一种抑制新生血管的多肽、含有该多肽的药物及其应用

摘要

本发明公开了一种抑制新生血管的多肽，属于生物医药技术领域，该多肽具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，还公开了上述多肽的制备方法，以及含有该多肽的药物组合物，以及该多肽的应用；本发明的抑制新生血管多肽是一种具有特异生物学活性和生物相容性的小分子抑制剂，可以经无创或微创的给药途径透过各种眼组织屏障，从而可以提高眼局部的生物利用度，降低给药剂量，减少局部和全身的副作用，安全性高，而且，本发明提供的多肽的生产成本，比现有大蛋白分子抑制剂的成本降低90%以上，具有极好的临床应用价值，能够显著减轻用药者的经济负担。

权利要求

1.分子量为1-2Kd的SEQ ID NO : 1所示的氨基酸序列的多肽或其药学上可接受的盐在制备用于治疗角膜病理性新生血管疾病的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，将所述多肽或其药学上可接受的盐制成针剂、眼药水、眼用凝胶或眼药膏。

说明书

一种抑制新生血管的多肽、含有该多肽的药物及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种新的抑制新生血管的多肽、含有所述多肽的药物组合物及其应用。

背景技术

[0002] 新生血管的形成包括现存血管的扩张、血管通透性的增加、血管周围基质的降解、内皮细胞的激活增殖、迁移以及新的毛细血管样管腔的形成等过程。约2/3 的眼部致盲性疾病均与病理性新生血管有关，例如：单纯疱疹性角膜基质炎引起的角膜新生血管, 年龄相关性黄斑变性中的脉络膜新生血管，以及糖尿病视网膜病变或早产儿视网膜病变中的视网膜新生血管等。目前临床上，对于眼部病理性新生血管常规运用激光光凝、光动力学疗法(Photodynamic therapy,PDT) 以及经瞳孔温热疗法(Thermal transpupillary therapy,TTT) 等进行治疗，这些治疗手段不仅对局部组织易造成破坏，其远期疗效也并不令人满意。因此，近年来人们不断尝试开发治疗眼部病理性新生血管更有效的方法。

[0003] 由于眼部存在血-房水屏障和血-视网膜屏障，导致全身给药无法在眼组织局部达到足够的药物浓度；局部给药（如玻璃体腔注射），理论上大分子较小分子更难穿透视网膜作用于视网膜和脉络膜新生血管；眼表给药，药物必须要先后穿透亲脂性的角膜上皮细胞紧密连接和亲水性的角膜基质，因此只有具备适当脂溶性、低分子量或能与眼表组织内的转运体( 如：氨基酸转运体、寡肽转运体等) 结合的药物才能到达前房发挥作用。基于上述原因，眼科用药的生物利用度很低；若要提高眼科药物的药效，通常的做法是加大给药浓度。而用于治疗肿瘤新生血管的化合物毒副作用较为明显，无法通过在全身和局部提高给药剂量达到药效目的。另外，分子量较大的外源性蛋白质同时也是敏感的异物源, 可对眼部组织造成免疫损伤。虽然已有一系列相对安全的内源性血管新生抑制剂被先后发现，如由纤溶酶原Kringle结构域1-4(plasminogen  Kringle1-4)组成的血管抑素(angiostatin)，可明显抑制血管依赖性肿瘤的生长，但其分子量较大，同时空间构象复杂，故其制备工艺繁复，纯化过程难度较大，使得药物杂质残留成为最大问题。

[0004] 正是由于上述种种条件的限制，目前用于治疗眼部新生血管的药物十分有限，比如重组抗人VEGF单克隆抗体bevacizumab (Avastin)、重组抗人VEGF 单克隆抗体片段ranibizumab (Lucentis) 等，但它们价格高昂，并且需反复经玻璃体腔注射给药，可使患者面临血管栓塞等风险。

[0005] 而且，上述的单克隆抗体/片段属于大分子蛋白，大分子蛋白的表达通常涉及到真核细胞的转化、表达和纯化，需要进行细胞培养、收获等步骤，工艺流程繁琐，生产规模越大，生产的可控性越差，产物的不确定性越高，且大分子蛋白整个流程的成本较高。相对于大分子蛋白，20个氨基酸以下的多肽分子的大规模生产通常采用固相合成的方法进行，属于化学合成，其工艺路线成熟、结果可控、原材料成本较低。

[0006] 鉴于多肽分子较大分子药物的显著优势，对血管抑制多肽的研究一直较为热门，已有非常多关于通过不同技术手段筛选血管抑制多肽的报道， 但实际能进入临床开发的则非常少。

[0007] 由此可见，寻找具有特异生物学活性和生物相容性的小分子抑制剂，经无创或微创的给药途径透过各种眼组织屏障，提高眼局部的生物利用度，降低给药剂量，减少局部和全身的副作用，对新生血管性眼病的临床治疗具有十分重要的意义。因此，本领域迫切需要开发一种适于眼组织的有效安全的小分子新生血管抑制剂。

发明内容

[0008] 本发明的目的之一，就在于提供一种新的抑制新生血管的多肽，以解决上述问题。

[0009] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种抑制新生血管的多肽，具有如SEQ ID NO.: 1所示的氨基酸序列。

[0010] SEQ ID NO.: 1 His Arg His Thr Lys Gln Arg His Thr Ala Leu His

[0011] 本申请的发明人经过大量实验和深入研究，利用噬菌体展示技术进行筛选，制备出了1种分子量仅为1-2Kd的具有12个氨基酸的多肽P1。具体而言，本申请的发明人应用噬菌体展示技术，筛选到1种可以抑制VEGF与VEGF受体结合的小分子多肽P1，采用固相合成法合成，分离纯化得到高纯度的P1多肽，并使用HPLC及MS对其进行纯度测定和序列鉴定，再经过VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞增殖模型、鸡胚尿囊膜血管模型，以及大鼠角膜缝线模型筛选，获得了这种新的具有治疗血管新生功能的小分子多肽。

[0012] 本发明的多肽分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；安全性高，对生物组织毒副作用小；眼局部用药生物利用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用。

[0013] 血管内皮生长因子（VEGF）是一个关键的血管生成因子，它通过在细胞表面上的受体来调控血管生成的各个步骤。血管内皮生长因子患有血管生成相关病理性疾病的患者中的表达明显上调。因此，抑制VEGF的调控作用已经被广泛应用于某些癌症和眼内新生血管性疾病的治疗中。事实上，大量的抗VEGF药物已经被开发并上市。此外，许多临床试验结果表明，抗VEGF药物注射对眼部新生血管疾病的疗效显著。

[0014] 本发明的目的之二，在于提供一种上述多肽的制备方法：

[0015] 本发明的多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。

[0016] 一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc 固相法、Fmoc 固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N 端延伸。合成完成后，用含4%对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc 系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C 端氨基酸的PAM 树脂，PAM 树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4- 羟甲基苯乙酰胺；在Boc 合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM) 除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10%) 的氟化氢(HF), 在0℃下处理1 小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80% 乙酸(含少量巯基乙醇) 抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛Sephadex G10 或Tsk-40f 分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt) 或1,1,3,3- 四脲六氟磷酸酯(HBTU) 进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。

[0017] 在一优选例中，本发明多肽P1，按其序列，采用固相合成的方法制备，进行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20℃贮存。

[0018] 本发明还涉及编码P1多肽的多核苷酸。

[0019] 一种优选的编码序列是SEQ ID NO.:2(caccgtcata ccaaggagcg tcacacagcc ctgcac)，它编码SEQ ID NO.:1所示的多肽P1。

[0020] 本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，以SEQ ID NO:2为例，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1 序列的多肽，但与SEQ ID NO:2 中相应编码区序列有差别的核酸序列。

[0021] 本发明的P1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR 扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽的DNA 序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA 分子(或载体)和细胞中。

[0022] 本发明还提供一种药物组合物，它含有

[0023] (a)安全有效量的本发明多肽或其药学上可接受的盐；以及

[0024] (b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。

[0025] 采用本发明的多肽制成的药物，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外，本发明的多肽可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。

[0026] 通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括( 但并不限于) ：眼表、眼周、眼内( 尤其是玻璃体腔内)、肌内、静脉内、皮下、皮内或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。

[0027] 当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地，可以例举的有眼药水、针剂( 尤其是玻璃体腔内注射剂)、眼用凝胶和眼药膏。

[0028] 这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。

[0029] 在本发明中，所述血管新生相关疾病没有特别限制，包括本领域中已知的各种与血管新生相关的疾病。代表性的、与血管新生相关的疾病例子包括(但并不限于)：新生血管性眼病、肿瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、Berger's 病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症或肉瘤状病等。

[0030] 优选地，所述的新生血管性眼病包括但不限于 ：累及脉络膜、视网膜、角膜或虹膜，包括老年性黄斑变性、增生性糖尿病视网膜病变、视网膜血管阻断性疾病、早产儿视网膜病变、角膜感染、新生血管性青光眼等。

[0031] 经动物试验证实，本发明多肽不仅可以抑制鸡胚尿囊膜的血管新生，还可抑制大鼠角膜新生血管，而且可以抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖作用。

[0032] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的多肽是一种具有特异生物学活性和生物相容性的小分子抑制剂，可以经无创或微创的给药途径透过各种眼组织屏障，从而可以提高眼局部的生物利用度，降低给药剂量，减少局部和全身的副作用，安全性高，而且，本发明提供的多肽的生产成本，比现有大蛋白分子抑制剂的成本降低90%以上，具有极好的临床应用价值，能够显著减轻用药者的经济负担。

附图说明

[0033] 图1-3为多肽P1的高效液相色谱纯度分析及质谱鉴定分析结果，其中，图1为P1色谱图，图2为P1一级质谱图，图3为P1二级质谱图；

[0034] 图4-6为多肽P2的高效液相色谱纯度分析及质谱鉴定分析，其中，图4为P2色谱图，图5为P2一级质谱图，图6为P2二级质谱图；

[0035] 图7为多肽P1和P2对人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖的影响结果图；

[0036] 图8-9为多肽P1和P2对鸡胚尿囊膜上新生血管的影响结果图，其中，图8中A为PBS; B为筛查蛋白; C-1为10µg/ml P1; C-2为25µg/ml P1; C-3为50µg/ml P1; D-1为10µg/ml P2; D-2为25µg/ml P2; D-3为50µg/ml P2；

[0037] 图10为大鼠角膜缝线模型下抗大鼠角膜病理性新生血管效应结果图；

[0038] 图11为大鼠碱烧伤模型下抗大鼠角膜病理性新生血管效应结果图。

具体实施方式

[0039] 下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如萨姆布鲁克等人，分子克隆实验指南第三版(科学出版社，2002) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0040] 实施例1

[0041] P1的筛选

[0042] 筛选多肽P1使用的是12个氨基酸的多肽噬菌体展示文库（New England Biolabs，USA），筛查蛋白则由本实验室重组合成，为含有VEGFR1的结构域2和VEGFR2的结构域3的人造蛋白（下称筛查蛋白）。简而言之，涂有50µg筛查蛋白的培养板在4℃的加湿容器中震荡孵育过夜，之后使用含有1%的牛血清白蛋白（BSA）的磷酸缓冲液37℃封闭1小时。一个包含1×12 
10 菌落形成单位（PFU）的噬菌体展示库被加到封闭好的培养板上，室温孵育1小时。去除游离噬菌体后，低pH值的缓冲液（2.2 M甘氨酸盐酸盐、pH2.2）洗脱与筛查蛋白结合的噬菌体，之后使用大肠杆菌（K12 ER2738）扩增洗脱的噬菌体；之后再重复两次进行上述步骤。总共3轮筛选被执行。最终得到的噬菌体被提取DNA然后进行测序。测序由ABI公司的一代测序仪进行。

[0043] 通过三轮筛选，筛选出P1和P2多肽与筛查蛋白结合能力较好。确定了P1和P2的序列分别为SEQ ID NO.: 1和SEQ ID NO.: 3，其编码核酸序列为分别为SEQ ID NO.: 3和SEQ ID NO.: 4。但P2多肽已经被报道可与3种不同靶标蛋白结合，而P1多肽从未被报道过，则判定P2为与筛查蛋白非特异性结合多肽，后续实施例中将P2作为非特异性对照多肽进行试验。

[0044] 实施例2

[0045] P1和P2的合成、纯化

[0046] 采用市售的CS336X多肽合成仪（美国CS bio公司），合成序列分别为SEQ ID NO:1（His Arg His Thr Lys Gln Arg His Thr Ala Leu His） 所示的P1以及为SEQ ID NO:3 （Tyr Ile Thr Pro Tyr Ala His Leu Arg Gly Gly Asn）所示的P2多肽。具体方法如下：

[0047] 采用Fmoc法合成，取王氏树脂约0.3g（树脂偶联量为1.63mmol/g），置多肽合成仪反应器中，分别称取各氨基酸原料2.0mM，按顺序放入氨基酸反应塔中，设置合成序列，氨基酸缩合方法如下：10mlDMF洗涤树脂1min，重复3次；10ml 20%哌啶/DMF溶液洗涤树脂2min，重复2次；10mlDMF洗涤树脂1min，重复3次；10mlDCM洗涤树脂1min，重复2次；10mlDMF洗涤树脂1min，重复3次；2mlTBTU+2mlDIEA+2mlDMF溶解氨基酸原料，氮气鼓泡使溶解；氨基酸溶液加入反应器中，2mlDMF洗涤氨基酸储存管，转入反应器中，重复2次；翻转反应器反应50min；排空反应器中液体，10 mlDMF洗涤树脂1min，重复3次；

[0048] 所有氨基酸缩合完成后，对树脂进行脱Fmoc操作，具体步骤如下：10mlDMF洗涤树脂1min，重复2次；10ml 20%哌啶/DMF溶液洗涤树脂2min，重复2次；10mlDMF洗涤树脂1min，重复2次；10mlDCM洗涤树脂1min，重复2次；粗肽裂解：取出树脂，烘干后按11ml/g加入切割液（切割液配制比例为TFA:苯甲硫醚：水=94:4:2），室温切割反应2h，使用砂芯漏斗将切割液直接滤至2倍体积的无水乙醚中，沉淀多肽，再用干净的砂芯漏斗将多肽分离，即得多肽；

[0049] 最后将多肽溶液纯化冻干，既得到高纯度（>95%）的多肽P1或P2。

[0050] 实施例3

[0051] P1和P2的鉴定、保存

[0052] 取少量的成品多肽P1和P2，做HPLC 分析的纯度鉴定，和ESI-MS 的分子量鉴定。条[0053] 件如下：电喷雾电离，正离子模式检测，氮气作为鞘气、辅助气和吹扫气。喷雾电压4.7kV ：

[0054] 鞘气为15arb，辅助气为5arb，吹扫气为0arb ；毛细管温度：275℃，毛细管电压为40V，透镜电压为120V。全扫描质量范围：300-2000amu。二级质谱用数据依赖模式采集，全扫描图谱中响应度强度最高的3 个峰用于二级质谱分析，高纯氦气用作碰撞气，碰撞能量为
35ev。结果表明，多肽P1分子量：1521.34DA，其结构信息正确，符合理论设计的氨基酸序列，无位点突变及表达后修饰。多肽P2分子量：1361.50DA，其结构信息正确，符合理论设计的氨基酸序列，无位点突变及表达后修饰。（结果见图1-6）；

[0055] 将白色粉末状的多肽，密封包装，置于-20℃长期保存。

[0056] 实施例4

[0057] P1对人脐静脉血管内皮细胞增殖活性的影响

[0058] 使用CCK-8 方法，具体方法如下：将人脐静脉血管内皮细胞HUVECs（购自ScienCell 公司）接种于96 孔板中，接种浓度为2×104/ml ；细胞贴壁后加入无血清培养剂ECM37℃培养24 小时；之后在各孔中分别加入无血清培养剂ECM作为阴性对照、VEGF(20ng/ml)（购自R&D 公司）作为阳性对照、VEGF(20ng/孔)+筛查蛋白、VEGF(20ng/孔)+不同浓度的多肽P1和P2作为处理组；继续培养96小时后，在各孔中加入20μl 的CCK-8 溶液( 购自Dojindo 公司) ；37℃孵育4 小时后，利用酶标仪(Molecular Device 公司) 测定450nm 各孔的吸光度，根据OD450判断细胞的增殖活性，OD450 值越低，抑制效应越强，最后运用GraphPad Prism进行统计分析。结果见图7，可见相对于VEGF组，多肽P1有明显抑制人脐静脉血管内皮细胞HUVECs 增殖的效应，并呈剂量依赖性。非特异性对照多肽P2对人脐静脉血管内皮细胞HUVECs 增殖的抑制效应低于P1。

[0059] 实施例5

[0060] P1抗鸡胚尿囊膜新生血管效应的测定

[0061] 使用鸡胚尿囊膜模型，具体方法如下：

[0062] 将生后1-2 天的种鸡蛋消毒后装入恒温恒湿箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂，SPX-250C）（T=37℃，湿度H=60-70％）孵育5天（24小时计一天），每天早晚各翻蛋一次；之后将直径0.5厘米的灭菌O型硅胶圈放置于于种鸡蛋尿囊膜大血管之间，于分别滴加PBS（50μl）或低浓度(10μg/μl)、中浓度(25μg/μl)、高浓度（50μg/μl）的多肽P1或P2（50μl）以及筛查蛋白（10μg/μl，50μl），并密封种鸡蛋；继续将种鸡蛋置于恒温恒湿箱（温度T=37℃，湿度H=60-70％）孵育2天（24 小时计一天），不翻蛋；之后完全暴露鸡胚尿囊膜，拍照并对硅胶圈内3-5 级微血管计数，运用GraphPad Prism进行统计分析。

[0063] 结果见图8-9，可见相较PBS组，P1多肽在各浓度时均有明显抑制鸡胚尿囊膜新生血管的作用，且抑制作用呈浓度依赖性。非特异性对照多肽P2的抑制作用较P1弱。

[0064] 实施例6

[0065] P1抗大鼠角膜病理性新生血管效应的测定

[0066] 使用大鼠角膜缝线模型，具体方法如下：

[0067] 健康SD大鼠，160-180g，雄性，以右眼为实验眼。术前3天所有实验眼点0.3％氧氟沙星滴眼液，每日2次。实验前检查实验眼，排除眼部病变. 并磅体重。按3ml/kg体重腹腔内注射1%戊巴比妥钠，予以全身麻醉，并予眼表麻醉。首先用直径3mm的角膜环钻在大鼠角膜中央轻作压痕，用10-0尼龙线垂直压痕方向并以其为中线作角膜基质缝合，每眼于颞侧穿入角膜基质1针，每针跨度约1mm，缝线最外端距角膜缘约1mm，术毕结膜囊涂氧氟沙星眼膏。术后各组分别每日4 次滴眼液（10ul/次/眼）。

[0068] 分组如下：空白对照组（缝线+PBS），P1组（缝线+P1 10mg/ml）, P2组（缝线+P2 10mg/ml）。每组8只大鼠（n=8）。分别于术后第3、5、7、10和14天散瞳后观察角膜新生血管（CNV）情况，并用量规测量新生血管长度L，同时记录新生血管生长钟点数C。计算CNV 面积S=0.4*3.1416*C*L。并照相。运用one-way ANOVA比较各组CNV 面积S（mean±SE），运用GraphPad Prism进行统计分析。

[0069] 结果见图10，可见多肽P1组具有明显抑制大鼠角膜病理性新生血管作用（具体见注释）。图5可见相对于PBS组，多肽P1组在术后第7天、第10天及第14天具有明显抑制大鼠角膜病理性新生血管作用， ***P<0.001，差异具有统计学意义。非特异性对照多肽P2的抑制作用较P1弱。

[0070] 实施例7

[0071] P1抗大鼠角膜病理性新生血管效应的测定

[0072] 使用大鼠碱烧伤模型，具体方法如下：

[0073] 健康SD大鼠，160-180g，雄性，以右眼为实验眼。术前3天所有实验眼点0.3％氧氟沙星滴眼液，每日2次。实验前检查实验眼，排除眼部病变. 并磅体重。按3ml/kg体重腹腔内注射1%戊巴比妥钠，予以全身麻醉，并予眼表麻醉。一个4.0mm直径圆形滤纸浸泡在1N NaOH溶液中20秒，并将其应用于角膜中央40秒。从角膜去除滤纸后，眼睛与灭菌生理盐水和氧氟沙星软膏注入10毫升冲洗。术后各组分别每日4 次滴眼液（10ul/次/眼）。

[0074] 分组如下：空白对照组（烧伤+PBS），P1组（烧伤+P1 10mg/ml）, P2组（烧伤+P2 10mg/ml）。每组8只大鼠（n=8）。分别于术后第3、5、7、10和14天散瞳后观察角膜新生血管（CNV）情况，并用量规测量新生血管长度L，同时记录新生血管生长钟点数C。计算CNV 面积S=0.4*3.1416*C*L。并照相。运用one-way ANOVA比较各组CNV 面积S（mean±SE），运用GraphPad Prism进行统计分析。

[0075] 结果见图11，可见多肽P1组具有明显抑制大鼠角膜病理性新生血管作用（具体见注释）。图6可见相对于PBS组，多肽P1组在术后第7天、第10天及第14天具有明显抑制大鼠角膜病理性新生血管作用， ***P<0.001，差异具有统计学意义。非特异性对照多肽P2的抑制作用较P1弱。

[0076] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本本发明，凡在本本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本本发明的保护范围之内。