一种NKT细胞培养方法

摘要

本发明公开了一种新型的NKT细胞培养方法，该方法包括NKT原代细胞培养和NKT细胞继代培养，所述NKT原代细胞培养是采用外周血单个核细胞接种无血清培养基，所述继代培养的第一天向无血清培养基中加入启动因子人源化的CD3单抗、人源化的CD28单抗和IL‑2；随后在后续的扩增液中加入扩增因子IL‑2和IL‑7。本发明公开的NKT细胞培养方法培养的NKT细胞，细胞状态好、增殖速度快、增殖倍数高，可以获得更高纯度的NKT效应细胞，得到的NKT细胞杀伤效果也明显高于现有的培养方法。

权利要求

1.一种NKT细胞培养方法，该方法包括NKT原代细胞培养和NKT细胞继代培养，所述NKT原代细胞培养是采用0.5-2×106个/mL的细胞密度将外周血单个核细胞接种于含有终浓度为500-2000IU/mL IFN-γ的无血清培养基，其特征在于，所述继代培养的第一天向无血清培养基中加入终浓度为50-500ng/mL的人源化CD3单抗、终浓度为50-500ng/mL的人源化CD28单抗和终浓度为2000-5000IU/mL的IL-2作为启动因子；随后在后续的培养体系扩增中加入含有扩增因子IL-2和IL-7的无血清培养基作为扩增液，其中所述IL-2的终浓度为500-

1000IU/mL，且IL-7的终浓度为10-50ng/mL。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人源化的CD3单抗的最优终浓度为

500ng/mL，人源化的CD28单抗的最优终浓度为500ng/mL和IL-2的最优终浓度为5000IU/mL。

3.一种抗肿瘤过继免疫细胞，其特征在于，所述抗肿瘤过继免疫细胞是通过权利要求1或2所述培养方法得到的细胞。

4.一种生物制品，其特征在于，所述生物制品含有通过权利要求1或2所述培养方法得到的NKT细胞。

说明书

一种NKT细胞培养方法

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种新型的NKT细胞培养方法。

背景技术

[0002] 细胞免疫治疗是一种新兴的治疗技术。细胞免疫治疗疗法是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成百倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。细胞免疫治疗可以恢复与增强肿瘤患者自身的免疫监测和杀瘤功能，有效地杀灭患者术后和放化疗后体内残存的肿瘤细胞，达到治疗肿瘤、预防复发与转移和最终根治肿瘤的目的，具有特异性强、副作用轻等优点。

[0003] NKT细胞(自然杀伤T细胞)是免疫细胞治疗中非常重要的一类细胞群。NKT(natural killer T)细胞是一群细胞表面既有T细胞受体TCR，又有NK细胞受体的特殊T细胞亚群，可分泌大量的IL-4和IFN-γ因子，是免疫调节和细胞杀伤性作用的重要细胞群。NKT细胞活化后具有NK细胞样细胞毒活性，可溶解NKT细胞敏感的靶细胞，主要效应分子是穿孔素、Fas配体和IFN-γ。目前NKT细胞作为具有强力杀伤靶细胞的一类细胞群，在肿瘤免疫细胞治疗中具有非常重要的作用。经体外培养得到的NKT细胞能很好的起到肿瘤免疫治疗和保健作用。

[0004] 在NKT细胞常规培养中，主要是利用培养瓶或培养袋按一定细胞密度直接进行培养，具体培养方法是：普通培养瓶用包被液(Anti-CD3蛋白)包被；外周血分离单个核细胞(PBMC)，经磁珠分选获得NKT细胞，接种至经包被后的培养瓶中；培养14天收集NKT细胞。

[0005] 然而传统培养瓶培养NKT细胞，部分细胞很容易贴壁。当细胞增殖培养时，大量的成团细胞很容易沉于底部，易导致NKT细胞不能充分接触培养液，减缓细胞增殖，并且容易使成团的细胞死亡。

发明内容

[0006] 为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种新型的NKT细胞培养方法。该培养方法采用从病人自体外周血细胞分离得到的单个核细胞，经体外操作及其相关细胞因子的刺激活化作用使其转变成高效的NKT细胞，用于肿瘤细胞的杀伤作用。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 首先提供了一种新型的NKT细胞培养方法，该方法包括NKT原代细胞培养和NKT细胞继代培养，其中，所述NKT原代细胞培养是采用外周血单个核细胞接种无血清培养基，所述继代培养的第一天向无血清培养基中加入启动因子人源化的CD3单抗、人源化的CD28单抗和IL-2；随后在后续的扩增液中加入扩增因子IL-2和IL-7。

[0009] 优选的，所述单个核细胞接种无血清培养基的接种量为0.5-2×106个/mL。

[0010] 优选的，人源化的CD3单抗的终浓度为50-500ng/mL，人源化的CD28单抗的终浓度为50-500ng/mL和IL-2的终浓度为2000-5000IU/mL。

[0011] 优选的，所述扩增液为无血清培养基，所述IL-2的终浓度为500-1000IU/mL，IL-7的终浓度为10-50ng/mL。

[0012] 优选的，NKT原代细胞培养的无血清培养基中加入IFN-γ，该IFN-γ的终浓度为500-2000IU/mL的。

[0013] 优选的，所述继代培养的培养周期为14天以上。

[0014] 培养14天的NKT细胞进行肿瘤细胞的杀伤试验(杀伤选择的细胞系为：MCF-7,乳腺癌的细胞系)，使用CCK-8试剂盒的方法进行杀伤试验，NKT细胞在第14天的杀伤率即可达到80％以上。

[0015] 本发明所述培养方法中所述单个核细胞可以由外周血分离得到。

[0016] 在一些实施方案中，所述单个核细胞的制备方法为外周血加入生理盐水稀释，缓慢加入到含淋巴细胞分离液的离心管中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层清晰，500-800g离心20-30min。

[0017] 进一步地，本发明提供了一种抗肿瘤过继免疫细胞，所述抗肿瘤过继免疫细胞是通过上述制备方法得到。

[0018] 更进一步地，本发明提供了一种生物制品，所述生物制品含有通过上述制备方法得到的NKT细胞。

[0019] 有益效果

[0020] 本发明公开了一种新型的NKT细胞的培养方法，该方法培养的NKT细胞，细胞状态好、增殖速度快、增殖倍数高，可以获得更高纯度的NKT效应细胞，得到的NKT细胞杀伤效果也明显高于现有的培养方法。

附图说明

[0021] 图1培养前流式结果图；

[0022] 图2培养14天后流式结果图；

[0023] 图3培养前细胞照片；

[0024] 图4培养14天后细胞培养的照片；

[0025] 图5NKT细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

具体实施方式

[0026] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0027] 实验仪器、试剂和耗材如下：

[0028] NKT细胞必须是在符合GMP条件的超净环境下制备。与细胞培养相关的材料必须是无菌、无致热原的，并严格按照操作说明书使用，有特殊说明的情况除外。实验所用仪器如表1所示，实验所用试剂如表2所示。表1实验用仪器

[0029]名称 货号/型号 厂家
生物安全柜 BOOSERIES A2 Thermo
水平低速离心机 X3 Thermo
二氧化碳培养箱 FORMA SERIES II WATER JACKET Thermo
倒置显微镜 XDS-113 重庆广电
血细胞记数器 Z318427 把因医疗
血细胞计数板 Z319023 把因医疗
移液器 26300 eppendorf
热合机 GZR-Ⅲ 苏州市医用仪器
-20℃冰箱 BCD-322W 博西华家用电气有限公司
4℃冰箱 BCD-322W 博西华家用电气有限公司
生化培养箱 Blue pard 上海一恒科学仪器有限公司

[0030] 表2实验用耗材

[0031]

[0032]

[0033] 实施例1：单个核细胞的分离

[0034] 在无偿献血者自愿的情况下，发明人采集人静脉外周血50mL，加入10mL生理盐水稀释，缓慢加入到含淋巴细胞分离液15mL的离心管中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层清晰，500g-800g离心力，离心20-30min，提取中间白膜层细胞，即得单个核细胞，加生理盐水清洗两遍，计数，细胞量为2×107个～4×107个。

[0035] 实施例2细胞培养

[0036] 一、NKT原代细胞的制备

[0037] 1、将患者50-100mL外周血，均匀分至2管，用移液管吸取少许原血(约300μL)划线或滴入平皿进行检菌。然后，室温下，865g，离心15分钟(9,7，意指升9降7，下同)。

[0038] 2、将上层血浆转入离心管，56℃灭活30min，865g，10min离心，取上清备用。

[0039] 使用等体积的生理盐水与血细胞沉淀混匀后，小心加到用50mL离心管分装的15mL Ficoll层上，使分层保持清晰。室温865g，离心20分钟(9，3)。

[0040] 3、吸取外周血单个核细胞(PBMC)层，尽量吸尽两液面交接处的细胞层，加5mL生理盐水吹打混匀，后加生理盐水稀释至45mL。700g，离心8分钟(9，7)。相同方法再次洗涤细胞。

[0041] 弃去上清后，用5mL无血清培养基重悬，定容20mL，吸取少量细胞计数。

[0042] 4、种瓶将20mL已混匀的细胞加入到225cm2培养瓶内，用10mL无血清培养基清洗离心管，并入培养瓶内，视细胞数量多少来添加培养基终体积为30-50mL，调整细胞密度为6
0.5-2×10个/mL。加入500-2000IU/mL的IFN-γ、患者血浆5-10mL，剩余血浆4℃密封保存备用。

[0043] 5、在标记培养瓶侧壁后，将其放入CO2培养箱内进行培养。查看并保持培养箱状态如下，温度：37±0.5℃、湿度：大于90％、CO2浓度：5％。

[0044] 6、将加好样品的血琼脂平板正置放入35℃恒温生化培养箱，记录放入日期及培养物品。隔夜后倒置，保留48小时。

[0045] 计算细胞密度及细胞数量

[0046] 细胞浓度(个/mL)＝N/4×稀释总倍数×104

[0047] 细胞数量(个)＝细胞浓度(个/mL)×细胞悬液总体积(mL)

[0048] 二、NKT细胞继代培养

[0049] 1、启动扩增

[0050] 在培养的第1天：培养基为无血清培养基50mL，接种细胞3×107个；加入启动因子设置不同的终浓度梯度，如人源化的CD3单抗(0-500ng/mL)、人源化的CD28(0-500ng/mL)和IL-2(0-5000IU/mL)，具体见表3所示。并在瓶体侧面标上添加日期，放入CO2培养箱内继续培养，培养前的细胞照片如图3所示。

[0051] 扩增液的配制在1000mL培养基内加入(0-1000IU)IL-2和(0-50ng/mL)IL-7，其终浓度的梯度设置如表4所示。

[0052] 2、第一次扩增，主要为补液操作，将培养基扩增至100-150mL，再加入灭活血浆10mL

[0053] 2.1细胞培养第4天，显微镜下观察无异常情况，细胞生长良好，培养液变黄，可以开始扩增。若生长一般或较差，考虑减量扩增或推迟扩增。

[0054] 2.2将细胞培养基放至室温，与50毫升离心管(架)/移液管/检菌平皿/细胞培养瓶表面消毒后一并放入安全柜。

[0055] 2.3依次拧下培养瓶、50mL离心管、细胞培养基瓶盖。用50mL离心管量取100mL的扩增液，倒入培养瓶中，加入灭活血浆10mL。依次盖上培养瓶及培养基的瓶盖，轻摇培养瓶，使培养基混匀。在瓶体侧面标上培养代数P1、日期，放入培养箱继续培养。

[0056] 3、第二次扩增，主要为装袋操作，将培养体系由100-150mL扩增至500mL，加入剩余血浆(约20mL)

[0057] 3.1细胞培养第6天，显微镜下观察无异常情况，细胞生长良好，培养液变黄，可以开始扩增。若生长一般或较差，考虑减量扩增或推迟扩增。

[0058] 3.2拧紧瓶盖，从CO2培养箱内取出细胞培养瓶，与其它所需材料一并表面消毒后，移入生物安全柜。

[0059] 3.3拍打瓶壁，使细胞尽量从瓶底脱落，加入灭活血浆约20mL，拧紧瓶盖，轻摇混匀，

[0060] 3.4打开培养袋包装，做好标记，注明操作项目名称、日期等。

[0061] 3.5拧下管口盖子，将盖子小心倒置在洁净区域，防止在其上方经过。

[0062] 3.6将管口与已拔出内芯的50mL注射器头连接好，瓶中全部细胞悬液倒入袋中，并向袋内加扩增液至500mL，最后将培养袋的管口盖子盖好，拧紧。

[0063] 3.7在培养袋取样口(可插针头的管子顶端)，用5mL注射器抽取少量细胞悬液加至血平板上检菌，并做好标记。然后将培养袋放入细胞培养箱中继续培养。

[0064] 4、第三次扩增，主要为补液操作，将培养体系由500mL扩增至1000mL[0065] 4.1细胞培养第8天，显微镜下观察无异常情况，细胞生长良好，培养液变黄，可以开始扩增。若生长一般或较差，考虑减量扩增或推迟扩增。

[0066] 4.2从CO2培养箱内取出细胞培养袋，与其它所需材料一并表面消毒后，移入生物安全柜。

[0067] 4.3拧下管口盖子，将盖子小心倒置在洁净区域，防止在其上方经过。

[0068] 4.4将管口与已拔出内芯的50mL注射器头连接好，向袋内加扩增液500mL，最后将培养袋的管口盖子盖好，拧紧。标记培养袋数P3及第三次扩增日期。

[0069] 4.5在培养袋取样口(可插针头的管子顶端)，用5mL注射器抽取少量细胞悬液加至血平板上检菌，并做好标记。然后将培养袋放入细胞培养箱中继续培养。

[0070] 5、第四次扩增，主要为补液操作，将培养体系由1000mL扩增至2000mL[0071] 5.1细胞培养第11天，显微镜下观察无异常情况，细胞生长良好，培养液变黄，可以开始扩增。若生长一般或较差，考虑减量扩增或推迟扩增。

[0072] 5.2将培养袋从培养箱中取出，表面酒精消毒后，移入生物安全柜，拧开细胞培养袋管口的封盖并与已拔出内芯的50mL注射器头连接好，向袋中加入扩增液1L，充分混匀培养袋中的细胞悬液，并将2L细胞悬液均分到2个细胞培养袋中，标记培养袋数P4及第四次扩增日期。然后将2个培养袋放入培养箱中继续培养。

[0073] 三、收获

[0074] 1、第14天收获袋内细胞悬液，本次实验细胞培养后的照片如图4所示。

[0075] 将此项操作所用材料，包括细胞培养袋、细胞培养瓶、250毫升离心管(架)，表面消毒后移入安全柜。

[0076] 2、调整安全柜挂钩位置，使挂钩处于便于操作的位置，将培养袋竖直提起，轻弹连接管根部，使管内液体流回培养袋，至少在远端留出3厘米空段，用止血钳将此段夹死。

[0077] 4、反复轻柔按压培养袋，使其中的细胞尽量悬浮混匀。对250mL离心管进行标记，以防混淆。

[0078] 5、拧下离心管瓶盖，将其放至安全柜右侧洁净区，使此后的操作尽量不会经过瓶盖上方。离心管刻度面向操作者，便于观察。

[0079] 6、拧下管口盖子，取下并把持止血钳，左手固定靠近止血钳近端连接管，末端处于离心管口正上方。打开止血钳，并同时控制管口方向和液体流速，收集细胞悬液于250mL离心管中。配平离心管，盖好管盖，拧紧。700g，离心8分钟。

[0080] 7、细胞沉淀用生理盐水洗涤2遍，既可用于下游的功能检测试验。

[0081] 四、实验结果分析：

[0082] 1、不同浓度和种类的启动因子对培养14天的细胞数的影响

[0083] 初始分离的细胞总数为：3×107个。

[0084] 培养14天以后，各组的细胞数变化如表3所示，由表中数据分析可知在30-50mL无血清培养液中同时加入三种人源化的CD3单抗、人源化的CD28和IL-2的启动因子，其NKT细胞扩增效果要优于加入一种或其中两种启动因子。发明人经多次实验发现当加入的这三种启动因子在多于表中最高加入量时，培养的NKT细胞数没有明显增加，但是成本会增加很多，因此确定加入量是人源化的CD3单抗500ng/mL，人源化的CD28单抗500ng/mL，IL-2 5000IU/mL，是NKT细胞培养最优化的培养方案。

[0085] 表3初始启动因子的加入量

[0086]

[0087]

[0088] 2、NKT细胞的扩增过程中扩增液中添加IL-7和IL-2能够明显的增加扩增的细胞数量。

[0089] 初始分离的细胞总数为：3×107个

[0090] 在培养的第一天添加的启动因子终浓度是：500ng/mL的CD3单抗，500ng/mL的CD28单抗，5000IU/mL IL-2条件下，对扩增液加入扩增因子IL-7和IL-2。如表4中实验数据分析可知，同时加入IL-7和IL-2扩增因子要明显优于不加或单个加入IL-7或IL-2的情况，并且当加入的IL-7和IL-2终浓度分别为IL-2的终浓度为500-1000IU/mL，IL-7的终浓度为10-50ng/mL，得到的NKT细胞扩增效果最好，能够达到1010数量级。

[0091] 表4扩增液加入活化因子量

[0092]

[0093] 3、流式结果

[0094] 培养前流式结果图见附图1，培养14天后流式结果图见附图2，对比图1和图2可知，说明通过这个方法可以使得我们所需的效应细胞得到数量和百分比上的增加。对于细胞数扩增最优的组别(启动因子为：500ng/mL的CD3单抗，500ng/mL的CD28单抗，5000IU/mL IL-2；扩增液为：1000IU IL-2，50ng/mL IL-7，无血清培养基)进行流式检测，数据参见表5：

[0095] 流式表型分析的方法：分别取第0、14天的细胞，吸入1.5mL EP管，每管约含1.0×106细胞，2000rpm离心3分钟后弃去上清，细胞重悬在100μL PBS中，加入荧光标记抗体(BD，APC-CD56,FITC-CD3)，4℃避光孵育30分钟；用PBS洗涤2遍，弃去上清；用0.3mL PBS将细胞重悬，用流式细胞仪BD FACSAria III进行检测分析。NKT(CD3+CD56+)流式表型第14天时可达87.7％。

[0096] 表5流式检测结果

[0097]

[0098] 4、NKT细胞对肿瘤细胞的杀伤作用

[0099] 取对数生长期的MCF-7细胞株作为靶细胞，并调整细胞密度为8×105cells/mL，[0100] 每孔取50μL铺于96孔培养板中。取本方法制备的细胞调密度为4×106cells/mL、8×106cells/mL、1.6×107cells/mL，加入96孔培养板中，每孔50μL，使效靶比分别为5:1、10:1、20:1，每组设三个复孔。接种方式如下：

[0101] 实验组(a值)：MCF-7(50ul)+NKT(50ul)

[0102] 对照组(b值)：MCF-7(50ul)+无血清培养基(50ul)

[0103] (c值)：NKT(50ul)+无血清培养基(50ul)

[0104] 空白组(d值)：无血清培养基(100ul)

[0105] 将接种好的细胞，置于37℃、5％CO2条件下共培养24小时后，每孔加10μLCCK-8试剂，摇匀，37℃、5％CO2条件下继续培养3小时，酶标仪450nm波长测吸光度(A450)。按下式计算杀伤活性：杀瘤效率＝[1－(a值－c值－d值)/(b值－d值)]×100％。

[0106] 结果显示本方法制备的NKT细胞对MCF-7细胞株具有较高的杀伤活性，当效靶比为10:1、20:1时，第14天的NKT细胞的杀伤率即可达到80％以上，NKT细胞对肿瘤细胞的杀伤作用如图5所示。

[0107] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。