快速测定水和水产品中孔雀石绿和结晶紫的试剂盒及方法

摘要

一种快速测定水和水产品中孔雀石绿和结晶紫的试剂盒及方法，试剂盒由石英砂、硼氢化钾和第三提取试剂组成。快速测定时：用硼氢化钾配制第四提取试剂；待检测样品中加入色谱纯乙腈、石英砂、第三和第四提取试剂，涡旋，洗涤沉淀物，合并洗液和上清液，旋转蒸发，过滤离心后下层液，高效液相色谱测定，得第一色谱图；配制六个不同质量体积浓度的孔雀石绿及结晶紫混合标准溶液，高效液相色谱测定，得第二色谱图；绘制孔雀石绿及结晶紫标准溶液的工作曲线；计算待检测样品中孔雀石绿及结晶紫的含量。该试剂盒制造成本低，对孔雀石绿及结晶紫的吸附性强，对油脂、蛋白质、淀粉等大分子杂质不产生吸附，可以有效的净化样品，增大实验结果的回收率。

权利要求

1.一种快速测定水和水产品中孔雀石绿和结晶紫的试剂盒，其特征在于，由第一提取试剂、第二提取试剂和第三提取试剂组成，第一提取试剂为石英砂，第二提取试剂为硼氢化钾；第三提取试剂这样制得：分别称取1-苄基-3-乙基苯并咪唑六氟磷酸盐5.00g和1-丁基-

3-甲基咪唑六氟磷酸盐45.00g，加入100mL乙腈，溶解1-苄基-3-乙基苯并咪唑六氟磷酸盐和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，70℃旋转蒸发60min，去除乙腈，得第三提取试剂。

2.一种利用权利要求1所述试剂盒快速测定水和水产品中孔雀石绿和结晶紫的方法，其特征在于，该方法具体为：

步骤1：称取0.54g第二提取试剂，溶于50mL超纯水中，得第四提取试剂；

步骤2：称取5.00g待检测样品于离心管中，加入20mL色谱纯乙腈、1g第一提取试剂、

10mL第四提取试剂和1.00mL第三提取试剂，涡旋1min，10000rpm离心3min，得上清液和沉淀物，用5mL乙腈洗涤该沉淀物，将洗涤后液与该上清液合并，温度50℃旋转蒸发5min，至出现明显分层，于温度4℃、转速10000rpm离心3 min，取离心后下层液过滤；然后进行高效液相色谱测定，色谱条件：色谱柱：C18 4.6×250 mm分析柱；流动相：pH=3.5乙酸铵缓冲液+乙腈=20+80；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；激发波长：265 nm，发射波长：360nm；

得第一色谱图；

步骤3：以第三提取试剂为溶剂，配制六个不同质量体积浓度的孔雀石绿及结晶紫混合标准溶液，该六个标准溶液中孔雀石绿的质量体积浓度依次分别为：0.10ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；该六个标准溶液中结晶紫的质量体积浓度依次分别为：0.10ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、

1000.00ng/mL；将孔雀石绿及结晶紫系列混合标准溶液于附带荧光检测器的高效液相色谱仪中测定，进行高效液相色谱测定时的色谱柱：C18 4.6×250 mm分析柱；流动相：pH=3.5乙酸铵缓冲液+乙腈=20+80；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；激发波长：265 nm，发射波长：360nm；得第二色谱图，由该第二色谱图得到系列标准溶液中孔雀石绿及结晶紫在该色谱条件下的出生时间和不同浓度的峰面积，并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制孔雀石绿及结晶紫标准溶液的工作曲线；

步骤4：根据步骤2测得的样品制备液的峰面积值，从步骤3绘制的系列孔雀石绿及结晶紫标准溶液的工作曲线上找到峰面积值对应的孔雀石绿及结晶紫的含量，按下式计算待测水及水产品中孔雀石绿及结晶紫的含量X：式中：X表示试样中的孔雀石绿或结晶紫含量，单位ng/g；C1表示步骤2测得的样品制备液的峰面积所对应的孔雀石绿或结晶紫的含量，单位ng/mL；C0表示试样空白液中孔雀石绿或结晶紫的含量，单位ng/mL；m表示试样质量，单位g；V表示步骤2中第三提取试剂的体积，单位mL。

3.根据权利要求2所述的快速测定水和水产品中孔雀石绿和结晶紫的方法，其特征在于，所述步骤2中，过滤离心后下层液时，采用孔直径为0.45μm的滤膜进行过滤。

说明书

快速测定水和水产品中孔雀石绿和结晶紫的试剂盒及方法

技术领域

[0001] 本发明属于食品安全检测技术领域，涉及一种用于快速测定水和水产品中孔雀石绿和结晶紫的试剂盒；本发明还涉及一种用该试剂盒快速测定水和水产品中孔雀石绿和结晶紫的方法。

背景技术

[0002] 孔雀石绿、结晶紫是一种N-甲基三苯甲烷类染料，由于其抗菌效果好、价格便宜、容易获得，曾被广泛用于防治水产动物的真菌病、细菌病和寄生虫病等。由于孔雀石绿在生物体内的代谢产物无色孔雀石绿，而研究发现孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物无色孔雀石绿、结晶紫具有高毒素、高残留、高致癌和高致畸、致突变等副作用，尤其隐色孔雀石绿、结晶紫不溶于水，难于排出体外，其残留毒性比孔雀石绿更强。我国于2002年5月将孔雀石绿、结晶紫列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，禁止用于所有食品动物。目前，检测孔雀石绿的方法有表面增强拉曼光谱法（SERS）、紫外光谱法、荧光光谱法、量子点荧光淬灭法、液相色谱-质谱联用法（LC—Ms）、高效液相色谱法（HPLC）。液相色谱法和液相色谱-质谱串连法自动化程度高，仪器重复性好，被广泛应用。但实际试验过程中需要对样品进行比较繁琐的样品前处理提取工作，实验过程耗时长，稳定性不好，回收率不高。因此建立一种简单，快捷，稳定，回收率高的样品前处理提取方法是很有必要的。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种样品处理时间短、检测成本低、无需过固相萃取小柱净化的快速测定水和水产品中孔雀石绿和结晶紫的试剂盒。

[0004] 本发明的另一个目的是提供一种用上述试剂盒快速测定水和水产品中孔雀石绿和结晶紫含量的方法。

[0005] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种快速测定水和水产品中孔雀石绿和结晶紫的试剂盒，由第一提取试剂、第二提取试剂和第三提取试剂组成，第一提取试剂为石英砂，第二提取试剂为硼氢化钾；第三提取试剂这样制得：分别称取1-苄基-3-乙基苯并咪唑六氟磷酸盐5.00g和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐45.00g，加入100mL乙腈，溶解1-苄基-3-乙基苯并咪唑六氟磷酸盐和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，70℃旋转蒸发
60min，去除乙腈，得第三提取试剂。

[0006] 本发明所采用的另一个技术方案是：一种利用上述试剂盒快速测定水和水产品中孔雀石绿和结晶紫的方法，具体为：

[0007] 步骤1：称取0.54g第二提取试剂，溶于50mL超纯水中，得第四提取试剂；

[0008] 步骤2：称取5.00g待检测样品于离心管中，加入20mL色谱纯乙腈、1g第一提取试剂、10mL第四提取试剂和1.00mL第三提取试剂，涡旋1min，10000rpm离心3min，得上清液和沉淀物，用5mL乙腈洗涤该沉淀物，将洗涤后液与该上清液合并，温度50℃旋转蒸发5min，至出现明显分层，于温度4℃、转速10000rpm离心3 min，取离心后下层液过滤；然后进行高效液相色谱测定，得第一色谱图；

[0009] 步骤3：以第三提取试剂为溶剂，配制六个不同质量体积浓度的孔雀石绿及结晶紫混合标准溶液，该六个标准溶液中孔雀石绿的质量体积浓度依次分别为：0.10ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；该六个标准溶液中结晶紫的质量体积浓度依次分别为：0.10ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；将孔雀石绿及结晶紫系列混合标准溶液于附带荧光检测器的高效液相色谱仪中测定，得第二色谱图，由该第二色谱图得到系列标准溶液中孔雀石绿及结晶紫在该色谱条件下的出生时间和不同浓度的峰面积。并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制孔雀石绿及结晶紫标准溶液的工作曲线；

[0010] 步骤4：根据步骤2测得的样品制备液的峰面积值，从步骤3绘制的系列孔雀石绿及结晶紫标准溶液的工作曲线上找到峰面积值对应的孔雀石绿及结晶紫的含量，按下式计算待测水及水产品中孔雀石绿及结晶紫的含量X：

[0011]

[0012] 式中：X表示试样中的孔雀石绿或结晶紫含量，单位ng/g；C1表示步骤2测得的样品制备液的峰面积所对应的孔雀石绿或结晶紫的含量，单位ng/mL；C0表示试样空白液中孔雀石绿或结晶紫的含量，单位ng/mL；m表示试样质量，单位g；V表示步骤2中第三提取试剂的体积，单位mL。

[0013] 本发明试剂盒制造成本低，对孔雀石绿及结晶紫的吸附性强，对油脂、蛋白质、淀粉等大分子杂质不产生吸附，可以有效的净化样品。实验过程中所有试剂均为液体，与被测样品接触面积远远大于传统固相萃取小柱，利于提高萃取富集效率，增大实验结果的回收率。试剂盒中用于定量的提取试剂具有蒸汽压低，稳定，不易挥发等特点，有利于萃取过程和检测过程的稳定性及重复性。

附图说明

[0014] 图1是采用本发明快速测定方法检测水和水产品中孔雀石绿和结晶紫时，对待测样品处理后用高效液相色谱仪测定得到的色谱图。

[0015] 图2是采用本发明快速测定方法检测水和水产品中孔雀石绿和结晶紫时，对系列标准混合溶液进行高效液相色谱测定得到的色谱图。

具体实施方式

[0016] 下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

[0017] 本发明提供了一种用于快速测定水和水产品中孔雀石绿和结晶紫的试剂盒，由第一提取试剂、第二提取试剂和第三提取试剂组成，第一提取试剂为石英砂，第二提取试剂为硼氢化钾；

[0018] 第三提取试剂这样制得：分别称取1-苄基-3-乙基苯并咪唑六氟磷酸盐5.00g和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐45.00g，置于鸡心瓶中，加入100mL乙腈，溶解1-苄基-3-乙基苯并咪唑六氟磷酸盐和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，70℃旋转蒸发60min，去除乙腈，得到无色透明粘稠的液体，该液体即为第三提取试剂。

[0019] 第一提取试剂为石英砂。在提取过程中加入有机试剂乙腈，乙腈使蛋白质变性，容易使样品聚沉在一起，提取不完全。将石英砂加入固体样品中，在涡旋过程中石英砂可以将聚沉固体样品磨碎，让提取更充分。第二提取剂为硼氢化钾。加入硼氢化钾，将样品中的孔雀石绿和结晶紫还原为有荧光性的物质便于检测。第三提取试剂为苄基苯并咪唑疏水离子液体与咪唑疏水离子液体按照一定的比例混合得到的复合型离子液体。根据所提取目标物质孔雀石绿和结晶紫的结构，和相似相容原理，自主合成了与目标物结构相似的疏水性离子液体1-苄基-3-乙基苯并咪唑六氟磷酸盐，该离子液体对孔雀石绿和结晶紫有良好的吸附作用。但是该离子液体常温为固体，不能被应用到液-液分散萃取过程中，所以选用吸附性一般的疏水离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐作为1-苄基-3-乙基苯并咪唑六氟磷酸盐的载体，两种离子液体按照比例混合后呈现透明粘稠液体状，可以被用在液-液分散萃取过程中。而且混合比例大于1︰9，得到的复合离子液体过去粘稠，不方便使用；混合比例小于1︰9，萃取回收率偏小，达不到试验要求。

[0020] 用上述快速测定试剂盒能快速提取水及水产品中孔雀石绿及结晶紫，通过液相色谱荧光检测器，检测其含量。具体测定步骤为：

[0021] 步骤1：称取0.54g第二提取试剂，溶于50mL超纯水中，得到第四提取试剂，现用现配；

[0022] 步骤2：称取5.00g待检测样品于离心管中，加入20mL色谱纯乙腈、1g第一提取试剂、10mL第四提取试剂和1.00mL第三提取试剂，涡旋1min，10000rpm离心3min，得上清液和沉淀物，将该上清液转入鸡心瓶中，用5mL乙腈洗涤该沉淀物，将洗涤后液合并到盛放上清液的鸡心瓶中，50℃旋转蒸发5min，至出现明显分层，将鸡心瓶中液体于温度4℃、转速10000rpm离心3 min，取离心后下层液过滤孔直径为0.45μm的滤膜；然后进行高效液相色谱仪测定。色谱条件：色谱柱：C18 4.6×250 mm分析柱；流动相：pH=3.5乙酸铵缓冲液（v）+乙腈（v）=20+80；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；激发波长：265 nm，发射波长：
360nm；得图1所示的第一色谱图；

[0023] 步骤3：以第三提取试剂为溶剂，配制六个不同质量体积浓度的孔雀石绿及结晶紫混合标准溶液，该六个标准溶液中孔雀石绿的质量体积浓度分别为：0.10ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；该六个标准溶液中结晶紫的质量体积浓度分别为：0.10ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；将孔雀石绿及结晶紫系列混合标准溶液于附带荧光检测器的高效液相色谱仪中测定。色谱柱：C18 4.6×250 mm分析柱；流动相：pH=3.5乙酸铵缓冲液（v）+乙腈（v）=20+
80；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；激发波长：265 nm，发射波长：360nm。得图2所示的第二色谱图，由该第二色谱图得到系列标准溶液中孔雀石绿及结晶紫在该色谱条件下的出生时间和不同浓度的峰面积。并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制孔雀石绿及结晶紫标准溶液的工作曲线；该标准曲线的线性范围、回归方程、相关系数、检出限（3倍信噪比）、RSD%（n=10）值见表1：

[0024] 表1标准曲线的线性范围、回归方程、相关系数、检出限、RSD%

[0025]

[0026] 步骤4：根据步骤2测得的样品制备液的峰面积值，从步骤3绘制的系列孔雀石绿及结晶紫标准溶液的工作曲线上找到峰面积值对应的孔雀石绿及结晶紫的含量，按下式计算待测水及水产品中孔雀石绿及结晶紫的含量X：

[0027]

[0028] 式中：X表示试样中的孔雀石绿或结晶紫含量，单位ng/g；C1表示步骤2测得的样品制备液的峰面积所对应的孔雀石绿或结晶紫的含量，单位ng/mL；C0表示试样空白液中孔雀石绿或结晶紫的含量，单位ng/mL；m表示试样质量，单位g；V表示步骤2中第三提取试剂的体积，单位mL。

[0029] 由于第四提取试剂是硼氢化钾水溶液，其目的是为了将目标物还原为有荧光性的物质，加入的体积是非定量的，而第三提取试剂需要准确加入1.00mL；而且，在旋转蒸发后溶液会分层，下层为疏水性的复合离子液体，其体积为1.00mL，故上述公式中使用了步骤2中第三提取试剂的体积。

[0030] 下面通过本发明快速测定方法与GB/T20361-2006和现有的文献1～3公开的测定方法进行比较，突出该快速提取试剂盒在孔雀石绿和结晶紫的检测中的优越性：

[0031] 1）实验耗时对比：

[0032] 国标GB/T20361-2006规定的方法和现有的文献公开的方法中对孔雀石绿和结晶紫的样品前处理的提取过程都需要加入盐酸羟胺，以防止目标物变质，加入对甲苯磺酸增加溶剂对目标物的提取效率，并且要控制溶液的pH值，反复萃取，最后经过固相萃取小柱净化等一系列的操作。操作耗时60～120min。而用本发明快速提取试剂盒对样品进行前处理，耗时14min。而且因为操作步骤少，不会出现现有的文献公开的方法中，二氯甲烷萃取层忽上忽下的现象。

[0033] 2）稳定性实验对比：

[0034] 按国标GB/T20361-2006规定的方法和现有的文献1～3公开的方法的RSD%均大于5%。而本发明快速测定方法的RSD%为3%左右。说明本发明快速测定方法具有很好的重现性和稳定性。这是因为现有提取方法基本为固相萃取方法，固相萃取本身的缺点是操作繁琐，而且两根固相萃取小柱的填料和柱效也不是完全相同的，所以导致实验结果重现性不好。
而本发明的萃取剂为性质均匀的液体，切操作简单，步骤少，所以稳定性重现性好。

[0035] 3）回收率对比：

[0036] 文献[1]提供的方法的孔雀石绿和结晶紫的回收率为82.5%～105%，文献 [2] 提供的方法的孔雀石绿和结晶紫的回收率为78.3～100．9%，文献[3]提供的方法的孔雀石绿和结晶紫的回收率85.7～89.7%，国标方法的孔雀石绿和结晶紫的回收率为75～85%，可见，用现有方法测定水和水产品中孔雀石绿及结晶紫时，孔雀石绿和结晶紫的回收率不够稳定，这也是固相萃取柱的弊端。应用本发明快速测定方法时，孔雀石绿回收率为90.9～93.6%，结晶紫回收率为91.5～93.8%，可见本发明快速测定方法的回收率高，而且稳定。这是因为现有的固相萃取方法，萃取调料为C18，C18的结构与孔雀石绿及结晶紫的结构并不相似，所以萃取效果并不良好。而1-苄基-3-乙基苯并咪唑六氟磷酸盐的结构与孔雀石绿及结晶紫的结构非常相似，都有共轭大π键，可以使萃取效果更完全，所以本快速测定方法完全利用高效的萃取技术，更稳定，更快捷。
实施例

[0037] 分别称取1-苄基-3-乙基苯并咪唑六氟磷酸盐5.00g和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐45.00g，置于鸡心瓶中，加入100mL乙腈，溶解1-苄基-3-乙基苯并咪唑六氟磷酸盐和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，70℃旋转蒸发60min，去除乙腈，得到无色透明粘稠的液体，该液体即为第三提取试剂。用石英砂（第一提取试剂）、硼氢化钾（第二提取试剂）和该第三提取试剂组成用于快速测定水和水产品中孔雀石绿和结晶紫的试剂盒。使用该试剂盒时：称取0.54g硼氢化钾，溶于50mL超纯水中，得到第四提取试剂。称取5.00g待检测样品于离心管中，加入20mL色谱纯乙腈、1g石英砂、10mL第四提取试剂和1.00mL第三提取试剂，涡旋
1min，10000rpm离心3min，得上清液和沉淀物，将该上清液转入鸡心瓶中，用5mL乙腈洗涤该沉淀物，将洗涤后液合并到盛放上清液的鸡心瓶中，50℃旋转蒸发5min，至出现明显分层，将鸡心瓶中液体于温度4℃、转速10000rpm离心3 min，取离心后下层液过滤孔直径为0.45μm的滤膜；然后进行高效液相色谱仪测定。色谱条件：色谱柱：C18 4.6×250 mm分析柱；流动相：pH=3.5乙酸铵缓冲液（v）+乙腈（v）=20+80；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；
激发波长：265 nm，发射波长：360nm；得第一色谱图。以第三提取试剂为溶剂，配制六个不同质量体积浓度的孔雀石绿及结晶紫混合标准溶液，该六个标准溶液中孔雀石绿的质量体积浓度分别为：0.10ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；
该六个标准溶液中结晶紫的质量体积浓度分别为：0.10ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、
50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；将孔雀石绿及结晶紫系列混合标准溶液于附带荧光检测器的高效液相色谱仪中测定。色谱柱：C18 4.6×250 mm分析柱；流动相：pH=3.5乙酸铵缓冲液（v）+乙腈（v）=20+80；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；激发波长：
265 nm，发射波长：360nm。得图2所示的第二色谱图，由该第二色谱图得到系列标准溶液中孔雀石绿及结晶紫在该色谱条件下的出生时间和不同浓度的峰面积。并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制孔雀石绿及结晶紫标准溶液的工作曲线；根据测得的样品制备液的峰面积值，从绘制的系列孔雀石绿及结晶紫标准溶液的工作曲线上找到峰面积值对应的孔雀石绿及结晶紫的含量，按下式计算待测水及水产品中孔雀石绿及结晶紫的含量X：

[0038]

[0039] 式中：X表示试样中的孔雀石绿或结晶紫含量，单位ng/g；C1表示测得的样品制备液的峰面积所对应的孔雀石绿或结晶紫的含量，单位ng/mL；C0表示试样空白液中孔雀石绿或结晶紫的含量，单位ng/mL；m表示试样质量，单位g；V表示所用第三提取试剂的体积，单位mL。

[0040] 参考文献：

[0041] 文献[1] 张健玲、张勇清、胡子谦、闫剑勇，水产品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留量测定的液相色谱法[J] 中国卫生检驻杂志2006 年2月 第16卷 第2期 。

[0042] 文献[2] 罗瑞峰、罗小玲、马小宁，水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物检测方法的探讨[J] 化学分析计量 2011年，第20卷，第3期。

[0043] 文献[3] 李永夫、高华鹏、姚芳、殷居易，高效液相色谱法检测鳗鱼中孔雀石绿及其代谢物残留[J] 安徽农业科学. 2009.37（1）：31-33。。