一种快速提取细菌基因组DNA的方法

摘要

本发明公布了一种快速提取细菌基因组DNA的方法，利用低温等离子体活化水与细菌菌液反应，直接裂解细胞壁，释放出细菌基因组DNA。本发明方法简单易行，成本低，时间短，可现场快速提取样品中细菌基因组DNA，用于分子生物学检测。

权利要求

1.一种快速提取细菌基因组DNA的方法，包括以下步骤：

1)制备低温等离子体活化水：采用大气压等离子体射流喷枪激发低温等离子体与水反应生成低温等离子体活化水，其中大气压等离子体射流喷枪的激发电源为高频交流电，输入电压为50 100V，电流为0.2 0.5A，载气为5%V/V氧气和95%V/V氩气或氮气的混合气体；

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2)将步骤1）制备的活化水与菌液混合，震荡反应一定时间，实现细胞壁的裂解和DNA的提取。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）利用大气压等离子体射流喷枪激发低温等离子体与水反应，当水的pH至3 5之间，氧化还原电位值在400 500 mV之间，得到低温~ ~等离子体活化水。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中低温等离子体活化水与菌液按体积

1∶1混合，震荡反应5 20min。

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说明书

一种快速提取细菌基因组DNA的方法

技术领域

[0001] 本发明属于微生物样品前处理领域，具体涉及一种用于现场快速提取样品细菌基因组DNA的方法，主要是利用高压放电产生等离子体直接与无菌水混合，生成等离子体活化水，通过与包括空气、水体以及人体样品等混合，快速提取样品DNA，与当前基因检测方法结合后可以快速完成细菌检测。

背景技术

[0002] 随着生物化学与分子生物学技术的进步，核酸在微生物领域的应用日益广泛，核酸检测技术发展迅速。例如，环介导等温扩增(loop-mediated  isothermal amplification,LMAP)等快速检测技术出现，样本检测时间大大缩短，检测限降低。这对样本的前处理提出了新的要求，低成本、耗时短、操作简便的核酸提取方法逐渐成为研究热点。

[0003] 目前，细菌基因组DNA提取方法有专用DNA提取试剂盒法、碱裂解法、煮沸法、SDS裂解法及其他破壁方法(超声破碎、研磨破碎、反复冻融等)。碱裂解法具有简捷、纯度高等优点，是目前应用最广泛的细菌基因组DNA的常规提取方法之一，但该方法提取时间较长，通常需要两小时以上，且具有一定的腐蚀性；应用专用DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，效果好，但成本较高，临床应用受到限制；煮沸法时间短，操作简单，收率较低，其最大的缺陷是对提取革兰氏阳性菌基因组DNA的效果不佳；SDS裂解法及其他裂解方法需要复杂的裂解体系，不仅配制麻烦，而且部分药品有毒，操作危险性大，此外部分药品及相关酶试剂价格昂贵，因此在应用上受到一定的限制。

[0004] 本发明采用大气压等离子体射流喷枪制备的低温等离子体活化水(Plasma Activated Water，PAW)，该种经过处理的水具有强氧化性，在与细菌菌液混合反应后，可通过物理方法实现对细胞的裂解，提取细菌基因组DNA，具有简便、快速、材料易获得等特点，可大大缩短核酸样本提取的时间，显著降低DNA提取的费用以及对特定设备的依赖。目前国内外还没有采取这种方法提取细菌基因组DNA。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种快速提取细菌基因组DNA的方法，该方法可用于裂解细胞壁，将核酸从细胞中释放出来，所得核酸样品可用于分子生物学检测，例如环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)等方法。

[0006] 本发明采用的技术方案如下：

[0007] 一种快速提取细菌基因组DNA的方法，包括以下步骤：

[0008] 1)制备低温等离子体活化水(PAW)；

[0009] 2)将步骤1)制备的活化水与菌液混合，震荡反应一定时间，即可实现细胞壁的裂解和DNA的提取。

[0010] 上述步骤1)优选采用大气压等离子体(atmospheric pressure cold plasma)射流喷枪制备低温等离子体活化水。其中，以高频高压交流电作为大气压低温等离子体射流喷枪的激发电源，优选电源输入电压为50～100V，电流实时调整，一般在0.2～0.5A。载气优选使用5％V/V氧气和95％V/V氩气或氮气的混合气体，生成的低温等离子体从喷枪喷嘴喷出。将喷嘴置于无菌水液面上方(距离液面2cm左右)，激发低温等离子体与水反应，当水的pH至3～5之间，氧化还原电位(OPR)值在400～500mV之间，即为制备完成，通常控制反应时间在10～30min，生成低温等离子体活化水(PAW)，震荡混匀后用于后续实验。

[0011] 上述步骤2)中，优选PAW与菌液按体积1∶1混合，震荡反应5～20min。

[0012] 使用低温等离子体处理过的水具有强氧化性，且具有pH值低、氧化还原电位(ORP)值高，以及能长期贮存NO2-、NO3-与H2O2等特点。本发明利用低温等离子体活化水与细菌菌液反应，直接裂解细胞壁，释放出细菌基因组DNA。本发明方法简单易行，成本低，时间短，可现场快速提取样品中细菌基因组DNA，用于分子生物学检测。

附图说明

[0013] 图1：实施例1等离子体活化水提取铜绿假单胞菌DNA后LAMP检测结果比较图。

[0014] 图2：实施例2等离子体活化水提取肺炎链球菌DNA后LAMP检测结果比较图。

具体实施方式

[0015] 下面结合实施例进一步阐述本发明，本领域技术人员应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

[0016] 实施例1：等离子体活化水用于提取革兰氏阴性菌-铜绿假单胞菌DNA

[0017] (1)制备等离子体活化水：大气压低温等离子体射流喷枪的激发电源输入电压50V，电流0.20A，载气使用氩气(含5％V/V氧气)，流速5L/min，将喷嘴置于50mL无菌水液面上2cm，激发低温等离子体与水反应，反应时间为30min，生成低温等离子体活化水(PAW)，震荡混匀10s。

[0018] (2)制备铜绿假单胞菌菌液：使用LB培养基在37℃下培养24小时。菌落长出后，用20mL无菌水将其从培养基表面刮下来，置于50mL离心管中，7000rpm下离心7min，弃上清液后加入20mL无菌水，震荡混匀；重复上述步骤两次，最后加入20mL无菌水后混匀得到待处理菌液。

[0019] (3)梯度处理：将原菌液稀释，得到100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5浓度的菌液。

[0020] (4)将上述6个浓度梯度的菌液分别按体积1∶1与PAW混合，震荡反应20min。

[0021] (5)同时使用天根细菌基因组提取试剂盒(天根生物科技有限公司，北京)提取步骤(3)所得梯度菌液，作为对照。

[0022] (6)将上述反应液使用环介导等温扩增(LAMP)的方法进行扩增，反应体系为25μL，包含2μL DNA模板，1.6μM的FIP和BIP，0.2μM的F3和B3，0.8μM的LF和LB，8U Bst酶，以及12.5μL的2×RM，使用ddH2O补齐体积。将混合体系至于浊度仪(LA-500，Kyoto,Japan)中，64℃反应60min，最后80℃加热处理2min。

[0023] 结果如图1所示，高浓度时，使用PAW处理G-细菌(铜绿假单胞菌)得到的DNA样本，LAMP反应的检测时间小于传统的吸附柱法，表明该方法提取的DNA浓度较高，菌液浓度稍低时，使用PAW方法处理细菌的效率略低于试剂盒方法。

[0024] 实施例2：等离子体活化水用于提取革兰氏阳性菌-肺炎链球菌DNA

[0025] (1)制备等离子体活化水：大气压低温等离子体射流喷枪的激发电源输入电压50V，电流0.20A，载气使用氩气(含5％V/V氧气)，流速5L/min，将喷嘴置于50mL无菌水液面上2cm，激发低温等离子体与水反应，反应时间为30min，生成低温等离子体活化水(PAW)，震荡混匀10s。

[0026] (2)制备肺炎链球菌菌液：使用LB培养基在37℃下培养24小时。菌落长出后，用20mL无菌水将其从培养基表面刮下来，置于50mL离心管中，7000rpm下离心7min，弃上清液后加入20mL无菌水，震荡混匀；重复上述步骤两次，最后加入20mL无菌水后混匀得到待处理菌液。

[0027] (3)梯度稀释处理：将原菌液梯度稀释，分别得到1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5浓度的菌液。

[0028] (4)将上述6个浓度梯度的菌液分别按体积1∶1与PAW混合，震荡反应20min。

[0029] (5)同时使用天根细菌基因组提取试剂盒(天根生物科技有限公司，北京)提取步骤(3)所得梯度菌液，作为对照。

[0030] (6)将上述反应液使用环介导等温扩增(LAMP)的方法进行扩增，反应体系为25μL，包含2μL DNA模板，1.6μM的FIP和BIP，0.2μM的F3和B3，0.8μM的LF和LB，8U Bst酶，以及12.5μL的2×RM，使用ddH2O补齐体积。将混合体系至于浊度仪(LA-500，Kyoto,Japan)中，64℃反应60min，最后80℃加热处理2min。

[0031] 结果如图2所示，本发明提供的细菌基因组DNA的方法，与标准的吸附柱法提取方法相比，材料简单易得，成本低，反应时间短，并且对LAMP检测没有影响，可以广泛应用于提取细菌基因组DNA。