一种发酵生产头孢菌素C的方法

摘要

本发明提供了一种发酵生产头孢菌素C的方法，它包括如下步骤：a、取顶头孢霉菌，制备一级种子、二级种子；b、取步骤a制备的二级种子，接种至顶头孢霉菌发酵培养基中发酵，发酵50～115h后进行带放，并将带放料液进行再培养；c、取步骤b所得发酵液及带放培养液，分离纯化，即得头孢菌素C。本发明的发酵方法，可使头孢菌素C单批产量显著提高，大幅度降低成本，工业应用前景良好。

权利要求

1.一种发酵生产头孢菌素C的方法，其特征在于：它包括如下步骤：a、取保藏号为ATCC36225的顶头孢霉菌，制备一级种子、二级种子；

b、取步骤a制备的二级种子，按照18%接种量接种至顶头孢霉菌发酵培养基中发酵，发酵90h后进行带放，并将带放料液进行再培养；

c、取步骤b所得发酵液及带放培养液，分离纯化，即得头孢菌素C；

步骤b所述带放的次数为3次；首次带放体积为发酵液总量的10%；首次带放后，每隔12h再次带放；再次带放的体积为发酵液总量的12%；

步骤b所述将带放料液进行再培养的培养温度为25℃，pH为5.6；培养时间为50h；

步骤b中，在带放料液再培养过程中，全程补入葡萄糖溶液和植物油，工艺如下：葡萄糖溶液：连续流加4 11g/L·h；植物油：连续流加1 6g/L·h；

~ ~

其中，葡萄糖溶液的浓度为600-700g/L；

步骤b所述发酵培养基包括如下成分：玉米浆 50g，豆油 55mL，葡萄糖 8g，水解淀粉 

26g，甲硫氨酸 4g，花生粉 15g，消沫剂 2mL，碳酸钙 6g，硫酸镁 4g，硫酸铵 13g，硫酸亚铁 

0.09g，硫酸锰 0.03g，硫酸锌 0.025g，硫酸铜 0.025g；

步骤b所述发酵的条件为：发酵时间为130h；0～40h的温度为28℃，40～130h的温度为

24℃；pH为5.6；

步骤b中，在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖溶液和植物油，工艺如下：葡萄糖溶液：40 80h，连续流加4 11g/L·h；80 130h，连续流加 9 21g/L·h；

~ ~ ~ ~

植物油：50 90h，连续流加1 6g/L·h；90 130h，连续流加 3 8g/L·h；

~ ~ ~ ~

其中，葡萄糖溶液的浓度为600-700g/L。

说明书

一种发酵生产头孢菌素C的方法

技术领域

[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵生产头孢菌素C的方法。

背景技术

[0002] 头孢菌素C(英文全称为Cephalosporin C，缩写为CPC)，是由顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)产生的一类β-内酰胺抗生素，分子式为：C16H21N3O8S，分子量为415.4，结构式为：

[0003]

[0004] 头孢菌素C的结构与青霉素的结构相似，不同的是头孢菌素C的母核是7-氨基头孢烷酸(7-ACA)，而青霉素的母核则是6-氨基青霉烷酸，正是由于这种结构上的差异，使得头孢菌素C有着更强的稳定性。头孢菌素类C因其抗菌谱广和不良反应发生率低的特点，是临床上广泛使用的消炎、抗菌药物，也是生产各种注射用半合成头孢菌素的基本原料。

[0005] 目前国内头孢菌素C的发酵生产行业竞争激烈，如何提高头孢菌素C发酵产量,降低发酵成本，对提高企业效益、增强企业竞争力至关重要。头孢菌素C发酵生产多是在采取分批补料半连续发酵工艺的基础上，改良发酵菌种或调整发酵培养基，以期能够提高头孢菌素C产量。由于头孢菌素C发酵是一个受多种代谢调控反应控制的复杂的生物合成过程，对发酵工艺进行优化较为困难，目前报道较少。

[0006] 带放再培养工艺目前多见于青霉素发酵生产，针对头孢菌素C的带放再培养见甄成业的报道(甄成业等，头孢发酵带放再培养工艺的研究，煤炭与化工，2014,37:104-108)，该文献未提及何时带放，而且带放的料液再培养需要补充新鲜的基础料，得到的带放产量也较低，仍有待进一步改进。

[0007] 现有文献报道的发酵方法制备的头孢菌素C的产量较低，难以很好满足的满足工业化应用的要求。

发明内容

[0008] 为了解决以上问题，本发明的目的在于提供一种发酵生产头孢菌素C的方法。

[0009] 本发明提供了一种发酵生产头孢菌素C的方法，它包括如下步骤：

[0010] a、取顶头孢霉菌，制备一级种子、二级种子；

[0011] b、取步骤a制备的二级种子，接种至顶头孢霉菌发酵培养基中发酵，发酵50～115h后进行带放，并将带放料液进行再培养；

[0012] c、取步骤b所得发酵液及带放培养液，分离纯化，即得头孢菌素C。

[0013] 其中：步骤a所述顶头孢霉菌为保藏号为ATCC36225的顶头孢霉菌。

[0014] 其中：步骤b所述发酵培养基包括如下成分：玉米浆39～76重量份、花生粉9～21重量份、葡萄糖4～13重量份、水解淀粉19～31重量份、甲硫氨酸2～9重量份、植物油49～71体积份、消泡剂1.4～4体积份、硫酸镁1～6重量份、硫酸铵7～16重量份、硫酸亚铁0.04～0.1重量份、硫酸锰0.01～0.05重量份、硫酸锌0.01～0.05重量份、硫酸铜0.01～0.05重量份、碳酸钙4～11重量份；

[0015] 步骤b所述发酵的条件为：发酵时间为130h；0～40h的温度为28℃，40～130h的温度为24℃；pH为5.6。

[0016] 其中：步骤b所述带放的次数为3-4次。

[0017] 进一步地，首次带放的体积为发酵液总量的2-25％；首次带放后，每隔4-20h再次带放，再次带放的体积为发酵液总量的8-16％。

[0018] 其中，首次带放是在发酵50-100h后进行，带放体积为发酵液总量的2-15％；首次带放后，每隔8-20h再次带放；再次带放的体积为发酵液总量的12-16％；

[0019] 优选地，首次带放是在发酵80-95h后进行，带放体积为发酵液总量的8-12％；首次带放后，每隔10-14h再次带放；再次带放的体积为发酵液总量的12-14％。

[0020] 其中，首次带放是在发酵90h后进行，带放体积为发酵液总量的10％；首次带放后，每隔12h再次带放；再次带放的体积为发酵液总量的12％。

[0021] 其中：步骤b中，在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖溶液和植物油，工艺如下：

[0022] 葡萄糖溶液：40～80h，连续流加4～11g/L·h；80～130h，连续流加9～21g/L·h；

[0023] 植物油：50～90h，连续流加1～6g/L·h；90～130h，连续流加3～8g/L·h；

[0024] 其中，葡萄糖溶液的浓度为600-700g//L。

[0025] 其中：步骤b所述将带放料液进行再培养的培养温度为25℃，pH为5.6；

[0026] 培养时间为30～70h；优选时间为45～55h，进一步优选时间为50h。

[0027] 其中：步骤b中，在带放料液再培养过程中，全程补入葡萄糖溶液和植物油，工艺如下：

[0028] 葡萄糖溶液：连续流加4～11g/L·h；植物油：连续流加1～6g/L·h；

[0029] 其中，葡萄糖溶液的浓度为600-700g//L。

[0030] 带放是指补料发酵中，间歇放掉部分发酵液的操作过程。

[0031] 带放料液再培养是指对发酵中的带放料液收集，并在带放罐中进行二次发酵培养。

[0032] 本发明在特定的时间在头孢菌素C生产过程中进行带放，同时对带放发酵液再培养。本发明发酵生产头孢菌素C的方法，可使头孢菌素C单批产量显著提高，大幅度降低成本，工业应用前景良好。

[0033] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

[0034] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

[0035] 下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

[0036] 实施例1本发明发酵生产头孢菌素C的方法

[0037] 1、发酵方法

[0038] (1)制备一级种子

[0039] 取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)。按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。

[0040] 一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。

[0041] (2)制备二级种子

[0042] 取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。

[0043] 二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。

[0044] (3)发酵

[0045] 取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h 24℃，pH为5.6。

[0046] 发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌
0.025g，硫酸铜0.025g。

[0047] 发酵培养115h后进行带放，共带放3次；其中，初次带放体积为发酵液总量的25％，以后每隔4h带放一次，每次带放体积为发酵液总量的8％。

[0048] 带放料液带放至带放罐中继续培养，培养周期为30h，培养温度为25℃，pH为5.6。

[0049] 其中发酵罐容积为500m3，带放罐容积为156m3；

[0050] 培养期间，发酵罐和带放罐均分别进行补料：

[0051] 发酵罐是在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：

[0052] 葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；

[0053] 植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。

[0054] 带放罐是在培养全程补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：

[0055] 葡萄糖溶液：0～30h连续流加4～11g/L·h；

[0056] 植物油：0～30h连续流加1～6g/L·h。

[0057] 2、实验结果

[0058] 发酵结束后，取发酵罐发酵液和带放罐发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。

[0059] 效价检测:取1g发酵液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测效价。

[0060] 色谱条件如下：色谱柱：Hypersil ODS5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1mL/min，进样量：20uL。

[0061] 十亿为头孢菌素C的产量单位。

[0062] 十亿的计算方式为：十亿＝效价(μg/mL)*体积(m3)/1000

[0063] 发酵实验结果见表1：

[0064] 表1发酵实验结果

[0065] 带放时间(h) 带放间隔(h) 带放培养周期(h) 带放十亿 主罐总十亿 罐批产量(十亿)115 4 30 2026 9800 11826

[0066] 实施例2本发明发酵生产头孢菌素C的方法

[0067] 1、发酵方法

[0068] (1)制备一级种子

[0069] 取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)，按照1％的接种量接种至种子培养基中，在PH为7.0、27℃培养50h。

[0070] 一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。

[0071] (2)制备二级种子

[0072] 取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。

[0073] 二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。

[0074] (3)发酵

[0075] 取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h 24℃，pH为5.6。

[0076] 发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌
0.025g，硫酸铜0.025g。

[0077] 发酵培养110h后进行带放，初次带放体积为发酵液总量的20％，以后每隔6h带放一次，每次带放体积为发酵液总量的10％；共带放3次，放罐前8h停止带放；

[0078] 带放料液带放至带放罐中继续培养，培养周期为35h，培养温度为25℃，pH为5.6。

[0079] 其中发酵罐容积为500m3，带放罐容积为156m3；

[0080] 培养期间，发酵罐和带放罐均分别进行补料：

[0081] 发酵罐是在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：

[0082] 葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；

[0083] 植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。

[0084] 带放罐是在培养全程补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：

[0085] 葡萄糖溶液：0～35h连续流加4～11g/L·h；

[0086] 植物油：0～35h连续流加1～6g/L·h。

[0087] 2、实验结果

[0088] 发酵实验结果见表2：

[0089] 表2发酵实验结果

[0090] 带放时间(h) 带放间隔(h) 带放培养周期(h) 带放十亿 主罐总十亿 罐批产量(十亿)110 6 35 2200 9850 12050

[0091] 实施例3本发明发酵生产头孢菌素C的方法

[0092] 1、发酵方法

[0093] (1)制备一级种子

[0094] 取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)，按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。

[0095] 一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。

[0096] (2)制备二级种子

[0097] 取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。

[0098] 二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。

[0099] (3)发酵

[0100] 取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h 24℃，pH为5.6。

[0101] 发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌
0.025g，硫酸铜0.025g。

[0102] 发酵培养100h后进行带放，共带放3次；其中，初次带放体积为发酵液总量的15％，以后每隔8h带放一次，每次带放体积为发酵液总量的12％。

[0103] 带放料液带放至带放罐中继续培养，培养周期为40h，培养温度为25℃，pH为5.6。

[0104] 其中发酵罐容积为500m3，带放罐容积为156m3；

[0105] 培养期间，发酵罐和带放罐均分别进行补料：

[0106] 发酵罐是在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：

[0107] 葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；

[0108] 植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。

[0109] 带放罐是在培养全程补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：

[0110] 葡萄糖溶液：0～40h连续流加4～11g/L·h；

[0111] 植物油：0～40h连续流加1～6g/L·h。

[0112] 2、实验结果

[0113] 发酵实验结果见表3：

[0114] 表3发酵实验结果

[0115] 带放时间(h) 带放间隔(h) 带放培养周期(h) 带放总十亿 主罐总十亿 罐批产量(十亿)100 8 40 2374 9880 12254

[0116] 实施例4本发明发酵生产头孢菌素C的方法

[0117] 1、发酵方法

[0118] (1)制备一级种子

[0119] 取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)，按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。

[0120] 一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。

[0121] (2)制备二级种子

[0122] 取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。

[0123] 二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。

[0124] (3)发酵

[0125] 取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h 24℃，PH5.6。

[0126] 发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌
0.025g，硫酸铜0.025g。

[0127] 发酵培养95h后进行带放，共带放3次；其中，初次带放体积为发酵液总量的12％，以后每隔10h带放一次，每次带放体积为发酵液总量的14％。

[0128] 带放料液带放至带放罐中继续培养，培养周期为45h，培养温度为25℃，pH为5.6。

[0129] 其中发酵罐容积为500m3，带放罐容积为156m3；

[0130] 培养期间，发酵罐和带放罐均分别进行补料：

[0131] 发酵罐是在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：

[0132] 葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；

[0133] 植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。

[0134] 带放罐是在培养全程补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：

[0135] 葡萄糖溶液：0～45h连续流加4～11g/L·h；

[0136] 植物油：0～45h连续流加1～6g/L·h。

[0137] 2、实验结果

[0138] 发酵实验结果见表4：

[0139] 表4发酵实验结果

[0140] 带放时间(h) 带放间隔(h) 带放培养周期(h) 带放十亿 主罐总十亿 罐批产量(十亿)95 10 45 2729 9920 12649

[0141] 实施例5本发明发酵生产头孢菌素C的方法

[0142] 1、发酵方法

[0143] (1)制备一级种子

[0144] 取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)，按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。

[0145] 一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。

[0146] (2)制备二级种子

[0147] 取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。

[0148] 二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。

[0149] (3)发酵

[0150] 取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h 24℃，PH5.6。

[0151] 发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌
0.025g，硫酸铜0.025g。

[0152] 发酵培养90h后进行带放，共带放3次；其中，初次带放体积为发酵液总量的10％，以后每隔12h带放一次，每次带放体积为发酵液总量的12％。

[0153] 带放料液带放至带放罐中继续培养，培养周期为50h，培养温度为25℃，pH为5.6。

[0154] 其中发酵罐容积为500m3，带放罐容积为156m3；

[0155] 培养期间，发酵罐和带放罐均分别进行补料：

[0156] 发酵罐是在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：

[0157] 葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；

[0158] 植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。

[0159] 带放罐是在培养全程补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：

[0160] 葡萄糖溶液：0～50h连续流加4～11g/L·h；

[0161] 植物油：0～50h连续流加1～6g/L·h。

[0162] 2、实验结果

[0163] 发酵实验结果见表5：

[0164] 表5发酵实验结果

[0165] 带放时间(h) 带放间隔(h) 带放培养周期(h) 带放十亿 主罐总十亿 罐批产量(十亿)90 12 50 3200 9950 13150

[0166] 实施例6本发明发酵生产头孢菌素C的方法

[0167] 1、发酵方法

[0168] (1)制备一级种子

[0169] 取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)，按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。

[0170] 一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。

[0171] (2)制备二级种子

[0172] 取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。

[0173] 二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。

[0174] (3)发酵

[0175] 取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h 28℃40～130h 24℃，pH为5.6。

[0176] 发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌
0.025g，硫酸铜0.025g。

[0177] 发酵培养80h后进行带放，共带放3次；其中，初次带放体积为发酵液总量的8％，以后每隔14h带放一次，每次带放体积为发酵液总量的14％。

[0178] 带放料液带放至带放罐中继续培养，培养周期为55h，培养温度为25℃，pH为5.6。

[0179] 其中发酵罐容积为500m3，带放罐容积为156m3；

[0180] 培养期间，发酵罐和带放罐均分别进行补料：

[0181] 发酵罐是在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：

[0182] 葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；

[0183] 植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。

[0184] 带放罐是在培养全程补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：

[0185] 葡萄糖溶液：0～55h连续流加4～11g/L·h；

[0186] 植物油：0～55h连续流加1～6g/L·h。

[0187] 2、实验结果

[0188] 发酵实验结果见表6：

[0189] 表6发酵实验结果

[0190] 带放时间(h) 带放间隔(h) 带放培养周期(h) 带放十亿 主罐总十亿 罐批产量(十亿)80 14 55 2880 9965 12845

[0191] 实施例7本发明发酵生产头孢菌素C的方法

[0192] 1、发酵方法

[0193] (1)制备一级种子

[0194] 取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)，按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。

[0195] 一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。

[0196] (2)制备二级种子

[0197] 取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。

[0198] 二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。

[0199] (3)发酵

[0200] 取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h 24℃，pH为5.6。

[0201] 发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌
0.025g，硫酸铜0.025g。

[0202] 发酵培养70h后进行带放，共带放4次；其中，初次带放体积为发酵液总量的6％，以后每隔16h带放一次，每次带放体积为发酵液总量的16％；放罐前12h停止带放。

[0203] 带放料液带放至带放罐中继续培养，培养周期为60h，培养温度为25℃，pH为5.6。

[0204] 其中发酵罐容积为500m3，带放罐容积为156m3；

[0205] 培养期间，发酵罐和带放罐均分别进行补料：

[0206] 发酵罐是在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：

[0207] 葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；

[0208] 植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。

[0209] 带放罐是在培养全程补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：

[0210] 葡萄糖溶液：0～60h连续流加4～11g/L·h；

[0211] 植物油：0～60h连续流加1～6g/L·h。

[0212] 2、实验结果

[0213] 发酵实验结果见表7：

[0214] 表7发酵实验结果

[0215] 带放时间(h) 带放间隔(h) 带放培养周期(h) 带放十亿 主罐总十亿 罐批产量(十亿)70 16 60 2535 9952 12487

[0216] 实施例8本发明发酵生产头孢菌素C的方法

[0217] 1、发酵方法

[0218] (1)制备一级种子

[0219] 取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)，按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。

[0220] 一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。

[0221] (2)制备二级种子

[0222] 取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。

[0223] 二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。

[0224] (3)发酵

[0225] 取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h 24℃，pH为5.6。

[0226] 发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌
0.025g，硫酸铜0.025g。

[0227] 发酵培养60h后进行带放，共带放4次；其中，初次带放体积为发酵液总量的4％，以后每隔18h带放一次，每次带放体积为发酵液总量的10％。

[0228] 带放料液带放至带放罐中继续培养，培养周期为65h，培养温度为25℃，pH为5.6。

[0229] 其中发酵罐容积为500m3，带放罐容积为156m3；

[0230] 培养期间，发酵罐和带放罐均分别进行补料：

[0231] 发酵罐是在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：

[0232] 葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；

[0233] 植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。

[0234] 带放罐是在培养全程补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：

[0235] 葡萄糖溶液：0～65h连续流加4～11g/L·h；

[0236] 植物油：0～65h连续流加1～6g/L·h。

[0237] 2、实验结果

[0238] 发酵实验结果见表8：

[0239] 表8发酵实验结果

[0240] 带放时间(h) 带放间隔(h) 带放培养周期(h) 带放十亿 主罐总十亿 罐批产量(十亿)60 18 65 2425 9932 12357

[0241] 实施例9本发明发酵生产头孢菌素C的方法

[0242] 1、发酵方法

[0243] (1)制备一级种子

[0244] 取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)，按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。

[0245] 一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。

[0246] (2)制备二级种子

[0247] 取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。

[0248] 二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。

[0249] (3)发酵

[0250] 取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h 24℃，pH为5.6。

[0251] 发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌
0.025g，硫酸铜0.025g。

[0252] 发酵培养50h后进行带放，共带放4次；其中，初次带放体积为发酵液总量的2％，以后每隔20h带放一次，每次带放体积为发酵液总量的12％。

[0253] 带放料液带放至带放罐中继续培养，培养周期为70h，培养温度为25℃，pH为5.6。

[0254] 其中发酵罐容积为500m3，带放罐容积为156m3；

[0255] 培养期间，发酵罐和带放罐均分别进行补料：

[0256] 发酵罐是在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：

[0257] 葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；

[0258] 植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。

[0259] 带放罐是在培养全程补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：

[0260] 葡萄糖溶液：0～70h连续流加4～11g/L·h；

[0261] 植物油：0～70h连续流加1～6g/L·h。

[0262] 2、实验结果

[0263] 发酵实验结果见表9：

[0264] 表9发酵实验结果

[0265] 带放时间(h) 带放间隔(h) 带放培养周期(h) 带放十亿 主罐总十亿 罐批产量(十亿)50 20 70 2300 9900 12200

[0266] 对比例1现有方法制备头孢菌素C

[0267] 1、发酵方法

[0268] (1)制备一级种子

[0269] 取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)，按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。

[0270] 一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。

[0271] (2)制备二级种子

[0272] 取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。

[0273] 二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。

[0274] (4)发酵

[0275] 取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h 24℃，pH为5.6。

[0276] 发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌
0.025g，硫酸铜0.025g。

[0277] 培养期间，发酵罐进行补料：在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：

[0278] 葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；

[0279] 植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。

[0280] 2、实验结果

[0281] 发酵实验结果见表10：

[0282] 表10发酵实验结果

[0283] 带放时间(h) 带放量 带放间隔(h) 带放培养周期(h) 带放十亿 主罐总十亿 罐批产量(十亿)0 0 0 0 0 10000 10000

[0284] 将本发明方法(实施例1～9)及现有方法(对比例1)的参数及发酵结果进行归纳，见表11。

[0285] 表11发酵结果比较

[0286] 实施例 带放时间(h) 初次带放量 带放间隔(h) 带放培养周期(h) 带放总十亿 罐批产量(十亿)1 115 25％ 4 30 2026 11826
2 110 20％ 6 35 2200 12050
3 100 15％ 8 40 2374 12254
4 95 12％ 10 45 2729 12712
5 90 10％ 12 50 3200 13150
6 80 8％ 14 55 2880 12845
7 70 6％ 16 60 2535 12487
8 60 4％ 18 65 2425 12357
9 50 2％ 20 70 2300 12200
现有方法 0 0 0 0 0 10000

[0287] 由表11可以看出：与现有方法相比，使用本发明方法发酵头孢菌素C时，可使单罐头孢菌素C的产量提高1826个十亿之上，产量提高18％以上，头孢菌素C产量大大增加。

[0288] 在优选范围内(实施例4～6记载的工艺范围)，单罐头孢菌素C的产量更高，均在12712个十亿之上；在最佳工艺参数下(实施例5的工艺参数)，单罐头孢菌素C的产量高达
13150个十亿，比现有方法的产量提高达31.5％。

[0289] 目前公司头孢菌素C发酵罐容积为500m3，通过带放工艺可以显著提高头孢菌素C的产量，单罐产量提高达31.5％，单罐批直接多为公司创造50万经济效益。

[0290] 因此，综合考虑生产时间及发酵收益，实施例5的工艺更适合于工业化生产，工业应用前景良好。

[0291] 综上，本发明方法通过特定的带放工艺，可使头孢菌素C单罐批产量显著提高，大幅度降低生产成本，具有良好的应用前景。