一株乳酸菌及其在酸浆豆腐生产中的应用

摘要

一株快速产酸的乳酸菌，该乳酸菌为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）YQ336，已于2016年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12796。利用筛选到的干酪乳杆菌YQ336（Lactobacillus casei YQ336）和市售的乳酸乳球菌制备酸浆凝固剂并应用于酸浆豆腐的生产中。具有发酵速度快，无杂菌等致病菌污染，提高了生产速度并保证了豆腐食用安全性。酸浆发酵液作为豆腐凝固剂，可以充分保证豆腐产品的食用安全性。所生产的豆腐感官质量显著优于自然发酵酸浆豆腐凝固剂所生产的豆腐。

权利要求

1.一株乳酸菌，其特征在于该乳酸菌为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）YQ336 ，已于2016年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No . 12796。

2.根据权利要求1所述的一株乳酸菌的应用，其特征在于，应用在酸浆豆腐生产中。

说明书

一株乳酸菌及其在酸浆豆腐生产中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株乳酸菌及其在酸浆豆腐生产中的应用。技术背景

[0002] 酸浆点豆腐在我国有上千年的加工历史。酸浆是豆腐制作过程中产生的废水——黄浆水经自然发酵变酸即为酸浆，利用其所含的乳酸来制作豆腐，制成的豆腐更为醇香，与石膏、盐卤以及内酯等凝固剂相比，源自豆腐本身的酸浆更为天然、绿色和安全；同时，减少了豆腐废水排放造成的环境污染。

[0003] 但是，由于酸浆是自然发酵的产物，受环境因素的影响较大，很难控制酸浆的酸度，导致生产的酸浆豆腐品质不稳定。另一方面，自然发酵过程中，除有益菌外，还有许多腐败杂菌的存在，从而会导致所生产的酸浆豆腐保质期短。若将酸浆的生产由自然发酵变为严格的纯种发酵，将会解决以上两方面的问题，这也正是酸浆凝固剂标准生产的意义所在。

发明内容

[0004] 本发明针对自然发酵酸浆受环境因素的影响较大，难于控制的问题提供一株快速产酸的乳酸菌，该乳酸菌能够在新鲜的黄浆水中快速生长产酸。该乳酸菌为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）YQ336，已于2016年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 12796。

[0005] 本发明的另一个目的在于，利用筛选到的干酪乳杆菌YQ336（Lactobacillus casei YQ336）和市售的乳酸乳球菌制备酸浆凝固剂并应用于酸浆豆腐的生产中。

[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0007] 所述的Lactobacillus casei YQ336的个体形态特征：大小为（0.7µm～1.1µm）×（2.0µm～4.0µm），杆状或长杆状，单个、成对或呈链状排列，革兰氏阳性，无芽孢、荚膜及鞭毛。菌落形态特征：菌落大小在1 mm～3mm，正面为圆形，侧面稍有突起，乳白色，不透明，菌落边缘整齐，表面光滑，质地柔软有弹性。最适生长温度为30-40℃，最适pH为5.5-6.8，在pH为4或者更低时仍可生长。具有良好的耐酸性、耐盐性和耐胆汁能力。同型乳酸发酵，乳酸是最终的发酵终产物，不发酵葡萄糖产气。不产生脲酶，不能代谢精氨酸产氨。生长必需维生素B2、叶酸、钙、泛酸和烟酸。

[0008] 该菌株的16 S rDNA 序列全长共 1491 bp，经Genbank比对与Lactobacillus casei相似性达到99%；结合其个体、群体形态特征，鉴定为Lactobacillus casei，命名为Lactobacillus casei YQ336。

[0009] 该菌株从辽宁省锦州市气象台农贸市场豆腐作坊自然发酵黄浆水中分离获得，经测定其能够在黄浆水发酵过程中快速生长并产酸。本发明的优势在于提供了一株能够在新鲜黄浆废水中快速产酸的纯种发酵生长的乳酸菌，与市售乳酸乳球菌配伍接种于新鲜黄浆水中，经6h发酵，其发酵液可作为酸浆豆腐生产的酸浆凝固剂，充分利用了副产物资源且生产出的酸浆豆腐风味好口感佳，深受广大群众的喜爱。

[0010] 本发明提供利用Lactobacillus casei  YQ336发酵生产酸浆凝固剂的方法：在冷却至室温的新鲜黄浆水中添加2%的葡萄糖，调pH至6.8，接种3%-5%种子培养液，静置于恒温培养箱中发酵6h即为酸浆凝固剂。

[0011] 具体为：用接种环挑取一环斜面保藏的干酪乳杆菌YQ336于3mL黄浆水培养基中，37℃下发酵6h；另取一环乳酸乳球菌于3mL黄浆水培养基中，37℃下发酵6h。

[0012] 取上述干酪乳杆菌发酵液3mL和乳酸乳球菌发酵液1.5mL接入到100mL黄浆水培养基中37℃下发酵6h，获得种子培养液，将种子培养液按3%-5%接种量接入黄浆水培养基，37℃下发酵6h，该发酵液即为酸浆凝固剂。

[0013] 黄浆水培养基配方：葡萄糖20g，新鲜黄浆水1000mL。

[0014] 该酸浆凝固剂在豆腐生产中的使用方法：

[0015] 将酸浆凝固剂与蒸馏水按1:2稀释后备用。500g干豆泡发、磨浆、过滤后煮沸，待温度降至70℃，并保温70℃开始用稀释后的酸浆点浆，1-2min点浆一次约100mL左右，待出现明显大量块状凝聚停止点浆。

[0016] 本发明所用材料及使用后产生的效果：

[0017] （1）Lactobacillus casei YQ336在新鲜黄浆水中可快速生长产酸，3%接种量发酵5小时，pH即可降到4以下，乳酸产量为12.36g/L。

[0018] （2）与自然发酵酸浆凝固剂相比，Lactobacillus casei YQ336和乳酸乳球菌混菌发酵酸浆凝固剂具有发酵速度快，无杂菌等致病菌污染，提高了生产速度并保证了豆腐食用安全性。

[0019] （3）本发明所筛选的Lactobacillus casei YQ336及所使用的乳酸乳球菌为益生菌，利用益生菌发酵黄浆水获得的酸浆发酵液作为豆腐凝固剂，可以充分保证豆腐产品的食用安全性。

[0020] （4）Lactobacillus casei YQ336和乳酸乳球菌混菌发酵酸浆豆腐凝固剂所生产的豆腐感官质量显著优于自然发酵酸浆豆腐凝固剂所生产的豆腐。

具体实施方式

[0021] 实施例1

[0022] 发酵菌株的分离、筛选与鉴定

[0023] 1 实验材料

[0024] 黄浆水琼脂培养基：葡萄糖20g，琼脂15g，新鲜黄浆水1000mL，调pH至6.8，115℃灭菌30min。

[0025] 自然发酵黄浆水：取自锦州气象台农贸市场豆腐作坊。

[0026] 黄浆水培养基配方：葡萄糖20g，新鲜黄浆水1000mL。

[0027] 2 发酵菌株的分离

[0028] 2.1 样品的稀释

[0029] 用无菌吸管吸取自然发酵黄浆水25mL，移入盛有225mL无菌生理盐水带玻璃珠的-1 -1三角瓶中，充分振摇均匀，即为10 的样品稀释液。用无菌生理盐水对10 的样品稀释液进行梯度稀释至10-7。

[0030] 2.2平板分离培养

[0031] 取上述10-5、10-6、10-7稀释度的稀释液各1mL分别注入无菌培养皿中，每个稀释度做三个重复。以无菌操作按20g/L的量将灭菌的CaCO3加入熔化了的黄浆水琼脂培养基中，于自来水中迅速冷却至50℃左右，边冷却边摇晃将瓶内CaCO3摇匀的同时，立刻倒入培养皿内摇匀，使样品稀释液和CaCO3均匀分布于培养基中。待培养基凝固后，倒置于37℃温箱中培养24h。

[0032] 2.3 平板接种培养

[0033] 用接种环挑取菌落周围产生CaCO3溶解圈较大的菌落20株，编号后划线接种于黄浆水琼脂培养基斜面上，37℃培养24h，反复纯化3代，得到单菌落接种于黄浆水琼脂培养基斜面上，37℃培养24h。

[0034] 3 菌株筛选

[0035] 3.1方法 取上述20株斜面培养物各1环，进行涂片、革兰氏染色，油镜观察个体形态和纯度。同时分别挑取1环培养物接入3mL黄浆水培养基中， 37℃培养6h后，接入到100mL黄浆水培养基中37℃下发酵6h，获得种子培养液，将种子培养液按3%接种量接入黄浆水培养基，37℃下发酵，以pH和乳酸含量（利用高效液相色谱法检测乳酸含量）为指标，筛选出一株pH最低、产酸速度快的乳酸菌菌株YQ336。

[0036] 3.2结果

[0037] 3.2.1 pH结果见表1

[0038]

[0039] 由上述pH结果选择pH最低的一株细菌336号进行菌种鉴定。

[0040] 3.2.2 乳酸检测结果

[0041] 3%接种量发酵5小时，pH即可降到4以下，乳酸产量为12.36 g/L。

[0042] 4 菌种鉴定

[0043] 4.1 乳酸菌YQ336的形态特征观察

[0044] 将乳酸菌菌株YQ336在黄浆水琼脂培养基中37℃下培养24h，然后进行革兰氏染色，其个体形态特征见表2。

[0045]  表2 YQ336菌株的形态特征

[0046]

[0047] 菌株YQ336在黄浆水琼脂培养基，37℃下培养48h，观察菌落大小、形态和颜色，结果见表3。

[0048] 表3 菌落形态特征

[0049]

[0050] 4.2 乳酸菌YQ336的生理生化特征

[0051] 根据常规生理生化鉴定，结果见表4，参照《伯杰细菌鉴定手册》，初步判断菌株YQ336为乳杆菌属。

[0052] 表4 菌株生理生化特性

[0053]

[0054] 4.3 乳酸菌YQ336的16S rDNA序列分析结果

[0055] 该菌株的16 S rDNA 序列全长共 1491 bp，经Genbank比对与Lactobacillus casei相似性达到99%；结合其菌体的群体形态特征、个体形态特征、生理生化试验结果及菌株的16 S rDNA 序列比对，确定该菌株为干酪乳杆菌，命名为Lactobacillus casei YQ336，已于2016年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所，邮编100101），保藏编号为CGMCC No. 12796。

[0056] 实施例2

[0057] Lactobacillus casei YQ336在酸浆豆腐生产中的应用

[0058] 1 试验材料

[0059] 试验用的菌株为本发明分离的Lactobacillus casei YQ336和市售乳酸乳球菌，自然发酵黄浆水采集自锦州市气象台农贸市场豆腐作坊。

[0060] 2 酸浆凝固剂的制备

[0061] ⑴ 种子培养基配方：葡萄糖20g，新鲜黄浆水1000ml。

[0062] ⑵制备方法：

[0063] 用接种环挑取一环斜面保藏的干酪乳杆菌YQ336于3ml黄浆水培养基中，37℃下发酵6h；另取一环乳酸乳球菌于3mL黄浆水培养基中，37℃下发酵6h。

[0064] 取上述干酪乳杆菌发酵液3mL和乳酸乳球菌发酵液1.5mL接入到100mL黄浆水培养基中37℃下发酵6h，获得种子培养液，将种子培养液按3%-5%接种量接入黄浆水培养基，37℃下发酵6h，该发酵液即为酸浆凝固剂。

[0065] 3 微生物检验

[0066] 乳酸菌总数和大肠菌群数分别按GB 4789.35-2010和 GB 4789. 3-2010 方法测定。

[0067] 4 自然发酵酸浆与混菌发酵酸浆的比较见表5

[0068]  表5 自然发酵酸浆与混菌发酵酸浆比较

[0069]发酵方法 自然发酵 混菌发酵
最低pH 3.60 3.35
乳酸菌含量（cfu/mL） 3.2×10 8 4.9×10 12
大肠菌群数（个/100mL） 12 0

[0070] 5 酸浆豆腐的制作

[0071] 500g干豆泡发9个小时 +5000mL水打浆，然后100目筛子过滤，过滤后先小火后大火煮沸，再100目筛子过滤，温度降至70℃并维持70℃开始点浆（500mL酸浆1：2稀释），1-2min点浆一次约100mL，待出现明显大量块状凝聚停止点浆，再顺时针方向搅拌豆浆至块状增大至不变且水固分离时，保温养浆20min，再大火加热至微沸1min，1000g重物压制蹲脑
20min；

[0072] 6 自然发酵酸浆凝固剂与混菌发酵酸浆凝固剂生产豆腐的感官比较[0073] 6.1 感官评定 组织从事食品研究的专业人员 10 人，成立评定小组，按照表6对制得的酸浆豆腐的色、香、味、形及综合感官进行逐一评判，给出一个综合评分，满分为 100 分。

[0074]

[0075] 6.2 评定结果

[0076]

[0077] 由表7可知Lactobacillus casei YQ336和乳酸乳球菌混菌发酵酸浆豆腐凝固剂所生产的豆腐感官质量显著（P＜0.05）优于自然发酵酸浆豆腐凝固剂所生产的豆腐。

[0078] 7 自然发酵酸浆凝固剂与混菌发酵酸浆凝固剂生产豆腐的保水性

[0079] 7.1 保水性测定方法：称取2g (精确到0.0001g) 豆腐，于底部有脱脂棉的50mL离心管中，以1000 r/min转速离心10min后称重并记录(W1)，置于105℃下干燥至恒重(W0)。

[0080] 豆腐保水性=[(W1-W0)/W1]×100%

[0081] 7.2 结果

[0082] 从表8可以看出，混菌发酵酸浆豆腐凝固剂所生产的豆腐保水性显著（P＜0.05）高于自然发酵酸浆豆腐凝固剂所生产的豆腐。

[0083]

[0084]  8 结论

[0085] 本发明从自然发酵黄浆水中筛选到一株快速产酸乳酸菌Lactobacillus casei YQ336，利用该菌株产酸速度快的特性，将其与乳酸乳球菌混菌接入到新鲜黄浆水中发酵成酸浆凝固剂，用该酸浆凝固剂生产的豆腐特点是保水性好、质地细腻、口味清淡略带甘甜，安全无污染，避免了因使用盐类凝固剂而将重金属引入豆腐中，还可降低凝固剂成本，符合营养与安全的饮食理念。

[0086] 该酸浆凝固剂利用副产物新鲜黄浆水资源为原料，既能增加豆腐风味，又能减轻环境污染与治理压力。