智力障碍疾病的致病基因模型及其构建方法和应用

摘要

本发明涉及一种智力障碍疾病的致病基因模型及其构建方法和应用。通过对智力障碍患者及其家人和非智力障碍的正常人的外周血全基因组DNA进行分析，找到了与相应的智力障碍患者相关的致病基因，有利于了解智力障碍的发病机制及产前诊断预防。

权利要求

1.一种检测ARHGAP4基因突变位点chrX：g.153173202G>A的试剂在制备检测智力障碍疾病的检测芯片或检测试剂中的应用。

说明书

智力障碍疾病的致病基因模型及其构建方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因研究技术领域，尤其是涉及一种智力障碍疾病的致病基因模型及其构建方法和应用。

背景技术

[0002] 智力障碍(mental retardation，MR)是一种由于神经系统异常所导致的复杂性疾病。患者在发育期间一般智力功能明显低于同一年龄平均水平，同时对社会环境日常要求的适应能力有明显缺陷，通常在18岁之前发病。如下表所示，根据认知功能缺陷的程度可以将智力障碍分为轻度(IQ50一70)、中度(IQ35一50)、重度(IQ20一35)和极重度(IQ<20)。

[0003]术语 智商
极重度 <20
重度 20-35
中度 35-50
轻度 50-70
边缘 70-85

[0004] 智力障碍群体发病率约为1-3％，其中，中、重度智力障碍发病率约0.3-0.4％，男女发病率比约1.4～1.6:1。智力障碍患者在学龄前(5岁前)常表现为语言、运动发育迟滞等，故称之为生长发育迟缓(Nevelopment Delay，Dn)。在所有的智力障碍患者中，约有1/3与遗传因素相关。引起智力障碍的因素很多，智力障碍本身是一种复杂的疾病，与多因素有关，其中，遗传因素包括单基因疾病、染色体结构异常、染色体非整倍体和基因组疾病四大类型。智力障碍是一个影响人类健康、增加社会和家庭压力的一类疾病，在欧洲中部，大概有8％的医疗保健支出花费在智力障碍这一疾病上，远超其他疾病。智力障碍为家庭和社会带来巨大的经济压力，而此类疾病目前并没有有效的治愈手段，因此，做好产前诊断和预防是相当必要的。

发明内容

[0005] 基于此，有必要提供一种智力障碍疾病的致病基因模型及其构建方法和应用。

[0006] 一种智力障碍疾病的致病基因模型的构建方法，包括如下步骤：

[0007] 步骤一：提取智力障碍患者及其家人和非智力障碍的正常人的外周血的全基因组DNA；

[0008] 步骤二：对所述全基因组DNA进行片段化处理；

[0009] 步骤三：对片段化处理后得到的全基因组DNA片段连接测序接头；

[0010] 步骤四：扩增连接有测序接头的全基因组DNA片段；

[0011] 步骤五：捕获外显子DNA序列；

[0012] 步骤六：扩增目的DNA片段；

[0013] 步骤七：对扩增的目的DNA片段进行测序，并对测序结果进行SNPs和Indels分析，筛选致病基因，得到智力障碍疾病的致病基因模型。

[0014] 一种使用该智力障碍疾病的致病基因模型的构建方法筛选得到的致病基因模型。

[0015] 以及，该致病基因模型在制备诊断智力障碍疾病的诊断芯片或诊断试剂中的应用。

[0016] 本发明通过对智力障碍患者及其家人和非智力障碍的正常人的外周血全基因组DNA进行分析，找到了与相应的智力障碍患者相关的致病基因，有利于了解智力障碍的发病机制及产前诊断预防。但由于智力障碍也是一种复杂的疾病，单纯的致病基因突变并不能作为诊断是智力障碍的标准，还需要结合其他分析结果，如染色体核型分析、家族相关基因谱系分析等确定是否是智力障碍。

附图说明

[0017] 图1为实施例中先证者的家系图谱；

[0018] 图2为先证者的染色体G显带核型；

[0019] 图3为先证者13、16、21、22、X及Y染色体的FISH实验图；

[0020] 图4为目标基因碱基的测序深度覆盖率直方图；

[0021] 图5为目标区域的累计深度分布图；

[0022] 图6为不同灵长类的ARHGAP4T491序列保守性分析结果示意图；

[0023] 图7为PCR产物电泳图；

[0024] 图8为不同基因型测序结果图。

具体实施方式

[0025] 下面主要结合附图及具体实施例对本发明的智力障碍疾病的致病基因模型及其构建方法和应用作进一步详细的说明。

[0026] 1.研究对象

[0027] 本实施例经医学伦理委员会通过，获得实验研究对象的知情同意。

[0028] 先证者，男，22岁，汉族，175cm，66kg，出生时无异常。3岁开始走路，5岁开始说话，脑电图正常，脑部核磁共振正常，神经系统检查病理反射(-)，精神发育迟滞根据国际疾病分类第十版(ICD-10)诊断标准评定为F71.851，中度精神发育迟缓，F79.902，智力低下，IQ50。

[0029] 先证者的家人，包括其父母、姐姐及弟弟。先证者的家系图请见图1，其中，24为先证者，12是先证者母亲，13是先证者父亲，23是先证者姐姐，25是先证者弟弟。

[0030] 非智力障碍的正常人群100人。

[0031] 可理解，在其他实施例中，研究对象也可以取自相应的医疗机构收集的智力障碍先证者及其家人、以及一些非智力障碍的体外外周血或外周血淋巴细胞样本。

[0032] 2.主要仪器、试剂与耗材

[0033] 2.1主要仪器

[0034] DNA Vacuum Concentrator Eppendorf(Eppendorf)、Covaris E210(Covaris)、Spectrophotometer(NanoDrop)、DynaMag-2Magnet(Invitrogen)、480Instrument II(Roche Applied Science)、Illumina HiSeq2000Platform(Illumina)、Vortex mixer Barnstead(Thermolyne)、Thermocycler(Bio-Rad)、Bioanalyzer 2100(Agilent)、Applied Biosystems 37℃培养箱、电烤箱、超净工作台、低速离心机(上海飞鸽)、显微镜(OLYMPUS)、冷冻离心机(Heal Force)、恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)、核酸蛋白测定仪(Eppendorf，BioPhotometer plus)、PCR仪(杭州博日)、紫外成像仪(北京六一仪器有限公司)、3730测序分析仪(美国ABI公司)、电泳仪(天能EPS)、全自动分子杂交仪、荧光显微镜及分析软件、冰箱(中国海尔)、迷你离心机、考普林瓶15个、移液枪(5ml，
1000ul，200ul，10ul)(Eppendorff)、震荡混匀器、计时器、温度计、洗耳球、吸量管、烧杯、容量瓶、电子天平。

[0035] 2.2实验试剂

[0036] 小牛血清、乙醇、甲醇、秋水仙素、乙酸、PHA、TaKaRa HS DNA Polymerase(宝生物工程(大连)有限公司，DR010A)、PBS、HCl、KCl、SSC、NP-40、QIAamp DNA Kit Qiagen、Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit(Illumina)、Agencourt AMPure XP Kit(Agencourt)、Dynabeads M-270(Streptavidin Invitrogen)、QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)、Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer(NEB(Finnzymes))、Agilent DNA 1000 Kit(Agilent)、溴化乙锭(上海生工)、50×TAE(Promega)、AGROSE(Ecogen)、DNA Marker(天根生化科技有限公司)、PCR Grade Water Roche(NimbleGen)、PCR Kit(Fermentas)、SeqCap EZ Human Exome Library Kit(Roche NimbleGen)、PCR产物纯化回收试剂盒(上海生工)、TIANamp GenomicDNA Kit(北京天根，DP304)、吉姆萨染粉、甲醇、甘油、生理盐水、75％乙醇、20×SSC、胰蛋白酶干粉、NaOH、蛋白酶K、胃蛋白酶、FISH试剂盒。

[0037] 2.3耗材

[0038] 载玻片、盖玻片、离心管(10ml，1.5ml，200μL)油性笔、铅笔一次性吸管、离心管、个人防护用品、、标签纸、松节油等。

[0039] 3.各种溶液的配制

[0040] 2％胰蛋白酶：2g胰蛋白酶干粉置于烧杯中，加入100mL生理盐水，混匀，置于4℃冰箱保存。

[0041] 细胞固定液：甲醇30mL，冰乙酸10mL，混匀，现配现用。

[0042] 吉姆萨染液：称取1g的姬姆色素染料加入66mL甘油，混匀，60℃保温溶解2h，再加入66mL甲醇混匀，即配成姬姆色素原液。原液：PBS(pH6.8)为1:9，即为工作液。

[0043] 4％NaOH液：用天平称取4g分析纯的NaOH固体，置于一只三角烧瓶中。用200mL量筒准确取100mL蒸馏水，缓缓注入盛放NaOH固体的三角烧瓶中。摇荡三角烧瓶使NaOH固体充分溶解。缓缓倾倒入250mL广口瓶中，密封保存备用。

[0044] DEPC水：1mLDEPC溶于1L纯净水中，高压灭菌。

[0045] 2×SSC/0.1％NP-40：取50ml 20×SSC(pH 5.3)，0.5mL NP-40，加入400mL双蒸水，调pH为7.0，定容至500mL，封口膜封好，室温保存备用，有效期6个月。

[0046] 2×SSC：用20×SSC和双蒸水，按1:9的比例稀释，调pH为7.0，封口膜封好，4℃保存备用。

[0047] 0.075M KCl：KCl 2.794g溶入500mL去离子水中，备用，4℃低温保存。

[0048] 1M HCl：取9mL浓HCl加去离子到100mL混匀，4℃保存备用。保存1个月。

[0049] 0.08mg/L胃蛋白酶工作液：取40mg胃蛋白酶，放入1.5Ml EP管中，加1mL去离子水溶解，分装到10个200μL离心管中。使用时，在考普林瓶中加50mL去离子水，加入500mL 1M HCl，加入一管分装的胃蛋白酶溶液(100μL)。

[0050] PBS缓冲液：磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，氯化钠(NaCl)：8g，氯化钾(KCl)0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。高温高压灭菌后室温保存。

[0051] 酒精配制：取无水乙醇28mL和34mL，分别与12mL和6mL双蒸水混合，配成70％和85％的酒精，与无水乙醇共同组成70％，85％，100％的系列酒精，封口膜封好，室温保存备用。

[0052] 蛋白酶K工作液：称取0.1g蛋白酶K(PK)干粉溶于2×SSC(pH＝7.0)溶液中，轻轻摇动，直至PK完全溶解，不要漩涡混匀。-20℃保存。使用时取0.4mL PK储存液溶于40ml 2×SSC(pH7.0)溶液中。

[0053] 4.研究方法

[0054] 4.1染色体核型分析

[0055] 外周血淋巴细胞染色体检查采用含有PHA和小牛血清的人工液体培养基对外周血淋巴细胞进行体外培养72h，加入秋水仙素使淋巴细胞转化停留在中期以获得更多的中期分裂相，提取淋巴细胞制片，经胰蛋白酶消化、吉姆萨染色后，于显微镜下检查染色体数目和形态。

[0056] 4.1.1标本采集

[0057] 肝素钠真空管抽取静脉血4mL，立即混匀、接种(患者在放疗、化疗和使用抗生素治疗期间抽血做染色体检查会显著影响实验结果，很有可能会导致细胞培养失败而无法进行诊断，因此请尽量避免在上述治疗期间做染色体检查。标本采集时注意用品消毒，严格无菌。)。

[0058] 4.1.2标本接种

[0059] 用2.5mL注射器向培养液中滴加混匀后的全血约0.5mL(成人)、0.4mL(<5周岁的儿童)，摇匀，放入37℃孵箱培养72h，并做好记录。标本接种全过程应在超净工作台、无菌环境下进行，严防外界细菌污染实验用品和标本。

[0060] 4.1.3加秋水仙素

[0061] 加秋水仙素前注意观察培养基上清液是否仍清亮，若上清变混浊，说明标本被污染，应立即重新抽血再次培养。当培养至第70h时，用1mL注射器向培养液中加入秋水仙素0.07mL/瓶，摇匀再培养1小时30分钟。

[0062] 4.1.4收集细胞

[0063] 将培养液转移至15mL刻度离心管中，1500转/分，离心10min，取出离心管弃去上清液。沿管壁缓缓加入已预热至37℃的0.075mol/L KCl溶液7-8mL，悬起沉淀的细胞，置37℃水浴12min，在低渗溶液中使RBC溶解，淋巴细胞膨胀、染色体分散。

[0064] 4.1.5固定

[0065] 从水浴箱中取出离心管，沿管壁缓缓加入新鲜配制的固定液(甲醇：乙酸3：1)1-2mL，小心混匀，室温静置2min，1500转/分，离心10min，弃上清液，用吸管轻轻吹打沉淀直至吹打均匀为止，沿管壁缓缓加入新鲜配制的固定液8mL，混匀，室温静置≥30min，重复上述步骤两次，第二次放室温>2h可不再固定第三次，或连续固定三次，每次不少于30min。

[0066] 4.1.6制片

[0067] 将固定后管底沉淀的细胞用吸管轻轻吹打直至吹打均匀为止，加适量固定液混匀，从一定高度将细胞悬液滴落在冰玻片上，立即置75℃烤箱3h，或75℃烤10min后转65℃烤过夜。

[0068] 4.1.7显带

[0069] 将2％的胰蛋白酶1mL加入已预热至37℃的约50mL生理盐水中，充分混匀，加入0.1N NaOH 8滴调节pH至7.0，一次性吸管吸取约3-4mL饱和吉姆萨染液加入约50mL磷酸盐缓冲液中，充分混匀，G显带，立即吹干。

[0070] G显带法：制好的玻片浸入胰酶中消化30秒，立即取出浸入生理盐水，立即取出浸入稀释后的吉姆萨染液中染色约4分钟，自来水冲清、吹干即可。

[0071] 4.1.8染色体形态观察

[0072] 将玻片置于显微镜下观察染色体形态结构。

[0073] 4.2 FISH

[0074] 使用荧光原位杂交(Fluorensence in Situ Hybridization，FISH)技术对先证者进行部分染色体三体(13，16，18，21，22，X，Y)检测。

[0075] 4.2.1样本玻片制备

[0076] 1)样本采集。取外周血细胞悬液(2-5mL)置入肝素抗凝管中，4℃保存，不能过夜。

[0077] 2)将样本移入15mL离心管中，加入PBS，1200rpm，离心8min，去上清。可以重复一次。去上清，加入5mL 37℃预热的0.075M的KCl，重新吹打悬浮细胞，37℃水浴低渗15-20min，期间吹打2～3次。

[0078] 3)预固定。直接于细胞低渗混合液中缓慢加入2mL固定液(甲醇：冰醋酸＝3：1，必须现配现用)，轻轻吹打混匀。

[0079] 4)一固定。1500RPM离心8min，去上清，室温下缓慢加入5mL固定液，轻轻吹打悬浮细胞。

[0080] 5)二固定。1500RPM离心8min，去上清，室温下缓慢加入5mL固定液，轻轻吹打悬浮细胞。1500RPM离心8min，去上清。(固定至细胞完全无红色，呈乳白色)

[0081] 6)细胞悬液的制备和保存。根据细胞量加适量的固定液，制成浓度合适的细胞悬液。轻轻吹打混匀后，取适量悬液滴于处理好的干燥玻片上，自然晾干后，于光镜下观察细胞密度。剩余细胞悬液置-20℃冰箱中可保存1个月。在此期间可随时取出，离心去上清加入新鲜固定液，用于制片。

[0082] 7)老化玻片。室温下过夜老化玻片或56℃烤片机上烘烤30min以上，老化备用。

[0083] 4.2.2玻片预处理

[0084] 37℃2×SSC(pH 7.0)均衡玻片30分钟。将玻片依次置于70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2分钟脱水。自然干燥玻片。

[0085] 4.2.3变性杂交

[0086] 56℃，烤片2-5分钟。探针准备：杂交液8μL，探针2μL，加入到0.5mL离心管中混匀，离心1～3秒，备用。将10μl探针混合物滴加于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用封片胶封边准备杂交仪器，共变性条件，78℃7分钟，杂交条件，42℃16h。

[0087] 4.2.4玻片洗涤

[0088] 46℃，2×SSC洗5分钟。46℃，0.1％NP-40/2×SSC洗片5分钟。室温，70％乙醇洗片3分钟，并于暗处自然风干玻片。在室温下，将15μl DAPI复染剂滴加于玻片杂交区域，立即盖上盖玻片，15分钟后观察。

[0089] 4.2.5 FISH结果观察

[0090] 首先在10×物镜下，于FISH标本上找到细胞区域；然后在40×物镜下扫描整个杂交区域，观察标本的质量，满意的标本应是75％以上细胞核中都有杂交信号；在100×物镜下观察细胞核的FISH结果并进行信号计数，计数200个细胞。

[0091] 4.3全基因外显子组测序

[0092] 4.3.1全基因组DNA提取

[0093] 全基因组DNA根据说明用QIAamp DNA Blood Mini kit(Qiagen，Hilden，Germany)从研究对象外周血中提取出来。具体操作步骤如下：EDTA抗凝管抽取血样2mL，混匀，吸取200μL置于1.5mL离心管中。往离心管中加入蛋白酶K 20μL，摇匀。置于水浴箱中56℃孵育
10min。从水浴箱中去除，瞬时离心。加入200μL无水乙醇，摇匀，瞬时离心。将Mini spin column置于2mL收集管，将液体全部加入离心管，盖好，6000×g，1min。丢弃收集管及液体。
将Mini spin column置于另一2mL收集管，加入AW1缓冲液500μL，盖好，6000×g，1min。丢弃收集管及液体。将Mini spin column置于另一2mL收集管，加入AW2缓冲液500μL，盖好，2000×g，3min。丢弃收集管及液体。将Mini spin column置于另一2mL收集管中，加入AE缓冲液
200μL，室温放置1min，6000×g，1min。收集洗脱的基因组DNA，并对提取到的DNA进行定性和定量检测。

[0094] 4.3.2全基因外显子组捕获

[0095] 根据操作说明用NimbleGen SeqCap EZ Human Exome Library v2.0 kit(Roche NimbleGen Inc.，Wisconsin，USA)对外显子进行捕获，共包括样本全基因组DNA片段化、接头连接、LM-PCR扩增全基因组DNA、杂交及捕获全基因外显子组、通过LM-PCR扩增目标片段等五个步骤。

[0096] 1)全基因组DNA片段化

[0097] 取已获得的DNA，加入1×TE buffer至120μL，用DNA切割仪将DNA随意切割成150bp-200bp的片段。用AMPure磁珠纯化切割所得的片段。

[0098] 2)接头连接

[0099] 在片段化的DNA 3’端加“A”并连接测序接头(Illumina Paired-End Sample Preparation Kit)，并用AMPure磁珠纯化所得的片段。

[0100] 3)LM-PCR扩增全基因组DNA

[0101] 表1 LM-PCR扩增全基因组DNA实验体系

[0102]试剂 体积(μL)
2×mix 50.0
ddH2O 26.0
TS-PCR oligo1 2.0
1TS-PCR oligo 2 2.0
样品 20.0
总体积 100.0

[0103] PCR扩增参数：98℃30sec，(98℃10sec，65℃30sec，72℃30sec)×8，4℃5min，4℃hold。

[0104] 4)杂交及捕获全基因外显子组

[0105] 按顺序加入COT DNA、扩增后的目标序列、DNA文库、PE-HE1和PE-HE2oligos后真空热干燥，加入适量的2×杂交液及杂交组分A，95℃变性10分钟，47℃杂交72h。用免疫磁珠捕获外显子DNA序列。

[0106] 5)通过LM-PCR法扩增目标片段

[0107] 表2 LM-PCR扩增目标序列DNA实验体系

[0108]试剂 体积(μL)
2×Mix 50
Sample 20
100Μm PE-PRE1oligo 2
100Μm PE-PRE2oligo 2
ddH2O 26
总体积 100

[0109] PCR扩增参数：98℃30sec，(98℃10sec，60℃30sec，72℃30sec)×18，72℃5min，4℃hold。

[0110] 4.3.3高通量测序

[0111] 所获得的目标文库序列上机测序(Hiseq2000测序仪)，测序所得原始图像文件经过Illumina base-calling Software 1.7进行碱基读取，获得读长为90bp双末端序列(reads)。

[0112] 4.4数据处理及分析

[0113] 4.4.1原始数据统计

[0114] 所得的序列结果用SOAPaligner(SOAP2.20)分析测序结果，包括测序序列长度、测序深度、测序总量、文件输出总量、测序数据覆盖度等，并通过这些指标结果来评估测序质量。

[0115] 4.4.2 SNPs及Indels检测分析

[0116] 所得的序列结果用SOAPaligner(SOAP2.20)与NCBI的参考基因相比较。共有序列和每一个等位基因的质量通过用SOAPsnp系统设定参数进行分析。所预测的SNPs应该满足以下标准：

[0117] (a)SNP质量值大于或等于20；

[0118] (b)测序深度应在4×到10，000，000×之间；

[0119] (c)所预测的拷贝数小于2；

[0120] (d)两个SNPs之间的距离应大于5bp；

[0121] (e)运用BWA软件来进行Indels的分析。

[0122] 4.4.3致病基因筛选

[0123] 1)用SIFT(Sorting Intolerant From Tolerant)对SNPs进行分析评分，当评分值大于0.05时表示这个突变是可以接受的，即对蛋白质功能没有影响或者影响较小，标记为“tolerated”；当小于或等于0.05的时候则说明这个突变是有害的，即对蛋白质功能有较大影响，标记为“damaging”，所选出的突变基因应是“damaging”。

[0124] 2)将测序数据与NCBI人类参考基因序列(NCBI build 37)、NCBI dbSNP Build 132、千人基因组、hapmap、YH数据库进行比对，基因不存在于这些基因库中。

[0125] 3)结合家系分析，筛选可能基因。

[0126] 4)用GO(Gene Ontology)分析和KEGG分析查找相关的可能致病基因功能，分析排除。

[0127] 5)用Clustalw2在线软件ARHGAP4T491进行序列保守性分析。

[0128] 4.5 Sanger测序验证致病基因

[0129] 在用全基因组测序方法确定致病基因后，用sanger测序法对全基因组外显子测序结果进行验证，并在先证者的家人中探究该基因的表达情况，在100例非智力障碍的正常人中验证该基因突变的存在情况。

[0130] 4.5.1基因组DNA提取

[0131] DNA提取步骤严格按天根TIANamp Genomic DNA Kit说明书进行。

[0132] 1)向缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇。

[0133] 2)细胞样品加入200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。

[0134] 3)加入20μL Proteinase K溶液，混匀。

[0135] 4)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

[0136] 5)加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

[0137] 6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)。

[0138] 7)12，000rpm(～13，400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

[0139] 8)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm(～13，400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0140] 9)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm(～13，400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0141] 10)重复操作步骤8。

[0142] 11)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm(～13，400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

[0143] 12)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12，000rpm(～13，400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

[0144] 4.5.2电泳检测DNA提取情况

[0145] 1)煮胶：称取0.5g琼脂糖置于锥形瓶，后量取50mL 1×TAE混匀，置于微波炉中中高火煮2min。

[0146] 2)凝胶：清洗凝胶槽，滤纸擦干，倒胶凝胶1h。

[0147] 3)加样：取3μL 2x Loading Buffer(含20％SYBR染料)与3μL DNA混匀，点样。

[0148] 4)电泳：120V，20min。

[0149] 5)电泳完成后，置于紫外仪观察并照相。

[0150] 4.5.3 PCR扩增目标DNA序列

[0151] 表3 PCR扩增目标序列DNA实验体系

[0152]

[0153] PCR扩增参数：95℃3min，(94℃30s，55～58℃35s，72℃40s)×35，72℃5min，4℃hold。

[0154] 引物序列如下：

[0155] ARHGAP4-F:5'CTCTCTGCACAGGGTGAAGT 3'

[0156] ARHGAP4-R:5'GTGGCACAGAACATGGACTC 3'

[0157] 5.结果及分析

[0158] 5.1先证者染色体核型正常

[0159] 如图2所示，G显带核型分析证明先证者的染色体核型为(46，XY)。如图3所示，FISH实验证实先证者染色体13，16，21，22，X，Y均无三体情况。由此，可以排除染色体结构异常、染色体非整倍体方面的原因造成的智力障碍。

[0160] 从该家庭的家系图可见，先证者父母、姐姐和弟弟均为正常表型，可判断在此家庭中的智力障碍属于伴X染色体隐性遗传疾病。先证者中度精神发育迟缓，智力低下，IQ50符合智力障碍评定标准。

[0161] 5.2全基因组外显子测序结果

[0162] 5.2.1全基因外显子组高通量测序概况

[0163] 用高通量外显子测序对先证者进行外显子测序，如表4、图4和图5所示，在本实施例的结果中，目标区域共计46036367bp，测序覆盖率为99.13％，目标区域的平均测序深度为141.36，平均读长为89.88bp，chrX的测序深度为101.92，chrY的测序深度为158，GC碱基对出现率为43.82％，这些数据均表明本次全基因外显子组的测序质量良好，数据可靠。图4中，X-测序深度，Y-对应测序深度目标基因碱基所占比率；图5中X-测序深度，Y-取得的分数达到或超过一个给定的测序深度。

[0164] 表4 全基因外显子组测序概况

[0165]Exome Capture Statistics 先证者
(1)
Target region(bp) 46036367
Raw reads 154317500
Raw data yield(Mb) 13889
Reads mapped to genome 123252949
(2)
Reads mapped to target region 87220162
Data mapped to target region(Mb) 6507.56
Mean depth of target region(X) 141.36
Coverage of target region(％) 99.13
Average read length(bp) 89.88
Rate of nucleotide mismatch(％) 0.27
Fraction of target covered>＝4X(％) 97.4
Fraction of target covered>＝10X(％) 94.22
Fraction of target covered>＝20X(％) 89.56
Capture specificity(％)(3) 70.97
Reads mapped to flanking region(4) 14653823
Mean depth of flanking region(X) 38.17
Coverage of flanking region(％) 96.48
Fraction of flanking covered>＝4X(％) 86.73
Fraction of flanking covered>＝10X(％) 69.69
Fraction of flanking covered>＝20X(％) 50.66
Fraction of unique mapped bases on or near target 82.11

[0166](％)  
Duplication rate(％)(5) 17.98
Mean depth of chrX(X) 101.92
Mean depth of chrY(X) 158
GC rate(％) 43.82
Gender test result M

[0167] 注：(1)Target region是指实际覆盖的设计的探针的区域。

[0168] (2)Reads mapped to target regions是指读取内或与目标区域重叠。

[0169] (3)Capture specificity是指比对到目标区域的有效数据量占总的数据量的比例。

[0170] (4)Flanking region是指区域+/-200bp的每个目标区域的两侧。

[0171] (5)PCR复制对两链的起始和终止都是相同的，偶然不相同的情况很少发生。Duplication rate是复制序列的部分。

[0172] 5.2.2致病基因的筛选

[0173] 如表5所示，用SOAPaligner对所得的外显子测序数据进行比对，用BWA软件来进行Indel的分析，共在先证者外显子中鉴别出108767个突变，包括101787个SNPs和6980个Indels。

[0174] 表5 高通量测序所得SNP、Indels信息

[0175]

[0176] 如表6和表7所示，将测序数据与NCBI人类参考基因序列(NCBI build 37)、NCBI dbSNP Build 132、千人基因组、hapmap、YH数据库进行比对，对高通量测序进行进一步分析，发现发生在X染色体上的突变共有10个，其中SNP 7个，Indel 3个。

[0177] 表6

[0178]

[0179] 表7

[0180]

[0181] 如表8、表9和表10所示，对这些鉴别出来的突变基因用SIFT进行进一步评估，并对基因功能进行逐一排查，经过比较发现发生在X染色体上的突变只有ARHGAP4(chrX：153173202[g.153173202G>A；p.Thr941Met])。

[0182] 表8

[0183]

[0184]

[0185] 表9

[0186]

[0187]

[0188]

[0189]

[0190] 表10 ARHGAP4测序信息

[0191]  patient
GeneName ARHGAP4
Chromosome chrX
Position 153173202
Depth 6
Reference allele G
nunber of reads with Ref.allele[freq.] 0
Alternate Allele A
nunber of reads with Alt.allele[freq.] 6
mutation type missense
Codons ACG2822ATG
Substitution T941M
Gene description Rho GTPase activating protein 4

[0192] 在生物进化的过程中，基因序列的保守性与其功能重要性存在重要关联，主要是由于在进化过程中，重要的功能基因因为进化选择而得以保存，而非功能基因片段的突变对机体存活影响不大而使相关的突变可以被容忍并且得以累积，因此，当不同的个体间同一个位点序列越保守，会被认为功能越重要，其突变所引起的后果越严重。如图6所示，Sanger测序法证实ARHGAP4突变是导致X染色体相关智力障碍的原因，本实施例用Clustalw2在线软件对灵长类多个物种的ARHGAP4T491进行序列保守性分析，发现此位点在灵长类多个物种中均表现出保守性。

[0193] 本实施例利用sanger测序法对先证者及其家人(父亲、母亲、姐姐及弟弟)、100例智力障碍以外的人进行ARHGAP4基因测序。所用引物为ARHGAP4-F:5'CTCTCTGCACAGGGTGAAGT3'，ARHGAP4-R:5'GTGGCACAGAACATGGACTC3'，电泳结果如图7所示，
1：父亲:2：母亲:3：先证者姐姐:4：先证者5：先证者弟弟，产物质量良好。如图8所示，Sanger测序所得父亲在ARHGAP4153173202的碱基为G/G，母亲为A/G，姐姐为G/G，弟弟为G/G，先证者为A/A，100例正常人对照结果为G/G。由此可见，sanger测序结果与外显子测序结果一致。

[0194] 家系临床资料与实验结果分析

[0195] 在寻找此家系的智力发育不全所导致因素时，本实施例通过分析其核型、用FISH来分析其染色体结构，发现该家系的发病原因与染色体结构异常无关，结合到家系的遗传信息，判断该家系的智力障碍属于单基因遗传性疾病，因此用外显子测序方法来寻找其致病基因。

[0196] 单基因病是单基因遗传病是指符合孟德尔遗传定律的、由单个基因或一对等位基因发生突变所致的遗传病。根据基因所在位置、疾病遗传属于显性遗传或者显性遗传可以把单基因遗传病分为五种：常染色体显性遗传病、常染色体隐性遗传病、X染色体连锁显性遗传病、X染色体连锁隐性遗传病和Y染色体连锁遗传病。X染色体连锁隐性遗传病的最主要特点是家系内男性发病率明显比女性高(甚至只有男性发病)，隔代遗传，如红绿色盲和家族性低色素贫血等。通过对先证者家系来进行分析，家系内表现出来的患者均为男性，且符合隔代遗传的特点，可以判断其为X染色体连锁隐性遗传病。

[0197] 从外显子测序结果和sanger测序验证结果可见，父亲在ARHGAP4 153173202的碱基为G/G，母亲为A/G，姐姐为G/G，弟弟为G/G，先证者为A/A，100例正常人对照结果为G/G，ARHGAP4基因是该家系智力发育不全的相关基因。当153173202位点的参考碱基为G，当其突变为A时成为致病基因。G是X染色体上的显性因素，A为隐性因素，杂合状态时由于正常的显性基因的作用掩盖致病基因作用而不发病。

[0198] ARHGAP4基因与蛋白功能

[0199] ARHGAP4基因与大脑的发育相关。ARHGAP4位于Xq28，基因坐标为X:153172829-153191776(NCBI)，最早是Tribioli等在1996年在构建Xq28上的转录图时发现的，长约
200kb，共编码3.5kb mRNA，翻译的蛋白共计946个氨基酸。

[0200] 在自然界中存在有很多Rho GTPase调节分子，在神经系统中表达的也有很多报道。ARHGAP4基因编码的ARHGAP4也称为C1、P115、KIAA0131、RGC1、RhoGAP4，是一种RhoGAP，其是Rho GTPase激活蛋白家族中的成员，作用于Rho GTPase，朝胞内转导信号，引起下游效应。ARHGAP4由5个结构域组成，其中包括一个N端FCH(Fer/Fes CIP4homology)结构域，两个Coiled-coil基序，一个中间RhoGAP(Rho GTPase-activating protein)结构域，和一个C端SH3(Src homology 3)结构域。FCH域对于空间定位ARHGAP4到NIH/3T3细胞和轴突生长锥的前缘是重要的，并且GAP域和C末端的SH3域对ARHGAP4介导抑制的细胞和轴突蠕动是必需的。

[0201] RhoGAP在神经系统中有重要作用，其通过影响所调节的Rho GTPase或扰乱Rho GTPase所在的信号通路而起作用。同时神经元细胞中不同的Rho GTPase表达情况高度表明RhoGAP在不同的神经元中有不同的表达，在机体的发育和分化过程中的大脑特定区域占有独立专门的作用。ARHGAP4mRNA表达在发育中的、成熟的神经系统中均能见到。在进一步的蛋白分析中，发现ARHGAP4在神经系统中的特定区域特异性表达，其中包括了海马区中的CA3区域的透明层、脑干和纹状体的策府的神经纤维、颗粒细胞。亚细胞中，内源性的ARHGAP4表达位于高尔基复合体并可再分配到微管，就比如说有丝分裂中的微管。此外，本实施例研究还发现，PC12细胞的不同分化程度的神经元细胞中有不同的蛋白表达。这些研究都说明ARHGAP4与精神发育相关。在本实施例的研究以前，ARHGAP4基因突变的临床表型并不十分清楚，而本实施例的研究清楚显示ARHGAP4中的一个碱基突变会导致智力障碍。

[0202] 本实施例运用了外周血染色体核型检查法、FISH实验法、外显子测序法，并结合了该家系的遗传特点筛选出了该疾病的致病基因，最后用sanger测序法对致病基因进行筛选验证。几种研究方法穿插利用及结合临床数据，有效地保证了本实施例数据的准确性。同时，在疾病致病基因筛选的过程中，立足疾病的本身的特点是最重要的。研究数据与疾病的特点相结合，才能找到准确的致病基因。筛选出的ARHGAP4的突变基因可以用于设计检测智力障碍的检测芯片或检测试剂，用于智力障碍的产前诊断和预防。但由于智力障碍也是一种复杂的疾病，单纯的ARHGAP4基因突变并不能作为诊断是智力障碍的标准，还需要结合其他分析结果，如染色体核型分析、家族相关基因谱系分析等确定是否是智力障碍。

[0203] 查找智力障碍家系致病原因的必要性

[0204] 在中国，人口基数大，人口增长快。据国家人口计生委数据统计，我国每年出生的新生儿约2000万，而出生缺陷儿约占总新生儿人数的4％到6％，即每年约有80万到120万的缺陷儿出生，由此推算我国平均每30秒钟就有1名缺陷儿出生。XLMR发生率在男性约1/600～1/1000，危害人类健康，及时有效地查找出生缺陷的病因，以采取积极有效的措施减少或避免缺陷儿出生，是我国及世界各国面临的一个巨大难题。在已发现的所报道的XLMR致病基因中，大多数基因只存在于个别的家系或患病患者中，甚至还有一些XLMR家系目前仅能锁定致病基因所在的X染色体特定区域，而不能确定具体的致病基因，可见在XLMR的致病基因查找的过程中还有大量的工作需要进行。高通量测序的高速发展，对基因突变的快速定位，定会给XLMR致病基因的筛选提供有力的帮助。发现了XLMR的致病基因，可有效地进行产前筛查，帮助减相关家庭和社会的压力。

[0205] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0206] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。