一种特异性肿瘤抗原SF的CTL识别表位肽及其应用

摘要

本发明公开了一种特异性肿瘤抗原SF的CTL识别表位肽，其为九肽，其氨基酸序列为Glu‑Lys‑Asn‑Val‑Asn‑Gln‑Ser‑Leu‑Leu。本发明还公开了上述表位肽在制备具有SF表达的肿瘤治疗性多肽疫苗的应用。本发明还公开了由上述表位肽制备相应的DC细胞和DC‑CIK细胞的方法。本发明还公开了上述DC细胞和DC‑CIK细胞的应用。

权利要求

1.一种特异性肿瘤抗原SF的CTL识别表位肽，其特征在于，所述CTL识别表位肽为九肽，其氨基酸序列为Glu-Lys-Asn-Val-Asn-Gln-Ser-Leu-Leu。

2.权利要求1所述特异性肿瘤抗原SF的CTL识别表位肽在制备具有SF表达的肿瘤治疗性多肽疫苗的应用。

3.权利要求1所述特异性肿瘤抗原SF的CTL识别表位肽在制备肝癌治疗性多肽疫苗中的应用。

4.一种肿瘤抗原SF特异性DC细胞的制备方法，其特征在于，采用如权利要求1所述特异性肿瘤抗原SF的CTL识别表位肽加入DC细胞进行培养得到。

5.根据权利要求4所述肿瘤抗原SF特异性DC细胞的制备方法得到的特异性DC细胞在制备治疗肝癌药物中的应用。

6.一种肿瘤抗原SF特异性DC-CIK细胞的制备方法，其特征在于，采用如权利要求1所述特异性肿瘤抗原SF的CTL识别表位肽进行诱导得到。

7.根据权利要求6所述肿瘤抗原SF特异性DC-CIK细胞的制备方法得到的特异性DC-CIK细胞在制备治疗肝癌药物中的应用。

说明书

一种特异性肿瘤抗原SF的CTL识别表位肽及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及表位肽技术领域，尤其涉及一种特异性肿瘤抗原SF的CTL识别表位肽及其应用，还涉及一种肿瘤抗原SF特异性DC细胞的制备方法及其应用，以及一种肿瘤抗原
SF特异性DC-CIK细胞的制备方法及其应用。

背景技术

[0002] SF是一种铁结合蛋白，铁蛋白升高可见于下列肿瘤：急性白血病、何杰金氏病、肺癌、结肠癌、肝癌和前列腺癌。检测铁蛋白对肝脏转移性肿瘤有诊断价值，76％的肝转移病
人铁蛋白含量高于400μg/L，在肝癌时，AFP测定值较低的情况下，可用铁蛋白测定值补充，
以提高诊断率。在色素沉着、炎症、肝炎时铁蛋白也会升高。升高的原因可能是由于细胞坏
死，红细胞生成被阻断或肿瘤组织中合成增多。随着医学免疫学与分子生物学的发展，产生
了过继性细胞免疫治疗方法。过继细胞免疫是指体外培养自体或异体外周血单个核细胞，
当细胞增殖到达一定数量后再回输病人体内，发挥杀伤肿瘤作用的方法。过继性免疫包括
CIK及DC-CIK等，DC-CIK表现出更好的靶向性和特异性，拥有更强的杀瘤效果。随着对肿瘤
发生发展机制研究的深入以及对人类免疫系统进一步认识,肿瘤的免疫治疗的疗效不断得
到提高,使得利用细胞免疫疗法彻底治愈肿瘤成为可能。现在，免疫细胞治疗方法逐步走向
临床，给癌症患者带来新的希望。

[0003] SF蛋白在肿瘤或是炎症反应中会升高，但是在正常组织中低表达，所以SF在制备肿瘤过继免疫疗法中具有特异性。制备SF来源的抗肿瘤CTL表位并将去用于制备特异性DC-
CIK将会对肝癌等SF高表达肿瘤治疗起到一定作用。

发明内容

[0004] 基于背景技术存在的技术问题，本发明目的在于提供一种特异性肿瘤抗原SF的CTL识别表位肽。

[0005] 本发明目的还在于提供上述特异性肿瘤抗原SF的CTL识别表位肽的应用。

[0006] 本发明目的还在于提供一种肿瘤抗原SF特异性DC细胞的制备方法。

[0007] 本发明目的还在于提供一种肿瘤抗原SF特异性DC-CIK细胞的制备方法。

[0008] 本发明目的还在于提供上述肿瘤抗原SF特异性DC细胞和DC-CIK细胞的应用。

[0009] 为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

[0010] 本发明提出的一种特异性肿瘤抗原SF的CTL识别表位肽，所述CTL识别表位肽为九肽，其氨基酸序列如下：Glu-Lys-Asn-Val-Asn-Gln-Ser-Leu-Leu。

[0011] 上述特异性肿瘤抗原SF的CTL识别表位肽采用固相合成法进行合成。基本流程如下：首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱
掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上；其次将第二个氨基被Fmoc基团保护
的氨基酸的羧基缩合剂活化，活化后的第二个氨基酸羧基再与已接在固相载体的第一个氨
基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述
的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割得到目的
肽，再经HPLC纯化，其纯度大于90％。

[0012] 本发明还提出的上述特异性肿瘤抗原SF的CTL识别表位肽在制备具有SF表达的肿瘤治疗性多肽疫苗的应用。

[0013] 优选地，上述特异性肿瘤抗原SF的CTL识别表位肽在制备肝癌治疗性多肽疫苗中的应用，尤其对非小细胞肝癌细胞HepG2具有杀伤力。

[0014] 本发明还提出的一种肿瘤抗原SF特异性DC细胞的制备方法，采用上述特异性肿瘤抗原SF的CTL识别表位肽加入DC细胞进行培养得到。

[0015] 本发明还提出的上述肿瘤抗原SF特异性DC细胞的制备方法得到的特异性DC细胞在制备治疗肝癌药物中的应用。

[0016] 本发明还提出的一种肿瘤抗原SF特异性DC-CIK细胞的制备方法，采用上述特异性肿瘤抗原SF的CTL识别表位肽进行诱导得到。

[0017] 本发明还提出的上述肿瘤抗原SF特异性DC-CIK细胞的制备方法得到的特异性DC-CIK细胞在制备治疗肝癌药物中的应用。

[0018] 本发明巧妙利用SF作为一种特异性较强的肿瘤相关抗原，在肝癌、乳腺癌以及消化肿瘤中呈现高表达，而在正常组织中低或痕量表达，从而采用理论和实验相结合的方法
筛选得到肿瘤相关抗原的表位肽，所得表位肽未见文献报道，为研制基于抗原SF的肿瘤疫
苗或肿瘤特异性CTL细胞的制备提供理论基础，并为后续多价的抗原肽疫苗构建奠定基础。

附图说明

[0019] 图1为本发明提出的一种特异性肿瘤抗原SF的CTL识别表位肽的质谱分析图。

[0020] 图2为本发明实施例1所得P1、P2、P3……P20各自诱导得到的特异性CTL细胞分泌INF-γ的能力对比图。

[0021] 图3为本发明实施例1所得P2、P4、P10、P12各自诱导得到的特异性CTL细胞对肝癌细胞HepG2杀伤能力对比图。

[0022] 图4为由本发明提出的一种特异性肿瘤抗原SF的CTL识别表位肽所制备得到的特异性CTL细胞免疫细胞群的流式细胞仪检测数据的统计分析图。

具体实施方式

[0023] 下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

[0024] 实施例1：合成表位肽

[0025] 采用理论与实践相结合的方法，根据抗原的一级结构，综合运用免疫信息学手段，运用SYFPEITHI、BIMAS、NetCTL、WAPP和EpiJen综合对SF的抗原CTL表位进行预测分析，选取
评分前20的多肽序列进行试验筛选，一次命名为P1、P2、P3……P20。

[0026] 基本流程如下：首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上；其次将第二个氨
基被Fmoc基团保护的氨基酸的羧基缩合剂活化，活化后的第二个氨基酸羧基再与已接在固
相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基
的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，
最后切割得到目的表位肽粗品。将目的表位肽粗品经HPLC纯化得到目的表位肽精肽，其纯
度大于90％，质谱分析证实其分子量符合理论值。

[0027] 本发明提出的一种特异性肿瘤抗原SF的CTL识别表位肽采用Fmoc固相合成法进行合成，所述CTL识别表位肽为九肽，编号为P10，其氨基酸序列如下：Glu-Lys-Asn-Val-Asn-
Gln-Ser-Leu-Leu。对P10进行质谱分析，其质谱分析结果如图1所示，可以证实其分子量为
1044.15968g/mol，符合理论值。

[0028] 实施例2：多肽功能检测

[0029] 上述所得P10和其余19个表位肽，可用于制备具有SF表达的肿瘤治疗性多肽疫苗。

[0030] 1、上述CTL识别表位肽诱导特异性CTL细胞、IFN-γ分泌及对肿瘤靶细胞的杀伤实验检测：抽取患者的外周血经密度梯度离心分离，获得PBMCs，添加细胞因子培养DC细胞和
CTL细胞，进一步采用DC细胞负载本发明的SF表位肽，与CTL共培养刺激特异的CTL扩增，进
一步在体外采用ELISA和LDH实验检测特异的CTL在特异抗原刺激下INF-γ的分泌及对肝癌
细胞HepG2的杀伤作用。

[0031] 具体方法如下：

[0032] (I)、PBMC的分离与诱导：

[0033] 1)将50mL抗凝处理的外周血，2000rpm离心10min；

[0034] 2)收集上层血浆冻存，用PBS(pH＝7.4)稀释剩下的血细胞；

[0035] 3)将稀释的血细胞加入到等体积的淋巴分离液液面上；

[0036] 4)20℃离心20min，关闭离心机刹车；

[0037] 5)离心后，分为四层，用吸嘴玻璃滴管吸取白膜层(即第二层)；

[0038] 6)取出的白膜层用PBS洗涤两遍；

[0039] 7)将细胞以2～5×106/mL接种到6孔板内，2h后，回收未贴壁的细胞，用预包被anti-CD3IgG和anti-CD28IgG的培养板进行激活培养；

[0040] 8)贴壁的细胞加入GM-CSF和IL-4刺激培养5天诱导成DC细胞，第三天半换液；

[0041] 9)第5天，收集DC细胞，将10μg实施例1所得目的表位肽精肽加入DC细胞中，1h后，将DC细胞与激活的T细胞共培养，同时加入IL2及IL-15；

[0042] 10)继续培养5天后，得到抗原特异的CTL细胞进行细胞因子分泌及对肿瘤细胞的杀伤实验。

[0043] (II)、IFN-γ细胞因子分泌检测：Human IFN-gamma Platinum ELISA(IFN-γELISA检测试剂盒，eBioscience公司)检测CTL细胞分泌的IFN-γ，步骤如下：

[0044] 1)将CTL细胞去除细胞因子培养24h后，接种到96孔板内；

[0045] 2)细胞中加入刺激对应的多肽再次刺激24h后，离心去除细胞，收集细胞上清；

[0046] 3)采用ELISA检测上清中IFN-γ的表达，选择IFN-γ分泌较多的CTL表位肽进行杀伤实验。

[0047] 结果如图2所示，P10和P2、P4、P12负载的DC细胞均能够较好诱导出特异性CTL细胞，分泌较高量的IFN-γ。

[0048] (III)、肿瘤细胞杀伤实验：采用乳酸脱氢酶(LDH)释放检测法，使用CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(细胞毒性检测试剂盒，Promega公司)进行LDH试
验检测细胞杀伤能力。步骤如下：

[0049] 1)设立检测培养板(100μL/孔)

[0050] a.设立实验组：以SF阳性表达的肝癌细胞HepG2为靶细胞，按效应细胞和靶细胞比为5:1、10:1、20:1加入上述特性CTL细胞

[0051] b.设立效应细胞自发释放组

[0052] c.设立靶细胞自发释放组

[0053] d.设立靶细胞最大释放组

[0054] e.设立背景对照组

[0055] 2)细胞裂解及收获上清

[0056] a.37℃5％CO2共培养5h

[0057] b.靶细胞最大释放组中加入裂解液，45min后，所有的孔，250g/min离心收集上清

[0058] 3)LDH检测

[0059] a.转移50μL上清至另一个96孔板

[0060] b.每孔加入50μL稀释的底物混合物，室温避光孵育30min

[0061] c.每孔添加50μL终止液

[0062] d.在490nm下检测吸光值OD

[0063] 细胞杀伤率计算公式如下：

[0064] 杀伤率(％)＝[(OD实验组-OD效应细胞自发释放组-OD靶细胞自发释放组)/(OD靶细胞最大释放组-OD靶细胞自发释放组)]×100％

[0065] 结果如图3所示，图3为本发明实施例1所得P2、P4、P10、P12各自诱导得到的特异性CTL细胞对肝癌细胞HepG2杀伤能力对比图；由图3可知，P10诱导的CTL细胞对人肝癌细胞
HepG2杀伤效果最好。

[0066] 2、采用流式分析获得的特异CTL中各种免疫细胞所占的百分比，结果如图4所示。由图4可知，本发明由P10制备获得的免疫细胞群中含有大量的CTL细胞，同时也含有一定比
例的NKT细胞，即该免疫细胞群具有较好的免疫活性，具有强大的杀伤特定肿瘤细胞的能
力。

[0067] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其
发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。