芴基水杨醛联肼类衍生物及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及生物化学检测技术领域，具体涉及一种芴基水杨醛联肼类衍生物及其制备方法和应用。该类化合物可以自由进出细胞并特异性的在细胞内脂滴处富集，由原来的无荧光变为强烈荧光，同时在分子内激发态质子转移机制(ESIPT)的作用下，展现了较大的斯托克斯位移，表现为黄色、橙红或红色荧光，同生物体外的固态荧光相比，基本没有位移，可以准确的判断探针定域位置，从而实现对细胞脂滴结构、行为和生理过程的监测，在生物、医疗、健康和能源领域，具有极其广阔的应用前景。

权利要求

1.一种芴基水杨醛联肼类衍生物在制备细胞内特异性脂滴染色的荧光探针的应用，所述芴基水杨醛联肼类衍生物是以下任一结构式的化合物：

说明书

芴基水杨醛联肼类衍生物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物化学检测技术领域，具体涉及一种芴基水杨醛联肼类衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 随着国家经济的快速发展和人民生活水平的不断提高，个人身体健康的实时监测、疾病的预防和治疗逐渐成为人们更加关注的民生问题。相对于传统的体外化学检验的延迟性和放射线在线检测的危害性，荧光在线显像技术以其高效、绿色、实时性强的优势渐渐走入人们的视野，被广泛应用于细胞免疫学、微生物学、分子生物学、遗传学、神经生物学、病理学、肿瘤学、临床检验学、医学、植物学等方面的科研和民生等领域。

[0003] 荧光显像技术的关键技术就是荧光物质作为标记探针(或染色剂)的选择。理想的探针分子通过物理或化学作用，特异性吸附在特定的细胞和组织上，在低能量光学辐照下实现二维或三维的成像，通过与荧光颜色、强度和分布情况来判断细胞或组织的健康情况。与普通的化学染色相比，荧光染色的灵敏度要高出100-1000倍，而且通过适当的功能修饰即可实现对活体的在线分析。

[0004] 脂滴是细胞内中性脂的主要贮存场所，广泛存在于细菌、酵母、植物、昆虫以及动物细胞中。脂滴的大小差别很大，直径从40nm至100um不等。在医疗、健康领域，脂滴一直被认为是一种类似于糖原的颗粒，只是用来贮存能量，当细胞需要能量时，用来供给能量，是一个“惰性”的细胞内含物，因而脂滴在很长一段时间内并未受到人们的重视。但是，最新的研究表明，脂滴并非细胞内一个简单的能量贮存器，而是一个复杂、活动旺盛、动态变化的多功能细胞器。脂滴能够沿着细胞骨架运动，并与其它细胞器相互作用，可能在脂类代谢与存储、膜转运、蛋白降解，以及信号传导过程中起着重要的作用。另外，研究还表明，多种代谢性疾病，如肥胖、脂肪肝、心血管疾病及糖尿病、中性脂贮存性疾病和Niemann Pick C疾病，往往都伴随着脂质贮存的异常。因此，关于脂滴的生物学研究日益受到人们的重视。

[0005] 除了在健康领域的应用外，高脂滴含量低等植物的筛选在解决能源危机领域，逐步受到关注。在大部分海洋生物，如数亿万计的藻类体内也含有大量的脂滴结构，其结构与应用类似于“石油”，如果将其进行规模化出选育，将很容易地、快速地实现将自然界的无机能源转化为有机产物，这在解决日益邻近的能源危机上具有极其重要的意义。如何筛选出脂滴含量较高的藻类进行培育，也是目前相关研究人员更加关注的问题。

[0006] 分子荧光探针，作为人类较为成熟研究微观世界的有效工具，也逐步被应用在细胞细胞脂滴的结构与生理过程研究。利用暗场下，探针分子对细胞亚结构的特异性的识别能力和荧光性质，直观地观测到各种生理活动和过程中脂滴形貌、运动和分解等过程。

[0007] 从结构上分析，脂滴由磷脂单分子层及中性脂构成的疏水核心构成，并且表面分布有很多蛋白。相对于细胞内大部分亲水的环境而言，脂滴是相对较为疏水的油性区域，所以，很多脂溶性的荧光探针都可以对细胞脂滴进行标记和研究。但是，此类探针必须满足三个基本条件，才能成为与目前成熟的脂滴研究相比较。第一，该类荧光探针是否可以自由出入细胞：虽然纳米级别的包覆技术减少了对探针结构的选择性，但是大规模应用下的成本升高也是个值得关注的问题，所以，自身能够进出的细胞的探针结构显得更具优势；第二，荧光探针的选择性：并不是所有脂溶性探针都可以对脂滴进行识别，这可能与脂滴核心外有一层单层磷脂分子及各种蛋白结构有关；第三，荧光探针的开关比调节：大部分性能优异的荧光探针都是采用“点亮”对脂滴客体进行标记的，而脂滴处的有机探针富集通常会造成荧光强度的衰减，从而很难实现高分辨的成像。其中，第三点成为困扰该类探针发展的主要问题。

[0008] 2001年，唐本忠院士基于其发现的1-甲基-1,2,3,4,5-五苯基噻咯(MPPS)在乙腈溶液中不发光，而在聚集后而产生强烈的荧光的“反常”现象，提出“聚集诱导发光(AIE)”的新观念，通过“分子内旋转受限(RIR)”的工作机理是很好的解释了这种现象产生的，而且已得到诸多实验结果和理论计算的支持，发展了一个贴有“中国牌”的、具有自主知识产权的材料和理论体系。AIE类材料解决了传统的芳香环荧光生色团在水溶性溶剂中聚集猝灭荧光问题，在生理缓冲溶液或水介质中能够实现高亮度的荧光成像和示踪，与背景中的不发光或弱发光单分子实现高分辨率的区分，很好的定位在目标生物大分子。这种AIE荧光探针的“点亮(light-up)”模式为高灵敏度、对比度的生物研究提供了可能，在生物学、医学等领域具有划时代的意义。基于这类分子的设计理念，大量的“脂滴型”荧光分子探针被制备和发展起来，并表现的一定商用潜质。但是，这些探针都有一个显著的不足，就是在脂滴中的荧光行为(荧光主峰位或发光颜色)与探针在固态下的情况存在明显差异，荧光位移很大。因为很难估计发光颜色的变化幅度，就会导致此类结构很难对复杂的体系和过程进行荧光染色及标记，无法满足生物体系中更高的要求。

发明内容

[0009] 本发明的目的是提供一种芴基水杨醛联肼类衍生物及其制备方法和应用，解决现有技术中在脂滴中的荧光行为(荧光主峰位或发光颜色)与探针在固态下的情况存在明显差异、荧光位移很大的问题。

[0010] 本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种芴基水杨醛联肼类衍生物，其结构通式如下：

[0011]

[0012] 其中Ar表示芳香基团或其衍生结构，取代基R1～R8分别选自氢、烷基、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、巯基、卤素原子、苯基、甲苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、喹啉基、吲哚基、羧酸或羧酸衍生物、咔唑基或苯胺基中的一种，烷基和烷氧基的碳原子数分别为1～12。

[0013] 在本发明的芴基水杨醛联肼类衍生物中，所述取代基R1～R8分别均为氢，Ar结构为苯环或苯环衍生物，其优选化合物结构式为：

[0014]

[0015] 其中，A1～A4分别选自氢、烷基、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、巯基、卤素原子、苯基、甲苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、喹啉基、吲哚基、羧酸或羧酸衍生物、咔唑基或苯胺基中的一种，烷基和烷氧基的碳原子数分别为1～12。

[0016] 在本发明的芴基水杨醛联肼类衍生物中，所述取代基R1～R8分别均为氢，Ar结构为萘环、蒽环、菲环或萘环、蒽环、菲环的衍生物，其优选化合物结构式为：

[0017]

[0018]

[0019] 其中，B1～B8分别选自氢、烷基、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、巯基、卤素原子、苯基、甲苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、喹啉基、吲哚基、羧酸或羧酸衍生物、咔唑基或苯胺基中的一种，烷基和烷氧基的碳原子数分别为1～12。

[0020] 在本发明的芴基水杨醛联肼类衍生物中，所述取代基R1～R8分别均为氢，Ar结构为呋喃、噻吩、吡咯、吡啶、吡喃、喹啉、吲哚、咔唑、苯胺基或嘧啶基，或者Ar结构为呋喃、噻吩、吡咯、吡啶、吡喃、喹啉、吲哚、咔唑、苯胺基或嘧啶基的衍生物，其优选化合物结构为：

[0021]

[0022] 在本发明的芴基水杨醛联肼类衍生物中，所述取代基R1～R8分别均为氢，Ar结构为苯基乙烯结构或苯基乙烯结构的衍生物，其优选化合物结构为：

[0023]

[0024] 在本发明的芴基水杨醛联肼类衍生物中，Ar结构为苯环结构或苯环衍生物，所述取代基R1～R8中至少一取代基选自烷基、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、巯基、卤素原子、苯基、甲苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、喹啉基、吲哚基、羧酸或羧酸衍生物、咔唑基或苯胺基中的一种，烷基和烷氧基的碳原子数分别为1～12；

[0025] 其优选化合物结构为：

[0026]

[0027] 在本发明的芴基水杨醛联肼类衍生物中，Ar结构为苯基乙烯结构或苯基乙烯结构的衍生物，所述取代基R1～R8中至少一取代基选自烷基、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、巯基、卤素原子、苯基、甲苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、喹啉基、吲哚基、羧酸或羧酸衍生物、咔唑基或苯胺基中的一种，烷基和烷氧基的碳原子数分别为1～12；

[0028]

[0029] 上述化合物结构式中，其中R1～R8、A1～A8、B1～B8以及R的优选结构可以为下图中所示29种中的一种或氢原子：

[0030] -CH3、

[0031]

[0032] 本发明还提供一种芴基水杨醛联肼类衍生物的制备方法，包括如下步骤：

[0033] A、将芴酮或芴酮衍生物与水合肼在第一反应溶剂中加热至20℃～150℃，反应1小时～24小时，然后冷却至室温，去除溶剂后析出晶体或粉末，进行重结晶后得到中间体联肼；其中优选加热至45℃～90℃，反应6小时～12小时，重结晶所用溶剂优选四氢呋喃、乙醇、甲苯、DMF等，最优选为乙醇；

[0034] B、将中间体联肼与对应的芳基水杨醛结构化合物在第二反应溶剂中加热至20℃～150℃，反应1小时～24小时，然后冷却至室温，去除溶剂后析出晶体或粉末，通过柱层析或重结晶得到芴基水杨醛联肼类衍生物；其中优选加热至30℃～90℃，反应6小时～12小时，重结晶所用溶剂优选四氢呋喃、乙醇、甲苯、DMF等，最优选为乙醇。

[0035] 在本发明的制备方法中，在步骤A中的第一反应溶剂和步骤B中的第二反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸、四氢呋喃、甲苯、苯、氯仿、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的任意一种溶剂或任意几种形成的混合溶剂；第一反应溶剂和第二反应溶剂分别优选为乙醇或乙醇与其它溶剂形成的混合溶剂。

[0036] 本发明的芴基水杨醛联肼类衍生物可以作为制备细胞内特异性脂滴染色的荧光探针的应用，该荧光探针主要应用于在体内、体外及海洋中低等生物脂肪含量的测定方面以及用于病理和药物疗效研究等方面。

[0037] 实施本发明的芴基水杨醛联肼类衍生物及其制备方法和应用，具有以下有益效果：该类化合物可以自由进出细胞并特异性的在细胞内脂滴处富集，由原来的无荧光变为强烈荧光，同时在分子内激发态质子转移机制(ESIPT)的作用下，展现了较大的斯托克斯位移，表现为黄色、橙红或红色荧光，同生物体外的固态荧光相比，基本没有位移，可以准确的判断探针定域位置，从而实现对细胞脂滴结构、行为和生理过程的监测，在生物、医疗、健康和能源领域，具有极其广阔的应用前景。

[0038] 具体为：

[0039] (1)选择联肼结构作为共轭桥联基元，一方面利用单双键交替的形式保持探针分子的共轭程度，另一方面N原子的孤对电子具有较小的空间位阻，使其能够在一定程度上自由转动从调节空间体积，保证其能容易直接透过细胞膜，对细胞内亚结构进行选择；

[0040] (2)外围的共轭结构中引入芴基的五元环结构，使其吸电子能力增加，拓展光谱向波长更长的方向移动，以便应用于活体检测；

[0041] (3)在联肼两端引入酚羟基结构，与N的孤对电子形成ESIPT态(激发态下分子内的质子转移)，有效的增加斯托克斯位移，防止分子的自吸收现象，并赋予分子显著的AIE性能；酚羟基的水溶性也能够显著调节分子的脂水分配系数，从而增加探针直接透过细胞的几率；

[0042] (4)由于分子独特的刚性结构导致荧光探针在脂滴内的荧光情况与固体相似，便于在复杂体系内实现指认和定量分析。

附图说明

[0043] 图1A为芴基水杨醛联肼(FAS)在不同溶剂中的溶剂化效应和聚集诱导发光效应；

[0044] 图1B为FAS在不同含水量的四氢呋喃溶液中的溶剂化效应和聚集诱导发光效应；

[0045] 图2A为FAS细胞染色的明场照片；

[0046] 图2B为FAS细胞染色的荧光照片；

[0047] 图3为FAS在Hela细胞中荧光染色中浓度优化实验照片；

[0048] 图4为FAS在Hela细胞中荧光染色中指定浓度下的时间优化实验照片。

具体实施方式

[0049] 下面结合附图和实施例，对本发明的芴基水杨醛联肼类衍生物及其制备方法和应用作进一步说明：

[0050] 本发明提供一种芴基水杨醛联肼类衍生物，其结构通式如下：

[0051]

[0052] 其中Ar表示芳香基团或其衍生结构，取代基R1～R8分别选自氢、烷基、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、巯基、卤素原子、苯基、甲苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、喹啉基、吲哚基、羧酸或羧酸衍生物、咔唑基或苯胺基中的一种，烷基和烷氧基的碳原子数分别为1～12。

[0053] 具体合成过程：

[0054] (1)

[0055]

[0056] 将芴酮结构制备得到带有取代基结构的芴酮衍生物。

[0057] (2)

[0058]

[0059] 将芴酮或步骤(1)的产物芴酮衍生物采用适当的溶剂和温度制备重要的中间体产物芴基联肼。

[0060] 具体操作：将适量的芴酮或芴酮衍生物与水合肼在第一反应溶剂中加热至适当温度，反应一段时间后冷却至室温，去除掉大部分溶剂后析出晶体或粉末，重结晶后即得到中间体联肼，产率>90％，纯度>95％。其中，第一反应溶剂优选选自甲醇、乙醇、乙酸、四氢呋喃、甲苯、苯、氯仿、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的一种或几种形成的混合溶剂，最优选乙醇及其与其它溶剂的混合体系；加热至的适当温度优选20℃至150℃，其中最优选为45℃至90℃；反应时间优选1小时至24小时，其中最优选6小时至12小时；重结晶所用溶剂优选四氢呋喃、乙醇、甲苯、DMF等，最优选乙醇。

[0061] (3)

[0062]

[0063] 将步骤(2)中得到的中间体联肼，即芴基水合肼，与对应的芳基水杨醛结构反应制备目标化合物。

[0064] 具体操作：将适量的中间体联肼与对应的芳基水杨醛结构在第二反应溶剂中加热至适当温度，反应一段时间后冷却至室温，处理掉大部分溶剂后析出晶体或粉末，柱层析或重结晶后即得到目标产物。其中，第二反应溶剂优选选自甲醇、乙醇、乙酸、四氢呋喃、甲苯、苯、氯仿、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的一种或几种形成的混合溶剂，最优选乙醇及其与其它溶剂的混合体系；加热至的适当温度优选20℃至150℃，其中最优选为30℃至90℃；反应时间优选1小时至24小时，其中最优选6小时至12小时；重结晶所用溶剂优选四氢呋喃、乙醇、甲苯、DMF等，最优选乙醇。

[0065] 实施例1：芴基水杨醛联肼的合成(FAS)

[0066]

[0067] 将10g芴酮与20ml水合肼(85％)在100ml下回流4h，冷却后有大量针状固体析出，过滤后用乙醇重结晶2次，得到淡黄色针装晶体，纯度99％，产率95％；取2g水合肼晶体与2ml水杨醛在20ml乙醇中回流4h，冷却后得到淡黄色针装晶体，过滤后，用75％的乙醇溶液清洗，得到FAS结构，产率99％。MALDI-TOF(m/z):[M+]calcd.C20H14N2O,298.34；found,
299.34.Anal Calc.for C20H14N2O:C,80.52；H,4.73；N,9.39；O,5.36.Found:C,80.62；H,
4.71；N,9.19；O,5.36。

[0068] 实施例2：FAS衍生物的合成(1)

[0069]

[0070] 取500mg水合肼晶体与等摩尔的间羟基水杨醛(或间溴代水杨醛)衍生物在10ml乙醇中60℃反应4h，冷却后得到淡黄色晶体，过滤后，用75％的乙醇溶液清洗，得到产品层析得到对应的FAS衍生结构，产率>90％。

[0071] m-FAS-OH：MALDI-TOF(m/z):[M+]calcd.C20H14N2O2,314.34；found,315.24.Anal Calc.for C20H14N2O2:C,76.42；H,4.49；N,8.91；O,10.18.Found:C,75.32；H,4.48；N,8.35；O,10.09。

[0072] p-FAS-Br：MALDI-TOF(m/z):[M+]calcd.C20H13BrN2O,377.23；found,299.34.Anal Calc.for C20H13BrN2O:C,63.68；H,3.47；Br,21.18；N,7.43；O,4.24.Found:C,63.58；H,3.40；N,7.42；O,4.19。

[0073] 实施例3：FAS衍生物的合成(2)

[0074]

[0075] 取500mg水合肼晶体与等摩尔的N,N-二乙基氨基水杨醛在10ml乙醇中60℃反应4h，冷却后得到红色油状物，过滤后，用75％的乙醇溶液清洗，得到产品层析得到对应的FAS衍生结构，产率为85％。

[0076] p-FAS-N22：MALDI-TOF(m/z):[M+]calcd.C24H23N3O:369.18；found,370.66；Anal Calc.for C24H23N3O:C,78.02；H,6.27；N,11.37；O,4.33.found,C,77.93；H,6.10；N,11.25；O,4.45。

[0077] 实施例4：芴基-四苯乙烯类水杨醛联肼的制备(TPE-FAS)

[0078]

[0079] 采用Sizuki偶联得到四苯乙烯基水杨醛衍生物结构后，取500mg水合肼晶体与之在10ml乙醇中60℃反应4h，冷却后得到淡黄色粉末，过滤后，用75％的乙醇溶液清洗，得到产品层析得到对应的FAS衍生结构，产率为85％。

[0080] m-TPE-FAS:MALDI-TOF(m/z):[M+]calcd.C40H28N2O:552.22；found,553.28；Anal Calc.for C40H28N2O:C,86.93；H,5.11；N,5.07；O,2.89；found,C,86.87；H,5.01；N,5.08；O,2.79。

[0081] 实施例5：芴基水杨醛联肼FAS的光学性质及其在在脂滴染色方面的应用

[0082] (a)FAS的基本光学性质：如图1A所示为FAS在不同极性下的荧光光谱，随着极性的变化，FAS的醇式发射(450nm附近)和酮式发射(600nm附近)的比例发生明显变化，为典型的ESIPT发射。而对于ESIPT分子，聚集态多为酮式发射，所以我们检测了该处的聚集发光现象。如图1B所示，向FAS的四氢呋喃溶剂中(溶解单分子态)不断加入一定比例的水，FAS由于溶解度问题慢慢聚集成纳米颗粒，荧光强度明显增强(600nm附近)，称其为AIE性质。FAS具有明显的ESIPT和AIE性质，具有荧光探针的潜质。

[0083] (b)细胞染色实验：将FAS以一定浓度溶液DMSO溶液后滴入细胞培养液中，选择Hela细胞作为研究对象，培养一段时间后采用荧光显微镜对其极性观察，发现FAS可以顺利的透过细胞壁，并定向的在细胞脂滴处富集，从而显示出橘红色荧光(600nm附近)。

[0084] 图2A为Hela细胞在明场中的照片，其中馕包状为细胞的脂滴结构；图2B为染色后的细胞在330nm-385nm激发光的暗场下的荧光照片，二者对比显示，FAS能够特异性的对细胞脂滴进行染色，而且其荧光峰位与固态荧光光谱无明显差异。说明FAS可以不经任何修饰直接进入细胞实现靶向荧光染色，并未表现出明显的荧光偏移，AIE和ESIPT现象得到了很好的利用。

[0085] (c)脂滴染色实验条件的优化：如图3和图4所示，我们对染色浓度和时间进行了优化，发现FAS浓度在7.5μM，染色时间为30min时，细胞荧光脂滴成像的效果最好。

[0086] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内

[0087] 应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有改进或变换都属于本发明所附权利要求的保护范围之内。