血清糖化白蛋白检测方法及其专用候选标准物质

摘要

本发明公开了血清糖化白蛋白检测方法及其专用候选标准物质。本发明提供了一种利用同位素稀释液相色谱串联质谱法测定待测样品中糖化白蛋白含量的方法，包括如下步骤A：1)制备标准工作溶液和分离提纯待测样品的白蛋白；2)制备上机标准工作溶液和上机待测样品；3)用液相色谱串联质谱仪对所述上机标准工作溶液和所述上机待测样品分别进行检测，得出所述待测样品中糖化白蛋白含量。本发明的实验证明，本发明在JSCC推荐方法的基础上，应用液相色谱串联三重四级杆质谱建立准确测定糖化白蛋白的候选参考方法。在此基础上，研制冰冻混合人血清基质的GA候选标准物质，拟进一步用于GA项目的室间质量评价及正确度验证。

权利要求

1.一种利用同位素稀释液相色谱串联质谱法测定待测样品中糖化白蛋白含量的方法，包括如下步骤A：所述待测样品为血清糖化白蛋白标准品；

所述血清糖化白蛋白标准品为糖化白蛋白含量为249.53±13. 29mmol/mol或质量百分含量为14.36%水平1血清样本，糖化白蛋白含量为408.02±11. 70mmol/mol或质量百分含量为22.65%水平2血清样本，糖化白蛋白含量为637.22±17.03mmol/mol或质量百分含量为34.63%水平3血清样本；

1）制备标准工作溶液；

所述标准工作溶液按照包括如下步骤的方法制备：将赖氨酸、糖化赖氨酸和稳定同位素稀释液按照不同比例混匀，得到各物质不同摩尔比的标准工作溶液；

所述稳定同位素稀释液由同位素标记赖氨酸、同位素标记糖化赖氨酸和水组成；2）制备上机标准工作溶液和上机待测样品；

将不同的标准工作溶液和所述待测样品的白蛋白均依次进行氢化还原反应、强酸高温水解，得到上机标准工作溶液和上机待测样品；

所述待测样品的白蛋白采用SDS-PAGE电泳分离提纯得到；

具体步骤为；a.电泳分离；b.将每个条带置于EP管中碾碎，经体积百分含量为50%乙腈水溶液脱色3遍、体积百分含量100%乙腈脱水后加入质量分数0.25%氨水水溶液溶解白蛋白，超声振荡，所述超声振荡的功率为80%，时间为20分钟，温度为20℃，促进白蛋白溶解，

3000g离心2分钟取上清液，置于真空离心浓缩机抽干后获得较纯的白蛋白试料；

3）用液相色谱串联质谱仪对所述上机标准工作溶液和所述上机待测样品分别进行检测，得出所述待测样品中糖化白蛋白含量；所述检测采用SRM模式采集碎片离子峰；

所述检测中采用的色谱条件如下：色谱柱为C18色谱柱；流动相为如下流动相A和流动相B，采用所述流动相A和所述流动相B进行梯度洗脱；流动相A：水；流动相B：甲醇；

所述C18色谱柱为日本岛津LC20AB welch Ultimate AQ-C18色谱柱，规格为“2.1×

250mm，5μm”；所述梯度洗脱为：0-1min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比为100：0；1-3min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比为20：80；3.1-8min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比为100：0；

所述检测中采用的质谱条件如下：所述质谱仪为Thermo Fisher TSQ VANTAGE；扫描类型为MS2SRM；离子源为ESI；Ionized Voltage为3998.65V；喷雾气体为氮气；喷雾器压力为

30psi；气体流速为10 L/min；API温度200.42℃；扫描范围为300-2000M/Z。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤3）中，所述检测包括如下步骤：

1）SRM模式采集碎片离子峰：

用液相色谱串联质谱仪分别对所述上机标准工作溶液和所述上机待测样品进行检测，采用SRM模式采集赖氨酸、同位素标记赖氨酸、糖化赖氨酸和同位素标记糖化赖氨酸的碎片离子峰；

选取所述上机标准工作溶液中赖氨酸和同位素标记赖氨酸共同的碎片离子峰分别记作上机标准工作溶液中赖氨酸的碎片离子峰和上机标准工作溶液中同位素标记赖氨酸的碎片离子峰；

选取所述上机标准工作溶液中糖化赖氨酸和同位素标记糖化赖氨酸共同的碎片离子峰分别记作上机标准工作溶液中糖化赖氨酸的碎片离子峰和上机标准工作溶液中同位素标记糖化赖氨酸的碎片离子峰；

选取所述上机待测样品中赖氨酸和同位素标记赖氨酸共同的碎片离子峰分别记作上机待测样品中赖氨酸的碎片离子峰和上机待测样品中同位素标记赖氨酸的碎片离子峰；

选取所述上机待测样品中糖化赖氨酸和同位素标记糖化赖氨酸共同的碎片离子峰分别记作上机待测样品中糖化赖氨酸的碎片离子峰和上机待测样品中同位素标记糖化赖氨酸的碎片离子峰；

2）制备标准曲线A和标准曲线B：

以所述上机标准工作溶液中赖氨酸的碎片离子峰和所述上机标准工作溶液中同位素标记赖氨酸的碎片离子峰的峰面积比为纵坐标，所述上机标准工作溶液中赖氨酸和同位素标记赖氨酸的摩尔比为横坐标作标准曲线A；

以所述上机标准工作溶液中糖化赖氨酸的碎片离子峰和所述上机标准工作溶液中同位素标记糖化赖氨酸的碎片离子峰的峰面积比为纵坐标，所述上机标准工作溶液中糖化赖氨酸和同位素标记糖化赖氨酸的摩尔比为横坐标作标准曲线B；

3）计算待测糖化白蛋白含量：

将所述上机待测样品中赖氨酸的碎片离子峰面积和所述上机待测样品中同位素标记赖氨酸的碎片离子峰峰面积代入所述标准曲线A中，计算得到所述上机待测样品中赖氨酸的含量；

将所述上机待测样品中糖化赖氨酸的碎片离子峰面积和所述上机待测样品中同位素标记糖化赖氨酸的碎片离子峰峰面积代入所述标准曲线B中，计算得到所述上机待测样品中糖化赖氨酸的含量；

再计算所述上机待测样品中糖化赖氨酸的含量和所述上机待测样品中赖氨酸的含量的比值，得到待测糖化白蛋白含量。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

步骤1）中，所述稳定同位素稀释液中所述稳定同位素稀释液中同位素标记赖氨酸和同位素标记糖化赖氨酸的摩尔比为200:1；

或，所述稳定同位素稀释液中的同位素标记赖氨酸和同位素标记糖化赖氨酸的同位素标记不同。

4.根据权利要求1或2任一所述的方法，其特征在于：

步骤1）中，所述不同的标准工作溶液中所述糖化赖氨酸和同位素标记糖化赖氨酸的摩尔比分别为0.5：1、1：1、1.5：1、2.0：1和2.5：1；

所述不同的标准工作溶液中赖氨酸和同位素标记赖氨酸的摩尔比分别为0.8：1、0.9：

1、1.0：1、1.1：1和1.2：1。

说明书

血清糖化白蛋白检测方法及其专用候选标准物质

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及血清糖化白蛋白检测方法及其专用候选标准物质。

背景技术

[0002] 近年来，随着糖尿病患病率的显著增加，国内外糖尿病患者人数快速增长，从1980年至2014年间，全球成人糖尿病患者人数从1.08亿增长到4.42亿，糖尿病已经成为继心脑血管疾病、肿瘤之后又一个威胁全球人类健康最重要的非传染性疾病。在糖尿病管理中，血糖监测至关重要。作为短期血糖水平的监测指标，糖化白蛋白是葡萄糖与血清白蛋白发生非酶促糖化反应的产物，反映糖尿病患者近2-3周的血糖情况。与糖化血红蛋白相比，在溶血性贫血、缺铁性贫血、终末期肾病透析患者、脾切除、存在血红蛋白变异体等疾病或病理状态下，糖化白蛋白更接近真实的血糖水平，同时，针对初始化治疗及调整治疗后的患者，能更及时地反映血糖的变化，从而辅助临床医生有效地评估疗效、调整治疗。

[0003] 糖化白蛋白通常用糖化白蛋白占血清白蛋白的百分比来表示，检测方法主要有以下几种：亲和层析、高效液相色谱法(HPLC)、免疫法、酶法、同位素稀释色谱质谱串联法(ID-LC/MS)、拉曼光谱法等。各个方法由于其对糖化白蛋白的定义及检测的目标分子不同，而使各自的测量结果及参考区间有很大差别。目前，临床上糖化白蛋白检测的常规方法主要为酮氨氧化酶法。

[0004] 作为糖尿病患者血糖评估的常用指标，血糖及糖化血红蛋白均有国际权威机构如国际临床化学与检验医学联合会(IFCC)等推荐的参考方法及国际标准物质，但就糖化白蛋白而言，国际上尚无公认的参考测量程序及标准物质，国外仅有日本临床化学学会(JSCC)推荐的同位素稀释色谱质谱串联法及由该方法定值的人血清基质糖化白蛋白标准物质JCCRM611-1。我国目前尚未建立糖化白蛋白的参考方法，亦缺乏人血清基质的糖化白蛋白参考物质，而国外的有证标准物质价格昂贵，运输周期长，运输条件无法保证(全程低温运输)，已经成为我国实现临床糖化白蛋白检测方法标准化、测量结果的溯源和互认等方面的主要障碍。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的是提供一种利用同位素稀释液相色谱串联质谱法测定待测样品中糖化白蛋白含量的方法。

[0006] 本发明提供的方法，包括如下步骤A：

[0007] 1)制备标准工作溶液；

[0008] 所述标准工作溶液按照包括如下步骤的方法制备：将赖氨酸、糖化赖氨酸和稳定同位素稀释液按照不同比例混匀，得到各物质不同摩尔比的标准工作溶液；

[0009] 所述稳定同位素稀释液由同位素标记赖氨酸、同位素标记糖化赖氨酸和水组成；

[0010] 所述各物质不同摩尔比的标准工作溶液中所述糖化赖氨酸和所述同位素标记糖化赖氨酸摩尔比不同，且所述赖氨酸和所述同位素标记赖氨酸摩尔比不同；

[0011] 2)制备上机标准工作溶液和上机待测样品；

[0012] 将所述不同的标准工作溶液和所述待测样品的白蛋白均依次进行氢化还原反应、 强酸高温水解，得到上机标准工作溶液和上机前待测样品；

[0013] 3)用液相色谱串联质谱仪对所述上机标准工作溶液和所述上机待测样品分别进行检测，得出所述待测样品中糖化白蛋白含量；所述检测采用SRM模式采集碎片离子峰。

[0014] 上述液相色谱串联质谱仪采用的液相及质谱条件参数为表3。

[0015] 上述氢化还原反应为将待测样本白蛋白或者标准品工作液、稳定同位素稀释液和NaBH4溶液混匀，室温下进行氢化还原反应3小时，得到氢化处理后产物；

[0016] 上述强酸高温水解为将氢化处理后产物在浓度为6mol/L盐酸水溶液中用水泵抽去反应瓶内的空气，用自制的氮气球注入氮气，重复操作5次。将其放置于预热好的110℃烘箱中，反应回流20小时，得到酸解后氨基酸；

[0017] 上述强酸高温水解后还包括如下步骤：将酸解后氨基酸用体积百分含量0.08％的HFBA溶液溶解，得到上机前样本。

[0018] 上述方法中，步骤3)中，所述检测包括如下步骤：

[0019] 1)SRM模式采集碎片离子峰：

[0020] 用液相色谱串联质谱仪分别对所述上机标准工作溶液和所述上机待测样品进行检测，采用SRM模式采集赖氨酸、同位素标记赖氨酸、糖化赖氨酸和同位素标记糖化赖氨酸的碎片离子峰；

[0021] 选取所述上机标准工作溶液中赖氨酸和同位素标记赖氨酸共同的碎片离子峰分别记作上机标准工作溶液中赖氨酸的碎片离子峰和上机标准工作溶液中同位素标记赖氨酸的碎片离子峰；

[0022] 选取所述上机标准工作溶液中糖化赖氨酸和同位素标记糖化赖氨酸共同的碎片离子峰分别记作上机标准工作溶液中糖化赖氨酸的碎片离子峰和上机标准工作溶液中同位素标记糖化赖氨酸的碎片离子峰；

[0023] 上述上机标准工作溶液中赖氨酸和同位素标记赖氨酸共同的碎片离子峰为56.2；

[0024] 上述上机标准工作溶液中赖氨酸和同位素标记赖氨酸共同的碎片离子峰为84.2；

[0025] 选取所述上机待测样品中赖氨酸和同位素标记赖氨酸共同的碎片离子峰分别记作上机待测样品中赖氨酸的碎片离子峰和上机待测样品中同位素标记赖氨酸的碎片离子峰；

[0026] 选取所述上机待测样品中糖化赖氨酸和同位素标记糖化赖氨酸共同的碎片离子峰分别记作上机待测样品中糖化赖氨酸的碎片离子峰和上机待测样品中同位素标记糖化赖氨酸的碎片离子峰；

[0027] 2)制备标准曲线A和标准曲线B：

[0028] 以所述上机标准工作溶液中赖氨酸的碎片离子峰和所述上机标准工作溶液中同位素标记赖氨酸的碎片离子峰的峰面积比为纵坐标，所述上机标准工作溶液中赖氨酸和同位素标记赖氨酸的摩尔比为横坐标作标准曲线A；

[0029] 以所述上机标准工作溶液中糖化赖氨酸的碎片离子峰和所述上机标准工作溶液中同位素标记糖化赖氨酸的碎片离子峰的峰面积比为纵坐标，所述上机标准工作溶液中糖化赖氨酸和同位素标记糖化赖氨酸的摩尔比为横坐标作标准曲线B；

[0030] 3)计算待测糖化白蛋白含量：

[0031] 将所述上机待测样品中赖氨酸的碎片离子峰面积和所述上机待测样品中同位素 标记赖氨酸的碎片离子峰峰面积代入所述标准曲线A中，计算得到所述上机待测样品中赖氨酸的含量；

[0032] 将所述上机待测样品中糖化赖氨酸的碎片离子峰面积和所述上机待测样品中同位素标记糖化赖氨酸的碎片离子峰峰面积代入所述标准曲线B中，计算得到所述上机待测样品中糖化赖氨酸的含量；

[0033] 再计算所述上机待测样品中糖化赖氨酸的含量和所述上机待测样品中赖氨酸的含量的比值，得到待测糖化白蛋白含量。

[0034] 上述方法中，步骤2)中，所述待测样品的白蛋白采用SDS-PAGE电泳分离提纯得到。

[0035] 上述SDS-PAGE电泳分离提纯包括如下步骤：先用SDS-PAGE电泳分离待测样品中白蛋白，得到分离后白蛋白凝胶，再将所述分离后白蛋白凝胶分别依次用体积百分含量为50％乙腈溶液脱色、体积百分含量为100％乙腈脱水和质量分数为0.25％氨水溶液溶解，得到待测样品白蛋白。

[0036] 上述方法中，步骤1)中，所述稳定同位素稀释液中，所述稳定同位素稀释液中同位素标记赖氨酸和同位素标记糖化赖氨酸的摩尔比为200:1；

[0037] 或，所述稳定同位素稀释液中的同位素标记赖氨酸和同位素标记糖化赖氨酸的同位素标记不同。

[0038] 上述方法中，步骤1)中，所述不同的标准工作溶液中所述糖化赖氨酸和同位素标记糖化赖氨酸的摩尔比分别为0.5：1、1：1、1.5：1、2.0：1和2.5：1；

[0039] 所述不同的标准工作溶液中赖氨酸和同位素标记赖氨酸的摩尔比分别为0.8：1、0.9：1、1.0：1、1.1：1和1.2：1。

[0040] 上述方法中，所述待测样品为待测血清或血清糖化白蛋白标准品。

[0041] 上述方法中，所述血清糖化白蛋白标准品为糖化白蛋白含量为249.53±13.29mmol/mol或质量百分含量为14.36％水平1血清样本，糖化白蛋白含量为408.02±
11.70mmol/mol或质量百分含量为22.65％水平2血清样本，糖化白蛋白含量为637.22±
17.03mmol/mol或质量百分含量为34.63％水平3血清样本。

[0042] 本发明另一个目的是提供一种利用同位素稀释液相色谱串联质谱法定值血清糖化白蛋白标准品的方法。

[0043] 本发明提供的方法，包括如下步骤：为将上述的步骤A中的待测样品替换为血清糖化白蛋白标准品。

[0044] 由上述方法定值的血清糖化白蛋白标准品也是本发明保护的范围。

[0045] 上述血清糖化白蛋白标准品为糖化白蛋白含量为249.53±13.29mmol/mol或质量百分含量为14.36％水平1血清样本，糖化白蛋白含量为408.02±11.70mmol/mol或质量百分含量为22.65％水平2血清样本，糖化白蛋白含量为637.22±17.03mmol/mol或质量百分含量为34.63％水平3血清样本。

[0046] mmol/mol为质谱检测结果，质量百分含量为临床结果或常规方法检测结果。

[0047] 同位素稀释液相色谱串联质谱法在测定糖化白蛋白中的应用也是本发明保护的范围。

[0048] 上述的标准品在利用同位素稀释液相色谱串联质谱法测定待测样品中糖化白蛋白含量中的应用也是本发明保护的范围。

[0049] 上述的标准品在评价或辅助评价待测血清中糖化白蛋白含量中的应用也是本发明保护的范围。

[0050] 上述的标准品在制备利用同位素稀释液相色谱串联质谱法测定待测样品中糖化白蛋白含量产品中的应用也是本发明保护的范围。

[0051] 上述的标准品在制备评价或辅助评价待测血清中糖化白蛋白含量产品中的应用也是本发明保护的范围。

[0052] 本发明还保护一种产品，包括上述的标准品；

[0053] 所述产品具有如下1)或2)功能：1)利用同位素稀释液相色谱串联质谱法测定待测样品中糖化白蛋白含量；1)评价或辅助评价待测血清中糖化白蛋白含量。

[0054] 本发明的实验证明，本发明在JSCC推荐方法的基础上，应用液相色谱串联三重四级杆质谱建立准确测定糖化白蛋白的候选参考方法，通过验证其主要分析性能，推荐作为我国血清糖化白蛋白检测的候选参考方法。在此基础上，研制冰冻混合人血清基质的GA候选标准物质，拟进一步用于GA项目的室间质量评价及正确度验证。

附图说明

[0055] 图1为赖氨酸及同位素标记赖氨酸的56.2碎片离子峰图。

[0056] 图2为糖化赖氨酸及同位素标记糖化赖氨酸的84.2碎片离子峰图。

[0057] 图3为反应瓶1标准品的碎片离子峰图。

[0058] 图4为反应瓶2标准品的碎片离子峰图。

[0059] 图5为反应瓶3标准品的碎片离子峰图。

[0060] 图6为反应瓶4标准品的碎片离子峰图。

[0061] 图7为反应瓶5标准品的碎片离子峰图。

[0062] 图8为标准工作曲线。

[0063] 图9为样本1采集质谱峰图。

[0064] 图10为样本2采集质谱峰图。

[0065] 图11为样本3采集质谱峰图。

[0066] 图12为3个水平糖化白蛋白候选标准物质基质效应分析图。

[0067] 图13为标准品含量与贝克曼DXC800常规检测值直线拟合标准曲线。

具体实施方式

[0068] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0069] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0070] Thermo Fisher TSQ VANTAGE三重四级杆质谱仪(美国)，定期进行仪器维护保养。

[0071] 岛津LC-20AD液相色谱仪(日本)，welch Ultimate AQ-C18色谱柱：2.1x250mm，5μm。

[0072] Mettler AE240万分之一(Max＝200g,d＝10-4g)天平(德国)，用于校准溶液、内标溶液的配制，以及校准溶液和血清样品中内标的准确加入。

[0073] Eppendorf Reference移液器：北京市计量局每年校对检测一次。

[0074] DUG-9070A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

[0075] SHZ-D(III)循环水式多用真空泵，上海道京仪器有限公司。

[0076] Eppendorf真空离心浓缩仪(德国)。

[0077] Milli-Q净化水装置(Millipore，法国)用于实验用超纯去离子水的 制备，北京市计量局每年校对检测一次。

[0078] DYY-11型电泳仪，DYY-8C型电泳仪，北京市六一仪器厂。

[0079] Beckman DXC800全自动生化分析仪，日本旭化成Lucica糖化白蛋白试剂盒及配套标准品、质控品。

[0080] 血清糖化白蛋白标准物质：JCCRM611-1，水平M、H、HH，购自日本检查医学标准物质机构(ReCCS)。

[0081] D4-Lysine(同位素标记赖氨酸)购自美国Cambridge Isotope Laboratories(CIL)，纯度96-98％；

[0082] 13C6-DOF-Lys(同位素标记糖化赖氨酸)，其结构式如式1：

[0083]

[0084] 式1；也可以将13C6标记葡萄糖与赖氨酸反应所得，纯度98.76％；

[0085] DOF-Lys(糖化赖氨酸)标准品，其结构式如下式2：

[0086]

[0087] 式2；也可以由赖氨酸与葡萄糖反应所得，纯度95.06％。

[0088] 赖氨酸、七氟丁酸酐、乙腈等，均为分析纯(AR)，购自Sigma。

[0089] 电泳试剂：30％丙烯酰胺(ACR)、10％SDS(十二烷基硫酸钠)、PH8.8、0.5mol/L Tris-HCl缓冲液、1.5mol/L Tris-HCl缓冲液、TEMED(四甲基乙二胺)、浓缩电泳缓冲液(15g Tris,72g甘氨酸,5g SDS,用水溶解至1000mL)等购自Amersco。25％氨水，分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

[0090] 超纯去离子水：电阻值≥18.2MΩ.cm，电导率≤10μs/cm。

[0091] 浓盐酸，优级纯，购自上海化学试剂公司。

[0092] 血清样品：来自首都医科大学附属北京朝阳医院检验科。

[0093] 血清收集、分装管：洁净的50ml具螺旋帽聚乙烯塑料管，用于收集血清。1ml具螺旋帽聚乙烯管，环氧乙烷消毒后作为血清分装管。

[0094] 血清样品的收集：遵照ISO指南34及国家标准物质技术规范关于制备标准物质血清原料的收集指南，收集糖化白蛋白高值血清和体检健康人群血清。使用50ml聚乙烯密闭离心管直接收集血清并混合，不加任何添加物或防腐剂。收集后的血清管编号、记录体积后，75％酒精或碘酒消毒瓶体表面并密封，立即放入-80℃冰箱。收集的所有血清标本澄清透明，除外溶血与乳糜等异常性状及HIV抗体和肝炎病毒阳性的标本。共分别收集3个浓度水平血清670mL、650mL、600mL备用。

[0095] 所有的玻璃器皿：如移液管；容量瓶等均符合国家A级标准。所有与试剂、水、稀释液或样本接触的玻璃或塑料表面做如下清洗：

[0096] 使用常规清洗程序(含去污剂的热水浸泡，自来水冲洗)。

[0097] 在30％硝酸中浸泡过夜。

[0098] 去离子水冲洗5～6min。

[0099] 无尘环境中倒置自然干燥。

[0100] 实施例1、同位素稀释色谱质谱串联法检测血清糖化白蛋白A、方法建立[0101] 一、标准溶液的制备

[0102] 1、标准溶液的配制

[0103] 本研究采用重量法配制标准溶液。室内条件控制在温度20℃～25℃，湿度20％-50％。

[0104] DOF-Lys标准溶液(10μmol/g)：取DOF-Lys(MW＝308.3)溶于水中得到的溶液，且DOF-Lys的浓度为10μmol/g。

[0105] 13C6-DOF-Lys标准溶液(10μmol/g)：取13C6-DOF-Lys(MW＝314.3)溶于水中得到的溶液，且13C6-DOF-Lys的浓度为10μmol/g。

[0106] Lysine赖氨酸标准溶液(10μmol/g)：取Lysine·HCl(MW＝182.7，Sigma，L8662-25G，98.5-101.0％)溶于水中得到的溶液，且Lysine·HCl的浓度为10μmol/g。

[0107] D4-Lysine标准溶液(10μmol/g)：取D4-Lysine·2HCl(MW＝223.1，CIL，ZZS-DLM-2640-PK，96-98％)溶于水中得到的溶液，且D4-Lysine·2HCl的浓度为10μmol/g。

[0108] 稳定同位素稀释液(50nmol/g 13C6-DOF-Lys和10μmol/g D4-Lysine，均为稀释液中的终浓度)：吸取900μL D4-Lysine标准溶液(10μmol/g)，加入4.5μL 13C6-DOF-Lys标准溶液(10μmol/g)得到稳定同位素稀释液，C6-DOF-Lys在稳定同位素稀释液中的浓度为50nmol/g，D4-Lysine在稳定同位素稀释液中的浓度为10μmol/g。

[0109] 2、标准工作曲线溶液的制备

[0110] 标准工作曲线溶液的制备如表1。

[0111] 表1 标准工作曲线溶液配制

[0112]

[0113] 二、血清样本的前处理

[0114] 1、血清中白蛋白的分离提纯——SDS-PAGE电泳

[0115] 1)收集血清

[0116] 遵照ISO指南34及国家标准物质技术规范关于制备标准物质血清原料的收集指南，收集糖化白蛋白高值血清和体检健康人群血清。使用50ml聚乙烯密闭离心管直接收集血清并混合，不加任何添加物或防腐剂。收集后的血清管编号、记录体积后，75％ 酒精或碘酒消毒瓶体表面并密封，立即放入-80℃冰箱。收集的所有血清标本澄清透明，除外溶血与乳糜等异常性状及HIV抗体和肝炎病毒阳性的标本。共分别收集3个浓度水平血清670mL、650mL、600mL备用。

[0117] 从-80℃冰箱取出收集的血清，置于室温融化。将融化后的3个浓度水平血清分别充分混匀后，各取出约0.35ml，使用Beckman DXC800全自动生化分析仪测定。根据测定值，得到3个不同浓度水平的血清，即为血清糖化白蛋白候选标准品。

[0118] 3个不同浓度水平的血清13.9％为中值、22.5％为高值和32.6％为超高值，具体为水平1、水平2、水平3：

[0119] 水平1为670ml糖化白蛋白低值血清，不添加任何物质，常规酶法(Beckman DXC800全自动生化分析仪，日本旭化成Lucica糖化白蛋白试剂盒)检测糖化白蛋白浓度(质量百分含量，糖化白蛋白/白蛋白)约为13.9％，为1738支血清混合样本。

[0120] 水平2为650ml糖化白蛋白中值血清，不添加任何物质，常规酶法(Beckman DXC800全自动生化分析仪，日本旭化成Lucica糖化白蛋白试剂盒)检测糖化白蛋白浓度约为22.5％，为1809支血清混合样本。

[0121] 水平3为600ml糖化白蛋白高值血清，不添加任何物质，常规酶法(Beckman DXC800全自动生化分析仪，日本旭化成Lucica糖化白蛋白试剂盒)检测糖化白蛋白浓度约为32.6％，为1571支血清混合样本。

[0122] 2)SDS-PAGE电泳分离提纯

[0123] 按照SDS-PAGE电泳方法对3个水平血清样本的白蛋白进行分离提纯，得到水平1白蛋白、水平2白蛋白和水平3白蛋白：

[0124] (1)电泳分离

[0125] 按照表2配制4％-8％的梯度分离胶并灌入玻璃板，正丁醇溶液压平液面后室温聚合。凝固后弃去覆盖液，再按照表2配制4％的浓缩胶，立即加在凝固的分离胶上，插入梳子于并室温下聚合。电泳上样3个水平血清样本，上样量20ul，其中水2ul，血清样本10ul，上样缓冲液8ul。预电泳电压60V，进入分离胶后调到150V，经过夜染色、脱色后选择清晰的白蛋白(60KD大小)条带切下。

[0126] (2)提纯

[0127] 将每个条带置于EP管中碾碎，经50％(体积百分含量)乙腈水溶液脱色3遍、100％(体积百分含量)乙腈脱水后加入0.25％(质量分数)氨水水溶液溶解白蛋白，超声振荡(功率80％，时间20分钟，温度20℃)促进白蛋白溶解，3000g离心2分钟取上清液，置于真空离心浓缩机抽干后获得较纯的白蛋白试料，得到的水平1白蛋白、水平2白蛋白和水平3白蛋白的试料至少200ug。

[0128] 表2 分离胶和浓缩胶配制

[0129]

[0130]

[0131] 2、氢化还原处理

[0132] 将上述1得到的三个水平白蛋白试料分别加水溶解，均配制成浓度约10μg/μL的溶液，各取100μl加入不同的新的反应瓶中，再向加有不同水平白蛋白的反应瓶中分别加入15μL稳定同位素稀释液，混合放置1小时后各加入6μL50mmol/L的NaBH4溶液(NaBH4溶解于0.2mol/L NaOH水溶液)，在室温下进行氢化还原反应3小时，将糖基的羰基还原为羟基，得到氢化处理后水平1白蛋白、氢化处理后水平2白蛋白和氢化处理后水平3白蛋白。

[0133] 3、白蛋白强酸水解为氨基酸

[0134] 向经过2处理后的反应瓶中各加入150μL浓盐酸(质量分数37％),再加水300μL。此时反应瓶中盐酸浓度为6mol/L。用水泵抽去反应瓶内的空气，用自制的氮气球注入氮气，重复操作5次。将其放置于预热好的110℃烘箱中，反应回流20小时，得到水平1白蛋白酸解后氨基酸、水平2白蛋白酸解后氨基酸和水平3白蛋白酸解后氨基酸。

[0135] 4、ID-LC/MS测定样本的准备

[0136] 将经过3处理后的3个样品瓶中的反应液分别转移入1.5mL的EP管中，每个样品瓶分别用100μL水清洗两次合并转移入EP管中，用真空离心冻干机抽干，用150μL体积百分含量0.08％的HFBA溶液(0.8mlHFBA加入1L水)溶解，在20000g下离心30min，取上清液转移至液相进样瓶中，放于4℃冰箱保存，得到上机前水平1样本、上机前水平2样本和上机前水平3样本。

[0137] 三、标准工作曲线溶液的前处理

[0138] 吸取上述一制备的反应瓶中的5种标准工作曲线溶液相应的体积(总体积的15％)置于新的1-5号反应瓶中，同上述二中的2-4步骤处理，置于4℃冰箱保存，得到5种上机前标准工作曲线溶液样本。

[0139] 四、同位素稀释高效液相-串联质谱ID-LC/MS检测

[0140] 1、标准曲线的制备

[0141] 1)检测

[0142] 将上述三得到的5种上机前标准工作曲线溶液样本分别进行同位素稀释高效液相-串联质谱检测，检测条件见表3所示，得到5种标准工作曲线溶液前处理后样本的质谱图。

[0143] 表3 液相及质谱条件参数

[0144]

[0145]

[0146] 2、标准工作曲线质谱采集条件及采集图谱

[0147] 将5种上机前标准工作曲线溶液样本采用SRM模式进行检测，采集m/z为147的赖氨酸碎片离子峰84.2、67.1和56.2，m/z为151的同位素标记赖氨酸碎片离子峰88.2、70.2和56.2，选择两者共同的56.2碎片离子峰的峰面积，如图1。

[0148] 将5种上机前标准工作曲线溶液样本采用SRM模式进行检测，采集m/z为311的糖化赖氨酸碎片离子峰84.2、248.4和130.0，m/z为317的同位素标记糖化赖氨酸碎片离子峰84.2、270.1和189.1，选择两者共同的84.2碎片离子峰的峰面积，如图2。

[0149] 标准工作曲线5个浓度比标准品赖氨酸、糖化赖氨酸、氘标记赖氨酸及13C标记糖化赖氨酸质谱采集碎片离子峰图，如图3-7(图1和2是为了说明检测选择的共同离子碎片，3-7是具体样本的峰图)。

[0150] 以选取的赖氨酸56.2碎片离子峰和同位素标记赖氨酸56.2碎片离子峰的峰面积比为纵坐标，赖氨酸与同位素标记赖氨酸摩尔比为横坐标作标准曲线A，如图8，标准曲线A为赖氨酸/氘标记赖氨酸的标准工作曲线；

[0151] 以选取的糖化赖氨酸84.2碎片离子峰和同位素标记糖化赖氨酸84.2碎片离子峰的峰面积比为纵坐标，糖化赖氨酸与同位素标记糖化赖氨酸摩尔比为横坐标作标准曲线B，如图8，标准曲线B为糖化赖氨酸/13C标记糖化赖氨酸的标准工作曲线。

[0152] 3、血清样本白蛋白的检测

[0153] 将上述二得到的上机前水平1样本、上机前水平2样本和上机前水平3样本进行同位素稀释高效液相-串联质谱检测，检测条件见表3所示，检测模式及检测母离子、碎片离子同上述2，结果如图9-图11所示，得到水平1前处理样本质谱图、水平2前处理样本质谱图和水平3前处理样本质谱图。

[0154] 将水平1前处理样本质谱图、水平2前处理样本质谱图和水平3前处理样本质谱图中的赖氨酸和氘标记赖氨酸峰面积比、糖化赖氨酸和13C标记糖化赖氨酸峰面积比分别代入图8所示的标准曲线中，得到赖氨酸和氘标记赖氨酸峰含量比、糖化赖氨酸和13C标记糖化赖氨酸含量比，再根据上述二中加入的稳定同位素稀释液中的氘标记赖氨酸和13C标记糖化赖氨酸含量(氘标记赖氨酸为0.15μmol，13C标记糖化赖氨酸为0.75nmol)，计算得到水平1前处理样本中糖化赖氨酸的含量、水平2前处理样本质谱图中糖化赖氨酸的含量和水平3前处理样本中糖化赖氨酸的含量。

[0155] 计算样品中糖化白蛋白含量GA为糖化赖氨酸的含量/赖氨酸的含量。

[0156] 结果如表4、表5和表6所示，

[0157] 表4样品中赖氨酸含量

[0158]

[0159] 表5样品中糖化赖氨酸含量

[0160]

[0161] 表6样品中糖化白蛋白含量

[0162]

[0163] B、方法学评价

[0164] 1、精密度评价

[0165] 一个月内，在三个独立的工作日内，将上述分装好的实验样本(上述制备的水平1前处理样本、水平2前处理样本、水平3前处理样本)每次实验前各取出1管，待室温溶解后，经ID-LC/MS质谱仪检测(方法同上)，每管即为1批，每批重复测定3次，取平均值。计算批内、批间与总精密度。实验结果见表7。

[0166] 表7精密度实验结果(mmol/mol)

[0167]

[0168] 2、准确度评价

[0169] 选用日本检查医学标准物质机构(ReCCS)标准物质JCCRM611-1M、H、HH来评估建立的参考方法的准确性。611-1糖化白蛋白标准物质以ID-LC/MS方法定值，测量三个浓 度水平M、H、HH，认定值分别为230±7mmol/mol、365±10mmol/mol、564±18mmol/mol。标准物质经上述方法进行前处理后等量分装，-70℃冰箱冻存。每次实验前各取出1批，室温溶解，经ID-LC/MS质谱仪检测(方法同上)，每批重复测定3次，取平均值。计算准确度验证结果，见表8。

[0170] 表8 ID-LC/MS测定糖化白蛋白标准物质611-1M、H、HH结果(mmol/mol)[0171]

[0172] 证明上述A的方法更准确，因此上述A检测的水平1、水平2和水平3的糖化白蛋白的含量准确。

[0173] 3、测量不确定度分析

[0174] 1)重复测量产生的不确定度

[0175] 根据定值分析的要求，对同一浓度血清样品进行了多次测定，包括批内和批间重复测定，由此引入重复测定产生的不确定度。以上述水平2为例，进行测量不确定度分析，其重复测量的总CV为1.13％，即相对不确定度为1.13％。

[0176] 2)标准品产生的不确定度，该相对不确定度为(标准溶液采用称重法由赖氨酸及糖化赖氨酸纯品配制而成，赖氨酸纯度为99.75％±1.25％，糖化赖氨酸纯度为95.06％±2.1％，相对不确定度分别为0.627％，0.631％)

[0177] 3)万分之一的分析天平引起的称量不确定度，该称量不确定度为0.0058％(计算方法见下文：万分之一的天平精度为0.1mg，按均匀分布计算，取k＝√3，其不确定度为0.000l/√3＝0.000058)。

[0178] 计算相对合成不确定度，见公式(I)

[0179] Uc2(y)＝(u1)2+(u2)2+…+(un)2公式(I)

[0180] Uc2(y)＝(1.13％)2+(0.0058％)2+(0.627％)2+(0.631％)2

[0181] 按照“化学分析中不确定度的评估指南"：在大多数情况下，推荐k＝2(95％置信区间)，即扩展因子kp＝2。转换为相对扩展不确定度为：Urel＝c×Uc(y)＝408.02mmol/mol×1.43％＝5.83(mmol/mol)，扩展不确定度为：2×c×Uc(y)＝11.67(mmol/mol)；

[0182] 由此可知，样本水平1，2，3糖化白蛋白的浓度扩展不确定度分别为13.14mmol/mol，11.67mmol/mol，16.95mmol/mol，三个水平样本糖化白蛋白定值结果分别为249.53±13.14mmol/mol，408.02±11.67mmol/mol，637.22±16.95mmol/mol。

[0183] 注：随机因素产生的不确定度——质谱分析波动的影响。同一血清样品在不同时间按相同条件测量即重复进样分析，测量值会出现上下波动，这与仪器自身的性能，测定的浓度水平有关。在正式测定样品前，为了保证分析的准确性，对仪器进行了维护，以求其处于较稳定状态。该因素作为随机误差包含、体现在整个测量过程的重复性中，不单独计算此类不确定度。

[0184] 经方法学评价，已建立的方法测定样本信号强度强，线性良好，精密度高，准确 性好，可推荐将ID-LC/MS法作为糖化白蛋白测定的候选参考方法。

[0185] 因此，本发明的方法可以为血清糖化白蛋白标准品定值为249.53±13.14mmol/mol，408.02±11.67mmol/mol，637.22±16.95mmol/mol。

[0186] 实施例2、同位素稀释色谱质谱串联法中血清糖化白蛋白候选标准品研制[0187] 将上述实施例1的方法中获得的糖化白蛋白含量为249.53±13.14mmol/mol水平1血清样本，糖化白蛋白含量为408.02±11.67mmol/mol水平2血清样本，糖化白蛋白含量为637.22±16.95mmol/mol水平3血清样本作为血清糖化白蛋白候选标准品。

[0188] 一、血清糖化白蛋白候选标准品的制备

[0189] 1、血清收集

[0190] 与实施例1方法相同，遵照ISO指南34及国家标准物质技术规范关于制备标准物质血清原料的收集指南，收集糖化白蛋白高值血清和体检健康人群血清。使用50ml聚乙烯密闭离心管直接收集血清并混合，不加任何添加物或防腐剂。收集后的血清管编号、记录体积后，75％酒精或碘酒消毒瓶体表面并密封，立即放入-80℃冰箱。收集的所有血清标本澄清透明，除外溶血与乳糜等异常性状及HIV抗体和肝炎病毒阳性的标本。共分别收集3个浓度水平血清670mL、650mL、600mL备用。

[0191] 从-80℃冰箱取出收集的血清，置于室温融化。将融化后的3个浓度水平血清分别充分混匀后，各取出约0.35ml，使用Beckman DXC800全自动生化分析仪测定。根据测定值，得到3个不同浓度水平的血清，即为血清糖化白蛋白候选标准品。

[0192] 水平1为670ml糖化白蛋白低值血清，不添加任何物质，常规方法检测结果糖化白蛋白浓度(质量百分含量，糖化白蛋白/白蛋白)约为13.9％，为1738支血清混合样本。

[0193] 水平2为650ml糖化白蛋白中值血清，不添加任何物质，常规方法检测结果糖化白蛋白浓度约为22.5％，为1809支血清混合样本。

[0194] 水平3为600ml糖化白蛋白高值血清，不添加任何物质，常规方法检测结果糖化白蛋白浓度约为32.6％，为1571支血清混合样本。

[0195] 2、过滤

[0196] 将收集的每一浓度水平血清标本放入锥形瓶中，用磁力搅拌器充分混匀1小时；混匀后的血清标本依次用0.8μm滤膜、0.45μm滤膜、0.2μm滤膜过滤。所有的容器及过滤装置必须在120℃条件下高压灭菌；将过滤好的无菌血清，用移液器分装到已经贴好标签的无菌聚乙烯分装管中，每管0.35ml，密封。所有操作须在生物安全柜中无菌操作。分装管的标签标注糖化白蛋白浓度水平、编号、分装时间等内容。分装后的血清立刻放入-80℃冰箱中保存。水平1、水平2、水平3冰冻混合人血清糖化白蛋白候选标准物质分别为1738支、1809支、1571支，每支约0.35mL。

[0197] 二、血清糖化白蛋白候选标准品的性能检测

[0198] 1、冰冻混合人血清糖化白蛋白候选标准物质均匀性检验

[0199] 瓶间均匀性检验必须考虑测量的方法、抽样方法、抽样数量、取样量、测量顺序等对结果的影响，以及测量结果的数据分析。本项目采用了Beckman DXC800全自动生化分析仪(日本旭化成Lucica GA-L试剂盒配套质控品、校准品)测定候选标准物质中糖化白蛋白的含量，进行均匀性检验。

[0200] 1)抽样方法：采用微软公司Excel程序中的RAND函数随机生成0～500内的随 机数字，将编号与之相对应的血清分装管抽出，用于均匀性性检验。

[0201] 2)抽样数量：考虑到血清的均匀性较好，用上述方法随机抽取15个血清管备检。

[0202] 3)测量方法：根据《标准物质/校准样品生产者能力认可准则》，均匀性检验必须使用适当的并以形成文件的方法或程序、重复性符合项目要求的，可以与定值方法不同的测量方法进行均匀性研究。按照标准化操作程序对Beckman DXC800全自动生化分析仪进行维护保养，使用日本旭化成Lucica GA-L酶法检测试剂盒，进行校准及性能验证，结果显示其精密度较好，且能满足多次重复测定，适宜大批量样本在较短时间内同时进行测量，因此本研究选择该方法作为均匀性检验的研究测量方法。抽取的15个样本中，每一瓶均以上述方法分析测定3个数据，取均值作为均匀性检验数据。

[0203] 4)最小取样量：经过研究，本项目测定糖化白蛋白时最小取样量约为60μL。每个冻存管血清样约含350μL。

[0204] 5)测量顺序：按随机排序进行测量，每个样本重复测定三次。为了避免蒸发，每个血清冻存管在使用前要密闭。

[0205] 6)测量结果的数据分析：按ISO导则35的要求，单因素方差分析法是用来统计检验均匀性的最常用方法，此方法是通过组间方差和组内方差的比较来判断各组测量值之间有无系统性差异，若两者的比值F

[0206] 表9 人血清GA候选标准物质均匀性研究测量数据(水平1，单位％)

[0207]

[0208]

[0209] 表10 人血清GA候选标准物质均匀性研究测量数据(水平2，单位％)[0210]

[0211] 表11 人血清GA候选标准物质均匀性研究测量数据(水平3，单位％)[0212]

[0213]

[0214] 由表9-11可知3个浓度水平的冰冻混合人血清GA候选标准物质均匀性良好。不均匀性引入的不确定度较小，将ubb计入定值的总不确定度内。

[0215] 2、冰冻混合人血清糖化白蛋白候选标准物质稳定性考察

[0216] 1)冰冻混合人血清糖化白蛋白-80℃贮存条件下长期稳定性检验

[0217] 依据《标准物质及其应用技术》(第二版)，对血清样品的长期稳定性进行了监测，在12个月内，分别对3个不同浓度冰冻混合血清糖化白蛋白候选标准物质各进行了5次稳定性考察，每次随机取3个不同水平血清样品各2支，测3次取均值，以评价稳定性。

[0218] (1)使用Beckman DXC800全自动生化分析仪，在同一个实验室检测冰冻混合血清的稳定性。检测前当天将待测标本从-80℃冰箱中取出，在室温下放置30分钟平衡后(室温控制在25℃左右)，立即上机检测。

[0219] (2)第0天、30天、90天、180天、360天分别从-80℃冰箱中取出已经经过均匀性检验的同一批冰冻混合血清进行检测，每次检测均同时检测Lucica GA-L试剂盒配套质控品、校准品。

[0220] (3)稳定性评价方法：直线拟合法，拟合直线斜率b1＜t0.95,n-2·s(b1)，则斜率不显著，提示未观察到不稳定性。如果血清糖化白蛋白候选标准物质足够稳定，那么在不同时间点测量得到的血清糖化白蛋白值，不随时间变化而变化，即测定值与时间点拟合的曲线斜率趋近于零。

[0221] (4)稳定性结果：3浓度水平冰冻混合人血清糖化白蛋白候选标准物质在-80℃冰箱贮存0天、30天、90天、180天、360天后，使用Beckman DXC800全自动生化分析仪测量糖化白蛋白含量，每次平行测定两份，每份标本测定3次，取均值。具体数据如表12。

[0222] 表12 冰冻混合人血清糖化白蛋白候选标准物质稳定性检验数据(％)[0223]

[0224]

[0225] 2)冰冻混合人血清糖化白蛋白候选标准物质短期稳定性检验

[0226] (1)使用日本旭化成Lucica糖化白蛋白试剂盒，在Beckman DXC800全自动生化分析仪检测

[0227] (2)短期稳定性研究采用同步稳定性研究实验方法(5)，冷冻(-20℃)、冷藏(2-8℃)、室温(25℃)、37℃条件下，分别观察60天，7天，5天，3天，在同一时间，将不同时间点放入的待检标本同时从各自温度保存条件下取出，同时取出-80℃保存的冰冻混合人血清糖化白蛋白候选标准物质作为对照，室温放置20分钟平衡，同时上机检测。每份标本重复测量3次，取均值。出现明显可疑数值的血清标本将被重新检测。稳定性评价方法同上。结果如表
13-16。

[0228] 表13 冰冻混合人血清GA冰冻(-20℃)贮存稳定性检验数据(％)

[0229]

[0230] 表14 冰冻混合人血清GA冷藏(2-8℃)贮存稳定性检验数据(％)

[0231]

[0232] 表15 冰冻混合人血清GA室温(25℃)贮存稳定性检验数据(％)

[0233]

[0234] 表16 冰冻混合人血清GA 37℃贮存稳定性检验数据(％)

[0235]

[0236] 3)冰冻混合人血清糖化白蛋白候选标准物质稳定性评价，见表17。

[0237] 表17 冰冻混合人血清GA稳定性评价结果

[0238]

[0239] 4)冰冻混合人血清糖化白蛋白候选标准物质稳定性考查结论

[0240] 3个浓度水平的冰冻混合人血清糖化白蛋白候选标准物质在-80℃条件下贮存6个月，标准物质的特性量值没有发生显著性的变化，稳定性良好，但由于实验时间限制，长期稳定性仅观察至6个月，此后将继续进行。如表18所示，各个温度条件下各水平候选标准物质测定值的拟合直线斜率b1均小于t0.95，n-2·s(b1)，故斜率不显著，提示未观察到不稳定性。因此，3个浓度水平的糖化白蛋白候选标准物质在冷冻(-80℃)、(-20℃)、冷藏(2-8℃)、室温(25℃)、37℃条件下保存，分别至少稳定180天、30天、7天、2天、8小时。

[0241] 5)冰冻混合人血清糖化白蛋白候选标准物质定值

[0242] 定值不确定度来源由三个部分组成：第一部分是通过测量数据的标准偏差及所要求的置信概率按统计方法计算出的；第二部分是通过对测量影响因素分析，估算出其大小；第三部分是物质的均匀性和物质在有效期内的变动性所引起的不确定度。

[0243] 3、测量不确定度分析

[0244] 血清糖化白蛋白候选标准品采用实施例1的A的方法检测血清用实施例1的质谱的方法检测，方法同前。

[0245] 1)均匀性引起的不确定度

[0246] 候选标准物质的不均匀性所产生的标准偏差(Ubb)需要合成到定值最终不鸦定度中，若S1＞S2，计算公式为 其中n为测定次数(n＝3)，S12表示组间均方，S22表示组内均方，Sbb等同于Ubb；若S1＜S2，计算公式为 (n＝3，v2＝20

[0247] 计算结果见表18。

[0248] 表18 三个水平糖化白蛋白候选标准物质均匀性产生的不确定度

[0249]

[0250] 2)长期稳定性引入的不确定度分析

[0251] 监测-80℃保存6个月的长期稳定性，引入的不确定度计算公式为：Ust＝s(b1)·t，计算结果见表19。

[0252] 表19 三个水平糖化白蛋白候选标准物质长期稳定性产生的不确定度[0253]

[0254] 3)测量结果的不确定度

[0255] 总不鸦定度由制备标准物质的均匀性、长期稳定性及测量引入的不确定度合成，计算公式 (式中，Ubb＝不均匀性引入的不确定度；Ust＝长期稳定性的不确定度；Uchar＝测量不鸦定度)。三个水平糖化白蛋白标准物质定值采用“靶值  ±不确定度(U)”表示(U，相对扩展不确定度，k＝2)，三水平糖化白蛋白候选标准物质总不鸦定度见表20。

[0256] 表20 冻混合人血清糖化白蛋白标准物质定值及不确定度评定结果(％)[0257]

[0258]

[0259] 4)各浓度水平糖化白蛋白候选标准物质质谱法定值结果表示，如表21：

[0260] 表21 各浓度水平GA候选标准物质定值结果

[0261]

[0262] 依据日本临床化学学会推荐公式：Y＝0.0523X+1.306，将ID-LC/MS测定值X，转化为常规方法测定值Y。

[0263] 4、冰冻混合人血清GA候选标准物质的互通性实验

[0264] 1)挑选临床实验室常用的贝克曼DXC800、西门子2400作为常规方法，分别采用旭化成Lucica试剂盒和宁波美康GA试剂盒分别测量25份新鲜血清样本，3个水平GA候选标准物质各1支及2个水平旭化成试剂盒质控品，每份样本测量3次，取均值，结果见表22。

[0265] 表22 冰冻混合人血清糖化白蛋白候选标准物质互通性检测值(％)

[0266]

[0267]

[0268] 2)分别以贝克曼DXC800酶法结果为对照(X)，结合西门子测定结果(Y)进行线性回归，计算相应X值下Y预测值及其双侧95％置信区间。候选标准物质的Y值的预测值与95％置信区间比较以评价基质效应。结果见图12。

[0269] 3个水平冰冻混合人血清糖化白蛋白候选标准物质全部在回归直线95％置信区间范围内。因此，3个水平冰冻混合人血清糖化白蛋白候选标准物质在两种常规检测系统中均具有良好的互通性。此外，2个水平质控品尤其是高值质控品测定结果在回归直线95％置信区间范围外，故可认为质控品在不同检测系统存在基质效应，不具有互通性。

[0270] 因此，糖化白蛋白含量为249.53±13.29mmol/mol或质量百分含量为14.36％水平1血清样本，糖化白蛋白含量为408.02±11.70mmol/mol或质量百分含量为22.65％水平2血清样本，糖化白蛋白含量为637.22±17.03mmol/mol或质量百分含量为34.63％水平3血清样本作为血清糖化白蛋白候选标准品。

[0271] 三、标准品的应用

[0272] 1.标准曲线的建立

[0273] 上述二获得的糖化白蛋白含量为249.53±13.29mmol/mol或质量百分含量为14.36％水平1血清样本，糖化白蛋白含量为408.02±11.70mmol/mol或质量百分含量为
22.65％水平2血清样本，糖化白蛋白含量为637.22±17.03mmol/mol或质量百分含量为
34.63％水平3血清样本作为标准品(血清)校准临床常规检测系统贝克曼DXC800(旭化成试剂)，标准品认证值及常规检测值见表23，标准品的糖化白蛋白含量对常规检测值作直线拟合，即标准曲线见图13。

[0274] 表23 标准品认证值及贝克曼DXC800常规检测值

[0275]

[0276] 2、精密度评价

[0277] 使用旭化成厂家两个浓度水平(L1，L2)的质控品，每个水平质控品每天各测一次，连续检测20天。评价校准后贝克曼DXC800常规方法的精密度，结果见表24。

[0278] 表24校准后贝克曼DXC800常规方法精密度结果

[0279]

[0280] 3.准确度评价

[0281] 用日本检查医学标准物质机构(ReCCS)标准物质JCCRM611-1M、H两个水平来评价校准后的贝克曼DXC800常规方法的正确度。每个水平重复测定3批，每批平行测定3次。计算测定值、变异系数以及定值与认定值的相对偏差，结果见表25。

[0282] 表25 校准后的贝克曼DXC800常规方法的正确度验证结果(％)

[0283]

[0284] 4.常规系统检测结果一致性评价

[0285] 经研制的标准品校准临床常规检测系统贝克曼DXC800和西门子2400，校准后同时检测25份临床患者样本，采用相应水平标准曲线计算其糖化白蛋白的含量。比较校准前后西门子2400与贝克曼DXC800检测结果的偏移，结果见表26。

[0286] 表26 校准前后西门子2400与贝克曼DXC800检测结果及偏移(％)

[0287]

[0288]

[0289] 经研制的标准品校准后的常规系统，经方法学验证，精密度高，准确度好，建立和保证了糖化白蛋白常规检验结果的溯源性。校准前西门子2400与贝克曼DXC800两常规检测系统间25份临床样本的偏倚为6.95％～22.9％,经校准后的偏倚明显减低至-6.8％～4.3％，一致性良好，实现了临床常规检测结果的可比性。