表达模式，我们能够鉴定出许多与etrolizumab反应或无反应相关的按高于中位数的水平表达的基因。进一步的分析使我们鉴定出许多富集etrolizumab反应性的具有高基线表达或具有低基线表达的基因。具体而言，我们确定，粒酶A、KLRB1和FOXM1的高基线表达富集通过缓解、黏膜愈合和临床反应评估的etrolizumab反应性。这些基因中的每一个在来自试验的安慰剂臂中的患者的三份纵向活检组织中证明约70％一致性。此处报道的结果确认和扩展了我们之前报道的发现，之前的发现显示基线高αE表达和具有高基线表达的某些其他基因富集etrolizumab反应性(参见例如2014/055824)。
[0410] 在此处报道的研究中，我们还尤其确定，SL8A3(活检组织中)和TNFSF15的低基线表达富集通过缓解、黏膜愈合和临床反应评估的etrolizumab反应性。这些基因中的每一个也在来自试验的安慰剂臂中的患者的三份纵向活检组织中证明约70％一致性。
[0411] 外周血基因表达分析
[0412] 未治疗的患者样本群组
[0413] 群组1：在回肠结肠检查期间从UC患者(n＝30)、CD患者(n＝67)和非IBD健康对照(n＝14)采集回肠和结肠活检组织样品。从内镜医生判断为发炎或未发炎的区域采集活检组织。按上文详述从活检组织样品分离RNA。群组2：从进行肠切除的UC(n＝31)或CD(n＝32)患者采集外周血样品入PAXgene RNA管。从正常健康对照(n＝10)采集附加的PAXgene样品。群组3：从UC患者(n＝13)和健康对照(n＝8)二者的结肠的发炎和未发炎区域二者采集结肠活检组织，放入RNAlater然后按上文详述分离RNA、放入福尔马林、或立即处理用于按上文详述进行细胞分选。
[0414] 外周血RNA的收集和处理
[0415] 在etrolizumab 2期研究样品中，通过KingFisherTM(Thermo Scientific)磁性颗粒分离器上的自动化分离从冷冻的PAXgene血液管分离总RNA。简言之，使管在室温融化16小时。离心和洗涤收集白细胞沉淀后，在含有胍的缓冲液中裂解细胞。进行有机萃取，然后加入用于KingFisherTM运行的制剂中的结合缓冲液和磁珠。方法针对microRNA的保留进行优化，且在从磁珠洗脱之前包括DNAse处理步骤和清洗。使用NanoDrop ND-1000UV分光光度计，通过260和280nm吸光度读数来测定总RNA样品的纯度和量。使用Nano Assay和Caliper LabChip系统，通过Agilent Bioanalyzer 2100微流电泳评估总RNA的完整性。在来自未治疗患者样本(群组2)的外周血样品中，按照厂家说明书用PAXgene Blood RNA试剂盒IVD(Qiagen)分离RNA。用Nanodrop分光光度计定量RNA，并用RNA6000Pico试剂盒(Agilent Technologies)在Agilent 2100Bioanalyzer上评估RNA完整性。
[0416] 从结肠活检组织分离细胞
[0417] 用之前公开的方法将从未治疗患者样本(群组3(上文所述)的轻度至严重活性UC患者)采集的结肠活检组织处理为单细胞悬液。简言之，通过用5mM 1,4-二硫苏糖醇孵育后用1.5mg/ml胶原酶VIII和0.05mg/ml DNase I消化来提取单核细胞(所有试剂均来自Sigma,St Louis,MO,USA)。用 染料(Life Technologies Corporation,
Carlsbad,CA,USA)、CD45PeCy5、TCRαβPeCy7、CD8αAPC Cy7、αE integrin(CD103)FITC、β7整联蛋白APC(均来自Biolegend,London,UK)和CD8βPE(Beckman Coulter,Brea,CA,USA)染色细胞悬液。基于其αE和β7整联蛋白的表达，将TCRαβ+、CD4+或CD8+T细胞直接分选入含有β-巯基乙醇的RLT缓冲液(Qiagen,Hilden,德国)，并按照厂家的流程(Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA,USA)用PicoPure RNA分离试剂盒从其分离RNA。评估所分选群体的纯度，以确保样品纯度≥85％。
Carlsbad,CA,USA)、CD45PeCy5、TCRαβPeCy7、CD8αAPC Cy7、αE integrin(CD103)FITC、β7整联蛋白APC(均来自Biolegend,London,UK)和CD8βPE(Beckman Coulter,Brea,CA,USA)染色细胞悬液。基于其αE和β7整联蛋白的表达，将TCRαβ+、CD4+或CD8+T细胞直接分选入含有β-巯基乙醇的RLT缓冲液(Qiagen,Hilden,德国)，并按照厂家的流程(Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA,USA)用PicoPure RNA分离试剂盒从其分离RNA。评估所分选群体的纯度，以确保样品纯度≥85％。
[0418] 通过定量聚合酶链反应的基因表达分析
[0419] 用High-Capacity cDNA Reverse Transcription试剂盒(Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA,USA)将分离自上文所述PAXgene管和分选细胞的RNA反转录为互补的脱氧核糖核酸。通过实时聚合酶链反应(也称为定量聚合酶链反应)评估基因表达水平。按照厂家说明书使用各基因的Taqman基因表达测定(均来自Life Technologies
Corporation,Carlsbad,CA,USA)，用TaqMan PreAmp Master Mix(Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA,USA)和试剂(Fluidigm)在BioMarkTM HD System(Fluidigm Corporation,South San Francisco,CA,USA)上运行实时聚合酶链反应。用ΔCt法针对GAPDH表达归一化靶基因表达。
Corporation,Carlsbad,CA,USA)，用TaqMan PreAmp Master Mix(Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA,USA)和试剂(Fluidigm)在BioMarkTM HD System(Fluidigm Corporation,South San Francisco,CA,USA)上运行实时聚合酶链反应。用ΔCt法针对GAPDH表达归一化靶基因表达。
[0420] 免疫组织化学和细胞定量
[0421] 将来自etrolizumab II期研究的福尔马林固定的组织样品包埋在石蜡块中，并切为4μM切片进行染色。用抗整联蛋白αE抗体(EPR4166；Abcam plc,Cambridge,MA,USA)在Benchmark XT(Ventana Medical Systems,Inc.,Tucson,AZ,USA)自动染色仪上进行染色，用3,3”-二氨基联苯胺显色，并用苏木精对染。通过Olympus Nanozoomer自动载玻片扫描平台(Hamamatsu Photonics K.K.,Bridgewater,NJ,USA)按200x最终放大率获取全载玻片图像。经扫描的载玻片作为24位RGB图像在 软件包(version R2012a；The MathWorks,Inc.,Natick,MA,USA)中分析。计数总细胞、αE+细胞和与隐窝上皮相关的αE+细胞。用支持向量机和遗传编程的组合来鉴定隐窝上皮区域，其中单个细胞核节段化，然后在其总面积的≥25％与3,3”-二氨基联苯胺共定位时评估为免疫组织化学阳性。
[0422] 用上文详述的抗整联蛋白αE抗体和抗粒酶A多克隆山羊IgG(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)在37℃孵育60分钟，在福尔马林固定的石蜡包埋组织样品中进行了未治疗患者样本(群组3(上文所述))中的双免疫荧光研究。用抗山羊Omnimap-HRP作为检测(抗体)，并用DAPI和苏木精-II来对染切片(Ventana Medical Systems,Inc.,Tucson,AZ,USA)。
[0423] 统计学分析
[0424] 根据需要用Wilcoxon秩和检验或Fisher精确检验进行统计学分析。未进行多重比较的校正。对所选择的基因进行了使用样本中位数临界值的亚组分析。在随机化至研究的安慰剂臂的患者中评价了基因表达的纵向稳定性。
[0425] 结果
[0426] 按照上文所述的方法和分析，针对对etrolizumab的反应的预测评价了外周血RNA样品中的基线基因表达。我们分析了来自所有患者(n＝107)的基线和第1天的外周血样品。通过定量聚合酶链反应(qPCR)定量了基因表达，并用中位数临界值法评价了富集。将实施例1中所述的两个不同etrolizumab剂量组合并进行这些分析。
[0427] 我们分析了按基线外周血基因表达水平(低(低于中位数)对高(处于或高于中位数))分层的患者中，达到缓解、黏膜愈合和反应的患者的百分比。图20A-D显示，在用etrolizumab治疗的患者中，所有患者中处于和高于中位数水平的ITGAE基因表达富集缓解。如图21A-D中所示，我们还观察到具有高(处于或高于中位数)基线外周血ECH1表达的患者中富集缓解。还评价了FOXM1(图22A-D)、GZMA(图23A-D)和KLRB1(图24A-D)的外周血基因表达。如图25A-D中所示，与筛查活检组织基因表达时观察到的结果(图14A-D)不同，具有高水平SLC8A3外周血基因表达的患者响应etrolizumab治疗而具有提高的缓解。
[0428] SLC8A3基因编码钠/钙交换蛋白NCX3，NCX3作为双向切换钠和钙的膜转运蛋白发挥作用来维持细胞中的钙稳态。NCX3表达在人巨噬细胞和肌成纤维细胞上。虽然不完全了解单核细胞/巨噬细胞谱系的组织细胞和循环细胞之间的关系，但不受限于理论，它可以是，活检组织中低单核细胞/巨噬细胞细胞数指示更高水平的循环单核细胞/巨噬细胞。在这种情况下，通过低SLC8A3基因表达指示的具有低组织单核细胞/巨噬细胞含量的患者可以与通过高SLC8A3基因表达指示的具有高循环单核细胞/巨噬细胞含量的患者大致重叠。因此，组织中的低水平SLC8A3基因表达和外周血中的高水平SLC8A3基因表达相关，这种关系解释了为何组织中的低水平表达(图14A-D)和外周血中的高水平表达(图25A-D)各自可以预测对etrolizumab治疗的反应性。
[0429] 我们还观察到，某些基因低于中位数水平的基线外周血基因表达富集患者对etrolizumab治疗的反应性。如图26A-D中所示，在用etrolizumab治疗的患者中，低于中位数水平的TNFSF15基因表达富集缓解。我们还发现，如图27A-D中所示，响应etrolizumab，低于中位数水平的VNN2基因表达富集缓解。
[0430] 然后，我们评价了炎症对从上文所述未治疗的患者获得的黏膜活检组织中基因表达的影响。从CD患者、UC患者或非IBD健康对照个体采集回肠和结肠活检组织样品。从非IBD对照和UC患者的乙状结肠及从非IBD对照和CD患者的结肠和回肠采集活检组织。从内窥镜医师判断的正常黏膜采集未发炎的活检组织；如果证明有炎性疾病，则从发炎区域采集附加的活检组织。如图28A中所示，在非IBD和IBD患者二者中，与结肠活检组织相比，ITGAE基因表达在回肠活检组织中更高。但是，在IBD患者中，发炎和未发炎的结肠活检组织或发炎和未发炎的回肠活检组织之间没有显著性差异。类似地，与结肠活检组织相比，GZMA(图28B)、KLRB1(图28E)和TNFSF15(图28G)在回肠活检组织中具有更高的表达，且在发炎和未发炎的结肠或回肠活检组织之间没有差异。VNN2(图28C)在回肠中比在结肠中高，与CD患者的未发炎回肠相比在发炎的回肠中也提高。最后，与来自CD患者的未发炎的结肠活检组织相比，ECH1(图28D)在发炎的结肠中更低。
[0431] 在未治疗的患者样本群组2中评价了外周血基因表达。如图29A中所示，与健康对照个体相比，在UC患者中观察到了更低水平的ITGAE外周血基因表达。与健康对照个体相比，在CD患者中发现了更高水平的GZMA(图29B)和ECH1(图29D)外周血基因表达。与健康对照个体相比，VNN2(图29C)和FOXM1(图29H)基因表达水平在UC和CD患者中都更高。
[0432] 在基线时，与粒酶Alow和αElow患者相比，隐窝上皮中αE+细胞的数目在粒酶Ahigh和αEhigh患者中都显著更高(分别为图30A-B)。分别如图30C-D中所示，在粒酶Ahigh和αEhigh患者中，etrolizumab治疗显著降低第10周隐窝上皮中αE+细胞的数目，而在粒酶Alow和αElow患者中，etrolizumab治疗后隐窝上皮中αE+细胞数目未显著降低。
[0433] 在分离自来自群组3中的未治疗UC患者的结肠活检组织的流式细胞术分选CD4+αE+T细胞中，与CD4+αE-T细胞相比，粒酶A基因表达显著上调；与非IBD对照相比，CD4+αE+细胞中粒酶A的水平在UC患者中显著更高(图31A)。在来自UC患者的分选的CD4+αE+T细胞但不是CD8+αE+细胞中，粒酶A基因表达与αE表达正相关(图31B)。与来自未治疗的患者样本群组3的数据一致，在来自etrolizumab II期研究人群的基线结肠活检组织中，粒酶A和αE的基因表达显著正相关(图31C)。与这些观察结果一致，在来自etrolizumab II期研究中招募的患者的结肠活检组织中，粒酶A的结肠活检组织基因表达与隐窝上皮和固有层中αE+细胞的数目显著相关(图31D)。双免疫荧光染色分析显示，粒酶A染色限于结肠组织中的αE+细胞亚型(图31E)。这些数据表明，在UC患者的结肠中，αE+细胞可以是粒酶A的来源。
[0434] 总结起来，我们已显示，ITGAE、ECH1和SLC8A3的高基线外周血表达富集通过缓解、黏膜愈合和临床反应评估的etrolizumab反应性。此处报道的结果确认和扩展了我们之前报道的发现，之前的发现显示基线高αE表达和具有高基线表达的某些其他基因富集etrolizumab反应性。我们还尤其确定，VNN2和TNFSF15的低基线外周血表达富集通过缓解、黏膜愈合和临床反应评估的etrolizumab反应性。我们在独立群组中评价了这些基因的外周血基因表达，并发现它们与健康对照重叠，在来自IBD患者的样品中有一些变化。
[0435] 我们还在未治疗的患者群组中评价了本文所述基因的活检组织基因表达，发现基因表达在一些情况下(ITGAE、GZMA、KLRB1、TNFSF15)在回肠中提高，但在来自CD或UC患者的发炎样品中没有差异。VNN2在回肠中具有提高的基因表达，在发炎对未发炎的活检组织中也提高。与未发炎的结肠相比，ECH1在发炎的结肠中更低。关于ITGAE和GZMA的重叠的进一步研究显示，ITGAE和GZMA在活检组织中相关，与αE-CD4+T细胞相比，GZMA表达在分选的αE+CD4+T细胞中更高，免疫荧光显示αE+细胞亚型共表达粒酶A。
[0436] 概括起来，本文所述基因的表达水平(单独或组合)因此显示用作鉴定最有可能从靶向β7整联蛋白亚基的治疗剂(包括etrolizumab)受益的IBD患者(如UC和克隆病患者)的预测生物标志来的潜能。可以通过许多方法(例如通过qPCR)测量生物标志，且可以用多种组织样品(例如，肠活检组织或外周血)进行测量。