一种水溶性微球的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种水溶性微球的制备方法。将油溶性的纳米颗粒溶解于有机溶剂得到油相，将水溶性的含巯基或二硫键的生物大分子溶解到水中得到水相；将油水两相进行预混，得到粗乳液；所得粗乳液经物理刺激手段发生空化作用，并使生物大分子发生交联反应，形成生物大分子壳体包裹于纳米颗粒表面。该法制备方法简单，反应条件温和，制备的微球具有良好的水溶性，粒径可调控、粒径均匀、稳定性好，非特异性吸附低，生物相容性好且易于偶联标记，可广泛用于生物分析、环境分析、食品安全检测、样品分离纯化、医学检验与成像以及生物医药研究等领域。

权利要求

1.一种用于磁微粒免疫层析检测的水溶性微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)制备粗乳液：将油溶性的纳米颗粒溶解于有机溶剂得到油相，将水溶性的含巯基或二硫键的生物大分子溶解到水中得到水相；将油水两相进行预混，得到粗乳液；所述纳米颗粒是油溶性的超顺磁性纳米颗粒；

(2)空化交联反应：将步骤(1)获得的粗乳液经物理刺激手段发生空化作用，使得所述生物大分子发生交联形成生物大分子壳体包裹于纳米颗粒表面。

2.如权利要求1所述的水溶性微球的制备方法，其特征在于，所述生物大分子含有免疫球蛋白、白蛋白、血红蛋白、酪蛋白、胶原蛋白、酶中的一种或多种的混合。

3.如权利要求1所述的水溶性微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的物理刺激手段包括高速剪切、对流撞击。

4.如权利要求1所述的水溶性微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的物理刺激手段采用高压均质机或高压微射流纳米分散仪。

5.如权利要求4所述的水溶性微球的制备方法，其特征在于，所述高压均质机其腔内的均质压力范围为200～2000bar，所述高压均质机其高压均质循环次数为1～6次。

6.如权利要求1所述的水溶性微球的制备方法，其特征在于，所述油水两相体积比为1:

5～200，所述水相中生物大分子的浓度为0.5～250g/L，所述纳米颗粒与生物大分子的质量比为1:1.25～20。

7.如权利要求1所述的水溶性微球的制备方法，其特征在于，所述纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒、三氧化二铁纳米颗粒或是其他掺杂的氧化铁纳米颗粒。

8.一种水溶性微球，其特征在于，按照权利要求1至7任意一项所述的制备方法制备。

9.一种如权利要求8所述的水溶性微球的应用，其特征在于，应用于磁微粒免疫层析检测。

说明书

一种水溶性微球的制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于材料领域，更具体地，涉及一种水溶性微球的制备方法及其应用。

背景技术

[0002] 超顺磁性氧化铁因其良好的磁响应性可使其在外磁场的作用下方便地进行磁性分离和导向，由于在磁场中不被永久磁化，既安全又易于控制，可结合多种生物功能分子，如酶、DNA、蛋白质等，在DNA分离纯化、磁靶向给药、医学检测、诊断、基因治疗、细胞分离、免疫分析、固定化酶和蛋白质等方面，有着广泛的应用前景。

[0003] 热分解法制备的纳米粒子粒径小，呈单分散性，粒度分布窄，具有高结晶度和良好的磁性能，是目前单分散超顺磁性氧化铁纳米粒子主要的制备方法。但反应过程中需要使用带有疏水长烷基链的酸、醇和胺等表面配体，所得到的产物均表现出疏水性，为了更好地应用于生物领域，还需通过进一步水溶化修饰得到在水中具有溶解分散性质的磁性纳米颗粒。

[0004] 油溶性超顺磁性氧化铁的水溶化修饰可分为直接修饰和高分子包裹。

[0005] 直接修饰主要有配体交换法和氧化法。配体交换法是利用含有亲水基团的小分子交换纳米颗粒表面的油溶性分子，使其分散在水中。氧化法是将磁性纳米粒子表面油酸的双键通过氧化剂氧化成羧基，使其表面亲水。直接修饰所得纳米颗粒的粒径变化不大，都很小，即使具有很强的磁化率，表现出来的宏观磁性也极为有限，在溶液中的回收比较困难，操作时需要高强度的磁场，因此多用于磁共振成像对比剂，而在磁微粒免疫分析等众多需要进行磁场分离的领域无法直接应用。

[0006] 高分子包裹目前常用的方法是用聚苯乙烯等合成高分子包裹超顺磁性纳米颗粒形成稳定的核壳型微球，然后通过表面化学修饰等方法增加聚合物微球的水溶性与可修饰性。尽管这种高分子聚合物包裹微球具有制备技术成熟、表面基团可控、均一性好等优点，但仍存在制备过程复杂、非特异性吸附偏高、生物相容性较差、生物降解困难等问题。

[0007] 利用生物大分子替代合成高分子来包裹无机纳米材料是解决高分子材料包裹微球不足的一种方式。目前文献报道的用于包裹的生物大分子材料包括多糖类(壳聚糖、琼脂糖、葡聚糖、羟乙基淀粉等)和蛋白质类(人血清白蛋白HSA、牛血清白蛋白BSA、抗体、酶等)。绝大部分生物大分子都是两亲性物质，既有亲水基又有疏水基。在油水混合体系中，生物大分子会自发迁移到油水界面，自身的亲疏水基会起到类似表面活性剂的作用，降低两相间的界面张力，从而起到稳定乳化液的作用。目前报道的制备生物大分子微球的主要方法有乳化溶剂挥发法，乳化固化法，去溶剂化法等。

[0008] 乳化溶剂挥发法是将生物大分子水溶液与油性溶剂混合后，经过超声、震荡等方式制备乳液，并通过旋转蒸发等方式除去油性溶剂而得到纳米颗粒。乳化法制备的生物大分子颗粒结构不稳定，需要通过热处理或化学处理(交联剂如戊二醛、甲醛)得到稳定的颗粒。

[0009] 乳化固化法将生物大分子水溶液加到含有适量乳化剂的植物油或异辛烷等有机溶剂中，通过搅拌、超声或者膜乳化法制成油包水型乳剂，然后利用加热或者交联剂(甲醛、戊二醛等)使液滴固化，分离即可得到固体纳米粒。

[0010] 去溶剂化法是通过脱水剂的去溶剂化作用除去水化膜，使生物大分子析出，辅以搅拌，再用交联剂与生物大分子发生交联反应使之变性，从而稳定生物大分子微粒，然后纯化除去残留的交联剂和有机溶剂。其中交联剂多采用戊二醛；脱水剂多用乙醇或丙酮等。

[0011] 综上，现有技术采用乳化溶剂挥发法、乳化固化法和去溶剂化法制备生物大分子包裹的水溶性微球，均需要通过热处理或者借助于化学交联剂增加生物大分子的稳定性，存在以下的缺陷：一是采用交联剂发生化学交联，化学交联为非特异性，存在于生物大分子质结构内的任何亲核基团(如胺和羟基)都有反应活性，导致非特异性吸附偏高；二是热变性法会不可逆地改变生物大分子结构，导致生物大分子生物学特征损失；三是所得生物大分子微粒的生物相容性差，毒性大，残留的交联剂甲醛、戊二醛等醛类物质，会造成生物活性大分子失活。

发明内容

[0012] 针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种水溶性微球的制备方法，无需采用任何交联剂或热处理，即可制备生物大分子包裹的水溶性微球，有效解决微球的稳定性、水溶性、以及生物相容性问题。

[0013] 为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种水溶性微球的制备方法，包括以下步骤：

[0014] (1)制备粗乳液：将油溶性的纳米颗粒溶解于有机溶剂得到油相，将水溶性的含巯基或二硫键的生物大分子溶解到水中得到水相；将油水两相进行预混，得到粗乳液；

[0015] (2)空化交联反应：将步骤(1)获得的粗乳液经物理刺激手段发生空化作用，使得所述生物大分子发生交联形成生物大分子壳体包裹于纳米颗粒表面。

[0016] 优选地，所述的制备方法，其所述生物大分子含有免疫球蛋白、白蛋白、血红蛋白、酪蛋白、胶原蛋白、酶中的一种或多种的混合。

[0017] 优选地，所述的制备方法，其所述步骤(2)的物理刺激手段包括高速剪切、对流撞击。

[0018] 优选地，所述的制备方法，其所述步骤(2)的物理刺激手段采用高压均质机或高压微射流纳米分散仪。

[0019] 优选地，所述的制备方法，其所述高压均质机其腔内压力范围为200～2000bar，其高压均质循环次数为1～6次。

[0020] 优选地，所述的制备方法，其所述油水两相体积比为1:5～200，其所述水相中生物大分子的浓度为0.5～250g/L，所述纳米颗粒与生物大分子的质量比为1:1.25～20。

[0021] 优选地，所述的制备方法，其所述纳米颗粒可以是油溶性的超顺磁性纳米颗粒，优选为四氧化三铁纳米颗粒、三氧化二铁纳米颗粒或是其他掺杂的氧化铁纳米颗粒。

[0022] 按照本发明的另一方面，提供了一种水溶性微球，其按照所述的制备方法制备。

[0023] 按照本发明的另一方面，提供了一种水溶性微球的应用，其应用于磁微粒免疫层析检测。

[0024] 总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有如下的有益效果：

[0025] 1、本发明生物大分子包裹的水溶性微粒的制备方法，不采用任何交联剂，也无需通过热处理，制备的生物大分子包裹层稳定性好。利用高压液流在高速喷射对撞过程中产生的高速剪切效应、对流撞击效应以及空化效应的共同作用，由此引发局部高热，并生成超氧化物离子。在局部高温和化学作用的共同影响下，生物大分子中部分巯基残基会被氧化，大分子内部的二硫键也会被部分打开，形成游离巯基。一方面，生物大分子上的游离巯基会通过金属配位作用牢牢结合在氧化铁纳米粒表面形成稳定连接；另一方面，这些活泼的巯基进而会在生物大分子之间形成新的二硫键，通过分子间交联，使结合在氧化铁纳米粒表面的生物大分子之间逐步交联、聚集，最终形成稳定牢固的生物大分子包裹层。

[0026] 2、采用本发明水溶性微球的制备方法制备得到的微球，无需采用任何水溶性修饰手段，即可得到水溶性良好的水溶性微球。采用生物大分子替代合成高分子材料来包裹无机纳米粒，用一种简单易行的方式解决了油相纳米粒水溶化修饰的难题。生物大分子既有亲水基又有疏水基，在特定条件下表现出独特的两亲性。在本发明特定的油水混合体系中，两亲性生物大分子会自发迁移到油水界面，疏水基定向到油相，而亲水基定向到水相，在界面形成一层生物大分子吸附层。在微乳匀质阶段，生物大分子层起到稳定乳化液的作用，提高了产物的均一性；在形成微粒后，生物大分子的亲水基赋予了磁性微球良好的水溶性。

[0027] 3、本发明制备的水溶性微球表面的生物大分子含有大量羧基、氨基等可修饰基团且具有良好的生物相容性，使得微球表面标记抗体、酶等生物活性分子时不易失活，非常适于免疫标记分析、生物分离纯化、体内示踪成像以及生物医药研究等对生物相容性有特殊要求的领域。此外，生物大分子包裹微球表面带有大量羟基和氨基，既增强了微球的水溶性和稳定性，又为抗体、酶等生物分子的偶联标记提供了充足的可反应活性基团，便于进一步与靶向抗体、酶等生物活性物质进行偶联，非常适合生物医学应用。

[0028] 4、该技术方案制备方法简便易行，耗时短，制备的磁性微球具有良好的水溶性，且粒径均匀、稳定性好；通过控制投料比和制备条件，可以有效调控磁性微球产物的粒径，获得不同粒径大小的水溶性磁性微球，满足多种应用需求。

[0029] 综上所述，本发明所提供的生物大分子包裹磁性微球的制备方法简单，反应条件温和，制备的微球粒径可调控，生物相容性高，水溶性好，可广泛用于生物分析、环境分析、食品安全检测、样品分离纯化、医学检验与成像以及生物医药研究等领域。

附图说明

[0030] 图1：生物大分子包裹磁性微球的透射电镜(TEM)图片

[0031] 图2：超顺磁性氧化铁的透射电镜(TEM)图片

[0032] 图3：生物大分子包裹磁性微球的水合粒径分布图(DLS法)

[0033] 图4：超顺磁性氧化铁和生物大分子包裹磁性微球的磁滞回曲线(VSM法)[0034] 图5：超顺磁性氧化铁、生物大分子(牛血清白蛋白)和生物大分子包裹磁性微球的热重曲线

[0035] 图6：生物大分子包裹磁性微球的水溶性和磁分离情况

[0036] 图7：不同粒径大小生物大分子包裹磁性微球水合粒径结果图(DLS法)[0037] 图8：磁微粒免疫层析检测克伦特罗展层结果(克伦特罗浓度从左至右为0、0.015625、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4ng/mL，最后一个为未标记抗体磁球展层对照)

[0038] 图9：胶体金法和磁微粒免疫层析检测克伦特罗四参数拟合曲线

[0039] 图10：磁微粒免疫层析检测重组乙肝e抗原展层结果(重组乙肝e抗原浓度从左至右为0、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256ng/mL)

[0040] 图11：磁微粒免疫层析检测重组乙肝e抗原四参数拟合曲线

具体实施方式

[0041] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

[0042] 一种水溶性微球的制备方法，包括如下步骤：

[0043] (1)制备粗乳液：将油溶性的纳米颗粒溶解于有机溶剂得到油相，将水溶性的含巯基或二硫键的生物大分子溶解到水中得到水相，将油水两相进行预混，得到粗乳液。

[0044] 其中，纳米颗粒可以是油溶性的超顺磁性纳米颗粒，比如四氧化三铁纳米颗粒、三氧化二铁纳米颗粒或是其它掺杂的氧化铁纳米颗粒；有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、甲酸乙酯、乙酸乙酯、正已烷、环已烷，或是他们的混合物，同时含有无水乙醇作为助乳化剂；生物大分子含有免疫球蛋白、白蛋白、血红蛋白、酪蛋白、胶原蛋白、酶中的一种或多种的混合，例如血清、腹水、乳汁等生物体液；油水两相进行预混的方法为机械混合方法，包括高速机械搅拌、高剪切乳化或超声混匀。

[0045] 其中油水两相体积比为1:5～200，优选为1:11～89，水相中生物大分子的浓度为0.5～250g/L，优选为3～100g/L，纳米颗粒与生物大分子的质量比为1:1.25～20。

[0046] (2)空化交联反应：将步骤(1)获得的粗乳液经物理刺激手段发生空化作用，使得所述生物大分子发生交联形成生物大分子壳体包裹于纳米颗粒表面。

[0047] 将步骤(1)获得的粗乳液加压后形成高压液流，优选地，在高压均质机或高压微射流纳米分散仪内高速对射、碰撞，在高速剪切、对流撞击引起的空化作用以及由此引发的局部热效应和化学作用下，粗乳液的的粒径变小形成均一微乳，同时生物大分子之间通过新形成的化学键逐步交联，最终在微乳颗粒表面周围形成一个生物大分子壳体，将油溶性的超顺磁性纳米颗粒包裹在生物大分子壳体之中。

[0048] 高压均质机其腔内的压力范围为200～2000bar，优选为400～1200bar，高压均质次数为1～6次。

[0049] 利用高压液流在高速喷射对撞过程中产生的高速剪切效应、对流撞击效应以及空化效应的共同作用，由此引发局部高热，并生成超氧化物离子。在局部高温和化学作用的共同影响下，生物大分子中部分巯基残基会被氧化，大分子内部的二硫键也会被部分打开，形成游离巯基。一方面，生物大分子上的游离巯基会通过金属配位作用牢牢结合在氧化铁纳米颗粒表面形成稳定连接；另一方面，这些活泼的巯基进而会在生物大分子之间形成新的二硫键，通过分子间交联，使结合在氧化铁纳米颗粒表面的生物大分子之间逐步交联、聚集，最终形成稳定牢固的生物大分子包裹层。这种方法保留了生物大分子大部分的生物学特征，避免了交联剂残留等问题，克服了传统制备方法的缺陷。

[0050] (3)分离纯化：采用减压旋转蒸发或抽真空方法除去残留的有机溶剂，通过磁分离富集除去未反应的原料，最终得到生物大分子包裹的水溶性磁性微球。

[0051] 按照所述制备方法制备得到的水溶性磁性微球均采用激光粒度仪(ZetaSizer Nano-ZS90，英国马尔文仪器有限公司)测量平均水合粒径，测得平均水合粒径为50～500nm；另外也对上述制备方法制得的生物大分子包裹的水溶性磁性微球进行了透射电镜(TEM)、振动样品磁强计(VSM)和热重分析(TG)表征，来检验是否包裹成功。

[0052] 按照所述制备方法制备得到的水溶性微球可应用于磁微粒免疫层析检测，将其应用于竞争磁微粒免疫层析法检测克伦特罗，结合展层结果，绘制拟合曲线，验证了在一定范围内磁信号和克伦特罗浓度是否线性相关。

[0053] 以下为实施例：

[0054] 实施例1

[0055] 一种生物大分子包裹的水溶性磁性微球的制备方法，包括以下步骤：

[0056] (1)制备粗乳液：将溶有超顺磁性氧化铁纳米颗粒140mg/mL的氯仿0.6mL，无水乙醇0.06mL，与4.4g/L的牛血清白蛋白的水溶液30mL混匀，超顺磁性氧化铁的质量与牛血清白蛋白的质量比为1:1.57，油水两相体积比为1:44。

[0057] (2)空化交联反应：用高剪切分散乳化机(FLUKO FA25，上海弗鲁克流体机械制造有限公司)对步骤(1)制备的粗乳液经过10000转每分钟高剪切30s，再在高压均质机(JNBIO JN-02HC，广州聚能生物科技有限公司)中经过600bar高压均质1次形成均一的微乳液。

[0058] (3)分离纯化：最后通过40℃减压旋转蒸发20min除去上述微乳液中的有机相，用磁铁磁分离，清洗，除去未反应的原料，得到牛血清白蛋白包裹的水溶性磁性微球。

[0059] 按照上述制备方法制备得到的牛血清白蛋白包裹的水溶性磁性微球，为棕色，在外加磁场作用下能完全沉降，经激光粒径仪(ZetaSizer Nano-ZS90，英国马尔文仪器有限公司)测得平均水合粒径为237.9nm，PDI0.182(见图3)，Zeta电位为-12mV。

[0060] 将油溶性超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO)和实施例1制备所得牛血清白蛋白包裹的水溶性磁性微球(SPIO@BSA)进行透射电镜(TEM)、振动样品磁强计(VSM)、热重分析(TG)表征来检验BSA是否包裹成功。图1是和图2是SPIO@BSA和SPIO的透射电镜图，SPIO平均粒径约为9nm，粒径均一，单分散性好；SPIO@BSA平均粒径约为156nm，微球呈球形，粒径分布比较均一。图4是SPIO和SPIO@BSA的磁滞回曲线(VSM法)，SPIO和SPIO@BSA的剩磁和矫顽力很低，具有超顺磁性，饱和磁化强度分别为43.6和35.3emu/g，磁性较强。图5是SPIO、SPIO@BSA和BSA的热重曲线。SPIO质量减少15.5％，SPIO中油酸约占15.5％；SPIO@BSA质量减少38％，其中油酸约占11.4％，所以SPIO@BSA中BSA约占26.6％。图6是牛血清白蛋白包裹的水溶性磁性微球的水溶性和磁分离情况。SPIO是油溶性的，溶于正己烷，不溶于水，经过BSA包裹后能增加水溶性，SPIO@BSA能够分散在水中，BSA包裹后粒径增大，能够被外加磁铁吸附，便于进行分离。

[0061] 实施例2-14

[0062] 一种生物大分子包裹的水溶性磁性微球的制备方法，按照表1实施例2～14的实验条件制备生物大分子包裹的水溶性磁性微球，包括以下步骤：

[0063] (1)粗乳液的制备：溶有超顺磁性氧化铁纳米颗粒16.7-180mg/mL的氯仿0.6-4.1mL，无水乙醇0.06-0.41mL，与0.5～250g/L的牛血清白蛋白的水溶液30mL混匀，超顺磁性氧化铁的质量与牛血清白蛋白的质量比为1:1.25～20，油水两相体积比为1：5～200。

[0064] (2)空化交联反应：用高剪切分散乳化机(FLUKO FA25，上海弗鲁克流体机械制造有限公司)对步骤(1)所得到的粗乳液经过10000-16000转每分钟高剪切30-90s，再在高压均质机(JNBIO JN-02HC，广州聚能生物科技有限公司)中经过200～2000bar高压均质1～3次形成均一微乳液，

[0065] (3)分离纯化：最后通过40℃减压旋转蒸发20min除去步骤(2)所得到的微乳液中的有机相，用磁铁磁分离，清洗，除去未反应的原料，得到牛血清白蛋白包裹的水溶性磁性微球。

[0066] 表1生物大分子包裹的水溶性磁性微球制备实施例2-14

[0067]

[0068] 按照所述制备方法制备得到的牛血清白蛋白包裹的水溶性磁性微球，为棕色，在外加磁场作用下能完全沉降，经激光粒径仪(ZetaSizer Nano-ZS90，英国马尔文仪器有限公司)测得平均水合粒径为50～500nm，PDI 0.132～0.650，Zeta电位为-7.32～15.4mV。实施例7、实施例1和实施例2所得磁性微球分别标记为MB1，MB2，MB3，水合粒径分别为110.9、239.3、342.9nm，结果见图7。

[0069] 实施例15-23

[0070] 按表2实施例15-23的实验条件制备生物大分子包裹的水溶性磁性微球，其余步骤同实施例1。

[0071] 表2生物大分子包裹的水溶性磁性微球制备实施例15-23

[0072]

[0073] 实施例15-17比较可知，随着超顺磁性氧化铁浓度升高，磁性微球水合粒径先减小后增大。实施例16、18、19比较可知，随着蛋白质浓度升高，磁性微球水合粒径逐渐减小。实施例16、20、21比较可知，随着高压均质压力升高，磁性微球水合粒径逐渐减小。实施例16、22、23比较可知，随着高压均质循环次数增大，磁性微球水合粒径逐渐减小。通过调节不同投料比和制备条件，可以有效调控磁性微球产物的粒径，获得不同粒径大小的水溶性磁性微球。

[0074] 实施例24-31

[0075] 将牛血清白蛋白换为免疫球蛋白、白蛋白、血红蛋白、酪蛋白、胶原蛋白、血清、腹水和乳汁，其余步骤同实施例1。

[0076] 按照所述制备方法制备得到的生物大分子包裹的水溶性磁性微球，为棕色，在外加磁场作用下能完全沉降，经激光粒径仪(ZetaSizer Nano-ZS90，英国马尔文仪器有限公司)测得平均水合粒径为220～240nm，见表3。

[0077] 表3生物大分子包裹的水溶性磁性微球制备实施例24-31

[0078]实施例 生物大分子种类 水合粒径(d.nm)
24 免疫球蛋白 238.6
25 人血清白蛋白 240
26 血红蛋白 230
27 酪蛋白 235
28 胶原蛋白 236.4
29 血清 220
30 腹水 223.6
31 乳汁 234.5

[0079] 实施例32

[0080] 将油溶性超顺磁性氧化铁纳米颗粒(四氧化三铁)换为油溶性三氧化二铁纳米颗粒，高压均质机(JNBIO JN-02HC，广州聚能生物科技有限公司)改为高压微射流纳米分散仪(Microfluidics M-110P，美国Microfluidics公司)，其余步骤同实施例1。

[0081] 按照所述制备方法制备得到的牛血清白蛋白包裹的水溶性磁性微球，为棕色，在外加磁场作用下能完全沉降，经激光粒径仪(ZetaSizer Nano-ZS90，英国马尔文仪器有限公司)测得平均水合粒径为235.6nm，PDI0.200，Zeta电位为-12mV。

[0082] 实施例33

[0083] EDC/NHS法偶联SPIO@BSA与克伦特罗单抗mAbCLE

[0084] (1)活化：取395μL SPIO@BSA(5.09mg/mL，2mg水溶性磁性微球，其为实施例1制备所得到的牛血清白蛋白包裹的水溶性磁性微球)，磁分离2min，去上清，加入200μL 0.05mol/L pH 5.0MES混匀，磁分离1min，重复清洗3次后，加入41.5μL MES重悬备用。用MES配制好10mg/mL的EDC溶液和10mg/mL的NHS溶液；按EDC：NHS＝2:1的质量比，加入NHS溶液
19.5μL，加入EDC溶液39μL，最终体积100μL，磁球的终浓度为20mg/mL，EDC浓度为20mmol/L。
室温震荡活化15min。

[0085] (2)偶联：活化后的SPIO@BSA用MES清洗三次，200μL/次，磁分离1min/次；加入97μL MES重悬，超声30s。加入克伦特罗单抗mAbCLE 3.4μL(2.95mg/mL，10μg)。偶联时磁球的最终浓度为20mg/mL。充分混匀后37℃震荡偶联2h。

[0086] (3)封闭：用storage buffer溶液清洗偶联后的磁球3次，200μL/次，磁分离1min/次。加入5％脱脂奶粉@SB 200μL，超声30s，37℃下震荡封闭2h。

[0087] (4)保存：封闭后磁球用storage buffer溶液清洗3次，200μL/次，磁分离1min/次。用500μL storage buffer溶液重悬磁球，使磁球最终浓度为4mg/mL，4℃保存。

[0088] 竞争磁微粒免疫层析法检测克伦特罗

[0089] (1)用展层液(1％BSA@1％PBST)将克伦特罗标准品CLE稀释到不同浓度梯度(0、0.015625、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4ng/mL)。

[0090] (2)分别取不同浓度CLE 100μL至酶标板中，分别加入SPIO@BSA-mAbCLE 1μL(4mg/mL)，对照加入SPIO@BSA，混匀，将试纸条的NC膜端竖直插入孔中，等至所有溶液展层完毕。

[0091] (3)将试纸条放入诊断色谱卡(MAR Cassette)中在MAR仪器(美国Quantum Design公司)中检测磁信号，获得T线处的RMU值，用Origin软件绘制四参数拟合曲线，得到IC50。

[0092] 磁微粒免疫层析检测克伦特罗展层结果见图8，随着克伦特罗浓度增大，T线处磁球逐渐减少，颜色逐渐变浅。磁微粒免疫层析检测克伦特罗四参数拟合曲线见图9，曲线呈S型，IC50为0.9ng/mL，与胶体金法相比磁微粒免疫层析相对偏差更小，IC50更低，在一定范围内磁信号和克伦特罗浓度线性相关，生物大分子包裹的水溶性磁性微球可以用于磁微粒免疫层析的竞争法中。

[0093] 实施例34

[0094] EDC/NHS法偶联SPIO@BSA与重组乙肝e抗原单抗MceAb-5#

[0095] (1)活化：取一定体积的SPIO@BSA(如2mg水溶性磁性微球，其为实施例1制备所得到的牛血清白蛋白包裹的水溶性磁性微球)，用200μL/次MES清洗3次后，加入41.5μL MES重悬备用。用MES配制好10mg/mL的EDC溶液和10mg/mL的NHS溶液；按按EDC：NHS＝2:1的质量比，加入NHS溶液19.5μL，加入EDC溶液39μL，最终体积100μL，磁球的终浓度为20mg/mL，EDC浓度为20mmol/L。先加NHS，再溶解EDC，由于EDC溶解后5min失活，溶解后需迅速加入。室温震荡活化15min。

[0096] (2)偶联：活化后的SPIO@BSA用MES清洗三次，200μL/次；加入97μL MES重悬，超声30s。加入包被抗体MceAb-5#2.5μL(4mg/mL10μg)。偶联时磁球的最终浓度为20mg/mL。充分混匀后37℃震荡偶联2h。

[0097] (3)封闭：用storage buffer溶液清洗偶联后的磁球3次，300μL/次。加入5％脱脂奶粉@SB 300μL，超声2min，37℃下震荡封闭2h。

[0098] (4)保存：封闭后磁球用storage buffer溶液清洗3次，200μL/次。用500μL SB溶液重悬磁球，使磁球最终浓度为4mg/mL，4℃保存。

[0099] 夹心磁微粒免疫层析法检测重组乙肝e抗原。

[0100] (1)用展层液(1％BSA@1％PBST)将乙肝e抗原HBeAg稀释到不同浓度梯度(0、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256ng/mL)。

[0101] (2)分别加入100μL不同浓度HBeAg展层液于酶标板中，各加入1μL SPIO@BSA-MceAb-5#(4mg/mL)混匀。

[0102] (3)将试纸条的NC膜端竖直插入孔中，等至所有溶液展层完毕。

[0103] (4)HBeAg免疫磁球与HBeAg反应后，与试纸条上的包被抗体反应，形成夹心结构，展层至T线位置将有磁球截留下来，使T线显色；而C线为了检测标记抗体活性是否失活，C线显色代表抗体有活性；若展层液中无HBeAg，展层至T线位置不显色，C线显色。

[0104] (5)将试纸条放入诊断色谱卡(MAR Cassette)中在MAR仪器(美国Quantum Design公司)中检测磁信号，获得T线处的RMU值，用Origin软件绘制四参数拟合曲线，得到IC50。

[0105] 磁微粒免疫层析检测重组乙肝e抗原展层结果见图10，随着重组乙肝e抗原浓度增大，T线处磁球逐渐增多，颜色逐渐加深。磁微粒免疫层析检测重组乙肝e抗原四参数拟合曲线见图11，曲线呈S型，IC50为24.8ng/mL，在一定范围内磁信号和重组乙肝e抗原浓度线性相关，生物大分子包裹的水溶性磁性微球可以用于磁微粒免疫层析的夹心法中。

[0106] 本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。