生物碱类化合物的应用

摘要

本发明涉及医药技术领域，具体公开了具有式Ⅰ结构的生物碱类化合物在制备治疗病毒性疾病药物或在制备病毒抑制剂中的应用。式Ⅰ结构的生物碱类化合物来源于天然中草药植物平贝母，副作用小，对肠道病毒和流感病毒均有抑制作用，并对其引起的病毒性疾病有较好的治疗效果，提供了利用中药成分治疗手足口病和流感的新途径。

权利要求

1.具有式Ⅰ结构的生物碱类化合物在制备治疗病毒性疾病药物或在制备病毒抑制剂中的应用，所述病毒性疾病为手足口病和/或流感，所述病毒为流感病毒和/或肠道病毒；

其中，R为-OH或＝O。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述流感病毒为甲型流感病毒。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述甲型流感病毒为H1N1型流感病毒和/或H3N2型流感病毒。

4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述肠道病毒为柯萨奇病毒和/或肠道病毒EV71型。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒A16型。

6.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物和抑制剂独立选自口服给药剂型、注射给药剂型、外用给药制剂。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述口服给药剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、乳剂或混悬剂。

8.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述外用给药剂型为栓剂、贴剂或凝胶剂。

说明书

生物碱类化合物的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，更具体的说是涉及生物碱类化合物的应用。

背景技术

[0002] 手足口病(HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见传染病，主要通过消化道、呼吸道和密切接触等途径传播，以婴幼儿发病为主。手足口病主要由RNA病毒科肠道病毒属柯萨奇病毒A16型(CoxA 16)及肠道病毒71型(EV 71)感染引起，以71型病毒最为严重。HFMD主要表现为发热伴肌阵挛、口腔黏膜溃疡性疱疹及四肢末端水疱样皮疹，严重可引起脑炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、急性迟缓性瘫痪等多种与神经系统相关的疾病，危害严重。

[0003] 目前，尽管针对EV71病毒的疫苗已经获批上市，但仍没有直接靶向病毒的药物，临床主要采取对症治疗的策略；而广谱抗病毒药物利巴韦林在应用于婴幼儿时有致畸和抑制生长发育的风险。

[0004] 流行性感冒，是流感病毒引起的一种具有高度传染性的急性吸道疾病，是对人类健康威胁最大的传染病之一，具有发病率高、流行广等特点，至今尚不能有效控制。流感病毒可通过空气飞沫传播，传播迅速，一旦大规模爆发难以控制。流感起病急骤，并发症发生率高，可引起全身不适，包括打喷嚏、咳嗽、头痛、发热发冷、疲倦乏力、食欲不振等症状，其危害性更体现在严重时引起的肺炎、充血性心力衰竭及其他并发症，常危及婴幼儿、老年人及免疫力低下者的生命。2009年甲型H1N1流感，我国内地累计报告重症病例4328例，死亡326例；2013年中国出现的H7N9禽流感病毒感染人病例共计130例，其中35人死亡，该疫情再度引起了社会对流感的广泛关注以及对抗流感病毒药物研发的迫切需求。目前，治疗流感的西药主要有M2离子通道抑制剂(金刚烷胺和金刚乙胺)、NA抑制剂(奥司他韦和扎那米韦)和流感疫苗。金刚烷胺和金刚乙胺仅对甲型流感病毒有抑制作用，且存在不良反应。奥司他韦作为一线抗流感病毒药物使用，但陆续发现了奥司他韦耐药株出现并传播，且价格昂贵。
扎那米韦主要用于流感的早期治疗，但不适用于儿童，对有哮喘或慢性阻塞性肺病的患者可能有增加支气管痉挛的危险。而疫苗仅对己知道的流感病毒亚型有预防作用，对由抗原性漂移或抗原性转换所产生的新型流感病毒无效，流感疫苗研制和使用相对滞后。中药抗流感病毒具有整体调节、多靶点治疗的特点，具有较强的抗病毒作用，其作用往往是广谱的，不仅能抑制病毒增殖、抑制炎症反应和解热，同时还具有免疫调节功能，从根本上抵制病毒侵害，中药复方多成分、多途径、多靶点的特点可以达到“整体综合调节”的效果，较单一抗流感病毒的化学药物优势明显。

[0005] 近年来，中药治疗手足口和流感的抗病毒研究逐渐引起人们的关注，而且由于很多中药组分属于天然提取药物，具有副作用小等优点，因此研究抗病毒中药成分，能够弥补化学药物的不足，扩宽治疗途径。

发明内容

[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供具有式Ⅰ结构的生物碱类化合物在制备治疗病毒性疾病药物或在制备病毒抑制剂中的应用，使其对流感病毒和肠道病毒引起的病毒性疾病，如手足口病和流感有较好地治疗效果，同时对所述病毒有抑制作用。

[0007] 本发明所述具有式Ⅰ结构的生物碱类化合物具有如下结构：

[0008]

[0009] 其中，R为-OH或＝O；当R为-OH时，式Ⅰ化合物为贝母甲素(贝母素甲)，当R为＝O时，式Ⅰ化合物为贝母乙素(贝母素乙)。

[0010] 本发明所述生物碱类化合物可从平贝母中提取获得，也可通过市售途径购买，目前针对贝母甲素和贝母乙素的具体作用还没有相关的记载。本发明经过研究发现，2个生物碱类化合物对流感病毒神经氨酸酶具有较好的抑制活性，抗流感病毒活性明显；同时对肠道病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，能提高病毒感染细胞的存活率，具有抗手足口病毒作用，故本发明提出了上述应用和发明目的。

[0011] 在本发明所述应用的具体实施方式中，所述病毒性疾病为手足口病和/或流感，所述病毒为流感病毒和/或肠道病毒。其中，所述流感病毒可以是甲型流感病毒，例如H1N1型流感病毒和/或H3N2型流感病毒；所述肠道病毒可以是柯萨奇病毒和/或肠道病毒EV71型，柯萨奇病毒可以选自柯萨奇病毒A16型。

[0012] 本发明通过实验证明了式Ⅰ生物碱类化合物对肠道病毒、流感病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，能提高病毒感染细胞的存活率，抑制病毒的复制，提高病毒感染动物的生存率，延长感染动物的生存时间，缓解病毒感染引发的病症，明显减少流感病毒感染所致的小鼠死亡，延长小鼠的平均存活时间；能够明显抑制流感病毒感染所致小鼠肺部感染，有效缓解小鼠的肺部感染症状。

[0013] 上述试验结果表明式Ⅰ生物碱类化合物应用到药物或抑菌剂中会具有显著疗效，本发明提供了式Ⅰ生物碱类化合物针对肠道病毒及其引发的疾病的活性剂量为20-100mg/kg/d，针对流感病毒及其引发的疾病的活性剂量为5-80mg/kg/d。所述药物和抑菌剂可独立选自口服给药剂型、注射给药剂型、外用给药制剂。所述药物和抑菌剂包括式Ⅰ生物碱类化合物和药学上可接受的载体。

[0014] 在本发明中，所述药学上可接受的载体可根据药剂学领域的常用辅料，根据剂型和实际情况进行恰当选择，例如常用的辅料有淀粉、低取代羟丙基纤维素、微粉硅胶、硬脂酸镁、淀粉浆、蔗糖、糊精、羧甲基淀粉钠、滑石粉、聚山梨酯、聚乙二醇、注射用大豆磷脂和注射用甘油等；

[0015] 所述口服给药剂型可以为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、乳剂、混悬剂；口服给药剂型中式Ⅰ生物碱类化合物的质量分数为17.5～88％，更优选为20～80％，最优选为25～75％。

[0016] 所述外用给药剂型可以为栓剂、贴剂或凝胶剂。所述注射给药剂型可以为注射液、冻干粉等。

[0017] 由以上技术方案可知，本发明提供了式Ⅰ生物碱类化合物在制备治疗病毒性疾病药物或在制备病毒抑制剂中的应用。式Ⅰ结构的生物碱类化合物来源于天然中草药植物平贝母，副作用小，对肠道病毒和流感病毒均有抑制作用，并对其引起的病毒性疾病有较好的治疗效果，提供了利用中药成分治疗手足口病和流感的新途径。

附图说明

[0018] 图1为本发明实施例5中贝母甲素对MDCK狗肾细胞的毒性；

[0019] 图2为本发明实施例6中贝母甲素对流感病毒株H1N1的抑制活性；

[0020] 图3为本发明实施例6中贝母甲素对流感病毒株H3N2的抑制活性。

具体实施方式

[0021] 本发明公开了具有式Ⅰ结构的生物碱类化合物在制备治疗病毒性疾病药物或在制备病毒抑制剂中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0022] 在本发明的具体实施方式中，采用中国药品生物制品检定所提供的贝母甲素和贝母乙素。

[0023] 在具体实施方式中，本发明采用MTS法测定贝母乙素对肠道病毒EV71和CoxA16病毒感染Vero细胞的保护及抑制病毒复制作用，结果表明贝母乙素对抗EV71病毒EC50为87mg/L，约合202μmol/L，抗CoxA16病毒EC50为83mg/L，约合194μmol/L。同时，贝母乙素能够抑制病毒在宿主细胞内的复制，降低病毒载量，具有促进病毒转阴的作用。

[0024] 本发明以腹腔注射的方式进行了贝母乙素对肠道病毒EV71型所致小鼠感染的疗效测试，结果表明，贝母乙素明显抑制EV71病毒导致的小鼠死亡，显著延长小鼠的存活时间达51.2％；本发明以腹腔注射的方式进行了贝母乙素对柯萨奇病毒A16型所致小鼠感染的疗效测试，结果表明，贝母乙素明显抑制柯萨奇病毒A16型导致的小鼠死亡，显著延长小鼠的存活时间达39.4％；贝母乙素与阳性对照药利巴韦林的抑制效果相似，能够不同程度地缓解病毒导致的小鼠死亡，延长小鼠存活时间，并能抑制病毒导致的炎症因子释放，缓解炎症等症状。

[0025] 同时，本发明采用了MTS法测定了贝母甲素对甲型流感病毒的抑制活性，结果表明，贝母甲素对流感病毒株A/PuertoRico/8/1934(H1N1)和A/Human/Hubei/3/2005(H3N2)的抑制活性较好，在20μM时对H1N1抑制率可达75.1％。本发明测定了贝母甲素对流感病毒神经氨酸酶的抑制作用，根据贝母甲素、空白对照组、酶液对照组和阳性对照药奥司他韦组的荧光值计算出贝母甲素对流感病毒神经氨酸酶的抑制率和半数抑制浓度(IC50)，结果表明，贝母甲素对流感病毒神经氨酸酶的抑制率为64.35％；半数抑制浓度(IC50)为13.4±1.24μM，说明贝母甲素对流感病毒神经氨酸酶具有较好的抑制作用。本发明还分别以灌胃(口服)和注射的方式进行了贝母甲素对甲型流感病毒所致小鼠感染的疗效测试，结果表明，贝母甲素在剂量20/40/80mg/kg/day时灌胃给药6天，小鼠的存活率分别为20％、50％和
70％，平均存活天数分别为8.7±1.8天、10.4±2.1天和12.4±2.7天，肺指数抑制率分别为
21％、35％和48％，阳性对照奥司他韦的小鼠存活率为80％，平均存活时间为13.5±2.4天，肺指数抑制率为53％；贝母甲素在剂量20/40/80mg/kg/day时注射给药6天，小鼠的存活率分别为30％、50％和80％，平均存活天数分别为8.9±2.1天、10.6±2.4天和12.8±1.8天，肺指数抑制率分别为20％、32％和49％，阳性对照奥司他韦的小鼠存活率为80％，平均存活时间为13.1±2.0天，肺指数抑制率为51％。由此可见，贝母甲素与阳性对照药奥司他韦对甲型流感病毒的抑制效果相似，贝母甲素能够明显减少流感病毒感染所致的小鼠死亡，延长小鼠的平均存活时间；能够明显抑制流感病毒感染所致小鼠肺部感染，有效缓解小鼠的肺部感染症状。

[0026] 下面结合实施例，进一步阐述本发明。

[0027] 实施例1：贝母乙素的细胞毒性

[0028] 1、实验材料

[0029] 细胞与培养方法：采用非洲绿猴肾细胞(Vero)为细胞模型，采用含10％胎牛血清的DMEM培养基(江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：150713)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，当细胞生长至90％密度后胰酶消化(Gibco公司，批号：1535318)传代，传代比例1/3-1/4。

[0030] 试剂：MTS细胞增殖定量检测试剂盒，购自Promega公司(批号：0000158071)；贝母乙素，购自上海永恒生物科技有限公司，批号YH20150425。

[0031] 仪器：微孔板读数仪，购自Molecular Devices公司，型号：Spectra Max M2e；倒置显微镜，购自Olympus公司，型号：CKX41；二氧化碳培养箱，购自Thermo Scientific公司，型号：Forma Steri-Cycle 371；生物安全柜，购自上海洁佳空气净化技术有限公司。

[0032] 2、实验方法

[0033] 取培养至90％密度的Vero细胞，0.25％胰酶消化后，用含10％胎牛血清的M199培养基调整细胞密度至1×105mL-1，每孔接种100μL细胞悬液于96孔板中。加入200μL不同浓度的含药M199培养基(样品从2000μg/mL-1起连续2倍梯度稀释6个梯度，胎牛血清终浓度为2.5％)，同时设置对照组(培养基中不含任何受试药物)，各组处理含3个复孔，CO2培养箱中培养72h后进行细胞增殖定量检测，用酶标仪于490nm处检测各孔吸光值(A)。以100％×[A(样品组)/A(对照组)]作为各组处理的细胞存活率，计算样品对Vero细胞的半数毒性浓度(TC50)。

[0034] 3、实验结论

[0035] 如表1所示，贝母乙素对Vero细胞的毒性作用呈明显的量效关系，细胞活性随给药浓度提高而逐步降低，表明贝母乙素对细胞的毒性逐步增加，根据表1数据计算得贝母乙素对Vero细胞TC50＝747mg/L，约合1.74mmol/L。

[0036] 表1贝母乙素对Vero细胞活力的影响(％，均值±标准误，n＝3)

[0037]

[0038]

[0039] *表示各组数据与对照组相比，在P<0.05的水平上具有显著差异

[0040] 本实施例明确了贝母乙素对Vero细胞的毒性情况，TC50＝516mg/L，约合1.2mmol/L，贝母乙素在31.25μg/mL时对MDCK细胞无细胞毒性。

[0041] 实施例2：贝母乙素对EV71和CoxA16病毒感染Vero细胞的保护及抑制病毒复制作用

[0042] 1、实验材料

[0043] 采用非洲绿猴肾细胞(Vero)为细胞模型，采用含10％胎牛血清的DMEM培养基(江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：150713)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，当细胞生长至90％密度后胰酶消化(Gibco公司，批号：1535318)传代，传代比例1/3-1/4。

[0044] EV71病毒BJ09/07株，GenBank登录号JQ319054.1，CoxA16病毒TS10/08株，GenBank登录号JX068829。临用前测定EV71病毒半数细胞病变剂量(TCID50)为108/mL，CoxA16TCID50为108.5/mL。

[0045] MTS细胞增殖定量检测试剂盒，购自Promega公司(批号：0000158071)；贝母乙素，购自上海永恒生物科技有限公司，批号YH20150425；总RNA提取试剂盒TRIzol购自美国Invitrogen公司(批号14105)，反转录试剂盒Prime ScriptTM购自宝生物工程(大连)有限公司(批号：AK2401)，EV71和CoxA16病毒载量检测试剂盒购自上海之江生物科技股份有限公司(批号均为H20140301-3)。

[0046] 微孔板读数仪，购自Molecular Devices公司，型号：Spectra Max M2e；倒置显微镜，购自Olympus公司，型号：CKX41；二氧化碳培养箱，购自Thermo Scientific公司，型号：Forma Steri-Cycle 371；生物安全柜，购自上海洁佳空气净化技术有限公司；普通PCR仪，型号：2720，荧光定量PCR仪，型号：StepOne PlusTM，均购自ABI公司。

[0047] 2、实验方法

[0048] 取培养至90％密度的Vero细胞，0.25％胰酶消化后，用含10％胎牛血清的M199培养基调整细胞密度至1×105mL-1，每孔接种100μL细胞悬液于96孔板中。加入50μL CoxA16或EV71病毒悬液(100TCID50)，加入50μL不同浓度的含药M199培养基(终浓度从500μg/mL开始以2倍梯度连续稀释5个浓度，共计6个给药浓度，胎牛血清终浓度为2.5％)，同时设置对照组(既不含病毒也不含药)和模型组(仅含病毒)，各组处理含3个复孔，CO2培养箱中培养72h后进行细胞增殖定量检测，用酶标仪于490nm处检测各孔吸光值(A)。以100％×[A(样品组)-A(模型组)]/[A(对照组)-A(模型组)]作为各组的保护率，计算样品对CoxA16和EV71病毒细胞的半最大效应浓度(EC50)。

[0049] 在研究感染细胞病毒载量的实例中，消化的细胞用10％胎牛血清的M199培养基调整细胞密度至2×105mL-1，每孔接种1mL于6孔板中，加入1mL含2000TCID50病毒的M199培养基以及药物(终浓度为250μg/mL)，同时设置对照组和模型组，各组处理含2个复孔，CO2培养箱中培养8h后参照试剂盒说明书分别提取RNA，合成cDNA以及检测病毒载量。

[0050] 3、实验结论

[0051] 表2贝母乙素对EV71和CoxA16病毒的抑制率(％，均值±标准误，n＝3)

[0052]浓度(μg/mL) EV71抑制率(％) CoxA16抑制率(％)
15.625 18.81±3.17 12.97±3.74
31.25 23.09±2.46 33.26±2.57
62.5 34.72±3.39 42.63±3.37
125 56.37±1.97 52.08±4.64
250 78.93±4.49 77.25±3.42
500 62.84±2.19 60.70±2.57

[0053] 如表2所示，贝母乙素对EV71和CoxA16病毒的抑制呈剂量依赖效应，抑制率随给药剂量增加逐渐提高，其中250μg/mL浓度的病毒抑制效果最佳。根据表2中数据计算得贝母乙素抗EV71病毒EC50为87mg/L，抗CoxA16病毒EC50为83mg/L(0.194mmol/L)。

[0054] 表3贝母乙素对EV71和CoxA16病毒复制的抑制作用(均值±标准误，n＝6)[0055]

[0056] *表示各组数据与对照组相比，在P<0.05的水平上具有显著差异

[0057] 如表3所示，250μg/mL贝母乙素能够显著抑制细胞内EV71和CoxA16病毒复制，降低病毒载量，表明贝母乙素具有促进病毒转阴的作用。

[0058] 本实施例明确了贝母乙素对EV71和CoxA16病毒的抑制性情况，研究表明贝母乙素对抗EV71病毒EC50为87mg/L，约合202μmol/L，抗CoxA16病毒EC50为83mg/L，约合194μmol/L。同时，贝母乙素能够抑制病毒在宿主细胞内的复制，降低病毒载量，具有促进病毒转阴的作用。

[0059] 实施例3：贝母乙素对EV71病毒感染的治疗作用

[0060] 1、实验材料

[0061] 5日龄ICR小鼠(Mus musculus)，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场。EV71病毒BJ09/07株，GenBank登录号JQ319054.1。临用前测定EV71病毒半数细胞病变剂量(TCID50)为108/mL。

[0062] 利巴韦林注射液(辰欣药业有限公司，批号：140903642，RBV)、注射液用生理盐水、一次性无菌注射器。细胞因子IL-6(批号：117467012)、TNF-α(批号：116660009)和MCP-1(批号：105130013)ELISA测定试剂盒，购自eBioscience公司。

[0063] 2、实验方法

[0064] (1)病毒液配制：根据病毒TCID50值，临用前将病毒稀释至107TCID50/mL。

[0065] (2)药液配制：贝母乙素(购自成都普菲德生物技术有限公司，批号：141113)采用注射用生理盐水稀释至所需剂量，0.22μm微孔滤膜过滤后待用。利巴韦林注射液于临用前摇匀开瓶，采用生理盐水稀释至所需剂量。

[0066] (3)分组、造模与给药：5日龄小鼠按照如下设计进行分组、造模及给药：小鼠随机按为11组：空白对照组、EV71模型组、贝母乙素高、中和低剂量组(100、50和20mg/kg)以及利巴韦林组(10mg/kg)，每组含13只小鼠。各组小鼠分别腹腔注射EV71病毒悬液，每只0.1mL，空白对照组以注射生理盐水代替。给药：造模结束后，每只小鼠进行腹腔注射给药(空白对照组和模型组以注射生理盐水代替)，每次0.1mL，每日1次，连续给药13日。造模后第6天每组各取3只乳鼠，取血清测定细胞因子IL-6、TNF-α和MCP-1含量。动物实验过程的所有操作，都根据科技部2006年颁布的《关于善待动物的指导性意见》进行。

[0067] 3、实验结论

[0068] 如表4所示，与阳性药利巴韦林注射液相似，中剂量组(50mg/kg)贝母乙素明显抑制EV71病毒导致的小鼠死亡，显著延长小鼠的存活时间达51.2％；其他各剂量的贝母乙素也具有相似的药效，不同程度地缓解病毒导致的小鼠死亡，延长小鼠存活时间。

[0069] 表4贝母乙素注射给药缓解EV71病毒导致的小鼠死亡(n＝10)

[0070]

[0071] 和*表示该组数据与EV71组相比，P<0.05。

[0072] 如表5所示，EV71病毒感染导致小鼠血清中IL-6、TNF-α和MCP-1含量异常升高，50mg/kg贝母乙素明显平抑EV71病毒导致的小鼠细胞因子升高(P<0.05)。

[0073] 表5小鼠血清细胞因子含量(ng/L，n＝3)

[0074]组别 IL-6 TNF-α MCP-1
空白对照组 24.22±5.19* 38.07±4.36* 112.94±12.94*
EV71 153.73±26.86 187.26±17.36 387.59±31.68
EV71+100 42.83±7.89* 58.31±8.35* 187.82±8.81*
EV71+50 30.72±6.44* 49.06±6.83* 133.53±10.98*
EV71+20 98.48±7.59* 147.67±7.58* 336.09±16.06*
EV71+RBV 53.61±8.93* 60.75±10.48* 179.83±11.38*

[0075] ＊表示该组数据与EV71相比P<0.05。

[0076] 上述数据表明贝母乙素治疗性注射给药能够降低EV71病毒致小鼠死亡，延长小鼠存活时间，并能抑制病毒导致的炎症因子释放，缓解炎症等症状。

[0077] 实施例4：贝母乙素对柯萨奇病毒A16型感染的治疗作用

[0078] 1、实验材料

[0079] 5日龄ICR小鼠(Mus musculus)，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场。

[0080] CoxA16病毒TS10/08株，GenBank登录号JX068829，CoxA16TCID50为108.5/mL。利巴韦林口服液(广州中医药大学科技产业园有限公司，批号：150908，RBVO)、生理盐水、乳鼠灌胃器。细胞因子IL-6(批号：117467012)、TNF-α(批号：116660009)和MCP-1(批号：105130013)ELISA测定试剂盒，购自eBioscience公司。

[0081] 2、实验方法

[0082] (1)病毒液配制：根据病毒TCID50值，临用前将病毒稀释至107 TCID50/mL。

[0083] (2)药液配制：贝母乙素(购自成都普菲德生物技术有限公司，批号：141113)采用生理盐水稀释至所需剂量。利巴韦林口服液临用前摇匀开瓶，采用生理盐水稀释至所需剂量(0.32g/kg)。

[0084] (3)分组、造模与给药：5日龄小鼠按照如下设计进行分组、造模及给药：小鼠随机分为11组：空白对照组、CoxA16模型组、贝母乙素高、中和低剂量组(400、200和100mg/kg)以及利巴韦林组(0.32g/kg)，每组含13只小鼠。给药：每只小鼠进行灌胃给药(空白对照组和模型组以生理盐水代替)，每次0.1mL，每日1次，连续给药15天。给药后第3天进行造模，各组小鼠分别腹腔注射CoxA16病毒悬液，每只0.1mL，空白对照组以注射生理盐水代替。造模后第6天每组各取3只乳鼠，取血清测定细胞因子IL-6、TNF-α和MCP-1含量。动物实验过程的所有操作，都根据科技部2006年颁布的《关于善待动物的指导性意见》进行。

[0085] 3、实验结论

[0086] 如表6所示，与阳性药利巴韦林口服液相似，中剂量组(200mg/kg)贝母乙素明显抑制CoxA16病毒导致的小鼠死亡，显著延长小鼠的存活时间达39.4％。同时，其他各剂量的贝母乙素也具有相似的药效，不同程度地缓解病毒导致的小鼠死亡，延长小鼠存活时间。

[0087] 表6贝母乙素口服给药缓解CoxA16病毒导致的小鼠死亡(n＝10)

[0088]组别 死亡率(％) 平均生存时间(天)
空白对照组 0$ 15#
CoxA16 100 10.4±0.3
CoxA16+400 20$ 13.2±0.6#
$ #
CoxA16+200 10 14.5±0.4
CoxA16+100 40$ 11.1±0.7#
CoxA16+RBVO 50$ 12.0±0.5#

[0089] $和#表示该组数据与CoxA16组相比，P<0.05。

[0090] 如表7所示，CoxA16病毒感染导致小鼠血清中IL-6、TNF-α和MCP-1含量异常升高，200mg/kg贝母乙素明显抑制CoxA16病毒引起的小鼠细胞因子升高(P<0.05)。

[0091] 表7小鼠血清细胞因子含量(ng/L，n＝3)

[0092]组别 IL-6 TNF-α MCP-1
空白对照组 34.57±5.16* 53.17±8.09* 140.42±10.58*
CoxA16 171.41±19.67 195.64±16.76 402.24±21.94
CoxA16+400 58.35±6.59* 69.94±7.49* 234.84±16.05*
CoxA16+200 42.58±3.90* 56.67±8.36* 154.64±5.28*
CoxA16+100 88.56±6.80* 136.51±7.29* 237.81±11.84*
CoxA16+RBVO 63.94±4.36* 86.43±8.68* 212.62±6.06*

[0093] *表示该组数据与CoxA16组相比P<0.05。

[0094] 上述数据表明贝母乙素预防性口服给药能够降低CoxA16病毒致小鼠死亡，延长小鼠存活时间，并能抑制病毒导致的炎症因子释放，缓解炎症等症状。

[0095] 实施例5：贝母甲素的细胞毒性

[0096] 细胞与病毒：流感病毒A/PuertoRico/8/1934(H1N1)株，流感病毒A/Human/Hubei/3/2005(H3N2)株，均由中国科学院武汉病毒研究所陈绪林研究员惠赠；MDCK狗肾细胞，购于美国ATCC细胞库；

[0097] 药物：奥司他韦羧酸盐，购于上海佰世凯化学科技有限公司；贝母甲素购于中国药品生物制品检定所；

[0098] 动物：BALB/c小鼠，18～20g，雌雄各半，南京市江宁区青龙山动物繁殖场。

[0099] 仪器：CO2培养箱，美国Thermo Fisher Scientific；酶标仪，Molecular Devices；生物安全柜，购自Heal Force公司。

[0100] MDCK细胞按5×104个/ml浓度接种到96孔板中，置37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。贝母甲素以不同浓度5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM加入细胞，每组3个复孔。培养48h后，加入10％MTS,在酶标仪A490nm下测定吸光值，计算细胞存活率，确定药物的最大无毒浓度。

[0101] 结果如图1所示，图1为本发明实施例5中贝母甲素对MDCK狗肾细胞的毒性。由图1可知，贝母甲素在20μM时对MDCK细胞无细胞毒性。

[0102] 实施例6：贝母甲素对甲型流感病毒的抑制活性

[0103] 所需试验材料见实施例5。

[0104] MDCK细胞按5×104个/mL浓度接种96孔培养板，置37℃、5％CO2培养箱中培养形成细胞单层。加入1640培养基稀释(1:160)的流感病毒A/PuertoRico/8/1934(H1N1)或A/Human/Hubei/3/2005(H3N2)感染细胞，每孔100μL，37℃孵育2h后，弃去病毒液。加入最大无毒浓度下的贝母甲素和阳性对照药奥司他韦(5μM)，每组设3个复孔。细胞于培养箱中培养48h，MTS测定OD490nm，计算抑制率。

[0105] 病毒抑制率％＝(OD加药组-OD病毒对照组)/(OD正常细胞对照组-OD病毒对照组)×100％。

[0106] 实验结果见图2-3，图2为本发明实施例6中贝母甲素对流感病毒株H1N1的抑制活性；图3为本发明实施例6中贝母甲素对流感病毒株H3N2的抑制活性。由图2和图3可以看出，贝母甲素对流感病毒株A/PuertoRico/8/1934(H1N1)和A/Human/Hubei/3/2005(H3N2)的抑制活性较好，在20μM时对H1N1抑制率可达75.1％。

[0107] 实施例7：贝母甲素对流感病毒神经氨酸酶的抑制作用

[0108] 所需试验材料见实施例5。

[0109] 96孔黑板，每孔依次加入35μLMES缓冲液，30μL以MES稀释的病毒尿囊液，再加入10μL的不同浓度稀释的贝母甲素，置于37℃孵育5min，实验同时设置空白对照组、酶液对照组、阳性对照药奥司他韦组(5μM)。然后避光每孔加入25μL的神经氨酸酶特异性荧光底物MUNANA。于37℃孵育20min后，每孔加入100μL的终止液。于激发波长360nm发射波长440nm处测定荧光强度，计算贝母甲素对神经氨酸酶活性的抑制率及流半数抑制浓度(IC50)。

[0110] 神经氨酸酶酶活抑制率＝(空白对照组的荧光值-加药组的荧光值)/(空白组的荧光值-背景组的荧光值)100％。

[0111] 结果如表8所示，贝母甲素对A/PuertoRico/8/1934(H1N1)流感病毒神经氨酸酶具有抑制活性，抗流感病毒活性明显。

[0112] 表8贝母甲素和奥司他韦对A/PuertoRico/8/1934(H1N1)神经氨酸酶的抑制率和半数抑制浓度(IC50)

[0113]组别 浓度(μM) 抑制率(％) IC50(μM)
贝母甲素 20 64.35±0.47 13.4±1.24
奥司他韦 5 97.68±0.35 (0.27±0.01)×10-3

[0114] 实施例8：贝母甲素灌胃(口服)给药对甲型流感病毒所致小鼠感染的治疗效果[0115] 所需试验材料见实施例5。

[0116] 分组将小鼠随机分为6组，随机正常组、模型组、高剂量组、中剂量、低剂量组、阳性药奥司他韦组，每组10只。造模：小鼠乙醚麻醉后，模型组和贝母甲素给药组用生理盐水按照1:1600(V/V)稀释A/PuertoRico/8/1934(H1N1)毒株尿囊液，滴鼻感染小鼠，每只小鼠滴鼻60μL。滴鼻感染流感病毒2h后，高、中、低剂量组小鼠灌胃给予贝母甲素，每只0.2mL，正常组给于等量生理盐水，每天给药1次，连续给药6天。连续14天观察各组小鼠的存活情况，计算死亡保护率和平均存活时间。于感染病毒后第5天禁食禁水8h，记录体重，摘除眼球放血致死，酒精消毒，解剖，无菌取出全肺，用生理盐水清洗肺组织2次，用滤纸吸干，记录肺重。按照式1和式2计算肺指数及肺指数抑制率。

[0117]

[0118]

[0119] 实验结果及分析：

[0120] (1)贝母甲素灌胃给药对H1N1感染小鼠死亡的保护作用

[0121] 结果如表9所示，与模型组相比，贝母甲素高、中、低剂量组均能减少流感病毒感染所致的小鼠的死亡，延长小鼠的平均存活时间。

[0122] 表9贝母甲素灌胃给药对H1N1感染小鼠死亡的保护作用

[0123]组别 浓度(mg/kg/day) 存活数 平均存活时间(天)
**
正常组 - 10/10 14.0±0.0
模型组 - 0/10 7.2±1.3
高剂量 80 7/10** 12.4±2.7**
中剂量 40 5/10* 10.4±2.1*
低剂量 20 2/10 8.7±1.8
奥司他韦 50 8/10** 13.5±2.4**

[0124] *P<0.05，**P<0.01，与模型组比较。

[0125] (2)贝母甲素灌胃给药对H1N1感染小鼠肺的保护作用

[0126] 结果如表10所示，与模型组相比，贝母甲素高、中、低剂量组均能抑制流感病毒感染所致小鼠肺部感染，有效缓解肺部感染症状。

[0127] 表10贝母甲素灌胃给药对H1N1感染小鼠肺指数的影响

[0128]组别 浓度(mg/kg/day) 肺指数 肺指数抑制率％
正常组 - 0.63±0.03 -
模型组 - 2.14±0.04 -
高剂量 80 1.10±0.03** 48
***
中剂量 40 1.35±0.04 35
低剂量 20 1.61±0.02*** 21
奥司他韦 50 1.00±0.07** 53

[0129] *P<0.05，**P<0.01，与模型组比较。

[0130] 实施例9：贝母甲素注射给药对甲型流感病毒所致小鼠感染的治疗效果

[0131] 所需试验材料见实施例5。

[0132] 分组将小鼠随机分为6组，随机正常组、模型组、高剂量组、中剂量、低剂量组、阳性药奥司他韦组，每组10只。造模：小鼠乙醚麻醉后，模型组和贝母甲素给药组用生理盐水按照1:1600(V/V)稀释A/PuertoRico/8/1934(H1N1)毒株尿囊液，滴鼻感染小鼠，每只小鼠滴鼻60μL。滴鼻感染流感病毒2h后，高、中、低剂量组小鼠尾静脉注射给予贝母甲素，每只0.2mL，正常组给于等量生理盐水，每天给药1次，连续给药6天。连续14天观察各组小鼠的存活情况，计算死亡保护率和平均存活时间。于感染病毒后第5天禁食禁水8h，记录体重，摘除眼球放血致死，酒精消毒，解剖，无菌取出全肺，用生理盐水清洗肺组织2次，用滤纸吸干，记录肺重。计算肺指数及肺指数抑制率。

[0133]

[0134]

[0135] 实验结果及分析：

[0136] (1)贝母甲素注射给药对H1N1感染小鼠死亡的保护作用

[0137] 结果如表11所示，与模型组相比，贝母甲素高、中、低剂量组均能减少流感病毒感染所致的小鼠的死亡，延长小鼠的平均存活时间。

[0138] 表11贝母甲素注射给药对H1N1感染小鼠死亡的保护作用

[0139]组别 浓度(mg/kg/day) 存活数 平均存活时间(天)
正常组 - 10/10 14.0±0.0**
模型组 - 0/10 7.3±1.1
高剂量 20 8/10** 12.8±1.8**
中剂量 10 5/10* 10.6±2.4*
低剂量 5 3/10 8.9±2.1
奥司他韦 12.5 8/10** 13.1±2.0**

[0140] *P<0.05，**P<0.01，与模型组比较。

[0141] (2)贝母甲素注射给药对H1N1感染小鼠肺的保护作用

[0142] 结果如表12所示，与模型组相比，贝母甲素高、中、低剂量组均明显抑制流感病毒感染所致小鼠肺部感染，有效缓解肺部感染症状。

[0143] 表12贝母甲素注射给药对H1N1感染小鼠肺指数的影响

[0144]

[0145]

[0146] *P<0.05，**P<0.01，与模型组比较。

[0147] 实施例10：贝母甲素制备胶囊剂药物

[0148] 将350g贝母甲素和32g淀粉、6g低取代羟丙基纤维素、4.5g微粉硅胶、1.5g硬脂酸镁、及适量10％淀粉浆混合，装入胶囊，得到贝母甲素的胶囊制剂1000粒。每日3次，每次1粒。

[0149] 实施例11：贝母乙素制备颗粒剂药物

[0150] 将350g贝母乙素和1000g蔗糖及500g糊精混合，按照常规方法制成1000包贝母乙素颗粒剂。每日3次，每次1粒。

[0151] 实施例12：贝母甲素制备片剂药物

[0152] 将350g贝母甲素和50g淀粉、7.5g羧甲基淀粉钠、0.8g滑石粉、50g糊精、0.8g硬脂酸镁及适量10％淀粉浆适混合，按照常规方法制成贝母甲素片剂1000片。每日3次，每次1片。

[0153] 实施例13：贝母乙素制备丸剂药物

[0154] 将350g贝母乙素和12g聚乙二醇-6000、80.5g聚山梨酯-80、适量液状石蜡混合，按照常规方法制成贝母乙素丸剂1000粒。每日3次，每次1粒。

[0155] 实施例14：贝母甲素制备注射剂药物

[0156] 将200g贝母甲素和15g注射用大豆磷脂、25g注射用甘油，注射用水定容至1000mL，按照常规方法制成贝母甲素注射剂1000支。每日1次，每次1支，至少采用250mL 5％葡萄糖注射液稀释后静脉滴注。

[0157] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。