桥连型核苷和核苷酸转让专利

申请号 : CN201580014501.8

文献号 : CN106103463B

文献日 : 2018-11-30

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本发明公开一种桥连型核苷和核苷酸。本发明的核苷具有2',4'‑桥连结构，由以下的式I表示。本发明的包含2',4'‑桥连型人工核苷酸的寡核苷酸具有能够与公知的2',4'‑BNA/LNA相匹敌的对单链RNA的结合亲和性和超过LNA的核酸酶耐性。特别是与S‑oligo相比，具有对单链RNA非常强的结合亲和性，因此可以期待在核酸药物中的应用。

1.一种化合物或其盐，该化合物由以下的式I表示，

式中，

Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意的取代基的嘌呤-9-基或2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～

6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子；

R2和R3分别独立地表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基、可以具有1个以上选自该α组中的任意的取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～10的芳基、具有可以具有1个以上选自该α组中的任意的取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基、可以具有

1个以上选自该α组中的任意的取代基的酰基、可以具有1个以上选自该α组中的任意的取代基的甲硅烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意的取代基的磷酸基、由核酸合成的保护基保护的磷酸基、-P(R4)R5，式中，R4和R5分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1～5的烷氧基、碳原子数1～5的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基或由碳原子数1～6的烷基取代的氨基；

R6和R7分别独立地为氢原子；可以由可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基取代且可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基；或具有可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基；或者R6和R7一起表示-(CH2)n-，式中，n为2～5的整数，

所述核酸合成的保护基为：

可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基；

可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基；

甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、新戊酰基、正戊酰基、异戊酰基、辛酰基、壬酰基、癸酰基、3-甲基壬酰基、8-甲基壬酰基、3-乙基辛酰基、3,7-二甲基辛酰基、十一碳酰基、十二碳酰基、十三碳酰基、十四碳酰基、十五碳酰基、十六碳酰基、1-甲基十五碳酰基、14-甲基十五碳酰基、13,13-二甲基十四碳酰基、十七碳酰基、15-甲基十六碳酰基、十八碳酰基、1-甲基十七碳酰基、十九碳酰基、二十碳酰基、二十一碳酰基、琥珀酰基、戊二酰基、己二酰基、氯乙酰基、二氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、(E)-2-甲基-2-丁烯酰基、苯甲酰基、α-萘甲酰基、β-萘甲酰基、2-溴苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、2,4,6-三甲基苯甲酰基、4-甲苯酰基、4-甲氧苯甲酰基、2-羧基苯甲酰基、3-羧基苯甲酰基、4-羧基苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基、2-硝基苯甲酰基、2-(甲氧基羰基)苯甲酰基或4-苯基苯甲酰基；

四氢吡喃-2-基、3-溴四氢吡喃-2-基、4-甲氧基四氢吡喃-4-基、四氢噻喃-4-基或4-甲氧基四氢噻喃-4-基；

四氢呋喃-2-基或四氢硫代呋喃-2-基；

三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、异丙基二甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、甲基二异丙基甲硅烷基、甲基二叔丁基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基、丁基二苯基丁基甲硅烷基、二苯基异丙基甲硅烷基或苯基二异丙基甲硅烷基；

甲氧基甲基、1,1-二甲基-1-甲氧基甲基、乙氧基甲基、丙氧基甲基、异丙氧基甲基、丁氧基甲基或叔丁氧基甲基；

2-甲氧基乙氧基甲基；

2,2,2-三氯乙氧基甲基或双(2-氯乙氧基)甲基；

1-乙氧基乙基或1-(异丙氧基)乙基；

2,2,2-三氯乙基；

苄基、α-萘基甲基、β-萘基甲基、二苯基甲基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基或9-蒽基甲基；

4-甲基苄基、2,4,6-三甲基苄基、3,4,5-三甲基苄基、4-甲氧基苄基、4-甲氧基苯基二苯基甲基、4,4'-二甲氧基三苯基甲基、2-硝基苄基、4-硝基苄基、4-氯苄基、4-溴苄基或4-氰基苄基；

甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基或异丁氧基羰基；

4-氯苯基、2-氟苯基、4-甲氧基苯基、4-硝基苯基或2,4-二硝基苯基；

2,2,2-三氯乙氧基羰基或2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基；

乙烯氧基羰基或芳氧基羰基；或者

苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、3,4-二甲氧基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基或4-硝基苄氧基羰基，并且，该核酸合成的羟基的保护基为乙酰基、苯甲酰基、苄基、对甲氧基苯甲酰基、二甲氧基三苯甲基、单甲氧基三苯甲基或叔丁基二苯基甲硅烷基。

2.如权利要求1所述的化合物或其盐，其特征在于：

在所述式I中，所述Base为6-氨基嘌呤-9-基、2,6-二氨基嘌呤-9-基、2-氨基-6-氯嘌呤-9-基、2-氨基-6-氟嘌呤-9-基、2-氨基-6-溴嘌呤-9-基、2-氨基-6-羟基嘌呤-9-基、6-氨基-2-甲氧基嘌呤-9-基、6-氨基-2-氯嘌呤-9-基、6-氨基-2-氟嘌呤-9-基、2,6-二甲氧基嘌呤-9-基、2,6-二氯嘌呤-9-基、6-巯基嘌呤-9-基、2-氧代-4-氨基-1,2-二氢嘧啶-1-基、4-氨基-2-氧代-5-氟-1,2-二氢嘧啶-1-基、4-氨基-2-氧代-5-氯-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-甲氧基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-巯基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-羟基-

1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-羟基-5-甲基-1,2-二氢嘧啶-1-基或4-氨基-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基。

3.如权利要求1或2所述的化合物或其盐，其特征在于：

在所述式I中，所述Base为以下式：

所示的基团。

4.如权利要求1～3中任一项所述的化合物或其盐，其特征在于：

6 7

在所述式I中，R和R均为氢原子。

5.一种寡核苷酸或其药理学上可接受的盐，其含有至少1个以下的式II所示的核苷结构，式中，

6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子，R6和R7分别独立地为氢原子；可以由可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基取代且可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基；或具有可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基；或者

6 7

R和R一起表示-(CH2)n-，式中，n为2～5的整数，

并且，所述核酸合成的保护基为：

可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基；

可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基；

四氢吡喃-2-基、3-溴四氢吡喃-2-基、4-甲氧基四氢吡喃-4-基、四氢噻喃-4-基或4-甲氧基四氢噻喃-4-基；

四氢呋喃-2-基或四氢硫代呋喃-2-基；

甲氧基甲基、1,1-二甲基-1-甲氧基甲基、乙氧基甲基、丙氧基甲基、异丙氧基甲基、丁氧基甲基或叔丁氧基甲基；

2-甲氧基乙氧基甲基；

2,2,2-三氯乙氧基甲基或双(2-氯乙氧基)甲基；

1-乙氧基乙基或1-(异丙氧基)乙基；

2,2,2-三氯乙基；

苄基、α-萘基甲基、β-萘基甲基、二苯基甲基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基或9-蒽基甲基；

甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基或异丁氧基羰基；

4-氯苯基、2-氟苯基、4-甲氧基苯基、4-硝基苯基或2,4-二硝基苯基；

2,2,2-三氯乙氧基羰基或2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基；

乙烯氧基羰基或芳氧基羰基；或者

苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、3,4-二甲氧基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基或4-硝基苄氧基羰基。

6.如权利要求5所述的寡核苷酸或其药理学上可接受的盐，其特征在于：在所述式II中，R6和R7均为氢原子。

7.一种权利要求5所述的寡核苷酸或其药理学上可接受的盐的制造方法，其特征在于：包括使用以下的式I所示的化合物或其药理学上可接受的盐合成寡核苷酸的工序，式中，Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意的取代基的嘌呤-9-基或2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～

6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子；

所述核酸合成的保护基为：

可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基；

可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基；

四氢吡喃-2-基、3-溴四氢吡喃-2-基、4-甲氧基四氢吡喃-4-基、四氢噻喃-4-基或4-甲氧基四氢噻喃-4-基；

四氢呋喃-2-基或四氢硫代呋喃-2-基；

甲氧基甲基、1,1-二甲基-1-甲氧基甲基、乙氧基甲基、丙氧基甲基、异丙氧基甲基、丁氧基甲基或叔丁氧基甲基；

2-甲氧基乙氧基甲基；

2,2,2-三氯乙氧基甲基或双(2-氯乙氧基)甲基；

1-乙氧基乙基或1-(异丙氧基)乙基；

2,2,2-三氯乙基；

苄基、α-萘基甲基、β-萘基甲基、二苯基甲基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基或9-蒽基甲基；

甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基或异丁氧基羰基；

4-氯苯基、2-氟苯基、4-甲氧基苯基、4-硝基苯基或2,4-二硝基苯基；

2,2,2-三氯乙氧基羰基或2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基；

乙烯氧基羰基或芳氧基羰基；或者

桥连型核苷和核苷酸

技术领域

[0001] 本发明涉及桥连型核苷和核苷酸。更详细而言，涉及具有对单链RNA的高的结合亲和性和对核酸酶的高的耐性的桥连型核苷和核苷酸。

背景技术

[0002] 作为利用核酸药物治疗疾病的方法，有反义法、反义基因法、适配子、siRNA等。其中，反义法是从外部导入与疾病相关的mRNA互补的寡核苷酸(反义链)并形成双链，从而阻碍病原RNA的翻译过程，进行疾病治疗或预防的方法。siRNA也与此类似，通过向生物体中投与的双链RNA，阻碍从mRNA向蛋白质的翻译。另一方面，反义基因法通过从外部导入与转录病原RNA的DNA部位相对应的三链形成寡核苷酸，从而抑制从DNA向RNA的转录。另外，因为适配子是短核酸分子(寡核苷酸)，所以通过与作为疾病原因的蛋白质等生物体成分结合而发挥功能。

[0003] 作为这样的核酸药物的原料，开发出了各种人工核酸，但尚不存在最理想的分子。例如，作为目前为止所开发出来的核酸药物的原料，有S-oligo(硫代磷酸酯：
phosphorothioate)、2',4'-BNA(桥连核酸：bridged nucleic acid)/LNA(锁核酸：locked nucleic acid)(参照专利文献1～3和非专利文献1～4)等。S-oligo作为对巨细胞病毒的反义医药品，已经在美国上市。该药品虽然具有高的核酸酶耐性，但是存在与靶核酸链的结合亲和性低的难点，需要进行改进。目前为止所开发的2',4'-BNA/LNA与靶核酸链的结合亲和性都高，是作为今后的核酸药物的原料最为期待的分子。但是，对核酸酶的耐性不够，在生物体内的稳定性方面存在改善的余地。

[0004] 进一步，近年来，关于具有如下的式a和式b所示的核苷结构的寡核苷酸也提出了在该原材料中应用的方案(专利文献4)。

[0005]

[0006] 然而，作为上述式a和式b所示的结构的碱基的核苷本身的制造需要非常繁杂的工序。因此，期望开发出具有与这样的寡核苷酸同等或其以上的性能、且工业上的生产效率更加优异的寡核苷酸。

[0007] 现有技术文献

[0008] 专利文献

[0009] 专利文献1：国际公开第98/39352号

[0010] 专利文献2：国际公开第2005/021570号

[0011] 专利文献3：国际公开第2003/068795号

[0012] 专利文献4：国际公开第2009/006478号

[0013] 非专利文献

[0014] 非专利文献1：C.Wahlestedt等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000年，97卷，10号，5633-5638页

[0015] 非专利文献2：Y.Hari等，Bioorg.Med.Chem.，2006年，14卷，1029-1038页[0016] 非专利文献3：K.Miyashita等，Chem.Commun.，2007年，3765-3767页[0017] 非专利文献4：S.M.A.Rahman等，J.Am.Chem.Soc.，2008年，130卷，14号，4886-4896页

[0018] 非专利文献5：M.Kuwahara等，Nucleic Acids Res.，2008年，36卷，13号，4257-4265页

[0019] 非专利文献6：S.Obika等，Bioorg.Med.Chem.，2001年，9卷，1001-1011页发明内容

[0020] 发明所要解决的课题

[0021] 本发明是解决上述课题的发明，其目的在于提供一种生产率优异的用于反义法和核酸药物的新型分子，该分子在生物体内不容易受到核酸酶的分解、具有对靶标mRNA的高的结合亲和性和特异性，并能够高效地控制特定的基因表达。

[0022] 用于解决课题的方法

[0023] 本发明提供由以下的式I表示的化合物或其盐。

[0024]

[0025] (式中，

[0026] Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意的取代基的嘌呤-9-基或2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子；

[0027] R2和R3分别独立地表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基、可以具有1个以上选自该α组中的任意的取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～10的芳基、具有可以具有1个以上选自该α组中的任意的取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意的取代基的酰基、可以具有1个以上选自该α组中的任意的取代基的甲硅烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意的取代基的磷酸基、由核酸合成的保护基保护的磷酸基、-P(R4)R5[式中，R4和R5分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1～5的烷氧基、碳原子数1～5的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基或由碳原子数1～6的烷基取代的氨基]；

[0028] 并且，R6和R7分别独立地为氢原子；可以由可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基取代且可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基；或具有可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基；或者

[0029] R6和R7一起表示-(CH2)n-[式中，n为2～5的整数])。

[0030] 在1个实施方式中，在上述式I中，上述Base为6-氨基嘌呤-9-基、2,6-二氨基嘌呤-9-基、2-氨基-6-氯嘌呤-9-基、2-氨基-6-氟嘌呤-9-基、2-氨基-6-溴嘌呤-9-基、2-氨基-6-羟基嘌呤-9-基、6-氨基-2-甲氧基嘌呤-9-基、6-氨基-2-氯嘌呤-9-基、6-氨基-2-氟嘌呤-
9-基、2,6-二甲氧基嘌呤-9-基、2,6-二氯嘌呤-9-基、6-巯基嘌呤-9-基、2-氧代-4-氨基-1,
2-二氢嘧啶-1-基、4-氨基-2-氧代-5-氟-1,2-二氢嘧啶-1-基、4-氨基-2-氧代-5-氯-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-甲氧基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-巯基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-羟基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-羟基-5-甲基-1,2-二氢嘧啶-1-基或4-氨基-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基。

[0031] 在1个实施方式中，在上述式I中，上述Base为2-氧代-4-羟基-5-甲基-1,2-二氢嘧啶-1-基。

[0032] 在1个实施方式中，在上述式I中，R6和R7均为氢原子。

[0033] 本发明还提供含有至少1个以下式II所示的核苷结构的寡核苷酸或其药理学上可接受的盐，

[0034]

[0035] (式中，

[0036] Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意的取代基的嘌呤-9-基或2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子，

[0037] 并且，R6和R7分别独立地为氢原子；可以由可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基取代且可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基；或具有可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基；或者

[0038] R6和R7一起表示-(CH2)n-[式中，n为2～5的整数])。

[0039] 在1个实施方式中，在上述式II中，R6和R7均为氢原子。

[0040] 本发明还提供一种上述寡核苷酸或其药理学上可接受的盐的制造方法，该方法包括使用以下的式I所示的化合物或其药理学上可接受的盐合成寡核苷酸的工序，[0041]

[0042] (式中，

[0043] Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意的取代基的嘌呤-9-基或2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子；

[0044] R2和R3分别独立地表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基、可以具有1个以上选自该α组中的任意的取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～10的芳基、具有可以具有1个以上选自该α组中的任意的取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意的取代基的酰基、可以具有1个以上选自该α组中的任意的取代基的甲硅烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意的取代基的磷酸基、由核酸合成的保护基保护的磷酸基、-P(R4)R5[式中，R4和R5分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1～5的烷氧基、碳原子数1～5的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基或由碳原子数1～6的烷基取代的氨基]；

[0045] 并且，R6和R7分别独立地为氢原子；可以由可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基取代且可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基；或具有可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基；或者

[0046] R6和R7一起表示-(CH2)n-[式中，n为2～5的整数])。

[0047] 发明效果

[0048] 根据本发明，可以提供新型的2',4'-桥连型核苷和核苷酸。包含该2',4'-桥连型人工核苷酸的寡核苷酸具有能够与公知的2',4'-BNA/LNA匹敌的对单链RNA的结合亲和性和超过LNA的核酸酶耐性。特别是与S-oligo相比，具有对单链RNA非常强的结合亲和性，因此可以期待在核酸药物中的应用。与现有技术相比，本发明的2',4'-桥连型核苷和核苷酸还能够通过更简便的反应工艺制造，因此也可以进一步提高工业上的生产效率。

附图说明

[0049] 图1是表示关于5'-d(GCGTTXTTTGCT)-3'的序列的各种寡核苷酸，相对单链寡RNA靶标链而形成的双链杂交链发生解离的Tm曲线的图表。

[0050] 图2是表示利用3'-核酸外切酶对5'-d(TTTTTTTTXT)-3'的序列的各种寡核苷酸进行处理时的、未反应的寡核苷酸的比例的经时变化的图表。

[0051] 图3是表示在实施例7中进行的向小鼠活体内(in vivo)投与寡核苷酸时的靶标mRNA的敲落(knockdown)效率的结果的图表。

[0052] 图4是表示在实施例7中进行的向小鼠活体内(in vivo)投与寡核苷酸时的肝毒性的结果的图表。

[0053] 图5是表示在实施例8中进行的使用各种浓度的寡核苷酸的NMuLi细胞的相对Pten mRNA表达水平的结果的图表。

具体实施方式

[0054] 首先，对本说明书中使用的术语进行定义。

[0055] 在本说明书中，术语“碳原子数1～6的直链烷基”是指碳原子数1～6的任意的直链烷基，具体而言，是指甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基或正己基。

[0056] 在本说明书中，术语“碳原子数1～6的直链烷氧基”包括具有碳原子数1～6的任意的直链烷基的烷氧基。例如，可以列举甲氧基、乙氧基、正丙氧基等。

[0057] 在本说明书中，术语“碳原子数1～6的直链烷硫基”包括具有碳原子数1～6的任意的直链烷基的烷硫基。例如，可以列举甲硫基、乙硫基、正丙硫基等。

[0058] 在本说明书中，术语“碳原子数1～6的直链烷基氨基”包括具有1个或2个具有碳原子数1～6的任意的直链烷基的烷基氨基的、烷基氨基。例如，可以列举甲氨基、二甲基氨基、乙氨基、甲基乙基氨基、二乙基氨基等。

[0059] 在本说明书中，术语“可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基”包括碳原子数1～7的任意的直链烷基、碳原子数3～7的任意的支链烷基和碳原子数3～7的任意的环状烷基。有时也简称为“低级烷基”。例如，作为碳原子数1～7的任意的直链烷基，可以列举甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基和正庚基；作为碳原子数3～7的任意的支链烷基，可以列举异丙基、异丁基、叔丁基、异戊基等；另外，作为碳原子数3～7的任意的环状烷基，可以列举环丁基、环戊基、环己基等。

[0060] 在本说明书中，术语“可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基”包括碳原子数2～7的任意的直链烯基、碳原子数3～7的任意的支链烯基和碳原子数3～7的任意的环状烯基。有时也简称为“低级烯基”。例如，作为碳原子数2～7的任意的直链烯基，可以列举乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基等；作为碳原子数3～7的任意的支链烯基，可以列举异丙烯基、1-甲基-1-丙烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-甲基-2-丁烯基等；另外，作为碳原子数3～7的任意的环状烯基，可以列举环丁烯基、环戊烯基、环己烯基等。

[0061] 在本说明书中，术语“可以包含杂原子的碳原子数3～10的芳基”包括只由烃构成的碳原子数6～10的任意的芳基、和构成该芳基的环结构的至少1个碳原子被杂原子(例如氮原子、氧原子和硫原子以及这些原子的组合)取代的碳原子数3～12的任意的杂芳基。作为该碳原子数6～10的芳基，可以列举苯基、萘基、茚基、薁基等；另外，作为该碳原子数3～12的任意的杂芳基，可以列举吡啶基、吡咯基、喹啉基、吲哚基、咪唑基、呋喃基、噻吩基等。

[0062] 在本说明书中，作为术语“具有可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基”的例子，可以列举苄基、苯乙基、萘甲基、3-苯基丙基、2-苯基丙基、4-苯基丁基、2-苯基丁基、吡啶基甲基、吲哚基甲基、呋喃基甲基、噻吩基甲基、吡咯基甲基、2-吡啶基乙基、1-吡啶基乙基、3-噻吩基丙基等。

[0063] 在本说明书中，作为术语“酰基”的例子，可以列举脂肪族酰基和芳香族酰基。具体而言，作为脂肪族酰基的例子，可以列举甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基(pentanoyl group)、新戊酰基(pivaloyl group)、正戊酰基(valeryl group)、异戊酰基、辛酰基、壬酰基、癸酰基、3-甲基壬酰基、8-甲基壬酰基、3-乙基辛酰基、3,7-二甲基辛酰基、十一碳酰基、十二碳酰基、十三碳酰基、十四碳酰基、十五碳酰基、十六碳酰基、1-甲基十五碳酰基、14-甲基十五碳酰基、13,13-二甲基十四碳酰基、十七碳酰基、15-甲基十六碳酰基、十八碳酰基、1-甲基十七碳酰基、十九碳酰基、二十碳酰基和二十一碳酰基这样的烷基羰基；琥珀酰基、戊二酰基、己二酰基这样的羧基化烷基羰基；氯乙酰基、二氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基这样的卤代低级烷基羰基；甲氧基乙酰基这样的低级烷氧基低级烷基羰基；(E)-2-甲基-2-丁烯酰基这样的不饱和烃基羰基。另外，作为芳香族酰基的例子，可以列举苯甲酰基、α-萘甲酰基、β-萘甲酰基这样的芳基羰基；2-溴苯甲酰基、4-氯苯甲酰基这样的卤代芳基羰基；2,4,6-三甲基苯甲酰基、4-甲苯酰基这样的低级烷基化芳基羰基；4-甲氧苯甲酰基这样的低级烷氧基化芳基羰基；2-羧基苯甲酰基、3-羧基苯甲酰基、4-羧基苯甲酰基这样的羧基化芳基羰基；4-硝基苯甲酰基、2-硝基苯甲酰基这样的硝基化芳基羰基；2-(甲氧基羰基)苯甲酰基这样的低级烷氧基羰基化芳基羰基；4-苯基苯甲酰基这样的芳基化芳基羰基等。优选为甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、新戊酰基、苯甲酰基。

[0064] 在本说明书中，作为术语“甲硅烷基”的例子，可以列举三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、异丙基二甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、甲基二异丙基甲硅烷基、甲基二叔丁基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基这样的三低级烷基甲硅烷基；二苯基甲基甲硅烷基、丁基二苯基丁基甲硅烷基、二苯基异丙基甲硅烷基、苯基二异丙基甲硅烷基这样的由1～2个芳基取代的三低级烷基甲硅烷基等。优选为三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基，进一步优选三甲基甲硅烷基。

[0065] 在本说明书中，作为术语“卤原子”，例如可以列举氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。优选氟原子或氯原子。

[0066] 在本说明书中，术语“核酸合成的氨基的保护基”、“核酸合成的羟基的保护基”、“由核酸合成的保护基保护的羟基”、“由核酸合成的保护基保护的磷酸基”、“由核酸合成的保护基保护的巯基”的“保护基”，只要是核酸合成时能够稳定地保护氨基、羟基、磷酸基或巯基的基团，就没有特别限制。具体而言，是指在酸性条件或中性条件下稳定并可以利用氢解、水解、电解和光解这样的化学方法断裂的保护基。作为这样的保护基，例如，可以列举低级烷基、低级烯基、酰基、四氢吡喃基或四氢噻喃基、四氢呋喃基或四氢硫代呋喃基、甲硅烷基、低级烷氧基甲基、低级烷氧基化低级烷氧基甲基、卤代低级烷氧基甲基、低级烷氧基化乙基、卤代乙基、由1～3个芳基取代的甲基、“由芳基环被低级烷基、低级烷氧基、卤原子或氰基取代而得到的1～3个芳基取代的甲基”、低级烷氧基羰基、“由卤原子、低级烷氧基或硝基取代的芳基”、“由卤原子或三低级烷基甲硅烷基取代的低级烷氧基羰基”、烯氧基羰基、“芳基环可以被低级烷氧基或硝基取代的芳烷基氧基羰基”等。

[0067] 进一步具体而言，作为四氢吡喃基或四氢噻喃基，可以列举四氢吡喃-2-基、3-溴四氢吡喃-2-基、4-甲氧基四氢吡喃-4-基、四氢噻喃-4-基、4-甲氧基四氢噻喃-4-基等。作为四氢呋喃基或四氢硫代呋喃基，可以列举四氢呋喃-2-基、四氢硫代呋喃-2-基。作为低级烷氧基甲基，可以列举甲氧基甲基、1,1-二甲基-1-甲氧基甲基、乙氧基甲基、丙氧基甲基、异丙氧基甲基、丁氧基甲基、叔丁氧基甲基等。作为低级烷氧基化低级烷氧基甲基，可以列举2-甲氧基乙氧基甲基等。作为卤代低级烷氧基甲基，可以列举2,2,2-三氯乙氧基甲基、双(2-氯乙氧基)甲基等。作为低级烷氧基化乙基，可以列举1-乙氧基乙基、1-(异丙氧基)乙基等。作为卤代乙基，可以列举2,2,2-三氯乙基等。作为由1～3个芳基取代的甲基，可以列举苄基、α-萘基甲基、β-萘基甲基、二苯基甲基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、9-蒽基甲基等。作为“由芳基环被低级烷基、低级烷氧基、卤原子或氰基取代而得到的1～3个芳基取代的甲基”，可以列举4-甲基苄基、2,4,6-三甲基苄基、3,4,5-三甲基苄基、4-甲氧基苄基、4-甲氧基苯基二苯基甲基、4,4'-二甲氧基三苯基甲基、2-硝基苄基、4-硝基苄基、4-氯苄基、4-溴苄基、4-氰基苄基等。作为低级烷氧基羰基，可以列举甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、异丁氧基羰基等。作为“由卤原子、低级烷氧基或硝基取代的芳基”，可以列举4-氯苯基、2-氟苯基、4-甲氧基苯基、4-硝基苯基、2,4-二硝基苯基等。作为“由卤原子或三低级烷基甲硅烷基取代的低级烷氧基羰基”，可以列举2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基等。作为烯氧基羰基，可以列举乙烯氧基羰基、芳氧基羰基等。作为“芳基环可以被低级烷氧基或硝基取代的芳烷基氧基羰基”，可以列举苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、3,4-二甲氧基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基等。

[0068] 作为“核酸合成的羟基的保护基”，优选脂肪族酰基、芳香族酰基、由1～3个芳基取代的甲基、“由芳基环被低级烷基、低级烷氧基、卤原子或氰基取代而得到的1～3个芳基取代的甲基”或甲硅烷基，进一步优选乙酰基、苯甲酰基、苄基、对甲氧基苯甲酰基、二甲氧基三苯甲基、单甲氧基三苯甲基或叔丁基二苯基甲硅烷基。作为“由核酸合成的保护基保护的羟基”的保护基，优选脂肪族酰基、芳香族酰基、“由1～3个芳基取代的甲基”、“由卤原子、低级烷氧基或硝基取代的芳基”、低级烷基或低级烯基，进一步优选苯甲酰基、苄基、2-氯苯基、4-氯苯基或2-丙烯基。作为“核酸合成的氨基的保护基”，优选酰基，进一步优选苯甲酰基。作为“由核酸合成的保护基保护的磷酸基”的“保护基”，优选低级烷基、由氰基取代的低级烷基、芳烷基、“芳基环被硝基或卤原子取代的芳烷基”或“由低级烷基、卤原子或硝基取代的芳基”，进一步优选2-氰基乙基、2,2,2-三氯乙基、苄基、2-氯苯基或4-氯苯基。作为“由核酸合成的保护基保护的巯基”的“保护基”，优选脂肪族酰基或芳香族酰基，进一步优选苯甲酰基。

[0069] 在本说明书中，-P(R4)R5[式中，R4和R5分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1～5的烷氧基、碳原子数1～5的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基或由碳原子数1～6的烷基取代的氨基]所示的基团中R4可以表示为OR4a且R5可以表示为NR5a的基团称为“亚磷酰胺基(phosphoramidite group)”。作为亚磷酰胺基，优选式-P(OC2H4CN)(N(iPr)2)所示的基团或式-P(OCH3)(N(iPr)2)所示的基团。其中，iPr表示异丙基。

[0070] 在本说明书中，术语“核苷”和“核苷类似物”是指嘌呤或嘧啶碱基与糖结合而成的“核苷”中非天然型的物质、以及可以利用嘌呤和嘧啶以外的芳香族杂环和芳香族烃环代替嘌呤或嘧啶碱基与糖结合而成的物质。

[0071] 在本说明书中，术语“人工寡核苷酸”和“寡核苷酸类似物”指的是2～50个相同或不同的“核苷”或“核苷类似物”通过磷酸二酯键结合而成的“寡核苷酸”的非天然型衍生物。作为那样的类似物，优选列举糖部分被修饰的糖衍生物；磷酸二酯部分被硫酯化的硫酯衍生物；末端的磷酸部分被酯化的酯体；嘌呤碱基上的氨基被酰胺化的酰胺体，进一步优选列举糖部分被修饰的糖衍生物。

[0072] 在本说明书中，术语“其盐”是指本发明的式I或式II所示的化合物的盐。作为这样的盐，例如可以列举钠盐、钾盐、锂盐这样的碱金属盐，钙盐、镁盐这样的碱土金属盐，铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等金属盐；铵盐这样的无机盐、叔辛基胺盐、二苄基胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、N,N'-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N-苄基-苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐这样的有机盐等胺盐；氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐这样的氢卤酸盐，硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐；甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐这样的低级烷磺酸盐，苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐这样的芳基磺酸盐，乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等有机酸盐；和甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐这样的氨基酸盐。

[0073] 在本说明书中，作为术语“其药理学上可接受的盐”，是指含有至少1个本发明的式II所示的核苷结构的寡核苷酸类似物的盐。作为这样的盐，例如可以列举钠盐、钾盐、锂盐这样的碱金属盐，钙盐、镁盐这样的碱土金属盐，铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等金属盐；铵盐这样的无机盐、叔辛基胺盐、二苄基胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、N,N'-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N-苄基-苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐这样的有机盐等胺盐；氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐这样的氢卤酸盐，硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐；甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐这样的低级烷磺酸盐，苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐这样的芳基磺酸盐，乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等有机酸盐；和甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐这样的氨基酸盐。

[0074] 以下，对本发明进行详细说明。

[0075] 本发明的2',4'-桥连型核苷和核苷酸或其盐(优选药理学上可接受的盐)(以下，只要没有特别写明，术语“2',4'-桥连型核苷”包括2',4'-桥连型核苷本身、2',4'-桥连型核苷的盐、2',4'-桥连型核苷的药理学上可接受的盐)具有以下的式I所示的结构。

[0076]

[0077] (式中，

[0078] “Base”表示可以具有1个以上选自α组中的任意的取代基的嘌呤-9-基或2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～
6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子；

[0079] R2和R3分别独立地表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基、可以具有1个以上选自该α组中的任意的取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～10的芳基(优选可以具有1个以上选自该α组中的任意的取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～9的芳基)、具有可以具有1个以上选自该α组中的任意的取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意的取代基的酰基、可以具有1个以上选自该α组中的任意的取代基的甲硅烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意的取代基的磷酸基、由核酸合成的保护基保护的磷酸基、-P(R4)R5[式中，R4和R5分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1～5的烷氧基、碳原子数1～5的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基或由碳原子数1～6的烷基取代的氨基]；

[0080] 并且，R6和R7分别独立地为氢原子；可以由可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基取代且可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基；或具有可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基；或者

[0081] R6与R7一起表示-(CH2)n-[式中，n为2～5的整数])。

[0082] 在上述式I中，“Base”是嘌呤碱基(即嘌呤-9-基)或嘧啶碱基(即2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基)。这些碱基可以具有1个以上选自由包括羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基和卤原子的α组中的任意的取代基。

[0083] 作为上述“Base”的具体例，可以列举6-氨基嘌呤-9-基(腺嘌呤基)、2,6-二氨基嘌呤-9-基、2-氨基-6-氯嘌呤-9-基、2-氨基-6-氟嘌呤-9-基、2-氨基-6-溴嘌呤-9-基、2-氨基-6-羟基嘌呤-9-基(鸟嘌呤基)、6-氨基-2-甲氧基嘌呤-9-基、6-氨基-2-氯嘌呤-9-基、6-氨基-2-氟嘌呤-9-基、2,6-二甲氧基嘌呤-9-基、2,6-二氯嘌呤-9-基、6-巯基嘌呤-9-基、2-氧代-4-氨基-1,2-二氢嘧啶-1-基(胞嘧啶基)、4-氨基-2-氧代-5-氟-1,2-二氢嘧啶-1-基、4-氨基-2-氧代-5-氯-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-甲氧基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-巯基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-羟基-1,2-二氢嘧啶-1-基(尿嘧啶基)、2-氧代-
4-羟基-5-甲基-1,2-二氢嘧啶-1-基(胸腺嘧啶基)和4-氨基-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基。

[0084] 其中，从向核酸药物导入的观点考虑，“Base”优选分别由以下的结构式：

[0085]

[0086] 表示的2-氧代-4-羟基-5-甲基-1,2-二氢嘧啶-1-基(胸腺嘧啶基)、2-氧代-4-氨基-1,2-二氢嘧啶-1-基(胞嘧啶基)、6-氨基嘌呤-9-基(腺嘌呤基)、2-氨基-6-羟基嘌呤-9-基(鸟嘌呤基)、4-氨基-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基和2-氧代-4-羟基-1,2-二氢嘧啶-1-基(尿嘧啶基)，特别优选2-氧代-4-羟基-5-甲基-1,2-二氢嘧啶-1-基(胸腺嘧啶基)。另外，在合成寡核苷酸时，优选利用保护基对羟基进行保护。

[0087] 进一步，作为上述式(I)中R6和R7的组合的一个例子，可以列举R6和R7均为氢原子的情况。或者，作为R6和R7的组合的另一个例子，为可以根据在库林科维奇反应(Kulinkovich reaction)中使用的直链或支链状的格氏试剂的种类和所添加的烯烃的种类而制作的组合，例如，式(I)可以列举能够由以下：

[0088]

[0089] 表示的组合。

[0090] 本发明的2',4'-桥连型核苷通过向现有的2',4'-BNA/LNA的交联结构的6'位导入例如螺环丙烷基，可以提高后述的寡核苷酸的酶耐性。另外，这样的环丙烷基团中的环的形变直接影响糖部的构象。因此，相对于得到的寡核苷酸，本发明的2',4'-桥连型核苷也可以利用该影响而进一步提高与ssRNA的结合亲和性。另外，关于本发明的2',4'-桥连型核苷，在其合成中，向桥连结构的6'位导入螺环丙烷基可以容易地利用公知的反应(库林科维奇反应)。螺环丙烷基的至少1部分被取代的本发明的2',4'-桥连型核苷也是同样的。因此，本发明的2',4'-桥连型核苷即使与6'位导入甲基、甲氧基甲基等其它的取代基的现有的2',4'-BNA/LNA相比，也能够更有效地合成。

[0091] 在本发明中，寡核苷酸(2',4'-桥连型人工核苷酸)可以使用这样的2',4'-桥连型核苷进行制备。例如，可以按照非专利文献5所记载的方法容易地进行三磷酸化。

[0092] 本发明的寡核苷酸或其药理学上可接受的盐含有至少1个以下的式II所示的核苷结构：

[0093]

[0094] (式中，“Base”、R6和R7的含义与上述式I中定义的相同)。

[0095] 本发明的寡核苷酸在任意的位置具有至少1个上述核苷结构。其位置和数量没有特别限定，可以根据目的适当设计。

[0096] 包含这样的核苷结构的寡核苷酸类似物(反义分子)与使用现有的2',4'-BNA/LNA的情况相比，酶耐性飞跃性地提高。还具有能够与公知的2',4'-BNA/LNA相匹敌的ssRNA结合亲和性。

[0097] 根据这些内容，使用本发明的2',4'-桥连型核苷合成的寡核苷酸类似物可以期待作为以抗肿瘤剂、抗病毒剂为代表的阻碍特定基因的机能而治疗疾病的医药品(反义分子等)的有用性。

[0098] 特别是在反义法中，对于互补正义链RNA的结合亲和性和对生物体内DNA分解酶的耐性这两者是必须的。一般而言，已知核酸在单链状态下，糖部分的结构不断地在近似于DNA双链的形态、和近似于DNA-RNA双链或近似于RNA双链的形态之间摇摆。在单链核酸与互补的RNA链形成双链时，其糖部分结构被固定。因此，在本发明的2',4'-桥连型核苷中，因为糖部分被预先固定为形成双链时的状态，所以容易与目标RNA链形成双链，能够稳定地存在。另外，还已知核酸双链通过被称为水分子网络的、像链一样连接的水合水而稳定化。

[0099] 本发明的寡核苷酸类似物例如能够配合赋形剂、粘合剂、防腐剂、抗氧化剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂等在医药制剂技术领域中通常使用的辅助剂，制成非口服制剂或脂质体制剂。另外，例如能够配合在该技术领域一般使用的医药用载体，配制液剂、霜剂、软膏剂等局部用的制剂。

[0100] 实施例

[0101] 以下，利用实施例对本发明进行更加具体的说明，但本发明并不限定于这些实施例。

[0102] (实施例1：2',4'-桥连型核苷的合成(1)：螺环丙烷BNA-T(scpBNA-T)酰胺链段的合成)

[0103]

[0104] 各工序的试剂和条件：(a)DMP,CH2Cl2,室温,40分钟,定量；(b)H2O2水溶液,NaClO2,NaH2PO4水溶液,MeCN,室温,1小时,96％；(c)MeI,NaHCO3,DMF,室温,20小时,93％；(d)EtMgBr,Ti(OiPr)4,THF,室温,18小时,89％；(e)TBSOTf,2,6-二甲基吡啶,CH2Cl2,室温,2小时,90％；(f)Ac2O,TFA,AcOH,室温,5小时；(g)胸腺嘧啶,BSA,TMSOTf,MeCN,80℃,2小时；(h)MeNH2,THF,室温,4小时；(i)MsCl,吡啶,室温,4小时,72％(4工序)；(j)NaOH水溶液,THF-EtOH,70℃,8小时；(j2)TBAF,THF,室温,5小时,91％；(j3)K2CO3,DMF,90℃,20小时,
77％；(k)Tf2O,吡啶,室温,14小时；(l)TBAF,THF,室温,2小时,32％(3工序)；(m)H2,Pd(OH)2/C,EtOH,室温,2小时；(n)DMTrCl,吡啶,室温,14小时,60％(2工序)；(o)iPr2NP(Cl)OC2H4CN,DIPEA,MeCN,室温,2小时,60％。

[0105] (1)化合物2的合成

[0106]

[0107] 在氮气流下，向化合物1(7.38g，18.5mmol)的无水二氯甲烷溶液(100mL)中添加戴斯-马丁氧化剂(Dess-Martin perioddinane)(9.41g，22.2mmol)，以室温搅拌40分钟。反应结束后，在0℃添加饱和硫代硫酸钠水溶液和饱和碳酸氢钠水(2﹕1(v/v))，以室温搅拌10分钟。减压蒸馏除去溶剂后，添加二乙醚，用水和饱和食盐水清洗。接着，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂，得到化合物2(7.61g，定量)，其为无色油状物质。

[0108] 将得到的化合物2的物性数据表示在表1中。

[0109] [表1]

[0110]

[0111] (2)化合物3的合成

[0112]

[0113] 向上述得到的化合物2(7.61g，19.1mmol)的乙腈溶液(10mmL)中添加磷酸二氢钠(0.2M水溶液，20mL，3.82mmol)和过氧化氢水(30重量％，2.3mL，21.0mmol)。用10分钟向其中滴加亚氯酸(0.75M水溶液，38mL，28.6mmol)后，以室温搅拌1小时。接着，在0℃向反应溶液中添加亚硫酸钠(4.8g，19.1mmol)，以室温搅拌10分钟。减压蒸馏除去溶剂后，用乙酸乙酯提取，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂，得到化合物3(7.61g，96％)，其为白色固体。

[0114] 将得到的化合物3的物性数据表示在表2中。

[0115] [表2]

[0116]

[0117] (3)化合物4的合成

[0118]

[0119] 在氮气流下，向上述得到的化合物3(7.61g，18.4mmol)的无水N,N-二甲基甲酰胺溶液(30mL)中添加碳酸氢钠(15.4g，184mmol)和碘代甲烷(2.86mL，45.9mmol)，搅拌20小时。反应结束后，向其中添加饱和硫代硫酸钠水溶液和水，用二乙醚提取。用水和饱和食盐水清洗，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂，得到化合物4(7.35g，93％)，其为白色固体。

[0120] 将得到的化合物4的物性数据表示在表3中。

[0121] [表3]

[0122] 得到的化合物4的物性数据；计的计算值；实测值

[0123]

[0124] (4)化合物5的合成

[0125]

[0126] 在氮气流下，在0℃向上述得到的化合物4(500mg，1.17mmol)的无水四氢呋喃溶液(14mL)中添加钛酸四异丙酯(0.35mL，1.17mmol)和乙基溴化镁(1M四氢呋喃溶液，5.83mL，5.83mmol)，以室温搅拌18小时。反应结束后，向其中添加饱和氯化铵水溶液，搅拌10分钟。
减压蒸馏除去溶剂后，用乙酸乙酯提取，用水和饱和食盐水清洗。再用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂，得到化合物5(0.442g，89％)，其为红色膏状物质。

[0127] 将得到的化合物5的物性数据表示在表4中。

[0128] [表4]

[0129]

[0130] (5)化合物6的合成

[0131]

[0132] 在氮气流下，向上述得到的化合物5(2.55g，5.99mmol)的无水二氯甲烷溶液(50mL)中添加2,6-二甲基吡啶(2.09mL，18.0mmol)和三氟甲磺酸叔丁基二甲基甲硅烷基酯(2.75mL，12.0mmol)，以室温搅拌2小时。接着，向其中添加饱和碳酸氢钠水，用乙酸乙酯提取后，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯﹕己烷＝1﹕15(v/v)→1﹕5(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物6(2.92g，90％)，其为黄色油状物质。

[0133] 将得到的化合物6的物性数据表示在表5中。

[0134] [表5]

[0135]

[0136] (6)化合物7的合成

[0137]

[0138] 向上述得到的化合物6(8.04g，14.9mmol)的乙酸溶液(17.0mL，0.30mol)中添加乙酸酐(28.2mL，0.30mol)和三氟乙酸(3.20mL，44.7mmol)，以室温搅拌5小时。向其中加入饱和碳酸氢钠水，用乙酸乙酯提取后，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂，得到化合物7(9.43g，粗产物)，其为红褐色油状物质。不对该化合物7进行精制而直接用于接下来的反应。

[0139] (7)化合物8的合成

[0140]

[0141] 在氮气流下，以室温向上述得到的化合物7(9.43g，粗产物)的无水乙腈溶液(140mL)中添加胸腺嘧啶(5.63g，44.6mmol)、N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(25％乙腈溶液，18.2mL，74.3mmol)、三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(4.03mL，22.3mmol)，以80℃搅拌2小时。反应结束后，在0℃向其中添加饱和碳酸氢钠水，用乙酸乙酯提取，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂，得到化合物8(8.26g)，其为红褐色油状物质。

[0142] 将得到的化合物8的物性数据表示在表6中。

[0143] [表6]

[0144]

[0145] (8)化合物9的合成

[0146]

[0147] 向上述得到的化合物8(8.26g，粗产物)的四氢呋喃溶液(150mL)中添加甲胺(40％水溶液，30.4mL，0.73mol)，以室温搅拌4小时。反应结束后，减压蒸馏除去四氢呋喃。用乙酸乙酯提取，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂，得到化合物9(7.50g)，其为黄色泡状物质。

[0148] 将得到的化合物9的物性数据表示在表7中。

[0149] [表7]

[0150]

[0151] (9)化合物10的合成

[0152]

[0153] 在氮气流下，向上述得到的化合物9(7.50g，粗产物)的无水吡啶溶液(120mL)中添加甲磺酰氯(1.43mL，18.5mmol)，以室温搅拌4小时。反应结束后，向其中添加水，用乙酸乙酯提取，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯﹕己烷＝1﹕5(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物10(7.39g，4工序)，其为白色泡状固体。

[0154] 将得到的化合物10的物性数据表示在表8中。

[0155] [表8]

[0156]

[0157] (10)化合物11的合成

[0158]

[0159] 向上述得到的化合物10(3.19g，4.64mmol)的四氢呋喃-乙醇溶液(150mL，3﹕2(v/v))中添加氢氧化钠(4M，水溶液，60mL，0.23mol)，以70℃搅拌8小时。反应结束后，用盐酸中和，减压蒸馏除去溶剂。用乙酸乙酯提取后，用饱和食盐水和水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂，得到化合物11(2.71g，粗产物)，其为白色固体。

[0160] 将得到的化合物11的物性数据表示在表9中。

[0161] [表9]

[0162]

[0163] (11)化合物12的合成

[0164]

[0165] 在氮气流下，向化合物11(2.71g，粗产物)的无水吡啶溶液(50mL)中添加三氟乙酸酐(3.65mL，22.3mmol)，以室温搅拌12小时。再向其中添加三氟乙酸酐(0.73mL，4.45mmol)，以室温搅拌2小时。接着，向其中添加水，用乙酸乙酯提取后，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂，得到化合物12(4.12g，粗产物)，其为褐色泡状固体。不对该化合物12进行精制而直接用于接下来的反应。

[0166] (12)化合物13的合成(A)

[0167]

[0168] 向上述得到的化合物12(4.12g，粗产物)的四氢呋喃溶液(250mL)中添加四丁基氟化铵(1M四氢呋喃溶液，13.9mL，13.9mmol)，以室温搅拌2小时。反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯﹕己烷＝2﹕3(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物13(710mg，32％，3工序)，其为黄色泡状固体。

[0169] 将上述合成(A)中得到的化合物13的物性数据表示在表10中。

[0170] [表10]

[0171]

[0172] (12)－2化合物13的合成(B)

[0173]

[0174] 代替“上述化合物13的合成(A)”，作为“合成(B)”，按照如下操作由化合物10重新经过化合物17合成化合物13。

[0175] 在氮气流下，向化合物10(459mg，0.67mmol)的无水四氢呋喃溶液(25mL)中添加四丁基氟化铵(1M四氢呋喃溶液，0.67mL，0.67mmol)，以室温搅拌5小时。反应结束后，添加水，用乙酸乙酯提取，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(氯仿﹕甲醇＝50﹕1(v/v)→20﹕1(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物17(290mg，91％)，其为白色固体。

[0176] 将得到的化合物17的物性数据表示在表11中。

[0177] [表11]

[0178]

[0179] 接着，向化合物17(1.62g，3.40mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(35mL)中添加碳酸钾(1.1g，10.2mmol)，以90℃搅拌20小时。反应结束后，添加水，用二乙醚提取，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(己烷﹕乙酸乙酯＝1﹕1(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物13(1.23g，77％)，其为白色固体。

[0180] 将上述合成(B)中得到的化合物13的物性数据表示在表12中。

[0181] [表12]

[0182]

[0183] (13)化合物14的合成

[0184]

[0185] 在氢气流下，向上述得到的化合物13(350mg，1.50mmol)的乙醇溶液(20mL)中添加20％氢氧化钯/碳(钯20％，170mg)，以室温搅拌2小时。对反应混合物进行过滤后，减压蒸馏除去溶剂，得到化合物14(230mg，粗产物)，其为白色泡状固体。

[0186] 将得到的化合物14的物性数据表示在表13中。

[0187] [表13]

[0188]

[0189] (14)化合物15的合成

[0190]

[0191] 在氮气流下，向上述得到的化合物14(130mg，粗产物)的无水吡啶溶液(15mL)中添加4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(892mg，2.63mmol)，以室温搅拌14小时。向其中添加水，用二氯甲烷提取后，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(含有0.5％三乙胺的氯仿﹕甲醇＝50﹕1(v/v))对得到的粗产物进行精制，得到化合物15(160mg，60％)，其为白色泡状固体。

[0192] 将得到的化合物15的物性数据表示在表14中。

[0193] [表14]

[0194]

[0195] (15)化合物16的合成

[0196]

[0197] 在氮气流下，向上述得到的化合物15(30.0mg，0.05mmol)的无水乙腈溶液(1.0mL)中添加N,N-二异丙基乙胺(34.8μL，0.20mmol)、2-氰基乙基-N,N-二异丙基磷酰氯(22.3μL，0.10mmol)，以室温搅拌2小时。减压蒸馏除去溶剂，利用硅胶柱色谱法(含有0.5％三乙胺的乙酸乙酯﹕己烷＝2﹕1(v/v))对得到的粗产物进行精制，得到化合物16(24mg，60％(scpBNA－T酰胺链段))，其为白色泡状固体。

[0198] 将得到的化合物16的物性数据表示在表15中。

[0199] [表15]

[0200]

[0201] (实施例2)寡核苷酸的合成和精制

[0202] 将实施例1中得到的化合物16(酰胺链段)以及dG(iBu)、dC(Bz)和T的亚磷酰胺(均为Sigma-Aldrich公司制)分别制成0.1M的无水乙腈溶液，使用nS-8Oligonucleotides Synthesizer(GeneDesign,Inc.制寡核苷酸合成装置)，按照该领域中公知的亚磷酰胺法，进行寡核苷酸(5'-d(GCGTTXTTTGCT)-3'、5'-d(GCGTTXTXTGCT)-3'、5'-d(GCGTTXXTTGCT)-3'、5'-d(GCGXTXTXTGCT)-3'、5'-d(GCGTTXXXTGCT)-3'和5'-d(TTTTTTTTXT)-3')的合成(其中，X相当于实施例1中得到的化合物16(酰胺链段))。

[0203] 在该合成中，合成规模为0.2μmol，并且在Trityl-on条件下进行。活化剂使用Activator 42(Sigma-Aldrich公司制0.25M乙腈溶液)。关于缩合时间，在使用化合物16的合成中为8分钟，在使用其它的天然的酰胺链段的合成中为32秒。合成结束后，以室温用28％的氨水处理1.5小时，进行从柱载体的洗脱，接着以55℃静置12小时，从而进行碱基部和磷酸二酯部的脱保护。接着，利用简易反相柱(Waters公司制Sep-Pak(注册商标)Plus C18Environmental Cartridges)精制，再利用反相HPLC进行精制。

[0204] 其中，该HPLC的条件如下所述。

[0205] 柱使用Waters公司制Xbridge(注册商标)MS C18 2.5μmol(4.6mm×50mm，10mm×50mm)，调制0.1M的乙酸三乙铵(TEAA)缓冲溶液(pH7.0)作为流动相的A液，并调制0.1M的TEAA缓冲溶液：乙腈＝1﹕1(v/v)作为B液，对B液的浓度实行6～12％(30分钟)的梯度。分析以1mL/分钟进行，分离以3mL/分钟进行。检测UV为254nm。

[0206] 另外，代替上述化合物16(酰胺链段)，使用利用Obika等、Tetrahedron Lett.、1997年、38、pp.8735-8738所记载的方法合成的2',4'-BNA/LNA(除了在桥连结合部分的6'位不具有螺环丙烷基以外，具有与上述实施例1中得到的化合物16相同的结构)，与上述同样地合成寡核苷酸。

[0207] 另外，代替上述化合物16(酰胺链段)，使用天然胸苷(Sigma-Aldrich公司制)，与上述同样操作合成寡核苷酸。

[0208] (实施例3)寡核苷酸的组成的确认和定量

[0209] 利用MALDI-TOF-MASS测定确定实施例2中得到的寡核苷酸的组成。在进行该测定时，首先，使3-羟基吡啶甲酸水溶液(10mg/mL)和柠檬酸二铵水溶液(1mg/mL)以1﹕1的容量比混合而成的基体(1μL)在测定板上干燥，将溶解在水中的寡核苷酸(50μM，1μL)放在干燥的基体上使之干燥，之后进行测定。利用阴离子反射器(negative reflector)模式进行分子量的测定，使用寡聚胸苷酸(7mer、15mer和23mer)作为外部标准。另外，通过使用吸光度测定装置(岛津制作所制SHIMADZU UV-1800)测定260nm的紫外部吸收进行合成的寡核苷酸的定量。

[0210] 将得到的结果表示在表16中。

[0211] [表16]

[0212]

[0213]

[0214] (实施例4)熔解温度(Tm)的测定

[0215] 在本实施例中，关于具有5'-(AGCAAAAAACGC)-3'的序列(序列号1)的单链寡DNA和单链寡RNA的靶标链(与实施例1一样，分别按照亚磷酰胺法合成)，调查实施例2的各种寡核苷酸的杂交形成能(结合亲和性)。

[0216] 对各种寡核苷酸和靶标链进行退火处理形成双链，之后，测定Tm值，从而调查寡核苷酸的杂交形成能。测定所形成的双链的Tm值。

[0217] 具体而言，将各寡核苷酸(最终浓度4μM)和氯化钠(最终浓度100mM)的磷酸缓冲溶液(10mM，pH7.2，130μL)在沸水中进行水浴，缓慢地冷却至室温。测定装置使用SHIMADZU UV-1650PC、SHIMADZU UV-1800spectrometers(株式会社岛津制作所制)，在氮气流下，将测定溶液冷却至5℃，开始测定。以0.5℃/分钟的速度升温至90℃，以0.5℃的间隔绘制260nm的吸光度。利用中线法算出Tm值，取独立的3次测定的平均值。

[0218] 表17表示将单链寡DNA作为靶标链时的结果，表18表示将单链寡RNA作为靶标链时的结果。均表示作为双链的50％发生解离的温度的Tm值与每个修饰单位的Tm值之差(使用化合物16(酰胺链段)的情况和使用2',4'-BNA/LNA的情况)。

[0219] [表17]

[0220]

[0221] [表18]

[0222]

[0223] 由表17和18可知，与天然的寡核苷酸相比，包含化合物16(酰胺链段)的寡核苷酸相对单链寡DNA和单链寡RNA两者，Tm值都高，显示了高的结合亲和性。特别是相对单链寡RNA，包含化合物16(酰胺链段)的寡核苷酸显示出能够与2',4'-BNA/LNA相匹敌的高的结合亲和性。

[0224] 图1表示关于5'-d(GCGTTXTTTGCT)-3'的序列的各种寡核苷酸，相对单链寡RNA靶标链而形成的双链杂交链发生解离的Tm曲线。图1的纵轴表示260nm的吸光度，横轴表示温度(℃)。

[0225] 由图1还可知，相对单链寡RNA，包含化合物16(酰胺链段)的寡核苷酸显示出能够与2',4'-BNA/LNA相匹敌的高的结合亲和性。

[0226] (实施例5)核酸酶耐性的评价

[0227] 如下操作调制分别使用了实施例1的化合物16(酰胺链段)、2',4'-BNA/LNA(T)和天然胸苷作为5'-d(TTTTTTTTXT)-3'的序列的X的10mer的各种寡核苷酸。即，在寡聚物的合成中，将原料核苷的亚磷酰胺制成0.1M的无水乙腈溶液，使用nS-8 Oligonucleotides Synthesizer(GeneDesign,Inc.制寡核苷酸合成装置)，按照通常的亚磷酰胺法进行。在该合成中，合成规模为1.0μmol，并且在Trityl-on条件下进行。活化剂使用Activator 42(Sigma-Aldrich公司制0.25M乙腈溶液)。关于缩合时间，在使用化合物16的合成中为10分钟，在使用其它的天然的酰胺链段的合成中为40秒。合成结束后，将柱载体移入微型管，在28％的氨水中以55℃静置一晩，进行从柱载体的洗脱、以及碱基部和磷酸二酯部的脱保护。
接着，利用简易反相柱(Waters公司制Sep-Pak(注册商标)Plus C18 Environmental Cartridges)进行精制，再利用反相HPLC进行精制。关于HPLC的条件，柱使用Waters公司制Xbridge(注册商标)MS C18 2.5μmol(4.6mm×50mm，10mm×50mm)，调制0.1M的乙酸三乙铵(TEAA)缓冲溶液(pH7.0)作为流动相的A液，并调制0.1M的TEAA缓冲溶液﹕乙腈＝1﹕1(v/v)作为B液，对B液的浓度实行6～12％(30分钟)的梯度。分析以1mL/分钟，分离以3mL/分钟进行。检测UV为260nm。

[0228] 核酸酶耐性的评价如下所述进行。向各种寡核苷酸(最终浓度4μM)和氯化镁(最终浓度10mM)的三-盐酸缓冲溶液(50mM，pH8.0，100μL)中加入3'-核酸外切酶(Crotalus Admanteus Venom Phosphodiesterase：CAVP，Pharmacia Biotech公司制)，使其达到1μg/mL，以37℃静置。从反应开始起在2.5、5、10、20、40、80分钟后每次从反应液取20μL，在90℃下静置2.5分钟，使酶失活，利用反相HPLC对原料寡核苷酸的残量进行定量。关于HPLC的条件，柱使用Waters Xbridge(注册商标)MS C18 2.5μmol(4.6mm×50mm)，调制0.1M乙酸三乙铵(TEAA)缓冲溶液(pH7.0)作为流动相的A液，调制0.1M TEAA缓冲溶液﹕乙腈＝1﹕1(v/v)作为B液，以B液浓度6～12％(20分钟)的梯度进行。以1mL/分钟的流速进行分析，以260nm的UV进行检测。

[0229] 算出10mer和9mer的寡核苷酸的残量作为未反应的寡核苷酸的比例(％)，相对于反应时间绘图。将结果表示在图2中。

[0230] 图2是表示利用3'-核酸外切酶对5'-d(TTTTTTTTXT)-3'的序列的各种寡核苷酸进行处理时的、未反应的寡核苷酸的比例的经时变化的图表。图1的纵轴表示对于核酸酶处理未反应的寡核苷酸的比例(％)，横轴表示核酸酶处理时间(分钟)。图2的符号表示如下含义，菱形：含有实施例1的化合物16(酰胺链段)的寡核苷酸；四边形：含有2',4'-BNA/LNA的寡核苷酸；三角形：含有天然胸苷的寡核苷酸。

[0231] 由图2可知，含有化合物16(酰胺链段)的寡核苷酸即使在核酸酶处理的80分钟后也仍然残存60％以上未反应，难以分解。相对于此，含有2',4'-BNA/LNA的寡核苷酸和天然胸苷的寡核苷酸在核酸酶处理的20分钟后基本分解。因此，含有化合物16(酰胺链段)的寡核苷酸显示出远高于含有2',4'-BNA/LNA的寡核苷酸的酶耐性。

[0232] (实施例6：2',4'-桥连型核苷的合成(2)：螺环丙烷BNA-mC(scpBNA-mC)酰胺链段的合成)

[0233]

[0234] 各工序的试剂和条件：(a)Et3SiCl,吡啶,室温,2小时,95％.；(b)1,2,4-三唑,POCl3,Et3N,MeCN,室温,2小时,77％；(c)NH3水溶液,1,4-二噁烷,室温,2小时,98％(2工序)；(d)BzCl,吡啶,室温,3小时,83％；(e)TBAF,THF,室温,10分钟,88％；(f)iPr2NP(Cl)OCH2C H2CN,DIPEA,MeCN,室温,2小时,78％。

[0235] (1)化合物18的合成

[0236]

[0237] 在氩气流下，向实施例1中得到的化合物15(167mg，0.28mmol)的无水吡啶溶液(2mL)中添加三乙基氯硅烷(0.24mL，1.39mmol)，以室温搅拌2小时。反应结束后，以0℃添加饱和碳酸氢钠水，用乙酸乙酯提取，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(己烷﹕乙酸乙酯＝2﹕1(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物18(188mg，95％)，其为黄色泡状固体。

[0238] 将得到的化合物18的物性数据表示在表19中。

[0239] [表19]

[0240]

[0241] (2)化合物19的合成

[0242]

[0243] 在氩气流下，以0℃向化合物18(969mg，1.36mmol)、三乙胺(2.79mL，20.1mmol)和1,2,4-三唑(1.39g，20.1mmol)的无水乙腈溶液(15mL)中滴加磷酰氯(0.38mL，4.03mmol)。
以室温搅拌2小时后，向反应溶液中添加饱和碳酸氢钠水，用乙酸乙酯提取，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂，得到化合物19(1.06g，77％)。对于化合物19，不进行精制而直接用于接下来的反应。

[0244] (3)化合物20的合成

[0245]

[0246] 以0℃向化合物19(1.06g)的1,4-二噁烷溶液(10mL)中添加氨水溶液(28重量％，1.26mL，67.0mmol)，以室温搅拌2小时。反应结束后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(氯仿﹕甲醇＝30﹕1(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物20(958mg，98％，2工序)，其为白色泡状固体。

[0247] 将得到的化合物20的物性数据表示在表20中。

[0248] [表20]

[0249]

[0250] (4)化合物21的合成

[0251]

[0252] 在氩气流下，以0℃向化合物20(902mg，1.27mmol)的无水吡啶溶液(13mL)中添加苯甲酰氯(0.22mL，1.90mmol)，以室温搅拌3小时。反应结束后，加入饱和碳酸氢钠水，用乙酸乙酯提取，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(己烷﹕乙酸乙酯＝5﹕1(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物21(861mg，83％)，其为黄色泡状固体。

[0253] 将得到的化合物21的物性数据表示在表21中。

[0254] [表21]

[0255]

[0256] (5)化合物22的合成

[0257]

[0258] 以0℃向化合物21(701mg，0.86mmol)的四氢呋喃溶液(8mL)中添加四丁基氟化铵(1M四氢呋喃溶液，2.58mL，2.58mmol)，以室温搅拌10分钟。反应结束后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(己烷﹕乙酸乙酯＝2﹕1(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物22(528mg，88％)，其为白色泡状固体。

[0259] 将得到的化合物22的物性数据表示在表22中。

[0260] [表22]

[0261]

[0262] (6)化合物23的合成

[0263]

[0264] 在氩气流下，以0℃向化合物22(528mg，0.75mmol)的无水乙腈溶液(7mL)中添加N,N-二异丙基乙胺(0.39mL，2.26mmol)和2-氰基乙基-N,N-二异丙基磷酰氯(0.25mL，1.13mmol)，以室温搅拌2小时。反应结束后，添加饱和碳酸氢钠水，用乙酸乙酯提取，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(含有0.5％三乙胺的己烷﹕乙酸乙酯＝2﹕1(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物23(529mg，
78％：scpBNA-mC酰胺链段)，其为白色泡状固体。

[0265] 将得到的化合物23的物性数据表示在表23中。

[0266] [表23]

[0267]

[0268] (实施例7：动物实验)

[0269] (1)动物实验用寡核苷酸的设计和合成

[0270] 选择同源性鼠靶标磷酸酶-张力蛋白(mouse phosphatase and tensin homolog)(Pten)mRNA作为靶标基因(NCBI参照号：NM_008960.2)，合成与全部8229个碱基中的第60个碱基至第73个碱基互补的寡核苷酸。其中，序列使用已经报告的序列(Molecular Therapy-Nucleic Acids,2012,1,e47)。

[0271] 关于寡核苷酸的合成，首先为了比较，制作表24所示的对全部的连接(linkage)进行了硫代磷酸酯化的2',4'-BNA/LNA搭载寡核苷酸(寡核苷酸1)。另一方面，使用实施例1中m得到的scpBNA-T酰胺链段(化合物16)和实施例6中得到的scpBNA-C酰胺链段(化合物23)，制作scpBNA搭载寡核苷酸(寡核苷酸2)。这些寡核苷酸的制作通过GeneDesign,Inc.合作生产。制作的寡核苷酸被形成钠型、且为不含内毒素的活体内等级。

[0272] (2)熔解温度(Tm)的测定

[0273] 如下所述评价上述得到的寡核苷酸1和2的与互补链RNA(5'-agcugcagccauga-3'(序列号2))的结合亲和性。

[0274] 向磷酸缓冲溶液(10mM NaH2PO4-10mM Na2HPO4，100mM NaCl，pH7.0)中分别添加最终浓度达到2μM的寡核苷酸1和寡核苷酸2，调制各寡核苷酸溶液。使该溶液在4℃～95℃的温度范围内以0.5℃/分钟升温，分别监测260nm时的吸光度。利用中线法算出Tm值，取独立的3次测定的平均值。将结果与寡核苷酸1和寡核苷酸2的质量分析结果一起表示在表24中。

[0275] [表24]

[0276]

[0277] a对全部的连接进行了硫代磷酸酯化。

[0278] b各文字表示如下含义：小写DAN；大写2',4'-BNA/LNA；带下划线的大写scpBNA。

[0279] c利用MALDI-TOF-MS对各寡核苷酸进行测定，由Gene Design.Inc进行分析。

[0280] 如表24所示，寡核苷酸1(2',4'-BNA/LNA搭载寡核苷酸)与寡核苷酸2(scpBNA搭载寡核苷酸)的Tm值没有看到大的差异，可知这些寡核苷酸1和2的结合亲和性基本为同等程度。

[0281] (3)投与实验

[0282] 购入7周龄的小鼠C57BL/6J(雄)(日本SLC公司)作为被试验动物，驯化1周。之后，对这些小鼠向腹腔内给予总用量为200μL的溶解在生理盐水中的寡核苷酸1(35mg/kg)、寡核苷酸2(35mg/kg)或生理盐水(投与组N＝4)。72小时后，在异氟烷麻醉下解剖小鼠，从下腔大静脉采血后，用PBS进行心脏灌流。之后，摘出肝脏，在RNA later(注册商标)Stabilization Solution(Thermo Fisher Scientific，AM7021)下4℃保存。

[0283] 接着，从上述保存的肝脏取出一部分切片，添加QuickGene RNA tissue kit SII(和光纯药工业株式会社制RT-S2)的LRT(含有2-巯基乙醇)500μL，加入不锈钢球1粒，进行均质化(TAITEC公司制μT-12，转速：2,000rpm，3分钟)。之后，在室温下以12,000rpm离心3分钟，回收上清液385μL。添加试剂盒的SRT 175μL，利用旋涡混合15秒，减缓旋转。之后，添加特级乙醇140μL，利用旋涡再混合1分钟，减缓旋转。将这样得到的全部量放入RNA自动提取器(和光纯药工业株式会社制QuickGene-800)中，提取总RNA。

[0284] 接着，对总RNA 2μg进行逆转录反应。使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Thermo Fisher Scientific，4368813)，按照该制品的规程制作cDNA。

[0285] 之后，将上述cDNA稀释至30倍，调制cDNA溶液，进行针对靶标基因Pten的real-time PCR。Pten的表达量分析以对于管家基因Gapdh的表达量的相对表达量进行评价。在该反应中，使用TaqMan(注册商标)Fast Universal PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific，4352042)和TaqMan probe(Thermo Fisher Scientific，Pten：Mm00477208_m1，Gapdh:Mm99999915_g1)，按照该制品的规程进行。

[0286] 然后，从采自上述小鼠的下腔大静脉的血液样品中如下所述分离血清。

[0287] 向加入了血液凝固促进剂和血清分离剂的管(BD，365967)中添加所采集的血液样品，以5,000rpm、4℃离心20分钟。回收血清，用于以后的血液检查。

[0288] 对于该血清，使用转氨酶CII-Test Wako(和光纯药工业株式会社制431-30901)算出肝毒性的指标GOT(AST)值和GPT(ALT)值。将基质酶液和显色试剂等量混合，作为基质显色液。将基质显色液100μL分注到96孔板上，以37℃加温5分钟。之后，向该显色液中添加上述得到的血清2μL，以37℃加温20分钟，添加反应停止液200μL，使用微孔板检测仪(Plate Reader)(Molecular Device公司制SpectraMax M5e)测定555nm时的吸光度。按照该制品附带的规程，利用标准曲线法由得到的吸光度算出AST/ALT值。

[0289] 将得到的结果表示在图3和图4中。

[0290] 如图3所示，对在肝脏内表达的Pten mRNA的表达量进行定量，结果，给予寡核苷酸1和2都显示高的敲落(knockdown)效率(60％～70％)，可知scpBNA搭载寡核苷酸(寡核苷酸
2)显示了与2',4'-LNA/BNA搭载寡核苷酸(寡核苷酸1)同等的反义活性。

[0291] 相对于此，如图4所示，在2',4'-LNA/BNA搭载寡核苷酸(寡核苷酸1)的投与组中，AST/ALT值超过100/30Karmen，可以确认毒性。在scpBNA搭载寡核苷酸(寡核苷酸2)的投与组中，AST/ALT值与寡核苷酸1的值进行比较，值减少至其一半左右，没有确认到肝毒性。

[0292] (实施例8：活体外(in vitro)反义活性评价)

[0293] (1)向细胞导入反义核酸和制作细胞破碎液

[0294] 将来自小鼠肝脏肿瘤的细胞株NMuLi以2.5×103cells/well的细胞数接种在96孔板上，培养24小时。按照该板所附带的规程，使实施例7中得到的寡核苷酸1或2和Lipofectamine 2000在Opti-MEM中形成复合体，向各孔的10％FBS/DMEM(不含抗生物质)100μL中添加50μL的复合体。24小时后，从孔中除去培养基，用PBS清洗后，添加Lysis TM
Solution 49.7μL和gDNA Remover 0.3μL的混合液(SuperPrep ，Toyobo Co.,Ltd.制，SCQ-
101)50μL/孔，轻微振荡后，室温下培养5分钟。接着，添加Stop Solution 9.5μL和RNase Inhibitor 0.5μL的混合液(SuperPrepTM，Toyobo Co.,Ltd.制，SCQ-101)10μL/孔，轻微振荡后，室温下培养2分钟，得到细胞破碎液。

[0295] 之后，对于8μL的5×RT Master Mix和24μL的Nuclease-free Water的混合液(SuperPrepTM，Toyobo Co.,Ltd.制，SCQ-101)32μL，添加上述调制的细胞破碎液8μL。以37℃、15分钟→50℃、5分钟→98℃、5分钟→4℃、10分钟的顺序升高温度，进行逆转录反应，制作cDNA溶液。接着，将得到的cDNA溶液稀释至30倍，进行针对靶标基因Pten的real-time PCR。Pten的表达量分析以对于管家基因Gapdh的表达量相的相对表达量进行评价。在反应中，使用TaqMan(注册商标)Fast Universal PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific，4352042)和TaqMan probe(Thermo Fisher Scientific，Pten：Mm00477208_m1，Gapdh:Mm99999915_g1)，按照该制品的规程进行反应。

[0296] 另外，对于浓度的对数，绘制Pten mRNA的相对残存量，使用图形软件(Hulinks Inc.制Igor Pro)进行拟合(Sigmoid mode)，算出IC50。

[0297] 将以0.25nM至200nM的浓度(关于各浓度N＝4)分别导入寡核苷酸1和2的结果表示在图5中。并将上述算出的IC50的结果表示在表25中。

[0298] [表25]

[0299]

[0300] a对于利用NMuLi细胞的脂质转染法的转染后的Pten mRNA敲落的IC50

[0301] 由图5和表25可知，关于IC50的值，与寡核苷酸1相比，寡核苷酸2显示了稍高的值，但NMuLi细胞的Pten mRNA表达水平在寡核苷酸1与2之间没有看出实质的差异。由此可知scpBNA搭载寡核苷酸(寡核苷酸2)在活体外(in vitro)时也显示了与2',4'-LNA/BNA搭载寡核苷酸(寡核苷酸1)同等的反义活性。

[0302] 迄今为止，在投与了保持高的反义活性的2',4'-LNA/BNA搭载寡核苷酸的情况下，报告了大量肝毒性也显示高值的案例。然而，根据上述实施例7和8的结果，投与scpBNA搭载寡核苷酸时，获得了维持高的反义活性且不表现肝毒性的结果，由此可知，本发明的寡核苷酸对于开发面向核酸药品化的新型的桥连型人工核酸模拟是有用的。

[0303] (实施例9：2',4'-桥连型核苷的合成(3)：螺环丙烷BNA-A(scpBNA-A)酰胺链段的合成)

[0304]

[0305] 各工序的试剂和条件：(a)N6-苯甲酰基腺嘌呤,BSA,TMSOTf,MeCN,80℃,26小时,50％(2工序)；(b)K2CO3,MeOH,0℃,20分钟,99％；(c)AZADOL,PhI(OAc)2,CH2Cl2,室温,6小时,89％；(d)NaBH4,EtOH,0℃,20分钟,70％(2工序,R:S＝2.6:1)；(e)Tf2O,DMAP,CH2Cl2,室温,1小时；(f)TBAF,THF,室温,1小时,14％(2工序)；(g)MeNH2水溶液,THF,室温,1小时,
83％；(h)H2,Pd(OH)2/C,HCO2NH4,EtOH/AcOH,回流,5小时,46％；(i)(1)TMSCl,吡啶,0℃,40分钟,(2)BzCl,室温,2小时,(3)NH3水溶液,0℃,3小时,61％(3工序)；(j)DMTrCl,吡啶,室温,19小时,72％；(k)iPr2NP(Cl)OC2H4CN,DIPEA,MeCN,室温,4小时,67％.

[0306] (1)化合物24的合成

[0307]

[0308] 在氮气流下，以0℃向实施例1中得到的化合物7(6.14g)的无水乙腈(70mL)溶液中添加N6-苯甲酰基腺嘌呤(2.58g，10.8mmol)和N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(5.65mL，23.1mmol)，搅拌10分钟。接着，以0℃滴加三氟甲磺酸三甲基甲硅烷酯(2.78mL，15.4mmol)，在80℃搅拌22小时。反应结束后，以0℃添加饱和碳酸氢钠水，用乙酸乙酯提取，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(己烷﹕乙酸乙酯＝2﹕1(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物24(2.91g，50％(2工序))，其为白色泡状固体。

[0309] 将得到的化合物24的物性数据表示在表26中。

[0310] [表26]

[0311]

[0312] (2)化合物25的合成

[0313]

[0314] 向化合物24(2.20g，2.88mmol)的甲醇(40mL)溶液中添加碳酸钾(795mg，5.75mmol)，以0℃搅拌20分钟。反应结束后，以0℃添加水，用乙酸乙酯提取，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(己烷﹕乙酸乙酯＝
3﹕2(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物25(2.05g，99％)，其为白色泡状固体。

[0315] 将得到的化合物25的物性数据表示在表27中。

[0316] [表27]

[0317]

[0318] (3)化合物26的合成

[0319]

[0320] 向化合物25(1.08g，1.50mmol)的二氯甲烷(15mL)溶液中添加二乙酰氧基碘苯(724mg，2.25mmol)和2-羟基-2-氮杂金刚烷(11.5mg，0.075mmol，5mol％)，以室温搅拌6小时。反应结束后，添加饱和硫代硫酸钠水溶液和饱和碳酸氢钠水(2﹕1(v/v))，用乙酸乙酯提取，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂，得到化合物26(1.08g)，其为黄色泡状固体。不对该化合物26进行精制而直接用于接下来的反应。

[0321] (4)化合物27的合成

[0322]

[0323] 向化合物26(1.08g)的乙醇(15mL)溶液中添加硼氢化钠(79.4mg，2.10mmol)，以室温搅拌20分钟。反应结束后，添加水，用乙酸乙酯提取，用饱和食盐水和水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(己烷﹕乙酸乙酯＝1﹕1(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物27(773mg，70％，2工序，R﹕S＝2.6﹕1)，其为黄色泡状固体。得到的化合物27是非对映异构体的分离困难的混合物，因此将该混合物直接用于接下来的反应。

[0324] (5)化合物28的合成

[0325]

[0326] 在氮气流下，向化合物27(773mg，1.07mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中添加4-二甲基氨基吡啶(653mg，5.35mmol)和三氟甲磺酸酐(0.22mL，1.39mmol)，以室温搅拌1小时。反应结束后，添加饱和碳酸氢钠水，用乙酸乙酯提取，用饱和氯化铵水溶液、水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂，得到化合物28(869mg，R﹕S＝2.6﹕1)，其为黄色泡状固体。不对该化合物28进行精制而直接用于接下来的反应。

[0327] (6)化合物29的合成

[0328]

[0329] 向化合物28(869mg)的四氢呋喃(10mL)溶液中添加四丁基氟化铵(1M四氢呋喃溶液，3.21mL，3.21mmol)，以室温搅拌1小时。反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，利用硅胶柱色谱法(己烷﹕乙酸乙酯＝1﹕1(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物29(90mg，14％，2工序)，其为白色泡状固体。

[0330] 将得到的化合物29的物性数据表示在表28中。

[0331] [表28]

[0332]

[0333] (7)化合物30的合成

[0334]

[0335] 向化合物29(60mg，0.102mmol)的四氢呋喃(1mL)溶液中添加甲胺水溶液(40重量％，0.42mL，5.09mmol)，以室温搅拌1小时。反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯﹕己烷＝3﹕1(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物30(41mg，83％)，其为白色泡状固体。

[0336] 将得到的化合物30的物性数据表示在表29中。

[0337] [表29]

[0338]

[0339] (8)化合物31的合成

[0340]

[0341] 向化合物30(450mg，0.927mmol)的乙醇-乙酸(30.9mL，100﹕3(v/v))溶液中添加20％氢氧化钯/碳(钯20％，198mg)和甲酸铵(3.5g，55.6mmmol)，在回流下加热5小时。将反应溶液用菊花形滤纸过滤后，减压蒸馏除去溶剂，利用硅胶柱色谱法(氯仿﹕甲醇＝10﹕1(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物31(130mg，46％)，其为白色泡状固体。

[0342] 将得到的化合物31的物性数据表示在表30中。

[0343] [表30]

[0344]

[0345] (9)化合物32的合成

[0346]

[0347] 在氮气流下，向化合物31(81.0mg，0.265mmol)的无水吡啶(2mL)溶液中添加三甲基氯硅烷(67.0μL，0.531mmol)，以0℃搅拌40分钟。接着，添加苯甲酰氯(92.0μL，0.795mmol)，以室温搅拌2小时。然后，添加氨水溶液(28重量％，1.2mL，18.6mmol)，以0℃搅拌3小时。减压蒸馏除去反应溶液，利用硅胶柱色谱法(氯仿﹕甲醇＝30﹕1(v/v)→10﹕1(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物32(66mg，61％)，其为白色泡状固体。

[0348] 将得到的化合物32的物性数据表示在表31中。

[0349] [表31]

[0350]

[0351] (10)化合物33的合成

[0352]

[0353] 在氮气流下，向化合物32(16mg，39.0μmol)的无水吡啶(0.5mL)溶液中添加4,4'-二甲氧基氯化物(19.9mg，59.0μmol)，以室温搅拌15小时。之后，添加4,4'-二甲氧基氯化物(23mg，67.9μmol)，以室温搅拌4小时。然后，添加4,4'-二甲氧基氯化物(223mg，0.18mmol)，以室温搅拌1小时。添加饱和碳酸氢钠水，用乙酸乙酯提取后，用饱和食盐水和水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯﹕己烷＝1﹕1(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物33(20mg，72％)，其为白色泡状固体。

[0354] 将得到的化合物33的物性数据表示在表32中。

[0355] [表32]

[0356]

[0357] (11)化合物34的合成

[0358]

[0359] 在氮气流下，向化合物33(52mg，73.1μmol)的无水乙腈(1mL)溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(38μL，21.9μmol)和2-氰基乙基-N,N-二异丙基磷酰氯(24μL，11.0μmol)，以室温搅拌2小时。之后，添加N,N-二异丙基乙胺(76μL，43.8μmol)、2-氰基乙基-N,N-二异丙基磷酰氯(24μL，11.0μmol)，以室温搅拌1小时。然后，添加2-氰基乙基-N,N-二异丙基磷酰氯(24μL，11.0μmol)，以室温搅拌1小时。添加饱和碳酸氢钠水，用乙酸乙酯提取后，用饱和食盐水和水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(含有0.5％三乙胺的乙酸乙酯﹕己烷＝2﹕1(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物34(45mg，67％：scpBNA-A酰胺链段)，其为白色泡状固体。

[0360] 将得到的化合物34的物性数据表示在表33中。

[0361] [表33]

[0362]

[0363] (实施例10：2',4'-桥连型核苷的合成(4)：螺环丙烷BNA-G(scpBNA-G)酰胺链段的合成)

[0364]

[0365] 各工序的试剂和条件：(a)N2-异丁基鸟嘌呤,BSA,TMSOTf,MeCN,80℃,18小时,49％；(b)K2CO3,MeOH,0℃,1小时,95％；(c)AZADOL,PhI(OAc)2,CH2Cl2,室温,7小时；(d)NaBH4,MeOH/CH2Cl2,0℃,1小时,80％(2工序,R:S＝2:1)；(e)Tf2O,DMAP,CH2Cl2,0℃,1小时；
(f)TBAF,THF,室温,30分钟,4％(2工序)；(g)H2,Pd(OH)2/C,AcOEt,回流,5小时；(h)DMTrCl,吡啶,室温,19小时；(i)iPr2NP(Cl)OC2H4CN,DIPEA,MeCN,室温,4小时。

[0366] (1)化合物35的合成

[0367]

[0368] 在氮气流下，以80℃向实施例1中得到的化合物7(77mg，0.132mmol)的无水乙腈(1.5mL)溶液中添加N2-异丁酰鸟嘌呤(41mg，0.184mmol)和N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(97.0μL，0.395mmol)，搅拌20分钟。接着，以0℃添加三氟甲磺酸三甲基甲硅烷酯(48.0μL，0.263mmol)，以80℃搅拌18小时。反应结束后，以0℃添加饱和碳酸氢钠水，用乙酸乙酯提取，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯﹕己烷﹕甲醇＝2﹕10﹕1(v/v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物35(48mg，49％)，其为白色泡状固体。

[0369] 将得到的化合物35的物性数据表示在表34中。

[0370] [表34]

[0371]

[0372] (2)化合物36的合成

[0373]

[0374] 向化合物35(48mg，65.6mmol)的甲醇(1.5mL)溶液中添加碳酸钾(27mg，0.197mmol)，以0℃搅拌1小时。反应结束后，以0℃添加水，用乙酸乙酯提取，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯﹕己烷＝
2﹕1(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物36(44mg，95％)，其为白色泡状固体。

[0375] 将得到的化合物36的物性数据表示在表35中。

[0376] [表35]

[0377]

[0378] (3)化合物37的合成

[0379]

[0380] 向化合物36(6.5g，9.23mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液中添加二乙酰氧基碘苯(4.46g，13.8mmol)和2-羟基-2-氮杂金刚烷(71mg，0.462mmol，5mol％)，以室温搅拌7小时。反应结束后，添加饱和硫代硫酸钠水溶液和饱和碳酸氢钠水，用乙酸乙酯提取，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂，得到化合物37(7.0g)，其为黄色泡状固体。不对该化合物37进行精制而直接用于接下来的反应。

[0381] (4)化合物38的合成

[0382]

[0383] 向化合物37(7.0g)的甲醇-二氯甲烷(90mL，1﹕2(v/v))溶液中添加硼氢化钠(489mg，12.9mmol)，以0℃搅拌1小时。反应结束后，添加饱和氯化铵水溶液，用乙酸乙酯提取，用饱和食盐水和水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(氯仿﹕甲醇＝30﹕1(v/v))对得到的粗产品进行精制，得到化合物38(5.2g，80％，2工序、R﹕S＝2﹕1)，其为黄色泡状固体。得到的化合物38是非对映异构体的分离困难的混合物，因此将该混合物直接用于接下来的反应。

[0384] (5)化合物39的合成

[0385]

[0386] 在氮气流下，向化合物38(300mg，0.43mmol)的无水二氯甲烷(5mL)溶液中添加4-二甲基氨基吡啶(156mg，1.28mmol)和三氟甲磺酸酐(90μL，0.55mmol)，以0℃搅拌1小时。反应结束后，添加饱和碳酸氢钠水，用乙酸乙酯提取，用水和饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂，得到化合物39(408mg)，其为黄色泡状固体。不对该化合物39进行精制而直接用于接下来的反应。

[0387] (6)化合物40的合成

[0388]

[0389] 向化合物39(408mg)的四氢呋喃(4mL)溶液中添加四丁基氟化铵(1M四氢呋喃溶液，1.28mL，1.28mmol)，以室温搅拌30分钟。反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯﹕己烷﹕甲醇＝2﹕7﹕1)对得到的粗产品进行精制，得到化合物40(9mg，4％(2工序))，其为白色泡状固体。

[0390] 将得到的化合物40的物性数据表示在表36中。

[0391] [表36]

[0392]

[0393] (7)化合物41的合成

[0394]

[0395] 向化合物40的乙酸乙酯溶液中添加20％氢氧化钯/碳(钯20％)，在氢气流下搅拌5小时。将反应溶液用菊花形滤纸过滤后，减压蒸馏除去溶剂，利用硅胶柱色谱法(氯仿﹕甲醇)对得到的粗产品进行精制，以适当的收率得到化合物41。

[0396] (8)化合物42的合成

[0397]

[0398] 在氮气流下，向化合物41的无水吡啶溶液中添加4,4'-二甲氧基氯化物，以室温搅拌19小时。添加饱和碳酸氢钠水，用乙酸乙酯提取后，用饱和食盐水和水清洗。用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯﹕己烷)对得到的粗产品进行精制，以适当的收率得到化合物42。

[0399] (9)化合物43的合成

[0400]

[0401] 在氮气流下，向化合物42的无水乙腈溶液中添加N,N-二异丙基乙胺和2-氰基乙基-N,N-二异丙基磷酰氯，以室温搅拌2小时。添加饱和碳酸氢钠水，用乙酸乙酯提取后，用饱和食盐水和水清洗。用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(含有0.5％三乙胺的乙酸乙酯﹕己烷)对得到的粗产品进行精制，以适当的收率得到化合物43(scpBNA-G酰胺链段)。

[0402] 产业上的可利用性

[0403] 根据本发明，可以提供6'位具有螺环丙烷基的新型的2',4'-桥连型核苷和核苷酸。包含该2',4'-桥连型人工核苷酸的寡核苷酸具有能够与公知的2',4'-BNA/LNA相匹敌的对单链RNA的结合亲和性、和超过LNA的核酸酶耐性。本发明的寡核苷酸例如作为核酸药物的原材料是有用的。

桥连型核苷和核苷酸转让专利

申请号 : CN201580014501.8

文献号 : CN106103463B

文献日 : 2018-11-30

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发明人 : 小比贺聪 , 山口卓男 , 堀场昌彦 , 胁玲子

申请人 : 国立大学法人大阪大学

摘要 :

权利要求 :

说明书 :

桥连型核苷和核苷酸

技术领域

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具体实施方式