高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其制备方法与应用

摘要

本发明提供一种高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其制备方法，通过基因工程技术构建出高产透明质酸的谷氨酸棒杆菌重组菌。本发明还提供所述高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产透明质酸中的应用。本发明利用食品安全级的微生物谷氨酸棒杆菌，其本身不会分泌内毒素，简化了后提取过程，通过基因工程技术构建高产透明质酸的谷氨酸棒杆菌重组菌，其能够产生不同分子量的透明质酸(3000Da～200万Da)，依据分子量不同透明质酸的产量可达7g/L‑20g/L，产品无需复杂的分离就即可满足食品、化妆品及医药品的要求。

权利要求

1.利用C.glutamicumΔzwf构建高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)C.glutamicumΔzwf的构建

通过基因工程手段敲除谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf，即构建得到C.glutamicumΔzwf；

所述C.glutamicumΔzwf的出发菌株为谷氨酸棒杆菌MB001；

2)高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建

通过在所述C.glutamicumΔzwf中过表达来自兽疫链球菌的序列如SEQ ID NO:7所示的透明质酸合成酶基因hasA，即构建得到高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述C.glutamicumΔzwf的具体构建方法，包括以下步骤：S11、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组DNA为模板，以zwf-up-F和zwf-up-R为引物进行PCR，获得葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf上游同源片段zwf-up并进行PCR产物纯化；

S12、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组DNA为模板，以zwf-down-F和zwf-down-R为引物进行PCR，获得zwf下游同源片段zwf-down并进行PCR产物纯化；

S13、将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB用EcoRI/XbaI进行双酶切，用Gibson Assembly试剂盒将zwf-up和zwf-down片段一步连接到酶切后的pK18mobsacB上，获得的重组质粒命名为pK18-zwf；

S14、将pK18-zwf转化到谷氨酸棒杆菌MB001中，筛选阳性克隆，即得；

其中，引物序列如下：

zwf-up-F：5’-acagctatgacatgattacgggcgattcctacgacgctca-3’zwf-up-R：5’-taaattatggcacgatggtagtgtcacgatcc-3’zwf-down-F：5’-taccatcgtgccataatttaggggcaaaaaatgatctttgaact-3’zwf-down-R：5’-tgcatgcctgcaggtcgactgtgcgcgtactacatcaaccatag-3’。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法包括：

1)基于兽疫链球菌的透明质酸合成酶的氨基酸序列，设计了密码子优化的透明质酸合成酶基因hasA，序列如SEQ ID NO:7所示，以人工合成的hasA基因为模板，以hasA-F和hasA-R为引物进行PCR扩增，并对扩增产物进行纯化，得到纯化的hasA片段；将携带有乳糖渗透酶基因LacY的载体pXYJ-12用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将上述纯化的hasA片段连接到载体pXYJ-12上，获得的重组质粒命名为pXYJ-hasA；

2)将pXYJ-hasA转化到所述C.glutamicumΔzwf中，筛选阳性克隆，即得；

其中，引物序列如下：

hasA-F：5’-acagctatgacatgattacgcgaaccacgcaatgcgtctc-3’hasA-R：5’-gcctgcaggtcgactcgtctcggttggcagtgac-3’。

4.根据权利要求1-3任一项所述方法构建得到的高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产透明质酸中的应用。

说明书

高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程及微生物发酵领域，具体地说，涉及高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 透明质酸是D-葡萄糖醛酸及N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,3及β-1,4糖苷键连接而成的高分子多糖类物质，又称玻尿酸。透明质酸广泛地存在于人体的各个部位，具有极其重要的生理作用，如协助水电解质的扩散转运，润滑关节，调节血管壁的通透性，促进伤口愈合等。另外，透明质酸具有极强的保湿作用，被称为理想的天然保湿因子。它是目前自然界中发现的化妆品用保湿性能最好的物质。透明质酸具有不同的分子量，其分布从几千到几百万道尔顿，因其分子量的不同，其性能及应用也有所不同。小分子量的透明质酸(分子量<10万)能渗入真皮，容易被人体吸收，因此主要用于保健食品，美容食品及药物载体领域；中分子量的透明质酸(10万<分子量<100万)能够紧致肌肤，因此在保湿、面膜、化妆品领域具有广泛应用；大分子量的透明质酸(分子量>100万)，可以作为皮肤填充剂，在美容、医药领域具有广泛的应用。目前全球透明质酸的销售额已超过100亿美元。

[0003] 透明质酸的生产方法主要包括动物组织提取法和微生物发酵法两种。前者由于来源有限、产率较低等因素，生产成本较高且容易产生免疫反应。因此，目前透明质酸的生产主要是通过发酵法进行。目前，工业上透明质酸的生产菌株主要包括兽疫链球菌、马链球菌和类马链球菌等条件致病性菌株。由于这类菌株会分泌内毒素，因此其分离过程要求极高，产品应用受到限制。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其制备方法。

[0005] 本发明的另一目的是提供所述高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产透明质酸中的应用。

[0006] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种重组谷氨酸棒杆菌Δzwf，通过基因工程手段使谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf失活，即构建得到重组谷氨酸棒杆菌Δzwf。优选出发菌株为谷氨酸棒杆菌MB001。

[0007] 例如，通过敲除谷氨酸棒状杆菌中的zwf基因，可以敲除整个基因或者部分基因，或者通过关键位点的突变实现葡萄糖6-磷酸脱氢酶功能的失活都可以达到相同的目的。

[0008] 本发明还提供一种重组谷氨酸棒杆菌Δzwf的构建方法，包括以下步骤：

[0009] S11、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组DNA为模板，以zwf-up-F和zwf-up-R为引物进行PCR，获得葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf上游约1000bp的同源片段zwf-up并进行PCR产物纯化；

[0010] S12、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组DNA为模板，以zwf-down-F和zwf-down-R为引物进行PCR，获得zwf下游约1000bp的同源片段zwf-down并进行PCR产物纯化；

[0011] S13、将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB(Journal of Biotechnology 104(2003)287-299)用EcoRI/XbaI进行双酶切，用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将zwf-up和zwf-down片段一步连接到酶切后的pK18mobsacB上，获得的重组质粒命名为pK18-zwf；

[0012] S14、将pK18-zwf转化到谷氨酸棒杆菌MB001中，筛选阳性克隆，即得；

[0013] 其中，葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf的序列如SEQ ID NO:1所示。所用引物序列如下：

[0014] zwf-up-F：5’-acagctatgacatgattacgggcgattcctacgacgctca-3’[0015] zwf-up-R：5’-taaattatggcacgatggtagtgtcacgatcc-3’

[0016] zwf-down-F：5’-taccatcgtgccataatttaggggcaaaaaatgatctttgaact-3’[0017] zwf-down-R：5’-tgcatgcctgcaggtcgactgtgcgcgtactacatcaaccatag-3’。

[0018] 优选采用电穿孔仪(伯乐)将pK18-zwf通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌MB001中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。在含25mg/L的卡那霉素LB平板上进行重组菌的第一次筛选。挑取阳性重组子进一步在液体LB培养基里过夜培养，然后在含有100g/L的蔗糖LB平板上进行二次筛选。利用zwf-up-F和zwf-down-R为引物进行菌落PCR，敲除zwf基因的重组子能够扩增出2Kb大小的片段，该重组菌命名为C.glutamicumΔzwf。

[0019] 为了验证葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf的敲除对透明质酸产量的影响，进行如下实验：

[0020] 基于兽疫链球菌的透明质酸合成酶的氨基酸序列，设计了密码子优化的透明质酸合成酶基因hasA(SEQ ID NO:7)，委托无锡青兰生物科技有限公司进行基因合成；以人工合成的hasA基因片段为模板，以hasA-F(5’-acagctatgacatgattacgcgaaccacgcaatgcgtctc-3’)和hasA-R(5’-gcctgcaggtcgactcgtctcggttggcagtgac-3’)为引物进行PCR，获得约
1400bp的hasA片段，并进行PCR产物纯化。将带有lacY基因(SEQ ID NO:8)的质粒pXYJ-12(购自Addgene)用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将hasA片段连接到pXYJ-12上，获得的重组质粒命名为pXYJ-hasA。将质粒pXYJ-hasA通过电转法(条件同上)分别转化野生型的谷氨酸棒杆菌MB001和重组菌C.glutamicumΔzwf，获得的重组菌分别命名为Cg/pXYJ-hasA和CgΔzwf/pXYJ-hasA。

[0021] 将Cg/pXYJ-hasA和CgΔzwf/pXYJ-hasA在摇瓶中发酵，检测其透明质酸的产量。发酵培养基为：葡萄糖40g/L、(NH4)2SO4 30g/L、玉米浆20g/L、KH2PO4 1g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgSO4 5g/L、FeSO4·7H2O0.01g/L、MnSO4·H2O 0.01g/L、谷氨酰胺1.5g/L、精氨酸0.5g/L。发酵过程温度控制在32℃，转速为200转/分钟。在发酵3h时，加入10.0mM乳糖诱导蛋白的表达和透明质酸的产生，发酵72h后检测发酵液中透明质酸的含量。

[0022] 透明质酸的检测方法为：取1mL的发酵液，向其中加入等量0.1％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)，在室温下静置30min，12000rpm条件下将发酵液离心10min，收集上清液，加入2倍体积的无水乙醇，于4℃条件下静置1h，充分沉淀。4℃，12000rpm条件下离心10min，弃去上清液，风干至乙醇完全挥发，用与原发酵液等体积的去离子水重悬沉淀。取300μL经过一次重悬稀释后的透明质酸溶液，向其中加入700μL的乙酸缓冲溶液(浓度为0.2mol/L的乙酸钠和0.15mol/L的NaCl，用乙酸调pH至6.0左右)，然后向其中加入2ml CTAB溶液(2.5g/L的CTAB，用0.5mol/L的NaOH溶液溶解)，反应进行5min后测定OD400值。

[0023] 发酵结果显示，Cg/pXYJ-hasA和CgΔzwf/pXYJ-hasA的透明质酸的产量分别为0.3g/L和2.2g/L，因此敲除葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf对于提高透明质酸的产量具有重要的作用。

[0024] 本发明进一步提供所述重组谷氨酸棒杆菌Δzwf在构建高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌中的应用。

[0025] 本发明提供一种高产中等分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌是通过在重组谷氨酸棒杆菌Δzwf中过表达内源的UDP-葡萄糖脱氢酶基因udgA(SEQ ID NO:2)构建得到的。

[0026] 本发明还提供所述高产中等分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括以下步骤：

[0027] S21、构建重组质粒pXYJ-hasA，方法如上所述；

[0028] S22、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组为模板，以udgA-F和udgA-R为引物进行PCR，获得约1200bp的UDP-葡萄糖脱氢酶基因udgA片段，并进行PCR产物纯化；

[0029] S23、将质粒pXYJ-hasA用SalI进行单酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将udgA片段连接到质粒pXYJ-hasA上，获得的重组质粒命名为pXYJ-hasA-udgA；

[0030] S24、将pXYJ-hasA-udgA转化(电转法条件同上)到所述重组谷氨酸棒杆菌Δzwf中，筛选阳性克隆，将获得的重组菌命名为CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA。

[0031] 其中，所用引物序列如下：

[0032] hasA-F：5’-acagctatgacatgattacgcgaaccacgcaatgcgtctc-3’

[0033] hasA-R：5’-gcctgcaggtcgactcgtctcggttggcagtgac-3’

[0034] udgA-F：5’-caaccgagacaaaggaggacacatatgaaaattgccgtcgcagg-3’[0035] udgA-R：5’-ccgccaaaacagccaagctgttagtcacgctggaaaatatcacgtgtataaact-3’。

[0036] 本发明还提供一种高产高分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌是通过在重组谷氨酸棒杆菌Δzwf中同时过表达内源的双功能UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因glmU(SEQ ID NO:3)、磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM(SEQ ID NO:4)以及氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因glmS(SEQ ID NO:5)构建得到的。

[0037] 本发明还提供所述高产高分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括以下步骤：

[0038] S31、构建重组质粒pXYJ-hasA，方法如上所述；

[0039] S32、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组为模板，以glmU-F和glmU-R为引物进行PCR，获得约1500bp的双功能UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因glmU片段并进行PCR产物纯化；

[0040] S33、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组为模板，以glmM-F和glmM-R为引物进行PCR，获得约1400bp的磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM片段并进行PCR产物纯化；

[0041] S34、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组为模板，以glmS-F和glmS-R为引物进行PCR，获得约1900bp的氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因glmS片段并进行PCR产物纯化；

[0042] S35、将质粒pXYJ-hasA用KpnI进行单酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将glmU、glmM、glmS片段连接到pXYJ-hasA上，获得的重组质粒命名为pXYJ-hasA-glmUMS；

[0043] S36、将pXYJ-hasA-glmUMS转化(电转法条件同上)到所述重组谷氨酸棒杆菌Δzwf中，筛选阳性克隆，获得的重组菌命名为CgΔzwf/pXYJ-hasA-glmUMS。

[0044] 其中，所用引物序列如下：

[0045] glmU-F：5’-ttggcaggatccccgggtacaaggatttgagataatcttgagcg-3’[0046] glmU-R：5’-ggccaagatcttagccttcctggttgtggacg-3’

[0047] glmM-F：5’-ggaaggctaagatcttggccaggccgtgca-3’

[0048] glmM-R：5’-tttctcgatcattagacttctgcaaccactgcag-3’

[0049] glmS-F：5’-cagaagtctaatgatcgagaaaaagttgttgtaaagtcatgc-3’[0050] glmS-R：5’-gctgaattcgagctcggtacttattcgacggtgacagactttgcc-3’。

[0051] 本发明还提供一种高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌是通过在重组谷氨酸棒杆菌CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA中过表达外源的透明质酸酶合成酶基因Hyal(SEQ ID NO:6)构建得到的。

[0052] 本发明还提供所述高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括以下步骤：

[0053] S41、基于水蛭的透明质酸酶的氨基酸序列，设计了密码子优化的透明质酸酶合成酶基因Hyal(SEQ ID NO:6)，委托无锡青兰生物科技有限公司进行基因合成；以人工合成的Hyal基因为模板，以hyal-F和hyal-R为引物进行PCR，获得约1500bp的Hyal片段，并进行PCR产物纯化；

[0054] S42、将带有信号肽的质粒pEC-S(购自Addgene)用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将Hyal片段连接到pEC-S上，获得的重组质粒命名为pEC-hyal；

[0055] S43、将pEC-hyal转化(电转法条件同上)到重组谷氨酸棒杆菌CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA中，筛选阳性克隆，获得的重组菌命名为CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA/pEC-hyal。

[0056] 其中，所用引物序列如下：

[0057] hyal-F：5’-ctacttccactgcacaaagcatgaaggagattgcggtcacg-3’

[0058] hyal-R：5’-gcctgcaggtcgactctagattactttttgcaggcctctacattgg-3’。

[0059] 本发明还提供所述高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产透明质酸中的应用。

[0060] 将所述重组谷氨酸棒杆菌在2L的发酵罐中进行发酵，装液量为1L，接种量为1-10v/v％，发酵培养基为：葡萄糖30-100g/L、(NH4)2SO4 10-50g/L、玉米浆10-30g/L、KH2PO4 
0.5-2g/L、K2HPO4 0.5-2g/L、MgSO4 1-5g/L、FeSO4·7H2O 0.01-1g/L、MnSO4·H2O 0.01-1g/L、谷氨酰胺0.5-2g/L、精氨酸0.1-2g/L；发酵过程温度控制在28-32℃，pH控制在6.8-7.3，转速为600-1200转/分钟；发酵3-5h时，通过加入0.5-10.0mM乳糖诱导蛋白的表达和透明质酸的产生，发酵周期为36-72h，发酵结束后，得到含有透明质酸的发酵液。

[0061] 优选地，发酵培养基为：葡萄糖50g/L、(NH4)2SO4 30g/L、玉米浆20g/L、KH2PO4 1g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgSO4 5g/L、FeSO4·7H2O0.01g/L、MnSO4·H2O 0.01g/L、谷氨酰胺1.5g/L、精氨酸0.5g/L。发酵过程温度控制在32℃，转速为1000转/分钟，利用NaOH溶液控制pH在7.0。在发酵3h时，加入10.0mM乳糖诱导蛋白的表达和透明质酸的产生，发酵48h，发酵结束后，得到含有透明质酸的发酵液。

[0062] 本发明具有以下优点：

[0063] (一)本发明利用食品安全级的微生物谷氨酸棒杆菌，其本身不会分泌内毒素，简化了后提取过程，通过基因工程技术构建高产透明质酸的谷氨酸棒杆菌重组菌株，产品无需复杂的分离就即可满足食品、化妆品及医药品的要求。

[0064] (二)本发明构建的高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌，其能够产生不同分子量的透明质酸(3000Da～200万Da)，依据分子量不同透明质酸的产量可达7g/L-20g/L，超过现有相关技术的产量，降低了透明质酸的生产成本。

[0065] (三)本发明构建的高产中等分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA，其发酵可产生分子量约为30万Da的透明质酸，产量可达9-10g/L；高产高分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌CgΔzwf/pXYJ-hasA-glmUMS，其发酵可产生分子量约为200万Da的透明质酸，产量可达6-7g/L；高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA/pEC-hyal，其发酵可产生分子量约为3000Da的透明质酸，产量可达15-20g/L。

具体实施方式

[0066] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

[0067] 实施例1 谷氨酸棒杆菌葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf的敲除

[0068] 1、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组DNA为模板，以zwf-up-F和zwf-up-R为引物进行PCR，获得葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf上游约1000bp的同源片段zwf-up并进行PCR产物纯化；

[0069] 2、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组DNA为模板，以zwf-down-F和zwf-down-R为引物进行PCR，获得zwf下游约1000bp的同源片段zwf-down并进行PCR产物纯化；

[0070] 3、将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB(Journal of Biotechnology 104(2003)287-299)用EcoRI/XbaI进行双酶切，用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将zwf-up和zwf-down片段一步连接到酶切后的pK18mobsacB上，获得的重组质粒命名为pK18-zwf；

[0071] 4、采用电穿孔仪(伯乐)将pK18-zwf通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌MB001中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。在含25mg/L的卡那霉素LB平板上进行重组菌的第一次筛选。挑取阳性重组子进一步在液体LB培养基里过夜培养，然后在含有100g/L的蔗糖LB平板上进行二次筛选。利用zwf-up-F和zwf-down-R为引物进行菌落PCR，敲除zwf基因的重组子能够扩增出2Kb大小的片段，该重组菌命名为C.glutamicumΔzwf。

[0072] 其中，所用引物序列如下：

[0073] zwf-up-F：5’-acagctatgacatgattacgggcgattcctacgacgctca-3’[0074] zwf-up-R：5’-taaattatggcacgatggtagtgtcacgatcc-3’

[0075] zwf-down-F：5’-taccatcgtgccataatttaggggcaaaaaatgatctttgaact-3’[0076] zwf-down-R：5’-tgcatgcctgcaggtcgactgtgcgcgtactacatcaaccatag-3’。

[0077] 实施例2 验证葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf的敲除对透明质酸产量的影响[0078] 基于兽疫链球菌的透明质酸合成酶的氨基酸序列，设计了密码子优化的透明质酸合成酶基因hasA(SEQ ID NO:7)，委托无锡青兰生物科技有限公司进行基因合成；以人工合成的hasA基因片段为模板，以hasA-F(5’-acagctatgacatgattacgcgaaccacgcaatgcgtctc-3’)和hasA-R(5’-gcctgcaggtcgactcgtctcggttggcagtgac-3’)为引物进行PCR，获得约
1400bp的hasA片段，并进行PCR产物纯化。将带有lacY基因(SEQ ID NO:8)的质粒pXYJ-12(购自Addgene)用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将hasA片段连接到pXYJ-12上，获得的重组质粒命名为pXYJ-hasA。将质粒pXYJ-hasA通过电转法(条件同实施例1所述)分别转化野生型的谷氨酸棒杆菌MB001和重组菌C.glutamicumΔzwf，获得的重组菌分别命名为Cg/pXYJ-hasA和CgΔzwf/pXYJ-hasA。

[0079] 将Cg/pXYJ-hasA和CgΔzwf/pXYJ-hasA在摇瓶中发酵，检测其透明质酸的产量。发酵培养基为：葡萄糖40g/L、(NH4)2SO4 30g/L、玉米浆20g/L、KH2PO4 1g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgSO4 5g/L、FeSO4·7H2O0.01g/L、MnSO4·H2O 0.01g/L、谷氨酰胺1.5g/L、精氨酸0.5g/L。发酵过程温度控制在32℃，转速为200转/分钟。在发酵3h时，加入10.0mM乳糖诱导蛋白的表达和透明质酸的产生，发酵72h后检测发酵液中透明质酸的含量。

[0080] 透明质酸的检测方法为：取1mL的发酵液，向其中加入等量0.1％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)，在室温下静置30min，12000rpm条件下将发酵液离心10min，收集上清液，加入2倍体积的无水乙醇，于4℃条件下静置1h，充分沉淀。4℃，12000rpm条件下离心10min，弃去上清液，风干至乙醇完全挥发，用与原发酵液等体积的去离子水重悬沉淀。取300μL经过一次重悬稀释后的透明质酸溶液，向其中加入700μL的乙酸缓冲溶液(浓度为0.2mol/L的乙酸钠和0.15mol/L的NaCl，用乙酸调pH至6.0左右)，然后向其中加入2ml CTAB溶液(2.5g/L的CTAB，用0.5mol/L的NaOH溶液溶解)，反应进行5min后测定OD400值。

[0081] 发酵结果显示，Cg/pXYJ-hasA和CgΔzwf/pXYJ-hasA的透明质酸的产量分别为0.3g/L和2.2g/L，因此敲除葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf对于提高透明质酸的产量具有重要的作用。

[0082] 实施例3 构建高产中等分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌

[0083] 1、构建重组质粒pXYJ-hasA，方法同实施例2所述；

[0084] 2、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组为模板，以udgA-F和udgA-R为引物进行PCR，获得约1200bp的UDP-葡萄糖脱氢酶基因udgA片段，并进行PCR产物纯化；

[0085] 3、将质粒pXYJ-hasA用SalI进行单酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将udgA片段连接到质粒pXYJ-hasA上，获得的重组质粒命名为pXYJ-hasA-udgA；

[0086] 4、将pXYJ-hasA-udgA通过电转法(电转法条件同实施例1所述)转化到实施例1的重组谷氨酸棒杆菌Δzwf中，筛选阳性克隆，将获得的重组菌命名为CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA。

[0087] 其中，所用引物序列如下：

[0088] hasA-F：5’-acagctatgacatgattacgcgaaccacgcaatgcgtctc-3’

[0089] hasA-R：5’-gcctgcaggtcgactcgtctcggttggcagtgac-3’

[0090] udgA-F：5’-caaccgagacaaaggaggacacatatgaaaattgccgtcgcagg-3’[0091] udgA-R：5’-ccgccaaaacagccaagctgttagtcacgctggaaaatatcacgtgtataaact-3’。

[0092] 将CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA在2L发酵罐中进行发酵，装液量为1L，接种量为10v/v％，检测其透明质酸的产量。发酵培养基为：葡萄糖50g/L、(NH4)2SO4 30g/L、玉米浆20g/L、KH2PO4 1g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4 5g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L、MnSO4·H2O 0.01g/L、谷氨酰胺1.5g/L、精氨酸0.5g/L。发酵过程温度控制在32℃，转速为1000转/分钟，利用NaOH溶液控制pH在7.0。在发酵3h时，加入10.0mM乳糖诱导蛋白的表达和透明质酸的产生，发酵48h后检测透明质酸的产量。透明质酸的产量达到了9.6g/L。利用凝胶过滤色谱法(PL aquagel-OH色谱柱，柱温25℃，流动相为0.2mol/L的NaCl，流速为1ml/min，检测器为示差折光检测器)检测透明质酸的分子量，其平均分子达到30万道尔顿。

[0093] 实施例4 构建高产高分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌

[0094] 1、构建重组质粒pXYJ-hasA，方法同实施例2所述；

[0095] 2、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组为模板，以glmU-F和glmU-R为引物进行PCR，获得约1500bp的双功能UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因glmU片段并进行PCR产物纯化；

[0096] 3、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组为模板，以glmM-F和glmM-R为引物进行PCR，获得约1400bp的磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM片段并进行PCR产物纯化；

[0097] 4、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组为模板，以glmS-F和glmS-R为引物进行PCR，获得约1900bp的氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因glmS片段并进行PCR产物纯化；

[0098] 5、将质粒pXYJ-hasA用KpnI进行单酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将glmU、glmM、glmS片段连接到pXYJ-hasA上，获得的重组质粒命名为pXYJ-hasA-glmUMS；

[0099] 6、将pXYJ-hasA-glmUMS通过电转法(电转法条件同实施例1所述)转化到实施例1的重组谷氨酸棒杆菌Δzwf中，筛选阳性克隆，获得的重组菌命名为CgΔzwf/pXYJ-hasA-glmUMS。

[0100] 其中，所用引物序列如下：

[0101] glmU-F：5’-ttggcaggatccccgggtacaaggatttgagataatcttgagcg-3’[0102] glmU-R：5’-ggccaagatcttagccttcctggttgtggacg-3’

[0103] glmM-F：5’-ggaaggctaagatcttggccaggccgtgca-3’

[0104] glmM-R：5’-tttctcgatcattagacttctgcaaccactgcag-3’

[0105] glmS-F：5’-cagaagtctaatgatcgagaaaaagttgttgtaaagtcatgc-3’[0106] glmS-R：5’-gctgaattcgagctcggtacttattcgacggtgacagactttgcc-3’。

[0107] 将CgΔzwf/pXYJ-hasA-glmUMS在2L发酵罐中进行发酵，装液量为1L，接种量为10v/v％，检测其透明质酸的产量。发酵条件及检测方法同实施例3所述。透明质酸的产量达到6.8g/L，其平均分子达到200万道尔顿。

[0108] 实施例5 构建高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌

[0109] 1、基于水蛭的透明质酸酶的氨基酸序列，设计了密码子优化的透明质酸酶合成酶基因Hyal(SEQ ID NO:6)，委托无锡青兰生物科技有限公司进行基因合成；以人工合成的Hyal基因为模板，以hyal-F和hyal-R为引物进行PCR，获得约1500bp的Hyal片段，并进行PCR产物纯化；

[0110] 2、将带有信号肽的质粒pEC-S(购自Addgene)用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将Hyal片段连接到pEC-S上，获得的重组质粒命名为pEC-hyal；

[0111] 3、将pEC-hyal通过电转法(电转法条件同实施例1所述)转化到实施例3的重组谷氨酸棒杆菌CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA中，筛选阳性克隆，获得的重组菌命名为CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA/pEC-hyal。

[0112] 其中，所用引物序列如下：

[0113] hyal-F：5’-ctacttccactgcacaaagcatgaaggagattgcggtcacg-3’

[0114] hyal-R：5’-gcctgcaggtcgactctagattactttttgcaggcctctacattgg-3’。

[0115] 将CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA/pEC-hyal在2L发酵罐中进行发酵，装液量为1L，接种量为10v/v％，检测其透明质酸的产量。发酵条件及检测方法同实施例3所述。透明质酸的产量达到18.2g/L，其平均分子达到3000道尔顿。

[0116] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。