异噁唑环类衍生物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了喜树碱衍生物、其制备方法及在制备治疗肿瘤药物中的应用，该喜树碱衍生物具有以下的结构通式，式中，R1为H、C1～C4的烷基，或(CH3)2‑N‑CH2‑；R2为H或总碳原子数不超过8的药学上可接受的亲水基团。发明人通过在喜树碱的9，10，20位上进行结构修饰，在保持喜树碱新衍生物的稳定性前提下，提高其生物活性，增加其水溶性，并降低毒性，最终实现提高其体内抗肿瘤的高效性和作为药物的应用。

权利要求

1.喜树碱衍生物，所述喜树碱衍生物的化学结构通式如式(1)所示：式(1)中，R1为H、C1～C4的烷基，或(CH3)2-N-CH2-；R2为H。

2.喜树碱衍生物或其药用盐，所述喜树碱衍生物的化学结构通式如式(2)所示：式(2)中，R1为H、C1～C4的烷基，或(CH3)2-N-CH2-。

3.喜树碱衍生物的制备方法，包括如下步骤：

1)10-羟基-喜树碱与六亚甲基四胺反应获得9位醛基化10-羟基-喜树碱，然后醛基与盐酸羟胺反应生成9-醛肟-10-羟基-喜树碱，在偶氮二甲酸二异丙酯和三苯基膦的作用下，

9位醛肟与10位羟基反应合环成异噁唑，生成9,10位异噁唑喜树碱；

2)将9,10位异噁唑喜树碱的20位羟基用BOC-甘氨酸酯化，脱去BOC保护基后，甘氨酸的氨基末端再用琥珀酸酐酰化得到在20位连接亲水基团的9,10位异噁唑喜树碱衍生物，即异噁唑环化喜树碱衍生物反应步骤如下所示：

4.喜树碱衍生物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其中，喜树碱衍生物为权利要求1或2所述的喜树碱衍生物，或权利要求2所述的喜树碱衍生物药用盐。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：肿瘤选自小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、直肠癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、淋巴癌。

6.一种治疗肿瘤的组合物，该组合物中的活性成分包括权利要求1所述的喜树碱衍生物，或权利要求2所述的喜树碱衍生物及其药用盐。

说明书

异噁唑环类衍生物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于化学合成领域，涉及异噁唑环化喜树碱衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 癌症是目前人类健康的头号杀手。2010年卫生部公布的统计数据显示，恶性肿瘤已成为中国人的首要死因，每年死于肿瘤的患者超过100万。而据世界卫生组织(WHO)统计，全世界平均每年死于恶性肿瘤的者近700万，新发病例约870万例，而且每年还在不断增长，死亡率居第二位，仅次于心脑血管疾病。因此，癌症的治疗刻不容缓。

[0003] 喜树碱(Camptothecin，CPT)是1966年从珙桐科植物喜树中提取的一种细胞毒性生物碱，其结构式如下：

[0004]

[0005] 喜树碱属于色氨酸-萜烯类生物碱，经肿瘤实验证明这种色氨酸-萜烯类生物碱具有明显的抗肿瘤活性，尤其对消化道肿瘤、白血病、膀胱癌等活性更强，但它易引起骨髓抑制、呕吐和血尿等副作用，且其不溶于水又难溶于脂，不便于制成适宜的剂型，进一步限制了它的应用。直到1985年的研究证实，CPT是拓扑异构酶Ⅰ的特异性抑制剂，使其又成为抗肿瘤药物研究的热点。通过对CPT环7、9、10、11位的结构改造(见喜树碱结构式)，可得到拓扑替康和伊立替康、勒托替康、羟基喜树碱等抗肿瘤活性更高、毒性更低的喜树碱类衍生物。两种喜树碱类衍生物，拓扑替康和伊立替康已经在全世界范围内分别用于小细胞肺癌/卵巢癌及大肠直肠癌的治疗(表1)，虽然相比喜树碱这两种药品的溶解性更强，但他们的毒性及不良反应仍然很强，包括腹泻、血尿、呕吐、恶心等，这就限制了他们的疗效及用量，目前还未开发出一种口服制剂。不过虽然如此，这两种药物2005年全球销售额仍然很巨大：伊立替康，大肠直肠癌一线药品，销售额达9亿美金；拓扑替康，卵巢癌及小细胞肺癌二线药品，销售额达2亿美金。

[0006] 表1拓扑替康和伊立替康的介绍

[0007]

[0008] 世界卫生组织已经把喜树碱衍生物的研究作为抗癌药物的主攻方向之一，各国科学家都在争相合成新的喜树碱类衍生物(CPTs)并进行筛选。目前许多对喜树碱的结构改造主要在7、9、10位上，或在A环上进行变化，又或者把E环打开、扩环以及衍生化，以期获得效果更好的化合物，但是现有的结构改造还有待优化。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于提供一类异噁唑环化喜树碱衍生物。

[0010] 本发明的目的于提供异噁唑环化喜树碱衍生物的制备方法。

[0011] 本发明的目的还在于提供异噁唑环化类喜树碱衍生物及其盐、组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0012] 本发明采取的技术方案为：

[0013] 发明人通过在喜树碱的9，10，20位上进行结构修饰，在保持喜树碱新衍生物的稳定性前提下，提高其生物活性，增加其水溶性，并降低毒性，最终实现提高其体内抗肿瘤的高效性和作为药物的应用。

[0014] 喜树碱衍生物，所述喜树碱衍生物的化学结构通式如式(1)所示：

[0015]

[0016] 式(1)中，R1为H、C1～C4的烷基，或(CH3)2-N-CH2-；R2为H或总碳原子数不超过8[0017] 的药学上可接受的亲水基团。

[0018] 作为本发明的进一步改进，R2为多元醇基及其酯、亲水性氨基酸残基及其盐和酯，这些基团包括但不限于如下基团：

[0019]

[0020] 喜树碱衍生物或其药用盐和酯，所述喜树碱衍生物的化学结构通式如式(2)所示：

[0021]

[0022] 式(2)中，R1为H、C1～C4的烷基，或(CH3)2-N-CH2-。

[0023] 喜树碱衍生物的制备方法，包括如下步骤：

[0024] 1)10-羟基-喜树碱与六亚甲基四胺反应获得9位醛基化10-羟基-喜树碱，然后醛基与盐酸羟胺反应生成9-醛肟-10-羟基-喜树碱，在偶氮二甲酸二异丙酯和三苯基膦的作用下，9位醛肟与10位羟基反应合环成异噁唑，生成9,10位异噁唑喜树碱；

[0025] 2)将9,10位异噁唑喜树碱的20位羟基用BOC-甘氨酸酯化，脱去BOC保护基后，甘氨酸的氨基末端再用琥珀酸酐酰化得到在20位连接亲水基团的9,10位异噁唑喜树碱衍生物，即异噁唑环化喜树碱衍生物

[0026]

[0027] 反应步骤如下所示：

[0028]

[0029] 上述的喜树碱衍生物，或其药用盐和酯在制备治疗肿瘤药物中的应用。

[0030] 优选的，所述肿瘤选自(非)小细胞肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、直肠癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、淋巴癌。

[0031] 一种治疗肿瘤的组合物，该组合物中的活性成分包括上述喜树碱衍生物及其药用盐和酯。

[0032] 优选的，所述肿瘤选自(非)小细胞肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、直肠癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、淋巴癌。

[0033] 一种治疗肿瘤的方法，包括持续或间断给予患者含有上述喜树碱衍生物及其药用盐和酯的药用组合物。

[0034] 本发明的有益效果是：

[0035] 1)本发明的喜树碱衍生物在抑制肝癌(HepG-2)、乳腺癌(MDA-MB-231)有更优于上市药物拓扑替康的体外生物活性，同时其毒性更低。本发明的喜树碱衍生物在作为一类低毒、高效的候选新药应用具有广泛前景。

[0036] 2)本发明通过用亲水基团酯化拓扑替康20位的羟基，打破其分子内氢键，使得喜树碱/拓扑替康衍生物在血浆中开环可能性降低，有助于保持其闭环形式，使得本发明喜树碱衍生物对靶点－Topoisomerase I的结合能力得以保持，同时通过异噁唑环化9，10位，最终达到提高这类衍生物的生物活性和降低毒性。

附图说明

[0037] 图1是实施例1产物(Rngn-YH-006)的核磁共振氢谱图；

[0038] 图2是实施例1产物(Rngn-YH-006)的核磁共振碳谱图；

[0039] 图3是实施例1产物(Rngn-YH-010)的核磁共振氢谱图；

[0040] 图4是实施例1产物(Rngn-YH-010)的核磁共振碳谱图；

[0041] 图5是Rngn-YH-010、Rngn-YH-006和拓扑替康在体外对10种肿瘤细胞的抑制效果；

具体实施方式

[0042] 本发明所使用的术语定义如下：

[0043] C1～C4的烷基：指含有1～4个碳的饱和烃基，特别是甲基、乙基、正丙基、正丁基。

[0044] 本发明所请求保护化合物的药用盐包括但并不限于碱土金属、碱性金属盐，特别是其钙盐、镁盐、钠盐、钾盐、锂盐、锌盐、铁盐等等。

[0045] 低级酯：指总碳原子数不超过8的酯类，包括取代和非取代的饱和酯。

[0046] 本发明所请求保护化合物的药用酯为其低级酯，优选C1～C4的饱和酯，特别是甲酯、乙酯。

[0047] 药学上可接近的，指已有研究表明化合物本身或其体内代谢物对人体基本无毒害作用。

[0048] 喜树碱衍生物，所述喜树碱衍生物的化学结构通式如式(1)所示：

[0049]

[0050] 式(1)中，R1为H、C1～C4的烷基，或(CH3)2-N-CH2-；R2为H或总碳原子数不超过8的药学上可接受的亲水基团。

[0051] 作为本发明的进一步改进，R2为多元醇基及其酯、亲水性氨基酸残基及其盐和酯，这些基团包括但不限于如下基团：

[0052]。亲水性氨基酸残基优选为天然亲水性氨基酸残基。

[0053] 喜树碱衍生物或其药用盐和酯，所述喜树碱衍生物的化学结构通式如式(2)所示：

[0054]

[0055] 式(2)中，R1为H、C1～C4的烷基，或(CH3)2-N-CH2-。

[0056] 喜树碱衍生物的制备方法，包括如下步骤：

[0057] 3)10-羟基-喜树碱与六亚甲基四胺反应获得9位醛基化10-羟基-喜树碱，然后醛基与盐酸羟胺反应生成9-醛肟-10-羟基-喜树碱，在偶氮二甲酸二异丙酯和三苯基膦的作用下，9位醛肟与10位羟基反应合环成异噁唑，生成9,10位异噁唑喜树碱；

[0058] 4)将9,10位异噁唑喜树碱的20位羟基用BOC-甘氨酸酯化，脱去BOC保护基后，甘氨酸的氨基末端再用琥珀酸酐酰化得到在20位连接亲水基团的9,10位异噁唑喜树碱衍生物，即异噁唑环化喜树碱衍生物

[0059]

[0060] 反应步骤如下所示：

[0061]

[0062] 上述的喜树碱衍生物，或其药用盐和酯在制备治疗肿瘤药物中的应用。

[0063] 优选的，所述肿瘤选自(非)小细胞肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、直肠癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、淋巴癌。

[0064] 一种治疗肿瘤的组合物，该组合物中的活性成分包括上述喜树碱衍生物及其药用盐和酯。

[0065] 优选的，所述肿瘤选自(非)小细胞肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、直肠癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、淋巴癌。

[0066] 一种治疗肿瘤的方法，包括持续或间断给予患者含有上述喜树碱衍生物及其药用盐和酯的药用组合物。

[0067] 1.剂型：

[0068] 本发明提供了用于治疗或预防癌症的方法，包括制定病人的治疗有效量，化合物或组合物，化合物及其组成，药学上可接受的载体、赋形剂，或稀释剂。该发明的化合物及其组合成分可以治疗或预防癌症包括但不仅限于，如淋巴管肉瘤，结肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，腺癌，肾细胞癌，肝癌，子宫颈癌，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，恶性黑色素瘤，白血病，急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞性白血病(粒细胞，早幼粒细胞，粒细胞，单核细胞和白血病)；慢性白血病(慢性粒细胞白血病(粒)和慢性淋巴细胞白血病)，淋巴癌(霍奇金疾病和非霍奇金疾病)，多发性骨髓瘤等等。

[0069] 本发明的化合物和组合物可以连续地或间断地任何与其他分子相容的方式给药，口服或不经肠道的方式吸收，包括肌肉注射、腹腔、静脉、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、脊柱内、心室内、鞘内、脑池内、囊内、阴道，透皮，直肠，通过吸入或外敷，特别是耳朵，鼻子，眼睛，或皮肤等。也可能是与另一种生物活性剂一起作用。其作用可以是全身或局部。不同的药物输送系统包括了，封装于脂质体、微粒子、微胶囊、胶囊等。

[0070] 本发明也可以通过使用吸入器或喷雾器，和制成气雾剂，或通过灌注在氟碳化合物或合成的肺表面活性剂。本发明的化合物还可作为栓剂，以传统的粘合剂和载体如甘油三酯。

[0071] “药学上可接受”普遍公认的药典所列在动物身上，更尤其是在人类身上载体是指稀释剂，助剂，辅料。这种载体可以诸如水和油。动物，蔬菜或合成来源，如花生油，大豆油，矿物油，香油之类的。载体亦可以为生理盐水，阿拉伯胶，明胶，淀粉糊，滑石粉，角质，胶体二氧化硅等等。此外。辅助剂，稳定剂，增稠剂，润滑剂，着色剂均可以使用。当给病人用药时，发明的化合物成分和药学上可接受载体，赋形剂或稀释剂，最好是无菌的。静脉给药时，水是本发明的化合物是首选的载体。盐、葡萄糖和甘油的溶液也可作为液态载体，特别是注射的方案中。合适的制药载体还包括诸如辅料淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明胶，麦芽，大米，面粉，硅胶，硬脂酸钠，甘油单硬脂酸，滑石粉，氯化钠，脱脂牛奶，甘油，丙二醇，水，乙醇等。目前化合物和组成，如果有需要的话，也可以包含适量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。

[0072] 目前的化合物和组合物可以采取解决方案的形式包括，悬浮物。乳剂，片剂，丸剂，装有液体的颗粒，胶囊，粉末，长控释制剂，栓剂，乳剂。航空溶胶，喷雾剂，悬浮物，或任何其他形式适合使用。

[0073] 发明的化合物和组成物口服给药可能是在片剂，含片，水的形式或油性悬浮物，颗粒，粉末，乳液，胶囊剂，糖浆的。化合物和组成物口服给药方式也可以制定食品和食品混合。另外在药片或药丸形式的化合物成分可延迟解体和在胃肠道吸收，从而提供持续一个较长时期的效果。时间延迟材料包括如甘油单硬脂酸酯或甘油硬脂酸。口服成分可以包括标准医药级别的载体如甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等等。

[0074] 1.1联合治疗

[0075] 本发明的化合物可同时与一个或多个其他的治疗药物，用于哺乳动物，尤其人类。当结合使用其他治疗，如其他抗癌化合物，该化合物和治疗剂的加法可以充当或更好的协同作用。发明的化合物与其他治疗药物可以是同样的组成，或是分开的组合，之前或之后的用药方式。对于许多慢性疾病治疗，其体现就在于一个综合疗法与交互组合的用药方式，例如，以尽量减少特定的药物毒性。在某些情况，当发明的组成与另一种治疗剂或试剂使用可能产生的副作用，包括，但不仅限于毒性，可以降低治疗剂剂量以低于阈值达到降低所引起的不良副作用。

[0076] 可用于与本发明的化合物组合的抗癌药物包括但不仅限于：阿西维辛；阿克拉霉素盐酸阿考达唑盐酸；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；阿美蒽醌醋酸；安吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；门冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苄替哌；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；马利兰；卡铂；卡莫司汀；顺铂；克拉屈滨；阿糖胞苷；达卡巴嗪；紫杉醇；多西紫杉醇；盐酸阿霉素；屈洛昔芬柠檬酸；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟脲嘧啶；吉西他滨盐酸；吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；环磷酰胺；伊立替康；兰瑞肽醋酸曲唑；洛莫司汀；醋酸甲地孕酮；醋酸美伦；马法兰；甲氨蝶呤钠；噻氨酯哒唑；嘌呤盐酸；链黑菌素；替尼泊苷；硫酸长春碱；长春地辛硫酸；酒石酸长春瑞滨等等。

[0077] 下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，实施例仅用于示例性说明本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。

[0078] 实施例1

[0079] 喜树碱的异噁唑衍生物(喹啉并异噁唑化合物)，20号位没有亲水基团的化学结构式如下，化学名为：(S)-8-ethyl-8-hydroxy-8H-isoxazolo[4,5-f]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinoline-9,12(11H,14H)-dione

[0080]

[0081] 20号位带有亲水基团的异噁唑环化喜树碱衍生物化学名为：(S)-4-((2-((8-ethyl-9,12-dioxo-9,11,12,14-tetrahydro-8H-isoxazolo[4,5-f]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-8-yl)oxy)-2-oxoethyl)amino)-4-oxobutanoic acid，其化学结构式如下：

[0082]

[0083] 上述喜树碱衍生物的制备方法，包括如下步骤，其合成路线如下：

[0084]

[0085]

[0086] 具体的合成步骤如下：

[0087] 1)在TFA(三氟乙酸)(10ml)中的10-羟基喜树碱(化合物1，100毫克，0.27毫摩尔)和六亚甲基四胺(HMTA，80毫克，0.55毫摩尔)的溶液在氩气下加热回流20小时。然后将反应混合物浓缩，加入20ml蒸馏水并搅拌1小时。补加部分蒸馏水后，通过碳酸氢钠将pH调节至8-9。水相用EA(丙烯酸乙酯)洗涤后将pH调至1.5，并用EA萃取(20mL×5)。将合并的有机相分别以1N HCl，H2O和饱和NaCl水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物经色谱纯化(甲醇：DCM(二氯甲烷)＝1：50)得到化合物5。化合物5由核磁氢谱和碳谱确定结构吻合；

[0088] 2)向化合物5(50毫克，0.13毫摩尔)和盐酸羟胺(11毫克，0.15毫摩尔)在乙醇(10毫升)中的溶液中缓慢加入TEA(15微升，0.15毫摩尔)。然后在95度下搅拌反应混合物20小时。将反应物浓缩，残余物用EA及水萃取。将合并的有机层用水洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物经色谱纯化(甲醇：DCM＝1：50)获得化合物10。化合物10由核磁氢谱和碳谱确定结构吻合；

[0089] 3)向化合物10的(48毫克，0.12毫摩尔)的THF(四氢呋喃)(10mL)溶液中缓慢加入偶氮二甲酸二异丙酯(Diisopropyl azodicarboxylate，DIAD，25毫克，0.12毫摩尔)后再加入PPh3(三苯基膦)(32毫克，0.12毫摩尔)。在室温下搅拌反应混合物5小时。除去溶剂，残余物通过色谱纯化，用甲醇：DCM(1：50)洗脱得到化合物11(Rngn-YH-006)；

[0090] 4)化合物11的溶液(120毫克，026毫摩尔)，钪(OTF)3(三氟甲基磺酸钪)(78毫克，0.16毫摩尔)和DMAP(4-二甲氨基吡啶)(94毫克，0.78毫摩尔)在干燥的DCM的混合物室温搅拌30min后，加入BOC-甘氨酸(136毫克，0.78毫摩尔)。室温下搅拌反应混合物30分钟后加入DCC(二环己基碳二亚胺)(272毫克，1.3毫摩尔)，室温下搅拌过夜，然后通过硅藻土过滤并浓缩。将残余物经色谱纯化(甲醇：DCM＝1：100)，得到化合物12。化合物12由核磁氢谱和碳谱确定结构吻合；

[0091] 5)往化合物12(95毫克，0.15毫摩尔)在DCM中的溶液中加入TFA(1毫升)，室温下搅拌为30分钟后除去溶剂，将剩余物溶解在2mL DMF(二甲基甲酰胺)，加入琥珀酸酐(97毫克，0.97毫摩尔)和4-甲基吡啶(73毫克，0.81毫摩尔)。室温搅拌反应混合物过夜。除去溶剂，将残余物经色谱纯化(甲醇：DCM＝1：50)获得Rngn-YH-010，两步反应收率49％。

[0092] 化合物11(Rngn-YH-006)结构由核磁氢谱和碳谱数据确定，其核磁氢谱、碳谱图分别见图1和图2，由核磁氢谱和碳谱确定结构吻合，表征数据如下：

[0093] 1H NMR(500MHz,DMSO)δ9.89(s,1H),9.12(s,1H),8.33(d,J＝9.3Hz,1H),8.25(d,J＝9.3Hz,1H),7.33(s,1H),6.53(s,1H),5.41(s,2H),5.34(s,2H),1.87(qd,J＝14.1,7.3Hz,2H),0.88(t,J＝7.3Hz,3H).

[0094] 13C NMR(101MHz,DMSO)δ172.93,161.84,157.20,152.07,150.48,147.12,146.48,145.74,133.19,132.20,128.07,122.44,119.45,116.94,115.01,97.04,72.84,65.70,
50.87,30.77,8.24。

[0095] 化合物Rngn-YH-010结构由核磁氢谱和碳谱数据确定，其核磁氢谱、碳谱图分别见图3和图4，表征数据如下：

[0096] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.06(s,1H),9.90(s,1H),9.11(s,1H),8.44(t,J＝5.1Hz,1H),8.32(t,J＝10.3Hz,1H),8.25(d,J＝9.4Hz,1H),7.15(s,1H),5.48(d,J＝
8.6Hz,2H),5.34(s,2H),4.17(dd,J＝17.8,5.8Hz,1H),4.00(dd,J＝17.9,5.6Hz,1H),2.42(t,J＝4.5Hz,2H),2.40–2.35(m,2H),2.16(dd,J＝14.7,7.4Hz,2H),0.92(t,J＝7.4Hz,
3H).

[0097] 13C NMR(400MHz；DMSO-d6)δ7.96,29.36,30.12,30.88,50.81,66.77,76.63,95.60,115.00,116.94,119.35,122.50,128.07,132.17,133.08,145.58,146.23,146.44,
147.11,151.88,156.89,161.85,167.50,169.58,172.07,174.12。

[0098] 药效实验

[0099] 下面结合实验对本发明化合物的活性作进一步的说明，但并不局限如此。

[0100] 制备得到的喜树碱/拓扑替康衍生物的体外抗肿瘤活性实验

[0101] 实验原理：MTT分析法以活细胞代谢物还原剂MTT噻唑蓝为基础，利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目，从而测定化合物对肿瘤细胞的杀伤效果。

[0102] 实验步骤：

[0103] 1)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL，铺板使待测细胞密度为1000-10000个/孔(边缘孔用无菌PBS填充)；

[0104] 2)将96孔板放在5％CO2，37℃培养箱中孵育，至细胞单层铺满孔底，加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天晚上铺板，次日上午加药。一般5-7个梯度，每孔5μL，设3-5个平行孔；5％CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察；

[0105] 3)每孔加入20μL MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液；终止培养，小心吸去孔内培养液；每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，酶标仪在490nm处测量各孔的吸光值(OD值)。

[0106] 计算公式如下：

[0107] 抑制率＝(平均OD值–给药组平均OD值)/(对照组平均OD值)×100％。

[0108] 3种药物分别用于检测10种肿瘤细胞的抗癌细胞活性，分别为：

[0109] 1)Rngn-YH-010(化合物12)；2)Rngn-YH-006(化合物11)；3)拓扑替康。

[0110] 10种肿瘤细胞为：1)A549,Lung Cancer；2)MCF-7,Breast Cancer；3)PANC-1,Pancreatic Cancer；4)MDA-MB-231,Human Breast；5)HepG-2,Liver Cancer；6)KB,Oral Carcinoma；7)BEL-7402,Liver Cancer；8)MGC803,Gastric Cancer；9)SK-N-SH,Human Neuroblastoma；10)HuT-78,Human T cell lymphoma。

[0111] 实验结果如下表及图5所示。

[0112] 表2喜树碱衍生物的体外抗肿瘤活性IC50(ng/ml)

[0113]

[0114]

[0115] 图5显示了Rngn-YH-010、Rngn-YH-006和拓扑替康对10种不同肿瘤的体外抑制活性，纵坐标为IC50，由上表及图5均可知，体外MTT试验检测这些化合物对10种主要肿瘤细胞株的抗肿瘤活性。Rngn-YH-010对乳腺癌细胞(MDA-MB-231)和肝癌细胞(HepG-2)两种肿瘤都显示出强于拓扑替康的活性，而对其他细胞的抗肿瘤活性也等同于上市药拓扑替康。Rngn-YH-006对10种肿瘤细胞的抗肿瘤活性基本等同于上市药拓扑替康。

[0116] 以上数据和分析证实了新制备的Rngn-YH-010、Rngn-YH-006喜树碱衍生物相较于上市的拓扑替康，具有更好的抗肿瘤生物活性，尤其在抗肝癌(HepG-2)和乳腺癌(MDA-MB-231)将可作为非常有前景的候选新药。