实时电磁场细胞暴露系统及其应用

摘要

实时电磁场细胞暴露系统是由C形电磁铁芯、励磁电流发生器、荧光显微镜、CCD摄像头、摄像头操作系统、荧光图像处理系统、电脑等组成。C形电磁铁芯与励磁电流发生器和荧光显微镜连接，荧光显微镜与CCD摄像头连接，CCD摄像头与摄像头操作系统连接，摄像头操作系统与励磁电流发生器、荧光图像处理系统和电脑连接，荧光图像处理系统与电脑连接。这种实时电磁场细胞暴露系统的有益之处在于：在细胞遭受电磁场暴露的同时，观察和记录细胞荧光随时间变化的动态过程。为排除可能的内源性或外源性干扰，准确判断细胞电磁生物效应及其生物物理机制提供科学研究仪器。

权利要求

1.一种实时电磁场细胞暴露系统，所述系统是由C形电磁铁芯(1)、励磁电流发生器(2)、荧光显微镜(3)、CCD摄像头(4)、摄像头操作系统(5)、荧光图像处理系统(6)、电脑(7)组成；C形电磁铁芯(1)与励磁电流发生器(2)和荧光显微镜(3)连接，荧光显微镜(3)与CCD摄像头(4)连接，CCD摄像头(4)与摄像头操作系统(5)连接，摄像头操作系统(5)与励磁电流发生器(2)、荧光图像处理系统(6)和电脑(7)连接，荧光图像处理系统(6)与电脑(7)连接；

其中所述的C形电磁铁芯(1)由矽钢片堆(9)和励磁线圈(10)组成，矽钢片堆(9)围成C形状，其中空隙作为细胞槽(8)，用于放置细胞皿；励磁电流发生器(2)是由信号发生器(11)、频率调节器(12)、电流放大器(13)、励磁电流调节(14)、励磁电流开关(15)、霍尔传感器(16)、霍尔传感器检测电路(17)组成；信号发生器(11)与频率调节器(12)和电流放大器(13)连接，电流放大器(13)与励磁电流调节(14)和励磁电流开关(15)连接；信号发生器(11)通过频率调节器(12)产生0-340Hz的正弦信号，并输入到电流放大器(13)；电流放大器(13)通过励磁电流调节(14)产生0-1A、0-340Hz的励磁电流，并通过励磁电流开关(15)输入到励磁线圈(10)，使细胞槽(8)中产生磁感应强度0.01-25.37mT，频率0-340Hz的交变磁场；励磁电流开关(15)控制励磁电流的导流和阻断；霍尔传感器(16)与霍尔传感器检测电路(17)连接，霍尔传感器检测电路(17)接受由霍尔传感器(16)的磁场检测信号，用于实测细胞槽(8)中交变磁场的磁感应强度。

2.根据权利要求1所述的实时电磁场细胞暴露系统，其特征在于，所述的CCD摄像头(4)产生和记录一个按时间序列排列的图像集，励磁电流发生器(2)在发生或阻断电流的同时，向摄像头操作系统(5)发出一个启闭信号，并标记在图像集中，用于指示交变磁场开启或关闭的时间。

3.根据权利要求1所述的实时电磁场细胞暴露系统，其特征在于，所述的荧光图像处理系统(6)是由图像采样(18)、细胞定位(19)、细胞识别(20)、荧光测算(21)、像线转换(22)、曲线校正(23)组成；图像采样(18)的数字图像每个像素的红、绿、蓝三原色亮度等级为一个字节，即为255个等级；细胞定位(19)先在图像集的第一帧图像中用一个或多个方框标记单个或多个目标细胞，然后，在第二帧及以后的图像中，在同一方框位置对标记的目标细胞进行边缘提取和荧光强度分析；细胞识别(20)是在细胞图像中，选择绿色分量作为阈值参数，当某一像素的绿色分量小于数值为50的阈值，则该像素标记为0，代表背景，否则，标记为1，代表细胞区部分；阈值在不大于50的范围内人工设定；对图像的噪声干扰采取自动选择最大面积的连通区标记为1，作为目标细胞，其它标记为0，作为背景噪声；荧光测算(21)是在定位的标记为1的细胞区域计算细胞总荧光亮度为区域各像素点的荧光强度C(λ)平均值S；

像线转换(22)是对图像集中的每一个目标细胞测算荧光强度平均值S后，按时间顺序连接成曲线，形成的荧光曲线图；曲线校正(23)是在电磁场暴露前t≤tp，先对感兴趣的目标细胞采集，根据这些数据建立在0＜t≤tp内，该目标细胞荧光淬灭线性拟合方程F1(t)＝at+b，其中 和 分别为细胞荧光实测值F和时间值t的平均值；在电磁场切入后t＞tp，对感兴趣的目标细胞实测值F(t)进行纠偏：ΔF＝F(t)-F1(t)，得到纠偏后细胞荧光校正函数为：

4.根据权利要求1所述的实时电磁场细胞暴露系统在研究实时电磁生物效应及其机制中的应用。

说明书

实时电磁场细胞暴露系统及其应用

技术领域

[0001] 本发明属生物技术领域，涉及一种细胞荧光检测系统，具体地说，涉及一种当细胞暴露于电磁场时，可以实时检测和记录细胞内荧光探针对电磁场动态响应的系统。

背景技术

[0002] 电磁生物效应是生物体对电磁场或电磁波的反应，可以分为热效应和非热效应两种。热效应作用机理比较清楚，是由焦耳热或辐射能所致。非热效应是一种弱效应，作用机理不清楚，是生物电磁学的研究热点。电磁生物效应是一种因果节联反应，最初是电磁场与生物分子发生物理反应，反应后的生物分子相互之间发生化学反应，化学反应后的生物分子导致细胞反应，细胞反应导致后续的生物器官和整体的反应。因此，基于物理反应的原初效应是电磁生物效应的起点，也是关键点。

[0003] 电磁生物效应的研究有流行病调查、动物或人体、细胞、分子与生化、生物物理等层次。目前，细胞实验的研究方法主要是基于暴露后观察的组间对照，没有在电磁场暴露期间观察细胞自身反应，即非实时性。这样，很难确认电磁场所引起的细胞效应，尤其是很难排除电磁场以外的其它外源性干扰因素，如细胞样品从培养箱移出瞬间遭受室温与培养箱之间温差所致的应激反应，以及细胞自身代谢的内源性干扰等。在电磁场暴露期内实时检测细胞的生物效应，可以最大限度地降低干扰因素，对认识无扰或低扰状态下电磁生物效应特性具有重要意义。

[0004] 在细胞实验中，活性氧自由基(ROS)、细胞内钙(Ca2+)、线粒体膜电位(MMP)等都是重要的电磁生物效应观察物。ROS是具有不配对电子的基团或分子(R.)，主要有超氧阴离子( )、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(.OH)等等，其化学性质活泼，寿命短，有顺磁性，是电磁生物原初效应的重要标志。细胞内钙(Ca2+)作为第二信使在细胞功能的调节中起着信号传导的关键作用，是多种参与蛋白质、磷脂和核酸分解的酶的激活分子之一。正常情况下，细胞内钙稳态是由质膜Ca2+转位酶和细胞内钙池系统共同操纵控制的。细胞损害时，这一操纵过程紊乱可导致Ca2+内流增加，胞内Ca2+浓度不可控地持续增加。研究表明，电磁场暴露可以使细胞内离子钙浓度增加，因此，Ca2+是电磁生物效应中信号传导的重要标志。线粒体是细胞能量生产工厂，ATP酶生成的主要场所。线粒体在呼吸氧化过程中产生ROS，在线粒体内膜集聚质子和其他离子而形成线粒体膜电位(MMP)。

[0005] 活性氧自由基(ROS)、细胞内钙(Ca2+)、线粒体膜电位(MMP)都可以用荧光探针观察。ROS的荧光探针有DCFH-DA、Ca2+有Fluo-3、MMP有JC-1等等。荧光淬灭是指随着时间的延长，荧光亮度逐渐变暗的过程，是荧光的一种基本特性。由于荧光淬灭特性的存在，一般细胞的荧光检测技术不用在实时研究，大大限值了电磁生物细胞效应的实时研究。

[0006] 本发明了一种由电磁场发生器和荧光显微成像系统整合在一起的一体机所构成的实时电磁场细胞暴露系统，可以在电磁场暴露期，实时观察和记录细胞内荧光的动态变化。

发明内容

[0007] 实时电磁场细胞暴露系统是由C形电磁铁芯1、励磁电流发生器2、荧光显微镜3、CCD摄像头4、摄像头操作系统5、荧光图像处理系统6、电脑7等组成。C形电磁铁芯1与励磁电流发生器2和荧光显微镜3连接，荧光显微镜3与CCD摄像头4连接，CCD摄像头4与摄像头操作系统5连接，摄像头操作系统5与励磁电流发生器2、荧光图像处理系统6和电脑7连接，荧光图像处理系统6与电脑7连接。

[0008] C形电磁铁芯1由矽钢片堆9和励磁线圈10组成。矽钢片堆9围成C形状，其中空隙作为细胞槽8，用于放置细胞皿。

[0009] 励磁电流发生器2是由信号发生器11、频率调节器12、电流放大器13、励磁电流调节14、励磁电流开关15、霍尔传感器16、霍尔传感器检测电路17组成。信号发生器11与频率调节器12和电流放大器13连接，电流放大器13与励磁电流调节14和励磁电流开关15连接。霍尔传感器16与霍尔传感器检测电路17连接。

[0010] 信号发生器11通过频率调节器12产生0-340Hz的正弦信号，并输入到电流放大器13。电流放大器13通过励磁电流调节14产生0-1A、0-340Hz的励磁电流，并通过励磁电流开关15输入到励磁线圈10，使细胞槽8中产生磁感应强度0.01-25.37mT，频率0-340Hz的交变磁场。励磁电流开关15控制励磁电流的导流和阻断，从而控制细胞槽8中交变磁场的发生和停止。霍尔传感器检测电路17接受由霍尔传感器16的磁场检测信号，用于实测细胞槽8中交变磁场的磁感应强度，实现磁场的质量控制。

[0011] 当励磁电流发生器2输出电流，在细胞槽8产生交变磁场时，细胞槽8中细胞皿的细胞暴露在该磁场中。同时，荧光显微镜3对该细胞进行显微荧光成像，CCD摄像头4对荧光显微镜3成像的图像进行实时记录、保存，产生一个按时间序列排列的图像集。摄像头操作系统5对CCD摄像头4的开启、关闭，图像捕获、测量、处理、记录、保存、标记等进行控制。

[0012] 励磁电流发生器2在发生或阻断电流的同时，向摄像头操作系统5发出一个启闭信号，并标记在图像集中，用于指示交变磁场开启或关闭的时间。

[0013] 荧光图像处理系统6从摄像头操作系统5中获取图像集，对图像集中的图像进行图像采样、细胞定位、细胞识别、荧光测算、像线转换、曲线校正等处理和分析，以实现时间序列的图像集转换为时间序列的细胞荧光曲线。

[0014] 荧光图像处理系统6是由图像采样18、细胞定位19、细胞识别20、荧光测算21、像线转换22、曲线校正23组成。图像采样18是通过A/D转换的方式将显微镜显示的模拟量图像转换为数字图像。数字图像的色彩用三原色(红、绿、蓝)亮度等级描述，每个像素原色(红、绿、蓝)的亮度等级为一个字节(1bit)，即为255个等级。细胞定位19先在图像集的第一帧图像中用一个或多个方框标记单个或多个目标细胞，然后，在第二帧及以后的图像中，在同一方框位置对标记的目标细胞进行边缘提取和荧光强度分析。细胞识别20是在细胞图像中，选择绿色分量作为阈值分析参数，当某一像素的绿色分量小于阈值(＜50)，则该像素标记为0，代表为背景，否则，标记为1，代表为细胞区部分。阈值50是可以根据分析要求人工设定的。对图像的噪声干扰采取自动选择最大面积的连通区标记为1，作为目标细胞，其它标记为0，作为背景噪声。荧光测算21是在定位的标记为1的细胞区域计算细胞总荧光亮度为区域各像素点的荧光强度C(λ)平均值S。像线转换22是对图像集中的每一个目标细胞荧光测算强度平均值S后，按时间顺序连接成曲线，形成的荧光曲线图。曲线校正23的方法是设时间为t，图像采集频率为Ts，tp为电磁场切入时刻。在电磁场暴露前(t≤tp)，先对感兴趣的目标细胞采集Tn时间(约1-10分钟)，有n＝Tn/Ts个数据，实测值为F(t)。根据这些数据建立该目标细胞荧光淬灭线性拟合方程：F1(t)＝at+b(0＜t≤tp)。在电磁场切入后(t＞tp)，对感兴趣的目标细胞采集Tm时间，有m＝Tm/Ts个数据，并对实测值F(t)进行纠偏：ΔF＝F(t)-F1(t)(t＞tp)。得到纠偏后细胞荧光校正函数为：

[0015] 本发明的有益之处在于：

[0016] 本系统可以在细胞遭受电磁场暴露的同时，观察和记录细胞荧光随时间变化的动态过程。为排除可能的内源性或外源性干扰，准确判断细胞电磁生物效应，研究细胞实时动态特性及其导致生物效应发生的生物物理机制提供科学研究仪器。

附图说明

[0017] 图1是实时电磁场细胞暴露系统图。

[0018] 图2是C形电磁铁芯1示意图。

[0019] 图3是励磁电流发生器2示意图。

[0020] 图4是荧光图像处理系统6示意图。

[0021] 图5是实时电磁场细胞暴露胞内ROS时序图。

[0022] 图6是实时电磁场细胞暴露胞内Ca2+时序图。

[0023] 图7是荧光淬灭校正曲线。

具体实施方式

[0024] 下面结合附图对本发明加以详细说明。

[0025] 实施例1：

[0026] 参见图1，实时电磁场细胞暴露系统是由C形电磁铁芯1、励磁电流发生器2、荧光显微镜3、CCD摄像头4、摄像头操作系统5、荧光图像处理系统6、电脑7等组成。C形电磁铁芯1与励磁电流发生器2和荧光显微镜3连接，荧光显微镜3与CCD摄像头4连接，CCD摄像头4与摄像头操作系统5连接，摄像头操作系统5与励磁电流发生器2、荧光图像处理系统6和电脑7连接，荧光图像处理系统6与电脑7连接。

[0027] 参见图2，C形电磁铁芯1由矽钢片堆9和励磁线圈10组成。矽钢片堆9围成C形状，其中空隙作为细胞槽8，用于放置细胞皿。

[0028] 励磁电流发生器2可发生0-1A的电流，并输入到C形电磁铁芯1的励磁线圈10中，以产生磁感应强度0.01-25.37mT，频率0-340Hz的交变磁场。荧光显微镜3对细胞皿中的细胞荧光进行显微成像，CCD摄像头4对荧光显微镜3成像的图像进行实时记录、保存，产生一个按时间序列排列的图像集，摄像头操作系统5对CCD摄像头4的开启、关闭，图像采集、测量、处理、记录、保存、标记等进行控制。

[0029] 励磁电流发生器2在发生或阻断电流的同时，向摄像头操作系统5发出一个启闭信号，并标记在图像集中，用于指示交变磁场开启或关闭的时间。

[0030] 荧光图像处理系统6从摄像头操作系统5中获取图像集，对图像集中的图像进行图像采样、细胞定位、细胞识别、荧光测算、像线转换、曲线校正等处理，以实现时间序列的图像集转换为时间序列细胞荧光亮度曲线。

[0031] 实施例2：

[0032] 参见图3，励磁电流发生器2是由信号发生器11、频率调节器12、电流放大器13、励磁电流调节14、励磁电流开关15、霍尔传感器16、霍尔传感器检测电路17组成。信号发生器11与频率调节器12和电流放大器13连接，电流放大器13与励磁电流调节14和励磁电流开关
15连接。霍尔传感器16与霍尔传感器检测电路17连接。

[0033] 信号发生器11通过频率调节器12产生0-340Hz的正弦信号，并输入到电流放大器13。电流放大器13通过励磁电流调节14产生0-1A、0-340Hz的励磁电流，并输入到励磁电流开关15。励磁电流开关15控制励磁电流的导流和阻断，从而控制细胞槽8中交变磁场的发生和停止。霍尔传感器检测电路17接受由霍尔传感器16的磁场检测信号，用于实测细胞槽8中交变磁场的磁感应强度，实现磁场的质量控制。

[0034] 实施例3：

[0035] 参见图4，荧光图像处理系统6是由图像采样18、细胞定位19、细胞识别20、荧光测算21、像线转换22、曲线校正23组成。荧光图像处理系统6的主要任务是从CCD摄像头4实时记录、保存的图像集中，将感兴趣的细胞图像的荧光亮度转换为按时间序列的数值数据，并建立时间域的荧光亮度曲线。

[0036] 摄像头操作系统5将CCD摄像头4的图像以1帧/秒的采样频率采集图像数据，将视野中的图像用1340×1004的高分辨率进行采样，通过USB接口将这些数据传输到摄像头操作系统5中，以连续图像的格式存储，进行后续图像处理。图像采样18是通过A/D转换的方式将显微镜显示的模拟量图像转换为数字图像。数字图像的色彩用三原色(红、绿、蓝)亮度等级描述，每个像素原色(红、绿、蓝)的亮度等级为一个字节(1bit)，即为255个等级。

[0037] 细胞定位19是用于确定感兴趣的目标细胞，其处理方法是选择成像清晰，荧光明亮，且周围没有粘连物的细胞作为分析目标，一般有人工定位和自动定位两种图像处理方法：

[0038] (1)自动定位：采用边缘检测，自动识别图像中的多个细胞。这种方法客观方便，数据处理自动化，可以快速处理大量的图像数据；

[0039] (2)人工定位：先在图像集的第一帧图像中用一个或多个方框标记单个或多个目标细胞，然后，在第二帧及以后的图像中，在同一方框位置对标记的目标细胞进行边缘提取和荧光强度分析。

[0040] 实际上，多细胞粘连是很常见的现象，自动定位往往会出现偏差，而人工定位介入人的判断能力，可以保证所定位的细胞是单个无粘连的，是切实可行的方法。

[0041] 细胞识别20的作用是在荧光图像中将细胞区域识别出来，把细胞区的部分标记为1，其余标记为0。实现方法是根据细胞荧光为绿色，背景为黑色的事实，将细胞图像进行二值化处理。处理方法是在细胞图像中，选择绿色分量作为阈值分析参数，当某一像素的绿色分量小于阈值(＜50)，则该像素标记为0，代表为背景，否则，标记为1，代表为细胞区部分。
阈值50是可以根据分析要求人工设定的。

[0042] CCD摄像头4是一种基于半导体的电荷耦合装置，其成像质量受到温度变化等的噪声干扰而不清晰，表现在细胞荧光图像中一些不是细胞的图像也显示为绿色，造成二值化后的多个图像连通现象。处理方法是自动选择最大面积的连通区标记为1，作为目标细胞，其它标记为0，作为背景噪声。

[0043] 荧光测算21是在定位的标记为1的细胞区域计算细胞总荧光亮度。计算方法是经图像采集获得的荧光图像是以R、G、B(红绿蓝)三分量表示的数据，根据国际照明委员会的规范(CIE)，将数字图像的RGB系统转换为CIE-XYZ系统。首先，RGB系统转换为CIE-XYZ系统三分量刺激值：

[0044]

[0045] 然后，转换色度坐标x，y，z：

[0046]

[0047] 以y色度坐标分量为主，搜索CIE不同波长与色度坐标x，y，z对应关系对比表，找到与y色度分量最为匹配的颜色波长λ。CIE-XYZ系统给出了不同波长λ对应的理想三原色值和空间色度坐标值。取色度坐标x，y建立直角坐标系，将代表不同波长的x、y值标记出来，即可得到一条马蹄形曲线。

[0048] 对于任意给出的像素RGB值，计算的色度坐标x、y不一定恰好位于马蹄形曲线上。如有一点P，在距离马蹄线上最近的点波长值作为该像素的波长，如P点距离马蹄线上480nm点最近，故P点的波长就是480nm。得到波长λ后，搜索CIE-RGB颜色空间，查找与波长对应的三分量刺激值R(λ)、G(λ)、B(λ)，并计算荧光强度C(λ)：

[0049] C(λ)＝R(λ)+4.590G(λ)+0.060B(λ)   (3)

[0050] 从像素的RGB数据计算相应的波长，计算量很大，尤其是对于连续采集30分钟的高分辨率图像，其运行时间非常大。因此，我们对于可穷举的RGB，先建立一张λ(x、y)＝λ(R，G，B)查询表，通过数据库查询，对于某一像素可以快速获得λ，大大提高了运算速度。

[0051] 细胞的总荧光亮度是在细胞识别的区域中各像素点的荧光强度C(λ)平均值S：

[0052]

[0053] 参见图5和图6，像线转换22是对图像集中的每一个目标细胞荧光测算强度平均值S后，按时间顺序连接成曲线，形成的荧光曲线图。图5和图6分别是电磁场海马神经元暴露期胞内ROS和Ca2+荧光的实时时序图。

[0054] 传统上，生物荧光技术是用于单次成像，荧光淬灭不影响图像获得。但在实时研究中，荧光图像是多次成像形成图像集，荧光淬灭将持续降低荧光亮度，形成成像偏差，影响像线转换。因此，像线转换的荧光曲线必须进行校正。曲线校正23的方法是：

[0055] 设时间为t，图像采集频率为Ts，tp为电磁场切入时刻。在电磁场暴露前(t≤tp)，先对感兴趣的目标细胞采集Tn时间(约1-10分钟)，有n＝Tn/Ts个数据，实测值为F(t)。根据这些数据建立该目标细胞荧光淬灭线性拟合方程：

[0056] F1(t)＝at+b (0＜t≤tp)   (5)

[0057] 这里：F1(t)为拟合方程目标细胞荧光亮度计算值，a和b为最小二乘拟合方程参数：

[0058]

[0059]

[0060] 这里：和 分别为细胞荧光实测值F和时间值t的平均值。

[0061] 在电磁场切入后(t＞tp)，对感兴趣的目标细胞采集Tm时间，有m＝Tm/Ts个数据，并对实测值F(t)进行纠偏：

[0062] ΔF＝F(t)-F1(t) (t＞tp)   (8)

[0063] 得到纠偏后细胞荧光校正函数为：

[0064]

[0065] 参见图7，曲线校正23的方法可以获得较好的效果。

[0066] 实施例4：

[0067] 在研究实时电磁场暴露海马神经元胞内ROS和Ca2+的应用。

[0068] 在超净台内用0.5ml的0.1mg/ml多聚赖氨酸(Poly-L-lysine，Sigma)包被细胞皿30min，吸弃，过夜晾干备用。用75％酒精消毒SD大鼠，终止生命，取大脑海马组织，剥除脑膜和血管，置于冰浴解剖液中。将海马组织切碎后，转移至2ml 0.25％胰酶溶液(Trypsin(1X)，Life technologies)中，37℃消化20min。吸弃胰酶，用37℃温浴中2ml种植液终止消化，再用种植液洗海马组织2遍。在海马组织中加入2m1种植液，用1ml移液枪轻轻吹打，用
500转/min离心30s，制成细胞悬液。细胞计数后，用种植液稀释细胞悬液，并按1×106/ml密度接种在细胞皿0.5ml。4h后用Neurobasal-A使用液全量换液，第3天用Neurobasal-A使用液半量换液，并加上0.5μl 10μM阿糖胞苷(Ara-c，Sigma)，再隔3天用Neurobasal-A使用液半量换液。取第7天的细胞用于后续实验。

[0069] 系统使用本系统前，励磁电流发生器2上的霍尔传感器16插入C形电磁铁芯1的细胞槽8中，通过频率调节器12和励磁电流调节14调节励磁电流，使细胞槽8内的磁感应强度在0-340Hz，0.01-25.37mT内连续可调，以保证细胞槽8内磁场的合格性。

[0070] 系统使用时，细胞皿放置在C形电磁铁芯1中的细胞槽8中。当励磁电流发生器2输出电流，在细胞槽8产生交变磁场时，细胞槽8中细胞皿的细胞暴露在该磁场中。同时，荧光显微镜3对该细胞进行显微荧光成像，实现C形电磁铁芯1中的电磁场暴露与荧光显微镜3的荧光成像同步产生，达到实时的目的。

[0071] 系统使用后，荧光图像处理系统6从摄像头操作系统5中导出图像集，通过像线转换，获得时间序列的实时电磁场暴露曲线。

[0072] 实施例5：

[0073] 研制了两台励磁电流发生器2，送浙江省计量科学研究院检测，检测结果如表1和表2。细胞槽内霍尔传感器电压：1-200mV；磁感应强度：0.01047-25.3679mT；精度：1.623％；磁场频率：0-340Hz。

[0074] 表1 1#机磁场特性

[0075]

[0076] 表2 2#机磁场特性

[0077]