一种改进1，3－丙二醇生物合成的方法

摘要

本发明公开了一种将克雷伯氏肺炎杆菌Klebsiella pneumoniae中的基因pck敲除，更高效转化甘油生产1,3‑丙二醇的方法。本发明的方法的优点是：pck基因敲除后大幅度减少了副产物2,3‑丁二醇的合成，提高了克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)转化甘油生成1,3‑丙二醇的生产水平。

权利要求

1.一种改进微生物生物合成1，3－丙二醇的方法，其特征在于：将1，3－丙二醇生产菌株中的基因pck敲除，降低了副产物2，3－丁二醇生成，促进了产物1，3－丙二醇的生产。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的pck基因具体为：pck基因负责编码EC编号为EC4.1.1.49的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于转化甘油生成1，3－丙二醇的菌株为克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsielapneum oniae)。

说明书

一种改进1，3－丙二醇生物合成的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体地说，即：敲除克雷伯氏肺炎杆菌中编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶合成的基因，从而提高1，3－丙二醇发酵的生产水平。

背景技术

[0002] 1，3－丙二醇(1，3－porpanediol，简称1，3－PD)是一种重要的化工原料，其最重要的用途是作为单体合成新型聚醋——聚对苯二甲酸丙二醇醋(PTT)。研究表明PTT一种性能特别优异的聚酯材料，因而1，3－PD的工业价值日益引起各国的重视。现在的研究表明：1，3－PD的生产方法中生物合成法因条件温和、操作简单、副产物少、绿色环保等，比化学合成法更有工业应用的优势。特别是随着生物柴油工业的发展，利用廉价的生物柴油工业的副产物甘油生物合成1，3－PD，成为如今工业生物技术领域的一个研究热点。

[0003] 自然界中有一些微生物能将甘油转化为1，3－PD。其中克雷伯氏肺炎杆菌(K lebsielapneumoniae)因生物转化效率高、生物转化过程操作方便，研究应用最多。克雷伯氏肺炎杆菌利用甘油代谢一般通过歧化途径：即甘油被氧化产生中间产物磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，简称PEP)，同时甘油也被还原产生产物1,3-PD。中间产物PEP会进一步在菌体里面代谢形成一系列的副产物如，乳酸、2,3-丁二醇和乙酸、琥珀酸等。特别是2,3-丁二醇，其生成量在副产物中最多，而且由于其沸点与产物1,3-PD相近，因而给后续1,3-PD的精制分离过程造成了很大的障碍。

[0004] 本发明公开了一种降低副产物2，3－丁二醇，提高产物1,3-PD生物合成的方法。该方法通过敲除克雷伯氏杆菌中的基因pck，显著降低了副产物2,3-丁二醇的产量，同时也促进了菌体的生长，提高产物1,3-PD的产量。

[0005] 在生物中PEP经过羧化形成四碳化合物草酰乙酸(oxaloacetate，简称OAA)，该途径能补充三羧酸循环(TCA循环)中减少的四碳化合物。但是有关该途径对克雷伯氏肺炎杆菌的生物学意义关注较少。pck基因负责编码“磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(简称PCK)”，在生物体内负责羧化PEP形成OAA，同时回收PEP中高能磷酸键的能量合成1分子的ATP。生物体内还有另外一个酶，即“磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(简称PPC)”，由基因ppc编码，PPC虽然也能羧化PEP形成OAA，但是PPC催化的反应不产生ATP。本发明发现，在克雷伯氏肺炎杆菌中同时存在着两种酶，两种酶都在PEP羧化过程中起作用，但是敲除pck基因阻断PCK酶活后，显著地降低了副产物2，3－丁二醇的生成，提高了菌体的生长和产物1，3－PD的合成。目前有关上述基因在克雷伯氏菌中的具体作用还没有详细研究，有关敲除pck基因对降低2,3-丁二醇、提高1 ,3-PD的产量的研究更是没有报道。经过检索国家知识产权局(www.sipo.gov.cn)、世界产权组织(www.wipo.int)、欧洲专利局(www.espacenet.com)和美国专利商标局(www.uspto.gov)也没有发现与本专利保护请求相同的公开专利或授权专利。

发明内容

[0006] 本申请的发明人在研究中发现，敲除编码PCK的基因pck，能降低副产物2,3-丁二醇的合成，提高1,3-PD的产量。所以，本发明目的在于提供一种更高效生产1，3－PD的方法，即：将克雷伯氏肺炎杆菌中的基因pck敲除，高效地生产1，3－PD。与现有的技术相比，利用本发明生产1，3－PD时，产生更少的副产物2，3－丁二醇，促进了菌体的生长，提高了1，3－PD的浓度。

[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：将克雷伯氏菌中的基因pck敲除,高效生产1，3－PD。本发明包括种子培养以及发酵罐发酵转化甘油生成1，3－PD。

[0008] 根据本发明，所述pck基因负责编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(EC 4.1.1.49)。该酶催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化形成草酰乙酸(OAA)，同时形成1分子的ATP。

[0009] 根据本发明，用于转化甘油生成1，3－PD的菌株为克雷伯氏肺炎杆菌(K.pneumoniae)。相比现有的转化甘油生产1，3－PD的方法，本发明的方法的优点是：副产物2，3－丁二醇少，菌体生长速度快、产物浓度高。

具体实施方式

[0010] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限定本发明的范围。

[0011] 实例中，斜面培养基的配方如下：

[0012] K2HPO43H2O 7g/L，(NH4)2SO4 1g/L，KH2PO4 2g/L，MgCl27H2O 0.1g/L，酵母膏7g/L，微量元素各0.3mL，调整pH 7.0，琼脂2g/L。

[0013] 种子培养基的配方如下：

[0014] K2HPO43H2O 7g/L，(NH4)2SO4 1g/L，KH2PO4 2g/L，MgCl27H2O 0.1g/L，酵母膏7g/L，微量元素各0.3mL，调整pH 7.0后加入NaCl调节渗透压。

[0015] 发酵罐培养基的配方如下：

[0016] KCl 0.75g/L，NaH2PO4 1.38g/L，(NH4)2SO4 5.35g/L，Na2SO4 0.28g/L，MgSO4 6H2O0.26g/L，柠檬酸0.42g/L，酵母粉2g/L，微量元素各0.3mL，调整pH 7.0。

[0017] 微量元素的配方如下：

[0018] ZnCl2 34.2g/L，FeCl36H2O 2.7g/L，MnCl24H2O 10g/L，CuCl22H2O 0.85g/L，CoCl22H2O 23.8g/L，H3BO3 0.31g/L，Na2MoO4 0.25g/L

[0019] 实施例中，测定发酵液中菌体干重的方法如下：

[0020] 取1.0mL发酵液稀释7￣10倍，以去离子水为对照，在721分光光度计上于620nm读取OD。取不同菌浓(即不同620nm吸光值)的菌液10mL，经离心收集菌体，并用去离子水洗涤二遍洗涤，将再次离心收集后的菌体于80℃烘箱中干燥至恒重。称量菌体作出菌体干重与OD620的标准曲线，并回归出关系式。以后菌体的干重根据测定的菌液的OD620值由标准曲线回归关系式计算得出。发酵液中1，3－PD与2，3－丁二醇的测定采用气相色谱法。产1，3－PD的菌株采用克雷伯氏肺炎杆菌CCTCC M 2014574，以下简称M 2014574。

[0021] 实施例1、敲除pck降低副产物2，3－BD的形成，促进了菌体生长和1，3－PD的合成[0022] 将M 2014574菌株于LB培养基(0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，1％NaCl，pH 7.0)中37℃培养过夜，抽提基因组。以抽提好的M 2014574基因组为模板，依据NCBI登录的克雷伯氏肺炎杆菌MGH 78578的基因组序列(LOCUS：NC＿009648)上的pck基因(locus＿tag：KPN＿03773)设计引物，PCR反应结束后胶回收目的条带并测序，测序后对目的条带进行基因分析，与MGH 78578上pck基因的相似度为100％。用同源重组办法，敲除M 2014574基因组的pck基因(1623bp)，获得的重组菌为M 2014574△pck。

[0023] 将M 2014574与M 2014574△pck分别接种于250ml的三角瓶中37℃厌好氧与微好氧培养12小时，培养基为种子培养基添加40g/L甘油。培养时三角瓶用8层纱布封口，摇床转述为50rpm。

[0024] 培养12小时后，测定发酵液中的菌体浓度、2，3－丁二醇以及1，3－PD的浓度，结果如表1所示。从表1中可以看出，敲除pck后显著降低副产物2，3－丁二醇的产量，但是促进了菌体的生长和1，3－PD的产量的下降。

[0025] 表1：敲除pck菌株摇瓶培养的结果

[0026]

[0027] 实施例2、敲除ppc基因对菌体生长，2，3－丁二醇以及1，3－PD的合成几乎没有影响

[0028] 将M 2014574菌株于LB培养基(0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，1％NaCl，pH 7.0)中37℃培养过夜，抽提基因组。以抽提好的M 2014574基因组为模板，依据NCBI登录的克雷伯氏肺炎杆菌MGH 78578的基因组序列(LOCUS：NC＿009648)上的ppc基因(locus＿tag：KPN＿04245)设计引物，PCR反应结束后胶回收目的条带并测序，测序后对目的条带进行基因分析，与MGH78578上ppc基因的相似度为100％。用同源重组办法，敲除M 2014574基因组的pck基因(2676bp)，获得的重组菌为M 2014574△ppc。

[0029] 将M 2014574与M 2014574△ppc分别接种于250ml的三角瓶中37℃厌好氧与微好氧培养12小时，培养基为种子培养基添加40g/L甘油。培养时三角瓶用8层纱布封口，摇床转述为50rpm。

[0030] 培养12小时后，测定发酵液中的菌体浓度、2，3－丁二醇以及1，3－PD的浓度，结果如表2所示。从表2中可以看出，敲除ppc后菌体生长和1，3－PD与2，3－丁二醇的合成几乎没有影响。因而虽然基因ppc编码的酶，即烯醇式丙酮酸羧化酶(EC 4.1.1.38)也能催化PEP形成OAA，但是本发明发现：只有敲除编码烯醇式丙酮酸羧化激酶(EC 4.1.1.49)的基因pck才能起到降低副产物2,3-丁二醇生产，促进产物1,3-PD合成的作用。

[0031] 表2：敲除ppc菌株摇瓶培养的结果

[0032]

[0033] 实施例3、敲除pck基因后在5L反应器上显著降低了副产物2，3－丁二醇的生成并促进了产物1，3－PD的合成

[0034] 5L反应器发酵实验如下：将菌株(M 2014574△pck、M 2014574)接入250ml的摇瓶(装液量50ml)进行种子培养20小时，后接入5L发酵罐中(发酵液装液量2L)，按照如下所示的工艺条件控制发酵过程。

[0035] 初始甘油浓度60g/L，发酵温度35℃；通气量1.0vvm；搅拌转速20rpm；在发酵过程中通过加入NaOH溶液控制pH值为5.5～7.5。在发酵的各个时期通过补入不同浓度甘油溶液控制甘油浓度在10～60g/L，发酵30小时结束。

[0036] 发酵结果表3所示。从表3中可以看出，在5L反应器上，同出发菌株M 2014574相比，敲除pck基因的菌株M 2014574△pck副产物2，3－丁二醇的产量显著降低，同时产物1，3－PD的产量显著提高。

[0037] 表3：两菌株发酵结果

[0038]