一种外源易提取球囊霉素土壤改良剂的制备方法及其使用方法

摘要

一种外源易提取球囊霉素土壤改良剂的制备方法，包括如下步骤，(1)、柠檬酸钠浸提剂的制备：采用柠檬酸溶液与磷酸氢二钠溶液以13:87的比例混合均匀制得柠檬酸钠浸提剂；(2)、外源易提取球囊霉素土壤改良剂的制备：将风干土加入柠檬酸钠浸提剂后灭菌、离心后收集上清液即为外源提取球囊霉素溶液；(3)、采用柠檬酸钠缓冲液稀释步骤(2)制备的溶液，即为外源易提取球囊霉素土壤改良剂。其优点是：提高植物根际内源土壤球囊霉素含量，促进植物营养生长以及植物根际水稳性大团聚体的形成，改善土壤结构；提高植物根际土壤中过氧化物酶、多酚氧化酶和土壤磷酸酶的活性，促进土壤养分循环；制备方法工艺简单，安全高效，绿色无污染，生态经济效益明显。

权利要求

1.一种外源易提取球囊霉素土壤改良剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤，

1)、柠檬酸钠浸提剂的制备：采用柠檬酸溶液与磷酸氢二钠溶液以质量比为13:87的比例混合均匀制得柠檬酸钠浸提剂；

2)、外源易提取球囊霉素土壤改良剂的制备：将风干土加入柠檬酸钠浸提剂后灭菌、离心后收集上清液即为外源提取球囊霉素溶液；

3)、采用柠檬酸钠缓冲液稀释步骤(2)制备的溶液，即为外源易提取球囊霉素土壤改良剂；

步骤1)中，柠檬酸溶液的制备为：取0.42～4.2g C6H8O7·H2O溶于100～1000mL蒸馏水，制备得0.02mol/L柠檬酸溶液；

磷酸氢二钠溶液的制备为：取0.5365～5.365g Na2HPO4·7H2O或0.716～7.16g Na2HPO4·12H2O溶至100～1000mL，制备得0.02mol/L的磷酸氢二钠溶液；

制备的柠檬酸钠浸提剂为20mmol/L、pH＝7.0；

步骤2)中，风干土的质量与柠檬酸钠浸提剂的体积比为1：8；球囊霉素溶液的提取条件为：103kpa，121℃条件下提取30min；离心条件为10000g/s下离心5min；

步骤3)中，外源易提取球囊霉素溶液与柠檬酸钠缓冲液的配比为1:1；柠檬酸钠缓冲液的浓度为20mmol/L，pH为7.0。

2.根据权利要求1所述制备的一种外源易提取球囊霉素土壤改良剂的使用方法，其特征在于：将制备的一种外源易提取球囊霉素土壤改良剂以营养液的形式施入种植有植物的容器内，且每个容器中施加50mL～100mL的外源球囊霉素土壤改良剂；或者取50mL外源球囊霉素土壤改良剂施入栽培植物的根围。

说明书

一种外源易提取球囊霉素土壤改良剂的制备方法及其使用

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及农业技术领域，具体地说是一种外源易提取球囊霉素土壤改良剂的制备方法及其使用方法。

背景技术

[0002] 全世界拥有耕地7.3亿hm2，但每年近500万hm2的土壤因退化或贫瘠而导致植物的生产力下降。因此，土壤改良成为当前社会关注的热点问题。开展土壤修复技术显得尤为重要。

[0003] 而当前土壤修复的方法大致可分为物理、化学和生物三类，包括热力学修复、热解吸修复、焚烧法、土地填埋法、化学淋洗、堆肥法、植物修复、渗透反应墙、生物修复等。其中，植物修复指在土壤中添加改良剂，改善土壤的理化性状，增强肥力，使得修复后的土壤更适宜植物生长，恢复重建自然生态环境和植被景观。因此，土壤改良剂对土壤的改善效果明显，应用非常广泛。

[0004] 但现有土壤改良剂的制备原料非常广，包括各种天然矿物质、农业生产废弃物、工业生产副产品、城市和生活废弃物以及有机肥料、人工聚合物等，这些制备的土壤改良剂存在许多的不足:(1)制备原料单一，产品质量、效果和性能不稳定；(2)富含其他的有毒有害物质，严重地影响了土壤环境和水环境。鉴于此，寻找一种简便、经济、性质稳定、绿色环保的土壤改良剂用于改良土壤的理化性状显得尤为重要。

发明内容

[0005] 本发明一方面提供能够提高土壤团聚体稳定性、改善土壤理化性状、络合土壤中重金属，从而促进土壤相关酶活性、增加土壤中有机质与养分含量的一种外源易提取球囊霉素土壤改良剂的制备方法。

[0006] 本发明一种外源易提取球囊霉素土壤改良剂的制备方法，包括如下步骤：

[0007] 1)、柠檬酸钠浸提剂的制备：采用柠檬酸溶液与磷酸氢二钠溶液以13:87的比例混合均匀制得柠檬酸钠浸提剂；

[0008] 2)、外源易提取球囊霉素土壤改良剂的制备：将风干土加入柠檬酸钠浸提剂后灭菌、离心后收集上清液即为外源提取球囊霉素溶液。

[0009] 3)、采用柠檬酸钠缓冲液稀释步骤(2)制备的溶液，即为外源易提取球囊霉素土壤改良剂。

[0010] 本发明第二方面是提供对第一方面所述一种外源易提取球囊霉素土壤改良剂的使用方法，采用该方法施加土壤改良剂后，植物营养生长、生物量显著提高，土壤结构显著改善，土壤肥力和养分显著提高。

[0011] 本发明一种外源易提取球囊霉素土壤改良剂的使用方法为：将所述第一方面制备的一种外源易提取球囊霉素土壤改良剂以营养液的形式施入种植有植物的容器内，且每个容器中施加50mL-100mL的外源易提取球囊霉素土壤改良剂；或者取50mL外源易提取球囊霉素土壤改良剂施入栽培植物的根围。

[0012] 本发明一种外源易提取土壤改良剂的制备方法与使用方法，其优点是：提高植物根际内源土壤球囊霉素的含量，促进植物营养生长以及植物根际水稳性大团聚体的形成，改善土壤结构；提高植物根际土壤中过氧化物酶、多酚氧化酶和土壤磷酸酶(酸性、中性)的活性，促进土壤养分循环；制备方法工艺简单，不污染环境，安全高效，生态经济效益明显。

附图说明

[0013] 图1为实施例二中外源易提取球囊霉素(0强度和1/2强度)对柑橘土壤有机碳含量的影响，即1/2强度处理比0强度处理对柑橘土壤有机碳含量促进效果要大。

[0014] 图1显示，1/2强度易提取球囊霉素显著提高了柑橘土壤中有机碳含量。

具体实施方式

[0015] 本发明一种外源易提取球囊霉素土壤改良剂的制备方法，包括如下步骤：

[0016] 1)、柠檬酸钠浸提剂的制备：采用柠檬酸溶液与磷酸氢二钠溶液以13:87的比例混合均匀制得柠檬酸钠浸提剂；

[0017] 2)、外源易提取球囊霉素土壤改良剂的制备：将风干土加入柠檬酸钠浸提剂后灭菌、离心后收集上清液即为球囊霉素溶液。

[0018] 3)、采用柠檬酸钠缓冲液稀释步骤2)制备的溶液，即为外源易提取球囊霉素土壤改良剂。

[0019] 优选地，步骤1)中，柠檬酸溶液的制备为：取0.42～4.2g C6H8O7·H2O溶于100～1000mL蒸馏水，制备得0.02mol/L柠檬酸溶液；

[0020] 优选地，步骤1)中，磷酸氢二钠溶液的制备为：取0.5365～5.365g Na2HPO4·7H2O或0.716～7.16g Na2HPO4·12H2O溶至100～1000mL，制备得0.02mol/L的磷酸氢二钠溶液；

[0021] 优选地，步骤1)中，制备的柠檬酸钠浸提剂为20mmol/L、pH＝7.0。

[0022] 优选地，步骤2)中，风干土的质量与柠檬酸钠浸提剂的体积比为：1：8；

[0023] 优选地，步骤2)中，提取条件为：103kpa，121℃条件下提取30min；

[0024] 离心条件为10000g/s下离心5min。

[0025] 优选地，步骤3)中，外源易提取球囊霉素溶液与柠檬酸钠缓冲液的配比为：0～1：1～0。优选地，步骤3)中，外源易提取球囊霉素溶液与柠檬酸钠缓冲液的配比为1:1。

[0026] 优选地，步骤3)中，柠檬酸钠缓冲液稀的浓度为20mmol/L，pH为7.0。

[0027] 本发明第二方面是提供对第一方面所述一种外源易提取球囊霉素土壤改良剂的使用方法，采用该方法施加土壤改良剂后，植物营养生长、生物量显著提高，土壤结构显著改善，土壤肥力和养分显著提高。

[0028] 本发明一种外源易提取球囊霉素土壤改良剂的使用方法为：将所述第一方面制备的一种外源易提取球囊霉素土壤改良剂以营养液的形式施入种植有植物的容器内，且每个容器中施加50mL-100mL的外源易提取球囊霉素土壤改良剂；或者取50mL外源易提取球囊霉素土壤改良剂施入栽培植物的根围。

[0029] 为了进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实例，详细说明如下：

[0030] 实施例一

[0031] 1、外源易提取球囊霉素的制备

[0032] 在长江大学柑橘园采集0～20cm土壤(黄壤)，混合均匀，风干，过孔4mm的筛子，去除土壤中的根系、垃圾以及石块。然后再根据下面的方法提取外源易提取球囊霉素：

[0033] 1)、柠檬酸钠浸提剂的制备：

[0034] 柠檬酸溶液的制备为：取4.2g C6H8O7·H2O溶于1000mL蒸馏水，制备得0.02mol/L柠檬酸溶液；

[0035] 磷酸氢二钠溶液的制备为：取5.365g Na2HPO4·7H2O溶至1000mL，制备得0.02mol/L的磷酸氢二钠溶液；

[0036] 分别取26g柠檬酸溶液磷、174g酸氢二钠溶液混匀得20mmol/L(pH＝7.0)的柠檬酸钠浸提剂；

[0037] 2)、取25g风干土样于试管中，加入200mL步骤1)制备的柠檬酸钠浸提剂；

[0038] 3)在103kpa，121℃条件下对步骤(2)试管中的混合物提取30min，10000g/s下离心5min，收集上清液；提取完成后外源易提取球囊霉素的浓度为0.022mg/mL。

[0039] 2、材料与方法

[0040] 试验于2013年在荆州市长江大学园艺园林学院塑料温室进行。供试植物为柑橘砧木—枳，土壤为黄壤土(过4mm塞，高压灭菌)。

[0041] 试验为单因素试验，完全随机设计，4个处理，重复4次，共16盆。4个处理分别为：1)、零强度的外源易提取球囊霉素溶液作为对照(记作0)；

[0042] 2)、1/4强度的易提取球囊霉素溶液(记作1/4)；

[0043] 3)、1/2强度的外源易提取球囊霉素溶液(记作1/2)；

[0044] 4)、完全强度的外源易提取球囊霉素溶液(记作1)。

[0045] 每盆(2L)种2株枳实生苗，移栽前2个月，每隔2天浇50mL/盆的蒸馏水，之后每隔2天对不同处理浇灌相对应强度的外源易提取球囊霉素溶液100ml，期间根据土壤的水分状况补充蒸馏水维持植物的良好生长；外源易提取球囊霉素溶液处理3个月后收获植株。

[0046] 3、结果

[0047] 由下表1可知，4种不同强度外源易提取球囊霉素溶液对枳实生苗的株高和茎粗的促进作用依次为：1/2强度外源易提取球囊霉素溶液>1/4强度外源易提取球囊霉素溶液>完全强度外源易提取球囊霉素溶液>柠檬酸钠缓冲液；对枳实生苗地下部分干重、地上部分干重和总干重的作用依次为：1/2强度外源易提取球囊霉素溶液>1/4强度外源易提取球囊霉素溶液>完全强度外源易提取球囊霉素溶液>柠檬酸钠缓冲液。

[0048] 表1外源易提取球囊霉素对枳实生苗生长特性的影响

[0049]

[0050]

[0051] 注：株高用皮尺测量，茎粗用游标卡尺测量，用千分之一天平称量干重。对于测得的数据采用邓肯新复极差法进行统计学分析，且表中数字为4次重复的平均值±标准差；同一行数字后不同小写字母表示经邓肯新复极差法在0.05水平差异显著，下同。

[0052] 由下表2可知，和对照相比，1/2强度外源易提取球囊霉素溶液显著提高了枳实生根际土壤热水提取碳水化合物的含量，提高了24％；4种不同强度外源易提取球囊霉素溶液中，1/2强度外源易提取球囊霉素溶液对枳实生苗根际水解碳水化合物的促进作用最大，提高了34％；对于枳实生苗根际土壤有机碳，1/2强度外源易提取球囊霉素溶液和完全强度外源易提取球囊霉素溶液的促进效果最显著，分别提高了5％和7％。

[0053] 表2外源易提取球囊霉素溶液对枳实生苗根际土壤碳化合物含量(mg/g)的影响[0054]

[0055] 注：热水提取碳水化合物采用的方法为：取风干土样0.75克于试管中，加蒸馏水5ml。沸水浴加热2h，冷却后过滤定容至50ml。吸取滤液1ml于试管中，加热蒽酮试剂5ml。沸水浴上15min显色，在波长306nm测量吸光值。

[0056] 水解碳水化合物的测定采用的方法：取风干土样0.5g于试管中，加入2.5mol/L的硫酸溶液10ml。沸水浴上加热20min，过滤后定容至50ml。吸取稀释液1ml，加冷蒽酮试剂5ml。沸水浴加热15min显色，在波长630nm测吸光值。

[0057] 土壤有机碳的测定采用的方法为：称取过0.25mm筛子的土样0.50g放入250mL三角瓶中，加10.0mL 1mol/L(1/6K2Cr2O7)摇匀，再加入加20mL浓H2SO4摇匀。反应30min后，加水至250mL，加邻啡罗啉3～4滴，用0.5mol/L FeSO4溶液滴定至终点(橙色→绿色→深绿→砖红色)。

[0058] 由下表3可知，和对照相比，所有的外源易提取球囊霉素溶液都显著提高了枳根际内源土壤球囊霉素含量，以完全强度外源易提取球囊霉素处理的效果最佳。

[0059] 表3外源易提取球囊霉素溶液对枳实生苗根际内源土壤球囊霉素含量(mg/g)的影响

[0060]

[0061] 注：称取0.5g风干土壤于10mL离心管中，加入4mL 20mmol/L柠檬酸钠缓冲液(pH7.0)在103kPa、121℃条件下灭菌30min。在10000g/s下离心5min，收集上清液转入另一个离心管中用于测定易提取球囊霉素。然后将残渣再加入4mL 50mmol/L柠檬酸钠缓冲液(pH8.0)在103kPa、121℃条件下灭菌60min。在10000g/s下离心5min，收集上清液用于测定难提取球囊霉素。然后分别吸取0.25mL上清液，再加入2.5mL考马斯亮蓝G-250试剂于595nm下测定吸光值。以0.1mg/mL的牛血清蛋白标准液绘制标准曲线分别计算易提取球囊霉素和难提取球囊霉素含量，总提取球囊霉素的含量是易提取球囊霉素和难提取球囊霉素含量的总和。

[0062] 从下表4可知，和对照相比，所有外源易提取球囊霉素溶液处理显著提高了枳根际2-4mm和1-2mm水稳性团聚体含量和团聚体稳定性，且1/2强度外源易提取球囊霉素溶液效果最好。

[0063] 表4外源易提取球囊霉素溶液对枳实生苗根际水稳性团聚体分布和稳定性的影响[0064]

[0065] 注：土壤团聚体的分布用湿筛法并用土壤团聚体分析仪(DM200–IV，中国上海制造)进行测定。

[0066] 表中数字为平均值±标准差；同一行数字后不同小写字母表示经邓肯新复极差法在0.05水平差异显著，下同。

[0067] 从下表5可知，和对照相比，所有外源易提取球囊霉素溶液处理均提高了枳根际过氧化物酶、多酚氧化酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性，通常情况下以1/2强度外源易提取球囊霉素的促进效果最显著。

[0068] 表5外源易提取取球囊霉素溶液对枳实生苗根际土壤相关酶活性的影响[0069]

[0070] 注：土壤多酚氧化酶和过氧化物酶活性的测定方法是：称取1g过1mm筛的风干土样于50mL容量瓶中，同时对每一土样做无基质(无邻苯三酚)对照，并且整个试验要做一个无土对照，加入10mL1％邻苯三酚溶液。振荡摇匀后，置于37℃恒温数显电热培养箱中培养3h。再往容量瓶中加入乙醚定容，摇动使其充分反应，在430nm下比色。

[0071] 土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二钠法测定：称取1g过0.25mm筛风干基质于25mL容量瓶中，同时设置一个不加土样的空白对照，加入0.2mL甲苯处理15min，再加入2.5mL磷酸苯二钠和2.5mL相应的缓冲液(酸性磷酸酶为pH＝5.0醋酸盐缓冲液；中性磷酸酶为pH＝7.0柠檬酸-磷酸缓冲液；碱性磷酸酶为pH＝10.0硼酸缓冲液)。仔细摇匀后放入恒温数显电热培养箱，37℃下培养12h。用38℃左右温热的蒸馏水将容量瓶中的内容物稀释至刻度，再用致密滤纸过滤。准确吸取0.25mL滤液于25mL容量瓶中，快速加入1.25mL pH＝9.0的硼酸缓冲液、0.75mL 2.5％的铁氰化钾以及0.75mL 2％的4-氨基安替吡啉。仔细混匀，溶液呈现粉红色后加水定容。放置30min待颜色稳定后，在570nm波长下测定各样品的吸光值。以0.01mg/mL的重蒸酚工作液绘制标准曲线分别计算酸性、中性及碱性磷酸酶的活性，三者相加之和即为总磷酸酶的活性。

[0072] 综合上述结果，可以看出，外源易提取球囊霉素溶液能显著促进盆栽枳实生苗的营养生长，提高植株的生物量，具有调节土壤碳库的潜在能力(提高枳根际的土壤有机碳的含量)，也可以通过提高枳根际的热水提取碳水化合物，来提高土壤的肥力和养分，可以促进水稳性大团聚体的形成，提高团聚体的稳定性，从而改善土壤的结构，以通过提高土壤中的过氧化物酶、多酚氧化酶和土壤磷酸酶(酸性和碱性)的活性来提高枳根际的土壤养分含量以及促进土壤中养分的循环。综合比较，1/2强度外源易提取球囊霉素溶液促进效果最佳。

[0073] 实施例二

[0074] 1、外源易提取球囊霉素的制备

[0075] 制备方法同实例1

[0076] 2、材料与方法

[0077] 试验于2014年在荆州市长江大学西校区橘园的枳砧国庆1号温州蜜柑树进行。试验为单因素试验设计。共2个处理，包括：

[0078] 1)零强度的外源易提取球囊霉素溶液作为对照(记作0)：500mL零强度外源易提取球囊霉素提取液，在柑橘树滴水线以内东西两侧进行浇灌处理；

[0079] 2)1/2强度的外源易提取球囊霉素溶液(记作1/2)：500mL 1/2强度EE-GRSP提取液，在柑橘树滴水线以内东西两侧进行浇灌处理。

[0080] 每个处理重复4次，每棵树为1小区，共8棵树，随机排列。试验共进行两次浇灌处，分别在2014年4月9日和5月9日。2014年8月29日收集试验土样(10～15cm土层)，风干，过4mm筛备用。

[0081] 3、结果

[0082] 由下表6可知，与柠檬酸钠缓冲液相比，1/2强度外源易提取球囊霉素溶液显著提高了田间栽培柑橘土壤中内源易提取球囊霉素、难提取球囊霉素、总提取球囊霉素的含量。

[0083] 表6外源易提取球囊霉素溶液对柑橘土壤中内源土壤球囊霉素含量的影响[0084]

[0085]

[0086] 注：方法同表3。

[0087] 由下表7可知，和柠檬酸钠缓冲液相比，1/2强度外源易提取球囊霉素显著提高了田间栽培柑橘土壤中各粒级的水稳性团聚体含量以及平均质量直径。

[0088] 表7外源易提取球囊霉素溶液对柑橘土壤中团聚体含量和稳定性的影响[0089]

[0090] 注：方法同表4。

[0091] 表下8可知，1/2强度外源易提取球囊霉素溶液处理显著提高田间栽培柑橘土壤酸性、中性、碱性和总磷酸酶活性。

[0092] 表8外源易提取球囊霉素溶液对柑橘土壤中磷酸酶活性(mg hydroxybenzene/g)的影响

[0093]

[0094] 注：方法同表5。

[0095] 综上所述，使用上述制备的土壤改良剂(1/2强度外源易提取球囊霉素溶液)能显著提高田间栽培柑橘土壤中内源球囊霉素各成分含量和土壤有机碳含量(如图1)，有效提高土壤团聚体稳定性，增强磷酸酶活性，从而增加土壤有效磷含量，提高土壤肥力。因此，试验证明了上述的土壤改良剂改善了田间栽培柑橘根际微域环境。

[0096] 文件中所述

[0097] 零强度外源易提取球囊霉素溶液表示：外源易提取球囊霉素溶液与柠檬酸钠缓冲液的配比为0:1；

[0098] 1/4强度外源易提取球囊霉素溶液表示：外源易提取球囊霉素溶液与柠檬酸钠缓冲液的配比为1:3；

[0099] 1/2强度外源易提取球囊霉素溶液表示：外源易提取球囊霉素溶液与柠檬酸钠缓冲液的配比为1:1；

[0100] 完全强度外源易提取球囊霉素溶液表示：外源易提取球囊霉素溶液与柠檬酸钠缓冲液的配比为1:0。

[0101] 以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。除上述实施例外，本发明还可以有其它实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求保护的范围之内。