一种丝胶导电水凝胶及其制备方法以及由其制备的支架

摘要

本发明涉及一种丝胶导电水凝胶，其由丝胶蛋白交联而成，所述丝胶导电水凝胶中包含0.0125‑0.0833g/mL的丝胶蛋白和0.01‑0.1mg/mL的碳纳米微管。本发明还公开了一种丝胶导电水凝胶的制备方法以及由所述丝胶导电水凝胶制成的支架及其应用。本发明的丝胶导电水凝胶以及由其制备的支架同时具备优良的导电特性、可注射性和记忆形变特性，以及促神经细胞分化的能力，因此尤其适用于神经、心脏、肌肉等与电生理活动密切相关的组织的创伤修复与治疗。本发明的丝胶导电水凝胶及其所制备的支架和缓释药物制剂能够通过注射或微创手术的方式移植到体内，最大程度减小了患者因移植手术而带来的创伤和痛苦，也降低了由此带来的感染风险，并且在植入体内后不产生严重的免疫反应。

权利要求

1.一种丝胶导电水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)使用不含家蚕丝素的蚕丝制备丝胶蛋白水溶液；

2)制备碳纳米微管溶液；

3)将所述碳纳米微管溶液添加至所述丝胶蛋白水溶液中，混匀，得到混合溶液；

4)向步骤3)得到的混合溶液中添加交联剂，混匀后静置，待其交联即得到所述丝胶导电水凝胶，所述丝胶导电水凝胶包含0.0125-0.0833g/mL的丝胶蛋白和0.01-0.1mg/mL的碳纳米微管。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述丝胶蛋白水溶液通过用LiBr水溶液从所述蚕丝溶出丝胶蛋白来得到，并且，所述丝胶蛋白水溶液的浓度为0.015-0.1g/mL。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述蚕丝为由家蚕丝素缺失型蚕所生产的蚕丝。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述碳纳米微管溶液中还包含0.01g/mL的京尼平，所述碳纳米微管溶液通过将碳纳米微管和京尼平溶解于PBS溶液中，使碳纳米微管的浓度为10mg/mL并且京尼平的浓度为0.01g/mL然后超声处理来得到。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂为0.01g/mL的京尼平溶液。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备丝胶蛋白水溶液：取家蚕丝素缺失型蚕所生产的蚕茧，剪碎，清洗；将清洗的蚕茧以每克55mL的比例浸泡于6mol/L的LiBr水溶液中，充分浸泡后置于35℃中水浴24小时，以溶解丝胶蛋白；得到液体于3500rpm下离心，去除不溶性物质，得到澄清溶液；向其中加入按所述澄清溶液体积计1/4份的1mol/L pH 9.0的Tris-HCl缓冲液，并装入截留分子量3500的透析袋中透析，得到所述丝胶蛋白水溶液；

2)制备碳纳米微管溶液：将碳纳米微管和京尼平粉末溶解于pH 7.4的PBS磷酸缓冲盐溶液中，使碳纳米微管终浓度为10mg/mL并且京尼平终浓度为0.01g/mL；然后超声5分钟充分混匀，每超声3秒间隔2秒，得到所述碳纳米微管溶液；

3)将所述碳纳米微管溶液添加至所述丝胶蛋白水溶液中至所述碳纳米微管的浓度为

0.1-1.0mg/mL，混匀，得到混合溶液；

4)向步骤3)得到的混合溶液中添加0.01g/mL的京尼平溶液，混匀后于37℃静置至少30分钟，待其交联即得到所述丝胶导电水凝胶。

7.权利要求1所述的丝胶导电水凝胶在医药材料中的应用。

8.一种支架，其特征在于，通过将权利要求1所述的丝胶导电水凝胶冷冻干燥得到。

9.权利要求8所述的支架在医药材料中的应用。

说明书

一种丝胶导电水凝胶及其制备方法以及由其制备的支架

技术领域

[0001] 本发明涉及生物材料领域，更特别地，涉及一种丝胶导电水凝胶及其制备方法以及由其制备的支架。

背景技术

[0002] 水凝胶(Hydrogel)是以水为分散介质的凝胶，具有网状交联结构的水溶性高分子中存在疏水基团和亲水基团，亲水基团与水分子结合，将水分子连接在网状内部，而疏水基团遇水膨胀的交联聚合物。

[0003] 丝胶蛋白(Silk Sericin)是包裹在丝素纤维表层的一种天然大分子粘性蛋白，约占蚕茧含量的20-30％，由分子量为24-400kDa的多肽组成，其分子由丝氨酸、天门冬氨酸和甘氨酸等18种氨基酸组成。近年来，由于丝胶蛋白良好的生物相容性、对细胞具有粘附和保护作用等生物学性能，成为生物医学材料领域新兴的材料。

[0004] 碳纳米微管(Carbon Nanotubes,CNTs)是由一层石墨层卷起来的直径为纳米级别的微管。碳纳米微管的直径在零点几个纳米到几十纳米之间，长径比大，约为100-1000。碳纳米微管特殊的结构，使其具有独特的性能，在力学、电子学、热学、能量储存等领域极具应用价值。在电学性能方面，碳纳米微管不同直径和螺旋度可以使其呈现金属导电性和半导体特性。利用碳纳米微管极好的导电性能、电致发光等特性，可使碳纳米微管在复合材料领域发挥新的作用。

[0005] 在人体的生理功能中，很多生理活动都与电生理活动密切相关。例如，在神经、肌肉等组织中，高度精准和快速产生与传播的电信号以非常快的速度在同一细胞膜表面和细胞之间传递。这些电生理活动与神经、肌肉等组织的功能活动密切相关。

[0006] 目前在组织工程和再生医学领域，已经研究和制造出了多种生物材料，但是这些材料往往都不具备可注射性和记忆形变能力，在神经组织、心肌组织等与电生理活动密切相关的领域的组织修复与再生则还要求材料具有导电性。然而，本领域现有的水凝胶材料尚没有哪种同时具备良好的导电性能、记忆形变能力以及生物活性。

发明内容

[0007] 为了解决以上技术问题，本发明提供了一种丝胶导电水凝胶，由丝胶蛋白交联而成，并且包含0.0125-0.0833g/mL的丝胶蛋白和0.01-0.1mg/mL的碳纳米微管。

[0008] 本发明还提供了所述丝胶导电水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

[0009] 1)使用不含家蚕丝素的蚕丝制备丝胶蛋白水溶液；

[0010] 2)制备碳纳米微管溶液；

[0011] 3)将所述碳纳米微管溶液添加至所述丝胶蛋白水溶液中，混匀，得到混合溶液；

[0012] 4)向步骤3)得到的混合溶液中添加交联剂，混匀后静置，待其交联即得到所述丝胶导电水凝胶。

[0013] 优选地，所述丝胶蛋白水溶液通过用LiBr水溶液从蚕丝溶出丝胶蛋白来得到，并且，所述丝胶蛋白水溶液的浓度为1.5-10％。

[0014] 优选地，所述蚕丝为由家蚕丝素缺失型蚕所生产的蚕丝。

[0015] 优选地，所述碳纳米微管溶液中还包含0.01g/mL的京尼平，所述碳纳米微管溶液通过将碳纳米微管和京尼平溶解于PBS溶液中使碳纳米微管的浓度为10mg/mL并且京尼平的浓度为0.01g/mL然后超声处理来得到。

[0016] 优选地，所述交联剂为0.01g/mL的京尼平溶液。

[0017] 优选地，所述方法包括以下步骤：

[0018] 1)制备丝胶蛋白水溶液：取家蚕丝素缺失型蚕所生产的蚕茧，剪碎，清洗；将清洗的蚕茧以每克55mL的比例浸泡于6mol/L的LiBr水溶液中，充分浸泡后置于35℃中水浴24小时，以溶解丝胶蛋白；得到液体于3500rpm下离心，去除不溶性物质，得到澄清的溶液；向其中加入按所述澄清溶液体积计1/4份的1mol/L pH 9.0的Tris-HCl缓冲液，并装入截留分子量3500的透析袋中然后置于pH 9.0的0.001mol/L Tris-HCl缓冲液中透析，得到所述丝胶蛋白水溶液；

[0019] 2)制备碳纳米微管溶液：将碳纳米微管和京尼平粉末溶解于pH 7.4的PBS磷酸缓冲盐溶液中，使碳纳米微管终浓度为10mg/mL并且京尼平终浓度为0.01g/mL；然后用超声5分钟充分混匀，每超声3秒间隔2秒，得到所述碳纳米微管溶液；

[0020] 3)将所述碳纳米微管溶液添加至所述丝胶蛋白水溶液中至所述碳纳米微管的浓度为0.1-1.0mg/mL，混匀，得到混合溶液；

[0021] 4)向步骤3)得到的混合溶液中添加0.01g/mL的京尼平溶液，混匀后于37℃静置至少30分钟，待其交联即得到所述丝胶导电水凝胶。

[0022] 所述丝胶导电水凝胶可用于制备医药材料，例如制备药物缓释制剂和细胞治疗载体,或制备用于损伤组织再生与修复的材料。

[0023] 本发明还提供了一种由上述丝胶导电水凝胶制备的支架。所述支架可用于制备医药材料，例如制备药物缓释制剂和细胞治疗载体,或制备用于损伤组织再生与修复的材料。

[0024] 本发明的丝胶导电水凝胶以及由其制备的支架，是一种全新的生物复合材料，有良好的生物相容性，具备导电特性、可注射性、记忆形变特性、荧光示踪特性和促进细胞分化等特性。基于这些优良特性其可用于以下用途：

[0025] 1.制备组织修复与再生的材料，并且由于其同时具备优良的导电特性、可注射性和记忆形变特性，因此尤其适用于神经、心脏、肌肉等与电生理活动密切相关的组织的创伤修复与治疗；

[0026] 2.制备药物递送载体，搭载药物或者其他治疗因子、小分子等到体内并可控地缓慢释放，进而发挥预期效果；

[0027] 3.作为细胞载体，搭载细胞，以注射方式或者微创、无创方式移植到体内，发挥作用；

[0028] 4.作为体内荧光示踪物质，应用于临床诊断和治疗中的体内示踪。

[0029] 本发明的丝胶导电水凝胶及其所制备的支架和缓释药物制剂能够通过注射或微创手术的方式移植到体内，最大程度减小了患者因移植手术而带来的创伤和痛苦，也降低了由此带来的感染风险，并且在植入体内后不产生严重的免疫反应。

附图说明

[0030] 图1为丝胶导电水凝胶的制备流程图；

[0031] 图2为支架在注射前后的光学显微镜下的微观结构对比图；

[0032] 图3为搭载细胞的支架注射后经Live&Dead染色的荧光显微照片；

[0033] 图4为搭载细胞的支架注射后其上的死活细胞的流式统计图；

[0034] 图5为支架的电阻测量图；

[0035] 图6为灭菌前后支架的电阻测量值对比图；

[0036] 图7为BMSC细胞接种于支架上后第7天和第14天GFAP、Tuj1、MAP2基因的表达情况；

[0037] 图8为接种于支架的BMSC细胞经钙黄绿素染色后的显微照片；

[0038] 图9为含不同浓度的碳纳米微管的支架和对照支架的扫描电镜照片；

[0039] 图10为根据图9的SEM电镜照片计算的含0.5mg/mL碳纳米微管的支架和对照支架的孔径统计图；

[0040] 图11为支架的弹性模量的统计图；

[0041] 图12为支架随时间的膨胀率图；

[0042] 图13为将骨髓间充质干细胞接种于支架上48小时后细胞的活力分析图；

[0043] 图14为将骨髓间充质干细胞接种于支架上48小时后死活细胞的流式统计图；

[0044] 图15为将支架注射到小鼠体内后进行的X光和荧光扫描成像图；

[0045] 图16为HRP缓释剂随时间释放HRP的统计图。

具体实施方式

[0046] 以下结合实例和附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

[0047] 实施例1-4丝胶导电水凝胶的制备

[0048] 本实施例的丝胶导电水凝胶的制备流程如图1所示。

[0049] 1.制备丝胶水溶液

[0050] 本实施例所使用的蚕丝来自家蚕丝素缺失突变品种的蚕茧(购于中国农业科学院蚕业研究所)。通过以下方法从该蚕茧制备丝胶水溶液：

[0051] 1)称取家蚕突变品种蚕茧1g并剪成1cm2的碎片，后置于洁净的烧杯中，用超纯水清洗3次，3500rpm离心5分钟去除水份；

[0052] 2)向步骤1)中得到的蚕茧碎片中加入55mL的浓度为6mol/L的LiBr水溶液，将该烧杯放入恒温水浴锅内35℃水浴24小时，溶解丝胶蛋白；

[0053] 3)将步骤2)得到溶液转入离心管内3500rpm离心5分钟，用滤器去除不溶性物质，得到澄清的溶液；

[0054] 4)向步骤3)得到的澄清溶液中加入1/4体积的Tris-HCl缓冲液(1mol/L，pH 9.0)；

[0055] 5)将步骤4)中的溶液转入到预处理好的透析袋(MWCO 3500)中，然后将透析袋两端用夹子夹紧，放置于含有pH 9.0的0.001mol/L Tris-HCl缓冲液的烧杯中；将该烧杯置于搅拌器上慢速搅拌透析，每隔3小时换一次水，共透析48小时，其中最后一次使用超纯水透析；

[0056] 6)将5)中透析后的丝胶蛋白水溶液转到离心管中，4000rpm离心5分钟，去除沉淀；

[0057] 7)将丝胶蛋白水溶液再装入到透析袋中并将透析袋两端用夹子夹紧，再将透析袋置于质量百分浓度为20％的PEG6000溶液中浓缩；将丝胶蛋白水溶液浓缩到浓度约为0.0274g/mL为止；

[0058] 8)置于4℃冰箱保存备用。

[0059] 2.制备碳纳米微管溶液

[0060] 1)将碳纳米微管和京尼平粉末溶解于pH 7.4的PBS磷酸缓冲盐溶液中，使碳纳米微管终浓度为10mg/mL并且京尼平终浓度为0.01g/mL；

[0061] 2)将步骤1)准备好的碳纳米微管溶液用30％的振幅超声5分钟充分混匀(美国qsonica 125超声细胞破碎仪)，每超声3秒间隔2秒。

[0062] 3.丝胶导电水凝胶的复合合成

[0063] 1)将所述碳纳米微管溶液按表1中的配比加入上述丝胶蛋白水溶液中，使所得的混合溶液中所述碳纳米管的浓度为0.1mg/mL(实施例1)、0.25mg/mL(实施例2)、0.5mg/mL(实施例3)或1mg/mL(实施例4)，充分混匀，以未添加所述碳纳米微管与京尼平的混合溶液的丝胶水溶液为对照；

[0064] 2)按表1中的配比向步骤1)得到的混合溶液中添加0.01g/mL的京尼平溶液；

[0065] 3)将步骤2)得到的混合溶液充分混匀，置于37℃温箱至少30分钟以上，等待其交联形成水凝胶。

[0066] 表1每毫升水凝胶所加的丝胶蛋白溶液、碳纳米微管溶液、京尼平溶液的量[0067]

[0068] 实施例5-8支架的制备和性能

[0069] 1.支架的制备

[0070] 将实施例1-4的丝胶导电水凝胶放入模具中，制成厚度1cm直径1cm的圆柱体形，成胶后置于-80℃，冷冻24h后取出；将样品置于冷冻真空干燥机中干燥(根据样品大小确定适宜的干燥时间)，分别得到实施例5-8的支架，即，实施例5-8的支架分别包含0.1mg/mL(实施例5)、0.25mg/mL(实施例6)、0.5mg/mL(实施例7)或1mg/mL(实施例8)碳纳米微管，用不加碳纳米微管溶液制备的水凝胶以上述方法制备对照支架。

[0071] 2.支架的记忆形变能力

[0072] 按照上述方法制备不同形状的水凝胶，并制成支架，将支架重悬于超纯水或PBS中，对所述支架进行挤压、折叠可使所述支架发生任意形变，或缩小成极小的体积，但是当重新水化后，支架均恢复原有形状和大小，显示本发明的支架具有非常好的记忆形变能力。

[0073] 3.支架的可注射性分析

[0074] 通过以下方法测试实施例5-8的支架的可注射性：

[0075] 1)将实施例5-8的支架和对照支架在75％乙醇中浸泡24小时灭菌，然后用超纯水洗两遍，重悬于2mL pH 7.4的PBS中；

[0076] 2)使用16gauge注射器将所述支架皮下注射于小鼠体内。

[0077] 在操作过程中观察支架的宏观和微观形态。结果显示，在注射过程中，支架保持宏观结构、形态的完整，并且支架在皮下恢复完整结构伸展。在普通光学显微镜下，无论是6mm×6mm的支架还是4mm×4mm的支架，均保持微观结构完整(图2)。

[0078] 将实施例5-8的支架注射至小鼠体内后，所述支架在小鼠体内均能恢复注射前的形状和大小，这使得所述支架能够通过注射到达靶部位。

[0079] 经Live&Dead染色显示，证实经过注射后，支架上搭载的细胞能够保持存活(图3)。图4通过Live&Dead染色流式分析显示，注射的过程对导电水凝胶搭载的细胞几乎没有损伤，能够保持92.3％以上的细胞存活，由此证实注射的过程对搭载的细胞几乎没有损伤。

[0080] 4.支架的导电性能

[0081] 通过以下方法来测定支架的导电性能

[0082] 1)将水化后的支架连接于发光二极管之间，连通电源；结果显示实施例5-8的支架都能使发光二极管发光，说明其导电性能良好。

[0083] 2)使用铜丝作为电极插入支架内，保持平行的正负极之间的距离为1cm，使用工作站来测量电阻；结果显示这些支架的导电性能良好，并且可通过改变碳纳米微管的浓度而改变其导电性能(图5)。

[0084] 3)将支架在75％乙醇中浸泡24小时灭菌，然后用超纯水洗两遍，再测试其灭菌前后的电阻，研究灭菌的过程对丝胶导电水凝胶的导电性能是否有影响；结果显示该灭菌操作不会对实施例5-8的支架的导电性产生影响(图6)。

[0085] 5.支架的促细胞分化能力

[0086] 通过以下方法来检测支架的神经细胞分化能力

[0087] 1)将实施例5-8的支架灭菌并水化后，按前述方法接种骨髓间充质干细胞(BMSC)；

[0088] 2)在第7天和第14天分别收取细胞样，通过q-RT-PCR实时定量检测与神经细胞分化有关的基因GFAP，Tuj1，MAP2和Nes。

[0089] 3、通过钙黄绿素染色显示接种在丝胶导电水凝胶上的BMSC的细胞形态。

[0090] 结果显示：接种在支架上的BMSC细胞在第7天和第14天，可以看到神经元分化相关的基因GFAP、Tuj1、MAP2均有显著上调(图7)；钙黄绿素染色显示活细胞的形态由未分化的椭圆形变为神经元类似的长梭形(图8)；由此提示接种在支架上的细胞有向神经元方向分化的趋势，说明导电丝胶水凝胶具有促分化的能力。

[0091] 6.支架的孔隙率

[0092] 通过扫描电镜观察实施例5-8的支架和对照支架的内部结果。图9为扫描电子显微镜下观察到的的支架内部结构图，从图中可见到这无论是实施例的加有碳纳米微管的支架还是对照的不含碳纳米微管的支架的内部都具有大量孔洞结构。

[0093] 通过以下公式计算孔隙率：

[0094]

[0095] Vw是支架的体积，M0是支架的初始重量，Mt是浸泡乙醇后的质量(无水乙醇密度ρ＝0.789g/cm3)。经统计计算实施例5(0.1mg/mL)和实施例8(1.0mg/mL)的支架的孔隙率分别为94.40±2.42％和95.13±3.61％，表明支架为多孔洞结构。根据图9的SEM电镜照片计算的实施例7的支架(含0.5mg/mL碳纳米微管)和对照支架(不含碳纳米微管)的孔径，结果如图10所示，无论是实施例7支架还是对照支架的内部的孔洞直径都主要落在60-110μm区间内。

[0096] 支架的孔洞结构是作为药物载体和细胞载体进行营养和气体交换的条件。

[0097] 7.支架的机械性能

[0098] 测定支架的弹性模量，得到的结果如表2和图11所示

[0099] 表2支架的弹性模量

[0100]

[0101] 通过弹性模量的测定结果可知，以上实施例的支架都具有良好的机械性能，并且可根据需要通过在制备时改变所使用的纳米微管的浓度来调节支架的机械性能。

[0102] 8.支架的37℃吸水膨胀率

[0103] 将实施例5-8的支架和对照支架称重，并分别浸泡于pH 7.4的PBS中，在不同时间点取出，按以下公式测定：

[0104]

[0105] 其中，Ws为膨胀状态下的重量，Wd为干重。

[0106] 结果如图12所示，实施例5-8的支架的吸水性能适中，浸泡前两天迅速膨胀后，支架基本操持稳定，一直持续到实验结束，这表明这些支架可用于植入体内而不对周围组织产生较大压迫损伤。

[0107] 9.通过细胞活力检测支架的生物相容性

[0108] 通过以下方法测定支架的生物相容性：

[0109] 1)使用DMEM高糖培养基于37℃、5％CO2和100％湿度下培养骨髓间充质干细胞(BMSC)24小时，收集培养的BMSC，使用培养基重新悬浮，吹散后，以每孔8000个细胞的数量接种于96孔板中；

[0110] 2)按前述制备水凝胶和支架的方法，直接以96孔板为模具制备水凝胶并制成支架，灭菌后用PBS冲洗3次，然后将重悬后的细胞铺于相应的孔中，设三孔平行样，孵育48小时；

[0111] 3)向每孔中添加10μL CCK-8，孵育1小时，然后将其吸出，置于新的孔中；

[0112] 4)利用酶标仪测量其在490nm处的吸光度。

[0113] 测定结果如图13所示，实施例5-8的支架和对照支架均具有良好的生物相容性。

[0114] 10.通过流式分析支架的生物相容性测试

[0115] 通过以下方法测定上述丝胶导电水凝胶的生物相容性：

[0116] 1)将骨髓间充质干细胞2000cells/mm2接种在实施例5-8的支架和对照支架上；

[0117] 2)48小时后进行Live&Dead染色和流式分析，死亡细胞和活细胞占总细胞数的比例。

[0118] 结果如图14所示，实施例5-7的支架上细胞的存活率超过94％，实施例8的支架上细胞存活率超过90％。

[0119] 11.支架的体内荧光示踪特性分析

[0120] 将实施例5-8的支架灭菌和水化后，注射到小鼠体内，在小鼠成像仪进行荧光和X光扫描成像。成像结果如图15所示，支架在动物体内有清晰和特异的荧光特性，这证明，实施例5-8的支架可用于体内荧光示踪。

[0121] 实施例9-12辣根过氧化物酶(HRP)缓释剂的制备

[0122] 在实施例1-4的制备过程中加入HRP溶液，使得最终制成的支架中HRP的含量为8μg；其余操作与实施例1-4中的水凝胶制备相同，由此得到四种包含HRP的丝胶导电水凝胶，以实施例5-8中的支架制备方法将这四种包含HRP的丝胶导电水凝胶冻干，形成实施例9-12的HRP缓释剂。

[0123] 将上述缓释剂置于1mL pH 7.4的PBS中，置于37℃；在第1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264，288、323小时小心取出清液，并重新加入1mL PBS(pH 
7.4)；采用酶联免疫法(ELISA)测量上清液中HRP的含量，通过计算各个时间点上清液中累计的HRP含量与实际载药量的比值即得到累计释放率，结果如图16所示，实施例9-12的HRP缓释剂对HRP具有良好的缓释作用，释放时程长，释放率高。

[0124] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。