玉米ZmSTP1蛋白及其编码基因与应用

摘要

本发明涉及分子生物学领域，具体提供了一种玉米ZmSTP1蛋白(如SEQ ID No.1所示)及其编码基因(如SEQ ID No.2所示)在促进植物根系单糖吸收中的应用。本发明首次从重要粮食作物玉米中获得了一个具有糖吸收功能的蛋白，此基因在玉米的根尖表达，具有吸收和转运多种单糖的功能；将该基因转入模式植物拟南芥可提高转基因植株对特定糖的吸收能力，显著提高土培植株生物量和种子产量，具有重要的应用前景；同时从碳水化合物对氮效率提高的角度考虑，更是有望改善植物氮效率，培育氮高效农作物。

权利要求

1.玉米ZmSTP1基因在调控植物光合途径中的应用；所述ZmSTP1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将所述基因转入植物中，促进植物光合途径基因表达，进而提高植物生物量和/或籽粒产量。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述基因通过重组表达载体转入植物细胞。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组表达载体为在pPT-HYG的多克隆位点间插入所述基因得到的重组质粒。

5.一种调控植物光合途径的方法，其特征在于，将玉米ZmSTP1基因通过重组表达载体转入植物细胞中；所述ZmSTP1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体为在pPT-HYG的多克隆位点间插入所述基因得到的重组质粒。

说明书

玉米ZmSTP1蛋白及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及玉米ZmSTP1蛋白及其编码基因在促进植物根系单糖吸收中的应用。

背景技术

[0002] 碳水化合物亦称糖类化合物，是自然界存在最多、分布最广的一类重要的有机化合物。糖类是光合作用的产物，又是呼吸作用的底物，为植物体内生理生化反应提供碳骨架和能量，因此糖的供应对碳氮代谢、干物质积累、作物产量形成至关重要。植物中的糖一部分来自光合作用和淀粉的降解，一部分由根系从土壤中直接吸收。其中根系直接吸收的糖类对植物总碳水化合物的积累意义重大。葡萄糖、果糖、蔗糖等中性糖由于分子量大、亲水性等性质，它们的跨膜运输需要膜运输蛋白的参与(Ludewig and Flügge，2013Frontiers in Plant Science 4，231)。目前在细胞膜上发现了一系列糖跨膜运输蛋白，它们的生化功能和分子特征不尽相同。在拟南芥中推测存在50多种单糖转运蛋白和20种二糖转运蛋白(Lalonde et al.，2004Annual Review of Plant Biology 55，341–372)。其中有14种单糖转运蛋白属于STP(Sugar Transporter Subfamily)蛋白家族(Johnson and Thomas，2007Molecular Biology and Evolution 24，2412–2423)。已有功能研究的STP蛋白主要在植物库器官表达，表现出了高亲和的运输特性(Km 10-100mm)(Buttner 2007FEBS Letters 
581，2318–2324)，表明了它们向库中运输、积累光合产物的主要特征。AtSTP1可以重吸收根系排出的单糖(Sherson et al.，2000The Plant Journal 24，849–857)，Atstp1突变体单糖积累减少，对半乳糖、甘露糖不敏感(Sherson et al.，2000The Plant Journal 24，849–
857)；AtSTP13主要在皮层、内皮层表达，负责重吸收非生物胁迫导致的表皮细胞受损而泄出的单糖类物质(Nour-Eldin et al.，2006Plant Methods 2，17–25；Yamada et al.，
2011The Journal of Biological Chemistry 286(50)，43577–43586)。超表达AtSTP13基因的拟南芥植株，对葡萄糖的吸收增加，含糖量显著提高，最终生物量显著提高(Schofield et al.，2009Plant，Cell and Environment 32，271–285)。因此，糖转运蛋白对糖的吸收和积累起到了十分重要的作用。糖类还调控昼夜节律钟，影响植物激素合成、防御系统及发育进程(Bolouri Moghaddam and Van den Ende，2013Journal of Experimental Botany 64(6)，1439–1449)。

[0003] 氮是与碳密切关联的植物必需矿物元素，2014年全球氮肥用量约为1.1亿吨，到2050年需求量预计达到2.25亿吨才能满足粮食安全的需求(Frink 1999P Natl Acad Sci USA.，96(4):1175-1180；Tilman et al.，2011P Natl Acad Sci USA.，108(50):20260-
20264)。大量投入氮肥引起了土壤酸化、水体富营养化等一系列环境问题(Guo et al.，
2010Science，327(5968):1008-1010)；另一方面，氮素缺乏仍然是发展中国家农业生产的主要制约因素(Diels et al.，2001Agronomy Journal，93:1191-1199；Vitousek 2009)。氮素不足会显著降低叶绿素合成和干物质积累，影响生殖器官的发育，最终导致严重减产(Marschner 1995Mineral Nutrition of Higher Plants，2nd edn)。碳氮代谢是植物体内最重要的代谢过程，碳代谢与氮同化关系密切(宋建民，1998植物生理学通讯)。空间上看，碳代谢与NO2-同化发生在叶绿体内，氮代谢需要碳代谢提供的碳源和能源，也需要碳代谢合成的酮酸作为骨架来合成氨基酸。硝酸还原酶(NR)的活性也受碳水化合物的影响(Cheng et al.，1986Metabolism 35，10–14；Cheng et al.，1992PAcad Sci 89，1861-1864；
Vincentz et al.1993)。在番茄中研究表明通过增加蔗糖的吸收和利用，使得硝酸还原酶的表达量增加，进而加速了氮代谢过程，增加了氨基酸的合成速率(Morcuende et al.1998Planta 206，394–409；Halford et al.2004Journal of Experimental Botany 
55，35-42)。另外，根系氮吸收也受根中可溶性碳水化合物供应影响(Tolley et al.，
1988Journal of Experimental  Botany  1988，39:613-622；Tolley  et al.，
1991Botanical Gazette 152:23-33)。

[0004] 作为重要的粮食作物，玉米在全球粮食安全中发挥重要的作用，并且相对于其它粮食作物增产潜力巨大(Chen et al.，2014Nature)。然而目前为止，玉米中的糖转运蛋白鲜有报道，本研究从玉米中克隆到糖转运蛋白STP1基因，将其互补至酵母中表现出对葡萄糖(Glc)、果糖(Frc)、甘露糖(Man)强烈的响应，对半乳糖(Gal)有部分响应，表明ZmSTP1转入酵母体系中后可以吸收多种单糖，但对不同单糖的吸收能力不同。超表达至拟南芥上表现出，对多种糖处理具有响应。表现为营养生长及生殖生长受到影响，包括生物量，籽粒产量显著增加，糖含量增加，蔗糖转运蛋白AtSUC2，叶绿素a和叶绿素b合成相关蛋白AtCAB1表达量也明显增加。其可为玉米糖高效积累基因工程提供重要的候选基因，同时对于提高植物，特别是粮食作物的氮吸收利用效率也有一定的提高作用，具有重要的实用价值和直接的经济效益。

发明内容

[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种玉米ZmSTP1蛋白及其编码基因在促进植物根系单糖吸收中的应用。

[0006] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种玉米ZmSTP1蛋白，来源于玉米属的玉米(zea mays L.)，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0007] 本发明还提供了所述蛋白的编码基因ZmSTP1，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

[0008] 本发明还提供了所述ZmSTP1基因在促进植物根系单糖吸收中的应用。

[0009] 具体地，所述应用为将所述ZmSTP1基因转入植物中，促进植物根系单糖高效吸收积累，进而提高植物生物量和/或籽粒产量。

[0010] 进一步地，所述ZmSTP1基因通过重组表达载体转入植物细胞。可用现有的植物表达载体构建含有ZmSTP1基因的重组表达载体。

[0011] 使用ZmSTP1基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒CAMV35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

[0012] 作为优选，所述重组表达载体为在pPT-HYG的多克隆位点间插入所述ZmSTP1基因得到的重组质粒pSuper1300+-ZmSTP。

[0013] 本发明还提供了含有所述ZmSTP1基因的重组表达载体、转基因细胞系和重组菌。

[0014] 本发明还提供了一种促进植物根系单糖高效吸收积累的方法，所述方法为将前述ZmSTP1基因通过重组表达载体转入植物细胞中。

[0015] 作为优选，所述重组表达载体为在pPT-HYG的多克隆位点间插入所述基因得到的重组质粒。

[0016] 本发明的有益效果在于：

[0017] 本发明克隆到了玉米ZmSTP1基因，通过研究该基因在玉米中的定量和定性表达特性，发现该基因主要在玉米幼苗根尖表达。进而用转基因技术将ZmSTP1基因导入模式植物拟南芥中(Columbia)，结果表明其对多种单糖处理具有响应，表现为营养生长及生殖生长受到影响，包括生物量，籽粒产量显著增加，糖含量增加；蔗糖转运蛋白SUC2，叶绿素a和叶绿素b合成相关基因CAB1表达量明显增加。本发明从玉米中克隆的糖转运蛋白基因为主要农作物的糖高效吸收并积累提供了更有效果的基因资源，在基因工程改良植物的营养高效性能研究中将发挥重要作用。同时从碳水化合物对氮效率提高的角度考虑，更是有望改善植物氮效率，培育氮高效农作物。

附图说明

[0018] 图1为本发明所述ZmSTP1基因的进化树分析；

[0019] 图2为本发明所述ZmSTP1基因在不同组织中的定量表达分析；

[0020] 图3a为本发明所述ZmSTP1基因的组织表达定位分析；

[0021] 图3b为本发明所述ZmSTP1基因的亚细胞定位分析；

[0022] 图4为异源功能互补验证—EBY.VW4000酵母突变体功能互补表型分析；

[0023] 图5为拟南芥超表达ZmSTP1基因的植株表型分析(板培18天)；

[0024] 图6为拟南芥超表达ZmSTP1基因的植株莲座叶表型分析(板培18天)；

[0025] 图7为拟南芥超表达ZmSTP1基因的植株对不同浓度无机氮供应响应分析(板培18天)；

[0026] 图8为拟南芥超表达ZmSTP1基因的植株莲座叶表型统计分析(土培35天)；

[0027] 图9为拟南芥超表达ZmSTP1基因的植株生物量、籽粒产量统计分析(土培55天)；

[0028] 图10为板培与土培条件下超表达ZmSTP1基因的拟南芥糖含量测定；

[0029] 图11为AtSuc2与AtCAB1的定量表达分析。

具体实施方式

[0030] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0031] 下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

[0032] 材料的准备

[0033] 1、菌株与工具质粒

[0034] 本发明实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌感受态细胞DH5α(Code No.CB101，天根生化科技有限公司)，根癌农杆菌GV3101(购自天根生化科技有限公司)和EBY.VW4000酵母突变体；TA克隆载体： 19-T Vector(Code No.D102，Takara公司)，pSuper1300+-Kanamycin，pDR195(资环院袁力行老师惠赠)；pUC-GFP(Takara Bio)。

[0035] 2、工具酶及生化试剂

[0036] 各种限制性内切酶购自NEB公司；各种Taq酶和Trizol RNA小量提取试剂盒购自Takara公司；dNTP混合物购自上海生工；T4DNA连接酶购自Promega公司；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Code No.DP209，天根生化科技有限公司)；质粒小提试剂盒购自(Code No.DP103，天根生化科技有限公司)氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)购自欣经科公司。

[0037] 3、PCR扩增引物

[0038] ZmSTP1-pDR-L：5′-CTCGAGATGGCCGGCGGTGGCATCGTG-3′

[0039] ZmSTP1-pDR-R：5′-GGATCCTCACGCGTCGGCCCCCTTGG-3′

[0040] ZmSTP1-RT-L：5′-GTCTTCATCGCCTTCTTCCTG-3′

[0041] ZmSTP1-RT-R：5′-TTGGTGTCGCTGCCGTTT-3′

[0042] ZmUbiquitin-L：5′-GTTGAAGCTGCTGCTGTATCTGG-3′

[0043] ZmUbiquitin-R：5′-GCGGTCGCACGATAGTTTTG-3′

[0044] ZmSTP1-Situ-F：5′-GATTTAGGTGACACTATAGAATGCTCCA

[0045] AAAACGGCAGCGACA-3′

[0046] ZmSTP1-Situ-R：5′-TGTAATACGACTCACTATAGGGGTACTAT

[0047] TGCTTGGTGGTG-3′

[0048] ZmSTP1-GFP-F：5′-TCTAGAATGGCCGGCGGTGGCATCGTG-3′

[0049] ZmSTP1-GFP-R：5′-GGATCCCGCGTCGGCCCCCTTGGTG-3′

[0050] AtAct2-L：5′-TGATGCACTTGTGTGTGACAA-3′

[0051] AtAct2-R：5′-GGGACTAAAACGCAAAACGA-3′

[0052] AtSUC2-L：5′-GGATCGCTTGGTTCCCTTTC-3′

[0053] AtSUC2-R：5′-GGAGTCAGAGCTGGTGCTTTGG-3′

[0054] AtCAB1-L：5′-CCCATTTCTTGGCTTACAACAAC-3′

[0055] AtCAB1-R：5′-TCGGGGTCAGCTGAAAGTCCG-3′。

[0056] 实施例1、玉米糖转运蛋白基因ZmSTP1基因的克隆

[0057] 拟南芥、水稻、小麦等单糖转运蛋白氨基酸序列获得数据库为NCBI，Maizesequence和Uniprot，运用ClustalW1.8进行比对(Thompson et al.1994Nucleic Acids Research 22，4673-4680)。进化树分析表明与AtSTP1亲缘关系最近，因此将该基因命名为ZmSTP1(图1)。

[0058] 1、总RNA提取

[0059] 取200mg新鲜B73玉米根，在液氮中研磨；加入1ml试剂盒提供的Trizol提取液，室温震荡5分钟；再加入200μl三氯甲烷，震荡30秒，4℃、12000转离心15分钟；取上清，加入0.5ml异丙醇，室温静置1小时，4℃、12000转离心15分钟；取沉淀，加入1ml 70％乙醇，震荡1分钟，4℃、10000转离心10分钟；吸弃上清，沉淀置通风橱中吹干，加入50μl DEPC水溶解沉淀。1％琼脂糖电泳检测RNA质量，同时用分光光度计测定RNA浓度。

[0060] 2、mRNA纯化

[0061] 取500μg总RNA加入到一新的无RNA酶离心管中，加入1ml试剂盒提供的结合液；置于65℃10分钟，然后立刻转到冰上放1分钟；液体转移到试剂盒提供的含oligo(dT)树脂的离心管中，室温轻摇20分钟，室温4000转离心10分钟，小心吸弃上清，重复2次；然后加入0.3ml结合液重悬树脂，转移到试剂盒提供的spin-column管中，加入500μl结合液洗涤，
4000转室温离心10秒，测洗出液的OD260，如果大于0.05，则再次加入500μl结合液洗涤，直至洗出液OD260小于0.05；加入200μl洗脱液，柔和悬起树脂，将spin-column管转到一新的离心管上，室温4000转离心10秒收集mRNA。最后加入10μl2mg/ml糖苷，30μl 2M醋酸钠，600μl无水乙醇，-80℃放置30分钟，4℃、14000转离心20分钟，弃上清，70％乙醇洗一次，用20μl TE溶解。取出0.5μl测定OD260并计算浓度。

[0062] 3、cDNA第一链合成

[0063] 取5μg mRNA，用试剂盒所带的反转录酶进行反转录。具体如下：取1μl试剂盒提供的Biotion-attB2-oligo(dT)加到10μL浓度为100ng/μl的上步纯化得到的mRNA溶液中，70℃放置5分钟，迅速转到冰上3分钟，然后加入以下成分：

[0064]

[0065] 参照试剂盒使用说明书设定如下反应条件:25℃10分钟，42℃60分钟，70℃10分钟，冰浴2分钟。

[0066] 4、ZmSTP1克隆

[0067] 以特异克隆引物(ZmSTP1-OE-F，ZmSTP1-OE-R)及以上cDNA为模板克隆STP1，具体操作过程：

[0068] 在200μl离心管中加入以下成分：

[0069]

[0070]

[0071] 离心混匀后进行PCR，PCR反应程序如下：

[0072]

[0073] 琼脂糖电泳凝胶检测回收，根据天根离心柱型试剂盒操作步骤。

[0074] 加A尾巴，在200μl离心管中加入以下成分:

[0075] 纯化DNA产物7μl

[0076]

[0077] 摇匀后，72℃孵育30min。使用 19-T TA克隆试剂盒，将回收的扩增片断克隆到T Vector上，构建重组质粒。

[0078]

[0079] 16℃过夜连接，热击转化至50μL感受态细胞中。37℃，150rpm摇床活化振荡60min；吸取100μl菌液涂布在LB+Amp固体培养基平板上，放于37℃恒温培养箱中培养过夜(12-16小时)。挑取单克隆，进行验证测序。以测序正确的质粒为模板，根据后续实验添加不同酶切位点，重复4操作，将含酶切位点的ZmSTP1连接在 19-T载体上，进行测序，测序正确后保菌备用。

[0080] 实施例2、Real-Time PCR分析玉米ZmSPT1基因各组织表达特性。

[0081] 供试材料种植在中国农业大学上庄实验站，至吐丝后一周收获不同组织的玉米样品，迅速放置在液氮中，带回实验室放置于-80度冰箱备用。

[0082] 定量结果表明，ZmSTP1在根中表达量最高(图2)。

[0083] 附Real-Time PCR操作步骤：

[0084] 1、提取不同处理样品根中的总RNA(方法同实施例1)；

[0085] 2、取50μg总RNA，用DNaseⅠ(TaKaRa公司，目录号:D2215)去除基因组DNA，方法如下：

[0086] 反应体系(50μl):

[0087]

[0088] 37℃反应30分钟；

[0089] 加入150μl DEPC水，加入200μl苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，充分混匀；

[0090] 4℃，12000rpm离心10分钟，取上层移入新的离心管中；

[0091] 加入200μl氯仿/异戊醇(24：1)，充分混匀；

[0092] 4℃12000rpm离心10分钟，取上层移入新的离心管中；

[0093] 加20μl的3M NaAc(pH＝5.2)，加500μl预冷无水乙醇，-20℃放置60分钟；

[0094] 4℃，12000rpm离心15分钟，回收沉淀，70％预冷乙醇洗沉淀2次；每次4℃，7500rpm离心5分钟；

[0095] 吹干，DEPC水重溶。

[0096] 3、常规方法反转录合成cDNA第一链(方法同实施例1)。

[0097] 4、Real-time PCR检测基因丰度，试剂选用TOYOBO公司的SYBR Green Realtime PCR Master Mix(目录号91620F3)，定量PCR仪器型号Bio-Rad iCycler iQ5system(BIO-RAD公司)，反转产物稀释10倍作为Real-time PCR模板

[0098] 反应体系：

[0099]

[0100] PCR反应程序：50℃2分钟，95℃10分钟，45个循环(95℃15秒，61℃30秒，72℃1分钟)；

[0101] 融解曲线步骤：95℃15秒，以10秒钟一个循环，每个循环增加0.5℃的速度从60℃升温到95℃，进行70个循环；

[0102] 以ZmUbi为内参，采用相对定量算法计算ZmSTP1在不同组织中的相对表达量。

[0103] 实施例3、运用原位杂交、绿色荧光蛋白技术对ZmSPT1表达定位分析。

[0104] 1、植物材料的准备

[0105] 植物培养用Hoagland培养液，三叶期玉米幼苗取根尖样。剪取根尖0.5-1cm放入FAA固定液中(成份每100ml固定液含:50％乙醇90ml，冰醋酸5ml，甲醛5ml)；

[0106] 然后进行植物材料脱水、透明、浸蜡，方法如下：

[0107] 弃去FAA固定液，DEPC水洗两次；

[0108] 50％乙醇，50％乙醇+10％叔丁醇，50％乙醇+20％叔丁醇，50％乙醇+35％叔丁醇，50％乙醇+50％叔丁醇，25％乙醇+75％叔丁醇，25％乙醇+75％叔丁醇+0.1％伊红Y)，100％叔丁醇依次各处理2小时；

[0109] 转入2/3叔丁醇+1/3石蜡油中放置4小时；

[0110] 倒出1/3叔丁醇石蜡油混合液，补充同体积60℃融化的石蜡于上层，形成凝固的蜡盖，60℃放置12小时，(重复3次)；

[0111] 倒出全部液体，加入纯的融化石蜡，60℃，8小时，(重复2次)；

[0112] 然后在65℃烫板上包埋。

[0113] 2、探针的合成和纯化

[0114] 在准备植物材料的同时进行RNA探针合成，参考Takara公司的T7-RNA polymerase(目录号：P2075)的使用方法，具体操作如下：

[0115] 华大基因公司合成含T7启动子和ZmSTP1的正向引物：

[0116] 5′-GATTTAGGTGACACTATAGAATGCTCCAAAAACGGCAGCGACA-3′

[0117] 反向引物：

[0118] 5-TGTAATACGACTCACTATAGGGGTACTATTGCTTGGTGGTG-3′；

[0119] 用KOD酶从质粒上扩增出含有T7启动子的DNA模板，体外转录成RNA探针，反应体系如下：

[0120]

[0121] 共20μl，混匀，在37℃反应2小时；

[0122] 加入4μl DNase I(TaKaRa公司，目录号D2215)37℃反应15分钟去除基因组DNA；

[0123] 反应结束后放置冰上，加0.8μl 0.5M EDTA(pH＝8.0)终止反应；

[0124] 加入2μl 5M LiCl，75μl-20℃预冷的无水乙醇，混匀后放置于-20℃2小时；

[0125] 13000rpm，4℃离心15分钟；

[0126] 弃去上清，加入50μl 70％预冷的乙醇洗涤沉淀，13000rpm 4℃离心5分钟；

[0127] 弃去上清，吹干沉淀；

[0128] 加24μl DEPC-H2O溶解，-80℃保存备用。

[0129] 3、制片：

[0130] 包埋好的腊块，用上海红宇QP-4型切片机切出8-10μm片子。截取合适位置的蜡带(含有植物样品)粘在多聚赖氨酸的载片(Sigma公司，目录号P0425-72EA)上，将蜡带放入DEPC水中45℃烤片台上展片，展片充分后吸去多余的水，40℃烘箱中烤片24-48小时，使切片充分干燥。

[0131] 切片脱蜡：片子在二甲苯中洗3次各5分钟，无水乙醇2次各2分钟，95％乙醇、85％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、30％乙醇依次各1分钟，DEPC水洗2次，每次1分钟。

[0132] 蛋白酶K处理：在一个染色缸中加入蛋白酶K反应缓冲液(100mM Tris-HCl pH 7.5，50mM EDTA)和蛋白酶K至终浓度1μg/ml，放入预处理好的片子，37℃保温20分钟；

[0133] 用DEPC水洗载玻片2次，每次1分钟；

[0134] 乙酰化处理：将载玻片置于染色缸中，加入40ml溶有100μl乙酸酐的0.1mol/L三乙醇胺溶液(pH＝8.0)，室温放置10分钟；倒掉溶液，2×SSC溶液洗涤两次，每次7分钟；

[0135] 在室温下，依次用不同稀释度的乙醇水溶液(30％，50％，70％，85％和95％)洗涤片子，每级1分钟，使组织切片脱水。然后用新的无水乙醇洗2次，每次2分钟。室温晾干。

[0136] 4、杂交

[0137] 杂交液组成：每张片子用200μl杂交液，包含：100μl去离子甲酰胺，20μl 10×杂交缓冲液(100mM Tris pH 7.5，10mM EDTA，3M NaCl)，24μl 50％硫酸葡聚糖，20μl 10×Blocking Solution，250μg鲑鱼精DNA，5μl探针，36.5μl 50×Denhardt’s溶液。避光杂交16-30小时。

[0138] 冲洗：片子浸入2×SSC中使盖片脱落，然后室温放置30分钟；换新的2×SSC，65℃1小时；0.1×SSC，65℃1小时。

[0139] 封闭:用吸水纸擦干载玻片背面，放在湿盒中，每片加2ml 1％封闭液(每400毫升含有Boehringer Block reagent 2g，0.1M Tris-HCl，pH＝7.5；和0.15M NaCl)，室温放置1小时。

[0140] 平衡:去掉封闭液，每片加1ml洗片液(100mM Tris-HCl pH＝7.5，150mM NaCl，0.3％Triton X-100，1％BSA)平衡15分钟。

[0141] 抗体吸附：去掉平衡液，加入400μl抗体溶液(每400μl抗体溶液含：399μl洗片液，1.32μl试剂盒提供的Anti-DIG-AP)，室温杂交2小时或4℃过夜。

[0142] 洗片：玻片在洗片液中洗3次，每次10分钟。

[0143] 显色前平衡：在显色缓冲液中浸5分钟(1ml显色缓冲液配方：100μl 1M Tris-HCl pH9.5，20μl 5M NaCl，860μl ddH2O，0.1g聚己烯醇)。

[0144] 显色：显色缓冲液中加入20μl NBT/BCIP，每片滴加200-500μl显色液，湿盒中室温黑暗处显色0.5-4h，当镜检时阳性信号为浅红或红棕色，而背景无明显色时即可停止反应，用水冲洗3次，每次5分钟。经中性树胶封片后，红棕色的阳性信号变为蓝色或蓝紫色。

[0145] 结果如图3a所示，为探针杂交结果，两图的上侧为根尖纵切图，下侧是根尖横切图。结果表明ZmSTP1在整个玉米根尖都有表达，这与其介导根从环境吸收糖的生物学功能是一致的。

[0146] 利用PUC-GFP载体，35S启动子，构建融合ZmSTP1的重组质粒的表达载体，注射烟草叶片，瞬时表达ZmSTP1，对其进行定位，结果表明其在细胞膜和细胞核上有表达(图3b)。

[0147] 实施例4、ZmSTP1酵母异源功能互补验证

[0148] pDR195载体的两端含有XhoI和BamHI酶切位点。取1-1.5ml菌液，参照天根质粒小提试剂盒说明，提取质粒，选用XhoI和BamHI将ZmSTP1基因从 19-T上切下来，电泳回收，连入pDR195载体上的XhoI和BamHI酶切位点之间，经测序选取正向连入的克隆。

[0149] EBY.VW4000酵母突变体，因为缺乏所有的己糖和半乳糖糖转运蛋白，导致在单糖为唯一碳源的环境中不能生存(Wieczorke et al.，1999)，但是可以在麦芽糖为碳源的环境中生长，运用这一特性我们来检测ZmSTP1的功能。经以上操作构建酵母pDR195重组质粒导入到EBY.VW4000酵母突变体，在碳源一定环境下分析酵母活性。

[0150] 酵母表达载体转入EBY.VW4000酵母突变体

[0151] 将待转化酵母接种到5ml液体YPD培养基中，于30℃，200rpm振荡过夜培养。测定浓度至OD600＝0.5接种到50mlYPD培养基中，于30℃，200rpm振荡培养至OD600＝2，3000×g离心5min收集细胞，弃去上层培养液，把细胞悬浮在25ml无菌水中，再离心收集细胞，弃水，把细胞悬浮在1ml无菌水中，转移至无菌的1.5ml离心管中，离心，去上清，再加入1ml无菌水悬浮细胞，

[0152] 根据转化量(约200μl)分装细胞悬液，再次离心1-2min沉淀细胞，用移液器小心吸出上清，然后，加入预混的转化混合液：

[0153]

[0154] 剧烈振荡至细胞完全混匀后，置于42℃水浴中热击至少40min(Suga and Hatakeyama，2005)，高速离心30sec，除去转化混合液，加入0.2-1.0ml无菌水，用移液器上下轻轻抽提悬浮沉淀。

[0155] 转入空载体的pDR-EBY.VW4000为阴性对照，野生型pDR-23344c为阳性对照。转化后在固体琼脂培养基上进行筛选培养，培养基为6.7g/L YNB(yeast nitrogen base)，其中尿嘧啶由硫酸铵(0.5g/L)麦芽糖(20g/L)替代。生长培养基在筛选培养基基础上添加2％葡萄糖、果糖、半乳糖或甘露糖作为唯一的碳源，硫酸铵(0.5g/L)作为氮源。取OD600＝1.0的酵母菌液，稀释为10-1，10-2，10-3，10-4四个梯度，用移液枪吸10μl滴至之前培养基上，30℃倒置培养3天观察表型。每一处理，用不同的单克隆重复三次。与突变体形成鲜明的对比，导入ZmSTP1酵母在葡萄糖(Glc)、果糖(Frc)和甘露糖(Man)生长明显，在半乳糖(Gal)供应条件下生长状况也得到一定程度改善(图4)，表明ZmSTP1转入酵母体系中后可以吸收多种单糖，但对不同单糖的吸收能力不同。

[0156] 附酵母质粒DNA提取方法：

[0157] 挑取生长菌斑接入0.5ml含1mM Arg的YNB液体培养基中，30℃，230rpm振荡培养过夜；4，000rpm离心5分钟收集菌体；

[0158] 倒掉上清液，用新鲜的液体培养基重悬菌体(总体积约50μl)，然后每管加入10μl浓度10mg/ml的溶菌酶溶液，充分振荡使溶液与菌体完全混匀；

[0159] 将试管在30℃，230rpm振荡培养60分钟；

[0160] 每管加入10μl 20％SDS，剧烈振荡1分钟使充分混匀；

[0161] 将样品放到-20℃2小时，取出再融解，剧烈振荡使充分裂解；

[0162] 用TE缓冲液(pH＝7.0)将每管体积补充到200μl；

[0163] 加200μl酚：仿：异戊醇(25:24:1)，剧烈振荡5分钟；14，000rpm离心10分钟，将上清转移到新离心管中；

[0164] 加8μl 10M NH4Ac和500μl无水乙醇；

[0165] 在-80℃冰箱中放1小时，14，000rpm离心10分钟；

[0166] 弃去上清，吹干沉淀，用20μl H2O溶解沉淀；

[0167] 取0.5μl质粒转到E.coli感受态细胞(DH5α菌株)中，37℃摇菌，提取质粒，酶切鉴定后送公司测序。

[0168] 实施例5、ZmSTP1拟南芥超表达载体的构建、转化及其表型分析。

[0169] 用重组表达载体pSuper1300+-ZmSTP1转化野生型拟南芥col。具体方法：取已经鉴定为阳性的农杆菌菌液0.5ml接种于500ml YEB液体培养基中，于28℃振荡培养至OD600到0.5。5000rpm 4℃离心15分钟收集菌体。用200ml的渗入缓冲液(1×MS大量元素，5％蔗糖)重悬菌体，加silwet L-77(GE公司，货号：S5505)至终浓度0.2％。1×大量元素含有1.65g/L NH4NO3，1.9g/L KNO3，0.44g CaCl2﹒2H2O，0.37g/L MgSO4﹒7H2O和0.17g/L KH2PO4。将抽苔后刚刚开花的拟南芥的花浸于重悬液中侵染30秒。用保鲜袋包裹植株，避光16℃下放置24小时，然后直立正常生长，直至收获T0代种子。

[0170] 1、转基因阳性植株的筛选

[0171] 由于转入pSuper1300+-ZmSTP1载体的拟南芥植株具有潮霉素抗性，所以在含有潮霉素的MS固体培养基上可以正常生长，而未转入基因的野生型种子不能正常生长并死亡。转化当代转基因植株为T0代，由该T0代植株自交产生的种子及由它所长成的植株为T1代。混合收集T1代种子，播种于含50μg/ml潮霉素的MS固体培养基上，筛选能正常生长的植株移栽于盆内继续生长，单株收种。T2代种子再经过1次潮霉素抗性筛选后单株收获T3代种子。同样再经过一次抗性筛选，所有个体都能生长的为转pSuper1300+-ZmSTP1的纯合体植株，留下备用。

[0172] 2、转基因拟南芥的分子检测

[0173] PCR检测：分别提取T3代转pSuper1300+-ZmSTP1基因拟南芥纯合植株的总RNA，在oligo(dT)引导下反转录成第一链cDNA，以ZmSTP1-RT-L和ZmSTP1-RT-R为引物进行RT-PCR检测在转基因拟南芥中ZmSTP1基因的表达水平。

[0174] 3、转基因植株单糖吸收能力分析

[0175] 对T3代种子进行春化、表面灭菌，在ATS无糖固体琼脂培养基进行发苗培养(Schofield et al.，2009Plant，Cell and Environment 32，271-285)。4天后进行处理，选取长势一致的ZmSTP1-OE 3个株系和Col-0幼苗移至方形(13×13cm2)筛选培养基上。筛选培养基为之前的发苗培养基，同时添加不同浓度的糖作为碳源，分别为：葡萄糖(Glc)、果糖(Frc)、蔗糖(Suc)、核糖(Rib)、半乳糖(Gal)、肌醇(MI)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)。无糖ATS培养基为阴性对照，添加三甲基葡萄糖(葡萄糖类似物，不能被己糖激酶磷酸化)的ATS培养基为阳性对照。Glc(2，5，10mM)，Frc(5，10mM)，Suc(5mM)或Rib(5，55mM)供应下，莲座叶数明显增多；高浓度Glc，Frc，Gal，Suc，Xyl，Rib，Man，MI下莲座叶数目减少(数据未全列)。莲座叶直径在低浓度Glc，Frc，Rib碳源下增加，在高浓度Glc，Frc，Gal，Suc，Xyl，Rib，Man或MI下降低，最终生物量也显著不同(图5，图6)。在55mM不同碳源同时添加9或1mM NO3-硝态氮下，生长明显受到抑制(图7)，说明超表达植株对氮素更敏感。

[0176] 土培试验中，转基因拟南芥及野生型种植在短日照条件下(8/16白天/黑夜，84μ-2 -1 -2 -1mol m s ，22℃)，直至35天。35天后短日照改为长日照(16/8h白天/黑夜，56μmol m s ，22℃)直至55天成熟。对第一花序高度，植株鲜重，干重，每棵种子重量进行统计。可溶性糖用氯仿/甲醇法提取(Antonio et al.，2008Rapid Communications in Mass Spectrometry 
22，1399-1407)，用液相色谱分光光度法测定(HP 1100，Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)，根据Focks等人的方法用试剂盒(Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)测定淀粉含量。短日照条件下，ZmSTP1超表达植株营养生长受到促进，表现为叶片增大、叶柄长增加、数目增加，莲座叶直径显著增加(图8)。长日照条件下，超表达植株表现为花序数目增加，干重增加，叶片颜色更深(图9)。超表达植株中AtSUC2(sucrose transporter 2)上调表达(图
10)，表明ZmSTP1影响其他糖类的转运；ZmSTP1还可能与光和途径相关，叶绿素a和叶绿素B合成相关蛋白AtCAB1在超表达植株中上调(图11)。综上表明，ZmSTP1可能是通过影响其他糖类的转运与调控光合途径而最终增加产量的。

[0177] 附：拟南芥培养及转基因幼苗筛选

[0178] 取适量拟南芥种子于1.5mL离心管中，加入去离子水。使水尽量没过所有种子，置于4℃冰箱春化2天。超净台中对种子进行消毒，加入75％乙醇灭菌1分钟，用灭菌水清洗一遍，再加入2％次氯酸钠灭菌2分钟，用灭菌水冲洗5-7遍。用10μL移液枪将种子均匀点在1/2MS(或1/2MS+50mg/ml潮霉素)培养基上，将点有种子的培养基垂直置于培养室(光照：
100·μE·m-2s-1、光周期：16h白天/8h黑夜、温度22/20℃、湿度100％)中培养。将长势较好的幼苗移栽至装有湿润营养土(m蛭石/m营养土＝1:1)的花盆中。4株每盆，每盘12盆，花盆表面覆盖一层保鲜膜，以防止水分过度蒸发影响幼苗生长。每5天浇400ml水，10天后揭去保鲜膜，每3天浇400ml水。

[0179] 取T0代拟南芥种子春化、消毒，将种子均匀涂抹在1/2MS筛选培养基上(含50μmol/L潮霉素)。包裹一层黑色塑料膜，放置于实验室，黑暗培养5-7天，若幼苗茎抽出很高则可能为具有抗性的转基因幼苗，各转基因植物挑选12株幼苗，编号，移至1/2MS培养基培养3-5天，待其长出4片幼叶后移至营养土中置于培养室培养，完成其整个生育期。重复以上操作直至得到纯合的T3代种子。

[0180] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。