抗人PDL1抗体及其用途

摘要

本申请提供了新的抗人PDL1的抗体或其片段。此外，本申请还提供了所述抗体或其片段的医学和生物学用途。

权利要求

1.特异性结合人PDL1的抗体，其包含含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区以及含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区，其特征在于：所述HCDR1序列为GGTFSRH(SEQ ID NO：26)，所述HCDR2序列为IPILGI(SEQ ID NO：27)，所述HCDR3序列为QTIGLSA(SEQ ID NO：29)，所述LCDR1序列为GGDNIGSHSAH(SEQ ID NO：31)，所述LCDR2序列为DDTNRPS(SEQ ID NO：32)，所述LCDR3序列为QAWDTAGDHPV(SEQ ID NO：33)；或者，所述HCDR1序列为GGTFSRH(SEQ ID NO：26)，所述HCDR2序列为IPILGI(SEQ ID NO：27)，所述HCDR3序列为QTFGLSS(SEQ ID NO：30)，所述LCDR1序列为GGDNIGSHSAH(SEQ ID NO：31)，所述LCDR2序列为DDTNRPS(SEQ ID NO：32)，所述LCDR3序列为QAWDTAGDHPV(SEQ ID NO：33)；或者，所述HCDR1序列为GGTFSRH(SEQ ID NO：26)，所述HCDR2序列为IPILGI(SEQ ID NO：27)，所述HCDR3序列为RGLGLDV(SEQ ID NO：28)，所述LCDR1序列为GGDNIGSHSAH(SEQ ID NO：31)，所述LCDR2序列为DDTNRPS(SEQ ID NO：32)，所述LCDR3序列为QAWDTAGDHPV(SEQ ID NO：33)；

其中HCDR和LCDR序列根据Chothia定义。

2.根据权利要求1所述的抗体，其中：

所述重链可变区序列为SEQ ID NO：22，所述轻链可变区序列为SEQ ID NO：25；或者所述重链可变区序列为SEQ ID NO：23，所述轻链可变区序列为SEQ ID NO：25；或者所述重链可变区序列为SEQ ID NO：24，所述轻链可变区序列为SEQ ID NO：25。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的抗体，其特征在于所述抗体为全抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或ScFv片段。

4.根据权利要求1-2中任一项所述的抗体，其特征在于所述抗体为全人源抗体。

5.根据权利要求1至2中任一项所述的抗体，其中所述抗体还包含选自IgG1、IgG2或IgG4亚型的重链恒定区和/或包含选自κ亚型或λ亚型的轻链恒定区。

6.根据权利要求5所述的抗体，其中所述重链恒定区为SEQ ID NO：12所示的IgG1亚型重链恒定区、SEQ ID NO：13所示的IgG2亚型重链恒定区或SEQ ID NO：14所示的IgG4亚型重链恒定区；和/或所述轻链恒定区为SEQ ID NO：15所示的κ亚型轻链恒定区或SEQ ID NO：16所示的λ亚型轻链恒定区。

7.药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项所述的抗体。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体在制备用于恶性肿瘤的预防和/或治疗的药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述恶性肿瘤选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、乳腺癌、白血病。

10.根据权利要求8所述的用途，其中所述恶性肿瘤为 晚期实体瘤。

说明书

抗人PDL1抗体及其用途

技术领域

[0001] 本申请大体涉及抗体药物领域，具体而言，本申请提供了抗人PDL1抗体及其医学和生物学用途。

[0002] 发明背景

[0003] 程序性死亡受体－1(programmed death-1,PD-1)是T细胞上的一种跨膜受体，PD-1能够与配体PDL1(程序性死亡受体配体1)、PDL2相互作用，抑制T细胞增殖。在正常机体中，PD-1作为一种T细胞增殖的负调节分子，对维持机体的免疫耐受有重要作用。在肿瘤和病毒感染时，细胞中PDL1和PDL2的表达上调，与T细胞表面的PD-1受体相互作用，能够抑制T细胞的活化、增殖及对肿瘤的杀伤，使其功能发生紊乱和枯竭。针对PD-1的单克隆抗体能够阻断PD-1与配体的结合，而抗PDL1的单克隆抗体可阻断PDL1与PD-1、CD80的相互作用，从而恢复T细胞功能，起到杀伤肿瘤细胞的作用。

[0004] 目前美国FDA已经批准使用的抗PD1的单抗药物包括百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb)的Opdivo(纳武单抗)和默克公司(Merck)的Keytruda(派姆单抗)。这些抗PD1的单抗在临床上用于治疗黑色素瘤和化疗后依然进展的转移性鳞状非小细胞肺癌等多种肿瘤。另外还有多个抗PD-1和抗PDL1的抗体进入临床试验用于多种肿瘤的治疗。但是本领域仍然需要更多适于治疗患者的改善的能阻断PD-1与PDL1结合的抗体。

[0005] 发明概述

[0006] 第一方面，本申请提供了特异性结合人PDL1的抗体，其包含含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区，其特征在于：所述HCDR1序列为GGTFSRH(SEQ ID NO：26)，所述HCDR2序列为IPILGI(SEQ ID NO：27)，所述HCDR3序列为RGLGLDV(SEQ ID NO：28)；或者，所述HCDR1序列为GGTFSRH(SEQ ID NO：26)，所述HCDR2序列为IPILGI(SEQ ID NO：27)，所述HCDR3序列为QTIGLSA(SEQ ID NO：29)；或者，所述HCDR1序列为GGTFSRH(SEQ ID NO：26)，所述HCDR2序列为IPILGI(SEQ ID NO：27)，所述HCDR3序列为QTFGLSS(SEQ ID NO：30)；其中HCDR序列根据Chothia定义。

[0007] 在一些实施方案中，特异性结合人PDL1的抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：22、23或24的氨基酸序列所示。

[0008] 第二方面，本申请提供了特异性结合人PDL1的抗体，其包含含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区，其特征在于：所述LCDR1序列为GGDNIGSHSAH(SEQ ID NO：31)，所述LCDR2序列为DDTNRPS(SEQ ID NO：32)，所述LCDR3序列为QAWDTAGDHPV(SEQ ID NO：33)，其中LCDR序列根据Chothia定义。

[0009] 在一些实施方案中，特异性结合人PDL1的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：25的氨基酸序列所示。

[0010] 第三方面，本申请提供了特异性结合人PDL1的抗体，其包含含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区以及含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区，其特征在于：所述HCDR1序列为GGTFSRH(SEQ ID NO：26)，所述HCDR2序列为IPILGI(SEQ ID NO：27)，所述HCDR3序列为QTIGLSA(SEQ ID NO：29)，所述LCDR1序列为GGDNIGSHSAH(SEQ ID NO：31)，所述LCDR2序列为DDTNRPS(SEQ ID NO：32)，所述LCDR3序列为QAWDTAGDHPV(SEQ ID NO：33)；或者，所述HCDR1序列为GGTFSRH(SEQ ID NO：26)，所述HCDR2序列为IPILGI(SEQ ID NO：
27)，所述HCDR3序列为QTFGLSS(SEQ ID NO：30)，所述LCDR1序列为GGDNIGSHSAH(SEQ ID NO：31)，所述LCDR2序列为DDTNRPS(SEQ ID NO：32)，所述LCDR3序列为QAWDTAGDHPV(SEQ ID NO：33)；或者，所述HCDR1序列为GGTFSRH(SEQ ID NO：26)，所述HCDR2序列为IPILGI(SEQ ID NO：27)，所述HCDR3序列为RGLGLDV(SEQ ID NO：28)，所述LCDR1序列为GGDNIGSHSAH(SEQ ID NO：31)，所述LCDR2序列为DDTNRPS(SEQ ID NO：32)，所述LCDR3序列为QAWDTAGDHPV(SEQ ID NO：33)；其中HCDR和LCDR序列根据Chothia定义。

[0011] 在一些实施方案中，特异性结合人PDL1的抗体的重链可变区序列为SEQ ID NO：22，轻链可变区序列为SEQ ID NO：25。

[0012] 在一些实施方案中，特异性结合人PDL1的抗体的重链可变区序列为SEQ ID NO：23，轻链可变区序列为SEQ ID NO：25。

[0013] 在一些实施方案中，特异性结合人PDL1的抗体的重链可变区序列为SEQ ID NO：24，轻链可变区序列为SEQ ID NO：25。

[0014] 在上述三方面的一些实施方案中，特异性结合人PDL1的抗体为全抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或ScFv片段。

[0015] 在一些实施方案中，特异性结合人PDL1的抗体为全人源抗体。

[0016] 在一些实施方案中，特异性结合人PDL1的抗体还包含选自IgG1(SEQ ID NO：12)、IgG2(SEQ ID NO：13)或IgG4(SEQ ID NO：14)亚型的重链恒定区和/或包含选自κ亚型(SEQ ID NO：15)或λ亚型(SEQ ID NO：16)的轻链恒定区。

[0017] 第四方面，本申请提供了包含前述特异性结合人PDL1的抗体的药物组合物。

[0018] 第五方面，本申请提供了前述特异性结合人PDL1的抗体在制备用于由PDL1介导的疾病的预防和/或治疗的药物中的用途。

[0019] 在一些实施方案中，由PDL1介导的疾病为癌症。

[0020] 在一些实施方案中，癌症包括但不限于：黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、乳腺癌、白血病、晚期实体瘤以及其它癌症。

[0021] 附图简要说明

[0022] 图1为噬菌体展示载体pADSCFV-S的质粒图谱。

[0023] 图2为显示对照抗体(MI4736和MPDL3280A)抑制噬菌体展示的ScFv(S4B11)结合人PDL1-His的图。

[0024] 图3为显示不同的抗PDL1单克隆抗体与重组PDL1-His的结合能力的图，其中三种抗体分别为IgG4-MI4736、IgG4-MPDL3280A和IgG1-H1B12+L5A10。

[0025] 图4为显示不同的抗PDL1单克隆抗体抑制PD1与PDL1的结合的图，其中三种抗体分别为IgG4-MI4736、IgG4-MPDL3280A和IgG1-H1B12+L5A10。

[0026] 发明详述

[0027] 本申请的发明人通过构建大容量天然人源噬菌体抗体库，筛选并优化得到了具有希望性质的抗PDL1单克隆抗体。在本申请的多个方面，提供了新型抗人PDL1的抗体或其抗原结合片段，编码该抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，包含所述多核苷酸的载体，包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞，制备和纯化该抗体的方法及所述抗体或其抗原结合片段的医学应用。根据本申请提供的抗体基因序列，可构建全长的抗体分子作为药物用于临床上由人PDL1介导的疾病。

[0028] 除非另外指明，本发明的实施将采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。

[0029] 除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。

[0030] 定义

[0031] 本文使用的术语“抗体”指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合靶标的免疫球蛋白分子。靶标包括但不限于碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、多肽等。本文使用的“抗体”不仅包括完整的(即全长)抗体，而且还包括其抗原结合片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及任何其他包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。

[0032] 通常，完整或全长的抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链含有重链变异区(VH)和第一、第二及第三恒定区(CH1、CH2及CH3)。每个轻链含有轻链变异区(VL)和恒定区(CL)。全长的抗体可以是任何种类的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或上述的子类)，但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链恒定区的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类别。通常，免疫球蛋白有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，而且这些类别中有几种可被进一步区分成子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ以及μ。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构和三维结构是公知的。

[0033] 本文使用的术语“抗原结合片段”或“抗原结合域”指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区域。抗原结合域可以包含重链变异区(VH)、轻链变异区(VL)或上述两者。VH和VL中的每一个通常含有三个互补决定区CDR1、CDR2及CDR3。

[0034] 抗原结合片段的实例包括但不限于：(1)Fab片段，其可以是具有VL-CL链和VH-CH1链的单价片段；(2)F(ab’)2片段，其可以是具有两个Fab片段的二价片段，该两个Fab片段由铰链区的二硫桥(即Fab的二聚物)连接；(3)具有抗体的单臂的VL和VH域的Fv片段；(4)单链Fv(scFv)，其可以是由VH域和VL域经短肽连接而组成的单一多肽链；以及(5)(scFv)2，其可以包含两个由肽连接的VH域和两个VL域，该两个VL域经由二硫桥与该两个VH域组合。

[0035] “特异性结合”指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合。

[0036] 详细描述

[0037] 第一方面，本申请提供了特异性结合人PDL1的抗体，其包含含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区，其特征在于：所述HCDR1序列为GGTFSRH(SEQ ID NO：26)，所述HCDR2序列为IPILGI(SEQ ID NO：27)，所述HCDR3序列为RGLGLDV(SEQ ID NO：28)；或者，所述HCDR1序列为GGTFSRH(SEQ ID NO：26)，所述HCDR2序列为IPILGI(SEQ ID NO：27)，所述HCDR3序列为QTIGLSA(SEQ ID NO：29)；或者，所述HCDR1序列为GGTFSRH(SEQ ID NO：26)，所述HCDR2序列为IPILGI(SEQ ID NO：27)，所述HCDR3序列为QTFGLSS(SEQ ID NO：30)；其中HCDR序列根据Chothia定义。

[0038] Chothia定义是基于结构环区的位置鉴定CDR区边界的经典规则。参阅例如Kabat,“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，National Institutes of Health,Bethesda，Md.(1991)；A1-Lazikani et al.，J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；以及Martin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989)。

[0039] 本领域技术人员公知，对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列中CDR区序列，例如可以利用在线软件Abysis确定(http://www.abysis.org/)。

[0040] 在一些实施方案中，特异性结合人PDL1的抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：22、23或24的氨基酸序列所示。

[0041] 第二方面，本申请提供了特异性结合人PDL1的抗体，其包含含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区，其特征在于：所述LCDR1序列为GGDNIGSHSAH(SEQ ID NO：31)，所述LCDR2序列为DDTNRPS(SEQ ID NO：32)，所述LCDR3序列为QAWDTAGDHPV(SEQ ID NO：33)，其中LCDR定义根据Chothia定义。

[0042] 在一些实施方案中，特异性结合人PDL1的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：25的氨基酸序列所示。

[0043] 第三方面，本申请提供了特异性结合人PDL1的抗体，其包含含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区以及含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区，其特征在于：所述HCDR1序列为GGTFSRH(SEQ ID NO：26)，所述HCDR2序列为IPILGI(SEQ ID NO：27)，所述HCDR3序列为QTIGLSA(SEQ ID NO：29)，所述LCDR1序列为GGDNIGSHSAH(SEQ ID NO：31)，所述LCDR2序列为DDTNRPS(SEQ ID NO：32)，所述LCDR3序列为QAWDTAGDHPV(SEQ ID NO：33)；或者，所述HCDR1序列为GGTFSRH(SEQ ID NO：26)，所述HCDR2序列为IPILGI(SEQ ID NO：
27)，所述HCDR3序列为QTFGLSS(SEQ ID NO：30)，所述LCDR1序列为GGDNIGSHSAH(SEQ ID NO：31)，所述LCDR2序列为DDTNRPS(SEQ ID NO：32)，所述LCDR3序列为QAWDTAGDHPV(SEQ ID NO：33)；或者，所述HCDR1序列为GGTFSRH(SEQ ID NO：26)，所述HCDR2序列为IPILGI(SEQ ID NO：27)，所述HCDR3序列为RGLGLDV(SEQ ID NO：28)，所述LCDR1序列为GGDNIGSHSAH(SEQ ID NO：31)，所述LCDR2序列为DDTNRPS(SEQ ID NO：32)，所述LCDR3序列为QAWDTAGDHPV(SEQ ID NO：33)；其中HCDR和LCDR序列根据Chothia定义。

[0044] 在一些实施方案中，特异性结合人PDL1的抗体的重链可变区序列为SEQ ID NO：22，轻链可变区序列为SEQ ID NO：25。

[0045] 在一些实施方案中，特异性结合人PDL1的抗体的重链可变区序列为SEQ ID NO：23，轻链可变区序列为SEQ ID NO：25。

[0046] 在一些实施方案中，特异性结合人PDL1的抗体的重链可变区序列为SEQ ID NO：24，轻链可变区序列为SEQ ID NO：25。

[0047] 在上述三方面的一些实施方案中，特异性结合人PDL1的抗体为全抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或ScFv片段。

[0048] 在一些实施方案中，特异性结合人PDL1的抗体为全人源抗体。

[0049] 在一些实施方案中，特异性结合人PDL1的抗体还包含选自IgG1(SEQ ID NO：12)、IgG2(SEQ ID NO：13)或IgG4(SEQ ID NO：14)亚型的重链恒定区和/或包含选自κ亚型(SEQ ID NO：15)或λ亚型(SEQ ID NO：16)的轻链恒定区。

[0050] 在一些实施方案中，特异性结合人PDL1的抗体拮抗至少一种与PDL1或其部分相关的体外或体内生物活性。

[0051] 在一些实施方案中，特异性结合PDL1的抗体能够特异性结合重组人PDL1胞外区。

[0052] 在一些实施方案中，特异性结合PDL1的抗体能够特异性抑制PD-1结合重组人PDL1胞外区。

[0053] 本申请还提供了编码前述抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体以及用所述载体转染的宿主细胞。

[0054] 第四方面，本申请提供了包含前述特异性结合人PDL1的抗体的药物组合物。

[0055] 在一些实施方案中，药物组合物还包含药学可接受的载体、赋形剂、稀释剂等。

[0056] 在一些实施方案中，药物组合物还可包含润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，如苯甲酸、山梨酸和丙酸钙；增甜剂和/或调味剂等。

[0057] 在一些实施方案中，可将本申请中的药物组合物配制为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、酏剂、悬液、乳剂、溶液、糖浆、栓剂或胶囊等形式。

[0058] 在一些实施方案中，可以利用任何生理上可接受的给药方式递送本申请的药物组合物，这些给药方式包括但不限于：口服给药、肠胃外给药、经鼻给药、直肠给药、腹膜内给药、血管内注射、皮下给药、经皮给药、吸入给药等。

[0059] 在一些实施方案中，可以通过混合具有所需纯度的试剂与视情况的药学上可接受的载体、赋形剂等，以冻干制剂或水溶液的形式配制用于治疗用途的药物组合物用于存储。

[0060] 第五方面，本申请提供了前述特异性结合人PDL1的抗体在制备用于由PDL1介导的疾病的预防和/或治疗的药物中的用途。

[0061] 在一些实施方案中，由PDL1介导的疾病为癌症。

[0062] 在一些实施方案中，癌症包括但不限于：黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、乳腺癌、白血病、晚期实体瘤以及其它癌症。

[0063] 在一些实施方案中，本申请的抗体的药理学活性、其在血清中的稳定性及其在小鼠体内的代谢均可在标准测试方法中进行证明。

[0064] 第六方面，本申请还提供编码本发明抗体或其轻链或重链的分离的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体、包含所述载体的宿主细胞以及产生所述抗体的方法。在一些实施方案中，所述核酸分子可操作地连接到调控序列，调控序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。在一些实施方案中，产生抗体的方法包括培养宿主细胞以便于表达核酸。在一些实施方案中，产生抗体的方法还包括从宿主细胞培养基中回收抗体。

[0065] 此外，本文所述的特异性结合人PDL1的抗体也可用于检测生物样品中PDL1的存在。基于抗体的检测方法在本领域是众所周知的，并且包括例如ELISA、免疫印迹、放射免疫试验、免疫荧光、免疫沉淀以及其它相关技术。

[0066] 应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。实施例

[0067] 提供以下实施例仅仅是对本申请的一些实施方案进行举例说明，没有任何限制性目的或性质。

[0068] 实施例1：高质量噬菌体展示抗体库的构建

[0069] 抗体库技术是制备和筛选人单克隆抗体的一个重要方法，而基于噬菌体展示的抗体库技术则是目前成熟的抗体库技术，已经成功地应用于人单抗药物的制备。本实施例描述利用当今多种基因工程技术构建噬菌体展示抗体库的策略和方法。

[0070] 1.1制备抗体重链和轻链可变区基因(VH和VL)。

[0071] 为构建人抗体库，首先需要获得人抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因。抗体可变区基因来自正常人外周血淋巴细胞以及全合成。

[0072] 1.1.1天然人抗体可变区基因的制备。

[0073] 采集19个正常志愿者的血液(各50mL)，其中所采集的血液由发明人及其同事作为志愿者提供，所有志愿者均已签署知情同意书。志愿者的纳入标准为：

[0074] 1.年龄大于18周岁；

[0075] 2.无HIV、HBV感染；

[0076] 3.血常规检测正常；

[0077] 4.非孕妇或哺乳期妇女。

[0078] 然后用淋巴细胞分离液(MP Biomedicals公司,Cat#:0850494)分离淋巴细胞，利用Omega公司的总RNA提取试剂盒(Cat#:R6834-01)制备RNA，然后用TransGen Biotech公司的反转录试剂盒(Cat#:AT301-03)制备cDNA。最后用下表1所列的引物组进行PCR，分别扩增抗体的重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL，包括Vk和Vl)。利用常规的琼脂糖凝胶电泳方法纯化并回收扩增的PCR产物(VH、VK或Vl)，置于-20℃保存备用。

[0079] 表1：扩增天然人抗体重链和轻链基因所用引物

[0080]

[0081]

[0082] 1.1.2全合成人抗体可变区基因的制备。

[0083] 全合成抗体基因制备的基本策略是利用简并引物在选定的模板抗体基因的CDR中引入设计的突变。为构建全合成人抗体库，本实施例中选择了3种人抗体重链可变区模板(VH1、VH3和VH5)和两种人抗体轻链可变区模板(VK1和Vl3)构建人全合成抗体库。

[0084] 设计并委托明琛志远生物技术公司合成5种抗体可变区基因VH1(SEQ ID NO:1)，VH3(SEQ ID NO:2)，VH5(SEQ IDNO:3)，VK1(SEQ ID NO:4)以及Vl3(SEQ ID NO:5)。设计并合成表2所列的引物，分别用于在5种可变区基因的CDR1、CDR2和CDR3中引入设计的各种突变。利用常规PCR技术及各组含有设计突变的兼并引物，分别在对应的CDR中引入设计的突变，然后再利用2-3轮重叠延伸PCR构建得到完整的重链可变区(VH1、VH3、VH5)和轻链可变区(VK1、VL3)基因。琼脂糖凝胶电泳回收扩增的最终的可变区基因PCR产物，置于-20℃保存备用。

[0085] 表2.扩增全合成人抗体可变区基因所用引物

[0086]

[0087]

[0088]

[0089] 1.2构建单链抗体(ScFv)基因

[0090] 为构建单链抗体基因(ScFv)，在重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)之间添加常用的由15个氨基酸组成的柔性连接肽，该连接肽的序列为GGGGSGGGGSGGGGS，编码序列为ggtggaggcggttct ggcggaggtgggagc ggaggcggaggttca。设计的单链抗体的结构为VH-连接肽-VL。

[0091] 基于此实施例第一部分的方法，共获得如下表3所示的多种重链和轻链可变区基因，即四种不同的重链可变区基因和3种轻链可变区基因。

[0092] 表3：各种不同重链和轻链可变区基因。

[0093]  重链可变区 轻链可变区
天然抗体基因 VH VL(VK+Vl混合)
合成抗体基因 VH1 VK1
  VH3 VL3
  VH5  

[0094] 基于上述单链抗体的设计以及目前已经成熟重叠延伸PCR技术，可以很方便的将此表所示的不同重链和轻链进行组合，共构建获得12种不同的单链抗体基因。利用琼脂糖凝胶电泳方法纯化并回收PCR扩增获得的12种单链抗体基因，置于-20℃保存备用。

[0095] 1.3构建基于阿拉伯糖启动子的噬菌体展示载体。

[0096] 常用的噬菌体展示载体基于乳糖启动子(Plac)，而乳糖启动子由于其渗漏表达等特性，影响抗体库的容量和多样性。以常用的噬菌体展示载体pCANTAB5E(Amersham Biosciences/GE公司)为基础，对pCANTAB5E进行了如下改造。

[0097] 利用AflIII和NotI双酶切，将pCANTAB5E载体上的Plac启动子及g3蛋白信号肽部分更换为包含AraC基因，阿拉伯糖启动子(Para)及PelB信号肽(PelB leader)的片段。其中AraC基因和ParaC来自invitrogen公司的pBADhis载体，而PelB前导序列(SEQ ID NO:6)为人工合成序列。然后再利用NcoI和NotI双酶切，将一段约750bp的无关序列(stuff sequence,SEQ ID NO:7)克隆在NcoI和NotI位点之间，构建得到最终的新型噬菌体展示载体pADSCFV-S(图1)。该载体中的NcoI位点和NotI位点，可以方便的用于克隆单链抗体(ScFv)基因。

[0098] 1.4人单链抗体库及噬菌体展示抗体库的制备。

[0099] 利用NcoI和NotI双酶切的策略，将1.2中制备的12种ScFv分别克隆至载体pADSCFV-S，将连接产物分别电转TG1电转感受态，每个子库约20个电转，总共约240次电转。利用稀释法对每个子库的库容量进行推算，随机从每个子库中取30-40个克隆进行序列分析，以推算每个子库的正确率，汇总12个子库的库容量及正确率见表4。此12个子库的总库容量达到1.0*10E9，平均正确率超过75％。

[0100] 表4：12个子库的库容量及正确率。

[0101]

[0102]

[0103] 将构建的12个子库分别接种于2YTAG液体培养基(A：氨苄青霉素，100μg/mL；G：葡萄糖，2％)，37℃，220rpm震荡培养至对数生长期(OD600＝0.8)，感染M13辅助噬菌体(M13KO7,NEB公司)，感染结束后置换2YTAKA液体培养基(A：氨苄青霉素，100μg/mL；K：卡那霉素，70μg/mL；A：阿拉伯糖，0.001％)，28℃，220rpm震荡培养过夜进行噬菌体扩增，然后利用PEG/Nacl沉淀方法制备纯化噬菌体(噬菌体-ScFv)，并进行滴度测定。然后参照库容量的比例将制备的12个子库的噬菌体-ScFv进行混合，制备噬菌体展示人抗体库，噬菌体的最终滴度为6*10E12cfu/mL，冻存于-70℃。此噬菌体展示抗体库可以用于筛选针对各种目的抗原的特异性人抗体。

[0104] 实施例2：重组蛋白的制备

[0105] 为了制备抗PDL1单抗，合成了多种重组蛋白基因，包括人PDL1胞外区(hPDL1，SEQ ID NO:8)、人PD1胞外区(hPD1，SEQ ID NO:9)以及对照重组抗体。重组抗人PDL1对照抗体MI4736(参见美国专利申请US20130034559A1)的重链和轻链可变区序列分别为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18，重组对照抗体MPDL3280A(参见美国专利US 8217149 B2)的重链和轻链可变区序列分别为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。为了方便纯化，非抗体类的重组蛋白在C端添加了His标签(SEQ ID NO:10)或者鼠抗体的Fc段(mFc1，SEQ ID NO:11)。在重组抗体制备过程中，使用的抗体重链恒定区可以是IgG1亚型(SEQ ID NO:12)、IgG2亚型(SEQ ID NO:
13)或IgG4亚型(SEQ ID NO:14)，轻链恒定区可以是κ亚型(SEQ ID NO:15)或λ亚型(SEQ ID NO:16)。

[0106] 根据Uniprot数据库的各种目的重组蛋白的氨基酸序列，设计并合成上述重组蛋白的基因(包含His标签或者mFc编码基因)。将合成的重组蛋白基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(购自Invitrogen公司)，然后利用脂质体(Invitrogen公司的293fectin)将制备的重组蛋白表达质粒转染Invitrogen公司的HEK293F细胞，在无血清悬浮培养条件下培养3-4天。然后通过离心方式收获培养上清。

[0107] His标签融合表达的重组蛋白利用金属螯合亲和层析柱(GE公司的HisTrap FF)对培养上清中的重组蛋白进行进一步纯化。而mFc1融合表达的重组蛋白和重组抗体用Protein A/G亲和层析柱(GE公司的Mabselect SURE)进行进一步纯化。然后利用脱盐柱(GE公司的Hitrap脱盐柱)将重组蛋白保存缓冲液置换为PBS(pH7.2)，然后分装保存于-20℃。

[0108] 实施例3：利用噬菌体展示抗体库技术筛选和优化抗人PDL1单克隆抗体[0109] 以制备的重组hPDL1-his(以下简写为PDL1-His)为抗原，利用固相筛选策略(参考技术为：噬菌体展示：通用实验指南/(美)克拉克森(Clackson,T.),(美)洛曼(Lowman,H.B.)编；马岚等译。化学工业出版社，2008.5)筛选展示人单链抗体库的噬菌体，获得多株序列不同但特异性结合人PDL1的人单链抗体(ScFv)。

[0110] 然后利用制备的重组抗人PDL1对照抗体MI4736(重链和轻链可变区序列分别为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18，重链恒定区为IgG4亚型，轻链恒定区为κ亚型)和MPDL3280A(重链和轻链可变区序列分别为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20，，重链恒定区为IgG4亚型，轻链恒定区为κ亚型)对筛选得到的阳性克隆进行噬菌体-ELISA抑制实验。结果显示，单抗S4B11(氨基酸序列SEQ ID NO:21，核酸序列SEQ ID NO:34)与PDL1的结合能够完全或者部分被MI4736或者MPDL3280A所抑制(图2)，表明此株单抗与MI4736或者MPDL3280A的抗原结合表位部分或者完全重叠，因而推测S4B11可能与对照抗体(MI4736和MPDL3280A)的功能类似，即能够阻断PDL1与PD1之间的结合。

[0111] 然后，基于公司建立的双载体噬菌体呈现系统，以单抗S4B11的重链(S4B11VH)为基础，利用轻链置换(具体操作可参照本申请人之前提交的中国专利第201510097117.0号中的实施例4.3)对抗体S4B11进行亲和力体外成熟研究，并最终筛选到能够提高单抗S4B11亲和力的新轻链L5A10(SEQ ID NO:25)。

[0112] 然后再利用重链CDR(HCDR)突变策略对S4B11单抗的HCDR3进行突变并构建了库容量超过1.0*10E7的突变库，其中HCDR3突变引入所需的引物名称和序列见表5。以筛选到的新轻链L5A10为基础，基于公司的双载体噬菌体展示系统，对HCDR3突变库进行筛选和单克隆鉴定(具体操作可参照本申请人之前提交的中国专利第201510097117.0号中的实施例5)，鉴定出两个亲和力提高的重链突变体H1B12(SEQ ID NO.22)和H1D12(SEQ ID NO.23)。

[0113] 将鉴定的新轻链L5A10和S4B11的重链或重链突变体进行组合，最终获得三株亲和力较亲本抗体S4B11提高的抗体突变体(具体信息参见表6)。

[0114] 表5：构建S4B11重链HCDR3突变库所需引物

[0115]

[0116] 表6：亲和力成熟的抗人PDL1的单克隆抗体

[0117]

[0118] 实施例3：BIacore 3000测定抗PDL1单克隆抗体全抗体的亲和力

[0119] 氨基偶联试剂盒和人抗体捕获试剂盒以及CM5芯片和pH7.4的10×HBS-EP均购自GE healthcare。

[0120] 根据试剂盒中的说明书，将抗人Fc段的抗体偶联至芯片CM5的表面上，稀释抗体蛋白至合适的浓度，保证100-200RU左右的抗体被抗人Fc的抗体捕获。将PDL1-His设置一系列的浓度梯度(100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.5625nM、0nm)流经固定相表面，分别测定单克隆抗体S4B11VH+L5A10、H1B12+L5A10和H1D12+L5A10的亲和力，其中各单克隆抗体的重链恒定区均为IgG1亚型，轻链恒定区均为κ亚型。

[0121] 结果如表7所示。数据显示：抗体H1B12+L5A10的亲和力最高。

[0122] 表7：抗PDL1单克隆抗体亲和力常数的测定数值

[0123]抗体 Kon(1/MS) Koff(1/S) KD(mol/L)
S4B11VH+L5A10 3.80E+06 1.60E-02 4.21E-09
H1B12+L5A10 4.20E+06 6.50E-03 1.55E-09
H1D12+L5A10 4.40E+06 9.90E-03 2.25E-09

[0124] 实施例4：不同抗PDL1单克隆抗体结合PDL1的能力分析

[0125] 选取单克隆抗体H1B12+L5A10进行后续测试。

[0126] 利用ELISA方法对抗PDL1单克隆抗体H1B12+L5A10和对照抗体MI4736、MPDL3280A结合PDL1-His的能力进行了分析。

[0127] 包被PDL1-his(1.5μg/mL，100μL/孔，4℃包被过夜)，各单克隆抗体的起始浓度为300nM，并分别进行3倍梯度稀释，每个单抗样品设置11个稀释度。利用HRP山羊抗人IgG检测各个稀释度的单克隆抗体结合PDL1的能力(图3)。然后利用Graphpad Prism对数据进行分析并作图(图3和表8)。数据显示，单克隆抗体H1B12+L5A10具有与对照抗体类似的结合PDL1的能力。

[0128] 表8：不同抗PDL1单克隆抗体的EC50

[0129]  IgG4-MI4736 IgG4-MPDL3280A IgG1-H1B12+L5A10
EC50(nM) 0.1144 0.1739 0.2457

[0130] 实施例5：抗人PDL1单克隆抗体竞争PDL1结合PD1

[0131] 功能性的抗PDL1单抗应该能在蛋白水平上阻断PDL1和PD1之间的结合，本实施例分析了3种不同的抗PDL1单抗(H1B12+L5A10和两种对照抗体MI4736、MPDL3280A)抑制PDL1与PD1的结合的能力。

[0132] 利用重组PD1-Fc包被ELISA板(5μg/mL)，然后用含有2.5μg/mL(50nM)PDL1-mFc1的PBST-2％牛奶分别对各种单抗进行系列稀释。单抗的起始浓度为70nM，前6个点3：4稀释，后4个点1：1稀释。利用HRP山羊抗鼠IgG检测PD1-PDL1的结合信号，然后利用GraphPad Prism 
6进行数据分析和作图(图4和表9)。数据显示，所有的单抗都能够有效抑制PD1-PDL1间的结合。

[0133] 表9：不同抗PDL1单克隆抗体抑制PD1-PDL1结合的IC50

[0134]  IgG4-MI4736 IgG4-MPDL3280A IgG1-H1B12+L5A10
IC50(nM) 9.939 16.8 7.285

[0135] 在不偏离本申请公开的实质和范围的情况下，可对本申请公开的各实施方案进行多种改变和用等同替换。除非上下文中另有说明，否则本公开的实施方案的任何特征、步骤或实施方案都可以与任何其他特征、步骤或实施方案组合使用。