枯草芽孢杆菌HMB19198在防治黄瓜白粉病上的应用

摘要

本发明公开了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株HMB19198在防治黄瓜白粉病上的应用；还公开了含有枯草芽孢杆菌HMB19198的微生物菌剂在防治黄瓜白粉病上的应用。本发明枯草芽孢杆菌HMB19198对黄瓜白粉病的药效高，平均防效在90.0％以上；其次，利用HMB19198防治黄瓜白粉病专化性强，且不易产生抗药性，持久性强；本发明方法中的微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染，属于环境友好型。

权利要求

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株HMB19198在防治黄瓜白粉病上的应用；其中所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株HMB19198于2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.5613。

2.含有枯草芽孢杆菌HMB19198的微生物菌剂在防治黄瓜白粉病上的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的微生物菌剂的活性成分为枯草芽孢杆菌HMB19198菌体。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述的微生物菌剂为液体制剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的微生物菌剂的液体制剂，按照如下方法制备：(1)将低温保存的HMB19198菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上，在30～32℃培养16～24小时，得活化的菌株；

(2)用无菌的接种环刮取一接种环步骤(1)活化的菌株并接种到100mLLB液体培养基中，在28～34℃、摇床转速为170～210rpm条件下培养20～24小时，得种子液；

(3)按照体积比为0.5～3.0％的比例将步骤(2)的种子液接入到pH值为5.8-6.2的蔗糖豆饼粉培养基中，在温度为28～34℃、摇床转速为170～210rpm条件下发酵培养36～54h，得发酵液；所述的蔗糖豆饼粉培养基的组成成分及其重量百分比为：蔗糖2.0～3.0％，豆饼粉

1.6～2.4％，NaCl 0.1～0.2％，CaCO3 0.1～0.3％，KH2PO4 0.01～0.03％和MgSO4·7H2O 

0.01～0.03％，其余为水；

(4)检测发酵液中菌体和芽孢数量，待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的90％时停止发酵培养；所得即为HMB19198菌株的液体制剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于其步骤(3)中所述的温度为30～32℃；所述的摇床转速为210rpm；所述的培养时间为48h。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的微生物菌剂中枯草芽孢杆菌HMB19198的活菌数大于1.0×109cfu/mL。

8.利用含有枯草芽孢杆菌HMB19198的微生物菌剂防治黄瓜白粉病的方法，其特征在于用水将权利要求5所得的微生物菌剂的液体制剂稀释至活菌体数为107cfu/mL，在黄瓜白粉病发病前在黄瓜叶面进行喷雾即可。

说明书

枯草芽孢杆菌HMB19198在防治黄瓜白粉病上的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物防治领域，具体涉及枯草芽孢杆菌HMB19198在防治黄瓜白粉病上的应用。

背景技术

[0002] 黄瓜白粉病，俗称“白毛病”，是由单丝壳白粉菌(Sphaerotheca fuliginea)引起的真菌性病害，该病原菌主要侵染黄瓜叶片，其次侵染叶柄和茎，严重影响黄瓜叶片的光合作用，造成减产并影响黄瓜品质。该病从幼苗期到成株期均可发病，具有流行性强、发病率高、潜育期短和再侵染频繁等特点。因白粉病导致的黄瓜产量损失一般年份在10％左右，而流行年份高达30％左右。

[0003] 对黄瓜白粉病的防治方法主要有：(1)培育抗病品种：培育抗病品种是最经济有效的方法，但是由于抗白粉病的资源较少，加之病原菌生理小种的不断进化，培育抗性品种相对比较困难。(2)农业措施防治：如减少种植密度、注意通风透光、避免过度施氮肥等，这种方法防治效果十分有限。(3)化学防治：是目前防治黄瓜白粉病的主要方法，主要通过喷施托布津、粉锈宁、瑞毒铜、多菌灵、氟硅唑、仙生或世高等化学杀菌剂来防治黄瓜白粉病。然而，长期大量使用化学农药，病原菌容易产生抗药性，致使防治效果降低；同时容易造成农产品和环境污染、引起新病害或次生病害大发生。(4)生物防治：生物防治具有专化性强、不易产生抗药性、对人畜无毒、环境友好等优点，因而日益受到人们的青睐。已知有多种微生物如地衣芽孢杆菌(CN102399712A)、枯草芽孢杆菌(CN1934241A、CN104403970A、CN1911043A)、哈茨木霉菌(CN102388922A、CN101575574A)、绿色木霉(CN101724572A)、木霉菌(CN1911043A)和淡紫灰链霉菌(CN101481669A)等对黄瓜白粉病具有很好的防治效果，但是由于生物的多样性，针对不同的病原菌，不同的微生物对其抗性不同，以及由于共同进化特性，病原菌不断产生新的生理小种，因此，应不断选择新的微生物应对黄瓜白粉病的生理小种的变化。

[0004] 枯草芽孢杆菌菌株HMB19198主要应用于黄瓜霜霉病(CN102586142A)和人参立枯病(CN105746579A)的防治。

[0005] 经检索，没有发现枯草芽孢杆菌HMB19198用于防治黄瓜白粉病的报道。

发明内容

[0006] 本发明目的在于提供枯草芽孢杆菌菌株HMB19198在防治黄瓜白粉病上的应用。

[0007] 本发明的另一目的在于提供一种含有枯草芽孢杆菌菌株HMB19198的微生物菌剂在防治黄瓜白粉病上的应用。

[0008] 本发明第三目的在于提供利用上述微生物菌剂防治黄瓜白粉病的方法。

[0009] 本发明通过以下技术方案实现：

[0010] 本发明提供了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株HMB19198在防治黄瓜白粉病上的应用。

[0011] 上述应用中所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株HMB19198于2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.5613。

[0012] 本发明还提供了含有枯草芽孢杆菌HMB19198的微生物菌剂在防治黄瓜白粉病上的应用。

[0013] 所述的微生物菌剂，其活性成分为枯草芽孢杆菌HMB19198菌体。

[0014] 所述的微生物菌剂为可以为液体制剂。

[0015] 所述的微生物菌剂的液体制剂，按照如下方法制备：

[0016] (1)菌种活化：将低温保存的HMB19198菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上，在30～32℃培养16～24小时，得活化的菌株；

[0017] (2)种子液制备：用无菌的接种环刮取一接种环步骤(1)活化的菌株并接种到100mL LB液体培养基中，在28～34℃、摇床转速为170～210rpm条件下培养20～24小时，得种子液；

[0018] (3)发酵培养：按照体积比为0.5～3.0％的比例将步骤(2)的种子液接入到蔗糖豆饼粉培养基(pH值为5.8-6.2)中，在温度为28～34℃、摇床转速为170～210rpm条件下发酵培养36～54h，得发酵液；所述的蔗糖豆饼粉培养基的组成成分及其重量百分比为：蔗糖2.0～3.0％，豆饼粉1.6～2.4％，NaCl 0.1～0.2％，CaCO3 0.1～0.3％，KH2PO4 0.01～0.03％和MgSO4·7H2O 0.01～0.03％，其余为水；

[0019] (4)检测发酵液中菌体和芽孢数量，待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的90％时停止发酵培养；所得即为HMB19198菌株的液体制剂。

[0020] 上述液体制剂，其步骤(2)或(3)中所述的温度优选为30～32℃；所述的摇床转速优选为210rpm；所述的培养时间优选为48h。

[0021] 所述的LB平板培养基、LB斜面培养基和LB液体培养基均按照常规方法制备。

[0022] 所述的蔗糖豆饼培养基的制备方法，按照重量百分比将蔗糖、豆饼粉、NaCl、CaCO3、KH2PO4和MgSO4·7H2O混合，再加水，搅拌均匀即可。

[0023] 上述微生物菌剂，其枯草芽孢杆菌HMB19198的活菌数大于1.0×109cfu/mL。

[0024] 利用上述微生物菌剂防治黄瓜白粉病的方法，包括用水将上述微生物菌剂的液体制剂稀释至活菌体数为107cfu/mL，在黄瓜白粉病发病前在黄瓜叶面进行喷雾即可。

[0025] 本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明为防治黄瓜白粉病提供了一个高效的微生物，开辟了一个有效防治途径；(2)本发明枯草芽孢杆菌HMB19198对黄瓜白粉病的药效高，平均防效在90.0％以上；(3)利用本发明方法防治黄瓜白粉病专化性强，且不易产生抗药性，持久性强；(4)本发明方法中的微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染；(5)本发明使用的微生物菌剂制备方法简单、使用方法简单、成本低，易于推广应用。

具体实施方式

[0026] 下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中所涉及的LB平板培养基、LB斜面培养基、LB液体培养基等均按照常规方法制备。

[0027] 实施例1 HMB19198微生物菌剂的制备

[0028] 按照如下步骤进行：

[0029] (1)菌种活化：将保存于-80℃的枯草芽孢杆菌(Baci11us subtilis)菌株HMB19198(保藏编号为CGMCC No.5613)在LB平板培养基上进行活化(30℃)，挑取单菌落在LB斜面培养基上在32℃下培养20小时，得活化的菌株；

[0030] (2)种子液的制备：在250mL三角瓶中装入LB液体培养基100mL，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入一接种环步骤(1)中活化好的菌株，在30℃、摇床转速190rpm的条件下振荡培养24h小时，得种子液；

[0031] (3)蔗糖豆饼培养基的制备：按照重量百分比将蔗糖3.0％，豆饼粉2％，NaCl 0.1％，CaCO3 0.3％，KH2PO4 0.02％和MgSO4·7H2O 0.03％加入水中，搅拌混合均匀，即得蔗糖豆饼培养基；分装于三角瓶中，每瓶装200mL；在121℃对蔗糖豆饼培养基进行灭菌30分钟，再降温到30℃备用；

[0032] (4)发酵培养：向步骤(3)所得每瓶蔗糖豆饼培养基200mL中接种步骤(2)所得种子液2mL；在30℃、摇床转速190rpm条件下进行发酵培养36h，以后每隔30分钟从三角瓶中取样进行镜检，对视野中的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢率(芽孢率(％)＝成熟芽孢数/(成熟芽孢数+菌体数)×100)；芽孢率达到90％时停止发酵培养；共发酵培养约48h，得枯草芽孢杆菌HMB19198的液体制剂。

[0033] 实施例2 HMB19198微生物菌剂对黄瓜白粉病防治效果对比试验

[0034] (一)试验材料：

[0035] (1)、黄瓜品种：津优1号。

[0036] (2)、黄瓜白粉病病原菌分生孢子悬浮液：初始菌株来自河北农业大学，接种用黄瓜白粉病病原菌分生孢子悬浮液由初始菌株在河北省农林科学院植物保护研究所植病生防实验室扩繁得来。

[0037] (二)试验处理：

[0038] (1)、实施例1制备的HMB19198液体制剂的100倍水稀释液；

[0039] (2)、空白对照：清水。

[0040] (三)试验方法：

[0041] 本试验在河北省农林科学院植物保护研究所植病生防实验室内进行。在直径6cm的营养钵中培育津优1号黄瓜苗，育苗基质为蛭石，每个营养钵播种两粒种子，出苗后留取一棵壮苗。待黄瓜苗子叶完全展平后开展试验。试验设2个处理，处理1为在黄瓜子叶上喷施实施例1制备的HMB19198液体制剂的100倍水稀释液，处理2为空白对照，喷施等量清水。每个处理重复4次，每个重复20株黄瓜苗。在25℃下保湿24h，然后喷雾接种黄瓜白粉病病原菌分生孢子悬浮液(1×105个/mL)，于25℃恒温培养(光照14小时，黑暗10小时)。待空白对照子叶充分发病后,调查黄瓜子叶白粉病病情并计算病情指数和防效。调查方法、分级标准和防治效果计算方法参照国家标准农药田间药效试验准则(一)杀菌剂防治黄瓜白粉病(GB/T17980.30-2000)。

[0042] 结果(见表1)经HMB19198液体制剂处理的病情指数为0.46，显著低于空白对照的病情指数(31.83)，HMB19198液体制剂对黄瓜白粉病的防效达98.56％。上述结果说明枯草芽孢杆菌菌株HMB19198及其HMB19198液体制剂对黄瓜白粉病具有突出的防治效果。

[0043] 表1 HMB19198微生物菌剂对黄瓜白粉病防治效果对比试验结果

[0044]处理 病情指数 防效(％)
HMB19198液体制剂 0.46b 98.56
空白对照 31.83a /

[0045] 实施例3 HMB19198微生物菌剂防治黄瓜白粉病效果对比试验

[0046] (一)试验材料：

[0047] (1)、黄瓜品种：津优1号。

[0048] (2)、黄瓜白粉病病原菌分生孢子悬浮液，初始菌株来自河北农业大学，接种用黄瓜白粉病病原菌分生孢子悬浮液由初始菌株在河北省农林科学院植物保护研究所植病生防实验室扩繁得来。

[0049] (二)试验处理：

[0050] (1)、实施例1制备的HMB19198液体制剂的100倍水稀释液；

[0051] (2)、空白对照：清水。

[0052] (三)试验方法：

[0053] 本试验在河北省农林科学院植物保护研究所植病生防实验室内进行。在直径6cm的营养钵中培育津优1号黄瓜苗，育苗基质为蛭石，每个营养钵播种两粒种子，出苗后留取一棵壮苗。待黄瓜苗生长出两片真叶时移栽到直径15cm的塑料花盆中(花盆中装填蛭石与田园土按照1:1比例配成的基质)，在25℃恒温培养(光照14小时，黑暗10小时)。将黄瓜苗用竹竿支撑固定，待长出5-7片真叶后开展试验。处理1喷施实施例1制备的HMB19198液体制剂的100倍水稀释液；处理2为空白对照，喷施等量清水。每个处理重复4次，每个重复5盆黄瓜苗。在25℃条件下保湿24h。24h后喷雾接种黄瓜白粉病病原菌分生孢子悬浮液(1×105个/mL)，继续于25℃恒温培养(光照14小时，黑暗10小时)。待空白对照真叶充分发病后,调查黄瓜真叶白粉病病情并计算病情指数和防效。调查方法、分级标准和防治效果计算方法参照GB/T17980.30-2000。

[0054] 结果(见表2)HMB19198液体制剂处理的黄瓜叶片没有发病，其病情指数为0.00，显著低于空白对照的病情指数(87.05)，HMB19198液体制剂对黄瓜叶片上的黄瓜白粉病的防治效果达100％。上述结果说明枯草芽孢杆菌菌株HMB19198及其HMB19198液体制剂对黄瓜白粉病具有突出的防治效果。

[0055] 表2 HMB19198微生物菌剂防治黄瓜白粉病效果对比试验结果

[0056]处理 病情指数 防效(％)
HMB19198液体制剂 0.00b 100.00
空白对照 87.05a /

[0057] 实施例4 HMB19198微生物菌剂对黄瓜白粉病防治效果对比试验

[0058] (一)试验材料：黄瓜品种津优1号。

[0059] (二)试验处理：

[0060] (1)实施例1制备的HMB19198液体制剂100倍水稀释液。

[0061] (2)10％苯醚甲环唑水分散粒剂(瑞士先正达作物保护有限公司)。

[0062] (3)空白对照：清水。

[0063] (三)试验方法：

[0064] 本试验于2015年春季在河北省保定市徐水县遂城镇城北庄村杨宝山黄瓜大棚内开展。翻地、施肥、播种、浇水同当地农事操作。试验设置3个处理，处理1为微生物菌剂，喷施实施例1制备的HMB19198液体制剂100倍水稀释液；处理2为化学药剂，喷施10％苯醚甲环唑水分散粒剂(瑞士先正达作物保护有限公司)800倍水稀释液；处理3为空白对照，喷施等量清水。每个处理重复4次。每个重复3行，每行约25棵黄瓜苗。在黄瓜白粉病发病之前开始试验，间隔7-10天处理一次，直到空白对照充分发病，调查黄瓜白粉病病情并计算病情指数和防效。调查方法、分级标准和防治效果计算方法参照GB/T17980.30-2000。

[0065] 结果(见表3)HMB19198液体制剂处理的病情指数为4.53，显著低于空白对照病情指数(76.25)和化学药剂的病情指数(8.36)，对黄瓜白粉病防效为94.06％，优于化学药剂对照的防效(89.04％)。上述结果说明枯草芽孢杆菌HMB19198及其微生物菌剂对黄瓜白粉病具有突出的防治效果。

[0066] 表3 HMB19198液体制剂对黄瓜白粉病防效对比试验结果

[0067]处理 病情指数 防效(％)
HMB19198液体制剂 4.53c 94.06
化学药剂 8.36b 89.04
空白对照 76.25a /